자가산부식접착제를이용한치면열구전색의미세누출평가 김현진 이난영 이상호 조선대학교치과대학소아치과학교실 국문초록 자가산부식접착제는산부식과정후수세없이와동을충전할수있다. 움직임이많고행동조절이어려운환자의경우시술의절차를줄일수있는자가산부식접착제가치면열구전색제의사용을보다용이하게할수있다. 그러나법랑질에대한산부식능력이인산에비해낮아서충분한부식이일어나는지에대해논란이되고있다. 이에대해자가산부식접착제의약한산부식능을감안하여열구성형술과 acidic primer의도포시간을증가시키는등의임상술식을시행하고자가산부식접착제의단점이보완되는지를알아보고자하였다. 35% 인산으로산부식후전색술을시행한경우와자가산부식접착제를사용하여도포한경우의미세누출도를염색액의침투도를비교하고주사전자현미경을이용한산부식상관찰을통하여다음과같은결론을얻었다. 1. 열구성형술을시행후자가산부식접착제를도포한군은인산부식 20초를시행한군과자가산부식접착제를 20초, 40초도포한군보다미세누출도가더낮았다. 2. 자가산부식접착제를제조회사의지시에따라 20초간도포한군과 40초로늘려도포한군간에미세누출도의유의차가없었다. 3. 주사전자현미경관찰시전형적인산부식양상은인산부식 20초군에서만관찰되었으며열구성형술을시행하고자가산부식접착제를도포한군이자가산부식접착제만 20, 40초도포한군보다는표면거칠기가증가하였다. 주요어 : 소와열구, 자가산부식접착, 35% 인산부식, 미세누출 Ⅰ. 서론 소아에서치아우식증의예방은임상의에게는가장관심있는분야중의하나로이와관련하여다양한방법들이강구되어왔다. 특히맹출한지얼마되지않은대구치나유구치는소와및열구부위의형태가복잡하고석회화의정도가낮아우식감수성이매우높기때문에이부위의치아우식증예방법에대해활발히연구되어왔다 1-5). 치아우식증은유병률이높은질환이며 교신저자 : 이난영 광주광역시동구서석동 375 번지조선대학교치과대학소아치과학교실 Tel: 062-220-3860 E-mail: nandent@chosun.ac.kr 이중에서도제 1대구치에서발생하는우식증의 90% 가소와열구에서발생되는것으로알려져있다 6,7). 대부분의제 1대구치는출은한지 2년이내에치아우식증에이환되고 8) 특히, 1987년도 NIDR(National Institute of Dental Reserch) 의조사에의하면하악제 1대구치의협측소와 (buccal pit) 가전체치아우식증의원인중 40% 를차지하고상악제 1 대구치의설측구 (lingual groove) 가약 30% 를차지한다고한다 9). 치아교합면소와및열구는구조적으로음식물잔사, 치태및세균의저장소역할을함으로써잇솔질등물리적인방법으로깨끗이닦기어렵고상수도수불소화, 국소도포또는불소액양치등에의한우식예방효과도평활면에비해크지않아치아우식이가장발생하기쉬운부위이다 10). 치면열구전색술은이와같이좁고깊은소와및열구를인위적으로폐쇄해줌으로써교합면우식증을예방하는효과적인 이논문은 2008 년도조선대학교학술연구비의지원에의해연구되었음. 216
대한소아치과학회지 35(2) 2008 방법으로현재까지어린이들에있어구치부치아우식증의이환율을감소시키는데많은기여를해오고있으나전색제의파절이나탈락등임상적인실패가많은것이문제점으로지적되고있다 10-12). 성공적인치면열구전색술을위한조건으로는대상치아의선정, 교합면우식증존재여부의진단, 환자와보호자의이해와협조, 대상치아의교합면세척방법, 방습유지, 재료에대한이해와적용방법, 침투도등여러가지단계와절차가관련되어있으며이들모두성공적으로이루어져야하므로매우술식에민감한방법이라할수있다 10,13). 현재치면열구전색제도포시임상가들이가장관심있게추구하는두가지사항은첫째, 치면열구전색제가소와및열구내로깊숙히침투하도록하는것과둘째, 치면열구전색제와치면사이의미세누출을최소로발생하게하는것이다 10). 미세누출은치질과수복물사이의공간에박테리아, 구강액, 분자및이온이임상적으로탐지해낼수없게스며드는것이라정의할수있다. 치면열구전색제가미세누출을방지할수있는성질은중요한데그것은미세누출이치면열구전색제하방으로우식이발생할수있도록해주기때문이다 14). 최근소개되고있는자가산부식접착제는산부식과정후수세없이와동을충전할수있다. 러버댐을적용하기어려운경우나움직임이많고행동조절이어려운경우산부식과세정없이치면열구전색제와법랑질의결합을가능하게하는자가산부식접착제는임상에서치면열구전색제의사용을용이하게할수있을것이다 15). 그러나모든자가산부식접착제는소수성단량체의개선을위해수분, 알코올, 아세톤을용매로사용하며이들은전자 (proton) 를해리하는능력이감소즉, 산성도가감소되어산부식능력이낮아표층법랑질적용과관련한최근연구를보면그효율성에대해많은논란이되고있다 16). 치면열구전색술은표층법랑질 (intact enamel) 에대한접착도가변연부누출과전색제의유지에관여한다고할수있다. 표층법랑질은하방의법랑질 (ground enamel) 에비해고도로광화되어있고불소의함량이더높다. 표층법랑질은치아의맹출이후로타액내의포화된 calcium phosphate에의해고도로광화되고, 불소이온에의해 hydroxyapatite 결정구조가 fluoroapatite로전환된다 17). 때문에자가산부식접착제는하방법랑질에비해표층법랑질에서레진이침투할미세공포를만들기어렵다 18). 그러나 Barkmeier는인산부식액에비해상대적으로높은 ph로인하여산부식능이부족할지라도, 삭제된법랑질표면에대해서는안정되고강한결합을형성할수있다고보고하였다 19). Ferrari 20) 등은 Class V와동에서자가산부식접착제사용시제조회사에서추천한시간보다 acidic primer의도포시간을두배로적용한경우더욱적절한변연부적합을보였고 acidic primer를두번도포한경우법랑질에대한접착강도가증가한다고보고하였으며, Strydom은치아구조를거칠게하거나 primer의도포시간을늘리거나여러번도포할것을추천하였다 21). Shinchi 등은인산의농도를 3, 5, 10, 20, 35, 65% 로달리하여법랑질산부식한뒤광중합레진을이용하여 tag의길이와인장결합강도를비교한결과 tag의길이는 35% 인산농도에서가장길었으나인장결합강도간에는유의차가없다고보고하였다 22). 이밖에도산부식된표면과결합강도간에는상관관계가없다는주장이제기되고있다 23,24,25). 그리고법랑질접착에대한중요한요소는탈회된법랑질표면으로의 bonding agent의침투와확산도에달려있다고한다 26). 자가산부식접착제의약한법랑질산부식능을감안하여열구성형술과 primer의도포시간을증가시키는등의임상술식을적용하여전색후 methylene blue 염색을통해미세누출도를비교하고법랑질표면의부식양상을주사전자현미경으로관찰하여자가산부식접착제의단점이보완되는지의여부를알아보고자하였다. Ⅱ. 실험재료및방법 1. 실험재료시진과탐침을시행하여교정목적으로발거된상악 1, 2소구치중형성부전이나치아우식증, 기계적손상이나균열등이관찰되지않은치아를대상으로하였다. 인산부식제는 35% 인산으로구성된 Ultra-Etch (Ultradent Products, Inc. USA) 를사용하였고자가산부식접착제는두단계로적용하는 Clearfil SE Bond (Kuraray Medical Inc., Okayama, Japan), 치면열구전색제는 Clinpro (3M-ESPE, USA) 를사용하였다. 광중합기는 L.E.Demetron I (KERR, Japan) 를사용하였다. 2. 실험방법 1) 미세누출도의평가모든치아는실험전불소가포함되지않은퍼미스를이용하여치관부에치면세마를시행하고 5% NaOCl에담아 Ultrasonic cleaner에 1시간동안세척하였으며증류수로재세척하여생리식염수에보관하였다. Wax를이용하여치근단을밀봉한소구치를 50개씩 4개의군으로나누고다음과같은방법으로전색하였다. 제 I군은 20초동안 35% 인산부식후세척하고건조시킨뒤전색하고 L.E.D로 20초간광중합하였으며제 II군은 Clearfil SE Bond 의제조회사의지시에따라 acidic primer를 20초간도포하고건조시킨뒤 bonding agent를도포후 10초간광중합하였다. 자가산부식접착제를적용한뒤전색제를교합면열구에바르고, 교합면에 20초간침투시킨뒤 20초간광중합하였다. 모든전색제는동일한임상적조건하에서도포되었다. 제 III군은자가산부식접착제의 acidic primer의적용시간을제조회사의추천시간보다 2배인 40초로적용하였다. 제 IV군은 ISO No. 132 composite finishing carbide bur를이용하여열구성형술 (Fissurotomy) 을시행한후제 II군과동일한방식으로자가산부식접착제를적용하였다 (Table 1). 217
전색된시편을 0.5% methylene blue 용액에서 24시간동안상온에침전시킨후칫솔을이용하여교합면부위과잉의염색액을제거하고절단하기전 4 수도물에보관하였다. 규격화된직사각형주형에소구치를고정시키고 epoxy resin에매몰시킨뒤 Isomet low speed diamond wheel saw(model 650, South Bay Technology) 를이용하여협설방향으로절단하여소와열구의수직단면을노출시키고주수하에서 100, 1200, 2400, 4000 grit의 silicon carbide paper로연마하였다 (Fig. 1). 연마과정중파절되어훼손된경우와 stereoscope 으로관찰이불가능한절편은표본에서제외하였다. 100배확대상을 Stereoscope(Olympus SZ61, Japan) 로관찰하였으며이를 image analyzing system(image Pro plus, Express, Mediacybermetics Co., U.S.A) 으로전송하여법랑질과치면열구전색제의계면으로침투한 methylene blue 용액의침투깊이를측정하였고다음의기준에따라기록하였다 15) (Table 2). 2) 열구내산부식양상의관찰소구치의장축에대해수직으로백악법랑경계직하방에서절단한뒤근원심열구를따라횡단으로파절시켰다 (Fig. 2). 열구내유기물의제거를위해세척과정을시행하고각군별로산부식후 (Table 1) 흐르는물로 15초간세척하고압축공기를사용하여건조하였다. 주사전자현미경 (S-4800, Japan) 을통하여각군별열구의벽 (wall) 과입구 (orifice) 를관찰하였다. 3. 통계분석각군간의미세누출에대한유의성검증은 Kruskal-Wallis test를시행하고사후검정은 Mann-Whitney test를유의수준은 p=0.05에대해 Bonferroni 수정을하여 0.0083에대해분석하였다. Table 1. Classification of experimental groups according to the method of treatment Group Method of treatment I Phosphoric acid etching(20 sec) II Self-etching primer(20sec) III Self-etching primer(40sec) IV Fissurotomy + Self-etching primer(20sec) Table 2. Scoring according to the degree of dye penetration Score Criteria 0 No dye penetration at the interface between enamel and fissure sealant 1 Dye penetration at the interface between enamel and fissure sealant up to 500μm depth 2 Dye penetration beyond 500μm of the enamel-fissure sealant interface Fig. 1. Sample preparation for observing the cross sectional view of fissure. Fig. 2. Sample preparation for observation of fissure surface. 218
대한소아치과학회지 35(2) 2008 Ⅲ. 실험성적 1) 미세누출도제 I군은전체표본 44개중염색액이침투하지않은절편이 8개, 침투깊이가 500μm이하인절편은 15개, 그이상인절편은 21개로나타났다. 제 II군에서 47개의절편중염색액이침투하지않은것은오직하나의절편에서만관찰할수있었다. 제 IV군은열구성형술을시행하고전색한군으로절편 46개중 19개가염색액의침투를보이지않았으며미세누출도가가장낮게나타났다 (Fig. 3, Table 3). 2) 산부식형태제 I군의열구벽은법랑소주의함몰이부분적으로관찰되고입구에서는 Silverstone 5) 에의해분류된제 1형산부식상이관찰되었다 (Fig. 4). 열구벽보다는입구부위에서산부식상이더명확하였다. II, III군에서는산부식상이관찰되지않았고군간에도차이가없었다 (Fig. 5). IV군은열구성형술에의해열구벽의표면거칠기가증가되었으나전형적인산부식양상은관찰되지않았다 (Fig. 6). Table 3. Results of dye penetration test: frequency distribution of micro-leakage scores and result of statistical analysis Group Microleakage scores 0 1 2 No. of specimen Mean rank Statistical difference* I 8 15 21 44 93.56 a II 1 23 23 47 102.86 a III 3 19 17 39 96.06 a IV 19 17 10 46 62.58 b Significantly different by Kruskal-Wallis test, * Mann-Whitney test, * The distinct letters, a and b, means statistically different. Fig. 3. Diagrams of distribution of microleakage per group. 219
a. wall b. orifice Fig. 4. Etched enamel of group I. Fig. 5. Etched enamel of group II, III. a. wall b. orifice Fig. 6. Etched enamel of group II, III. Ⅳ. 총괄및고찰치면열구전색술은교합면에서우식예방을위한효과적인치료법이다 11,12,27). 전색제의유지와변연부봉쇄성을증가시키는것은우식감소능과치면열구전색술의효율을극대화한다. 산부식과치면열구전색제의적용에앞서치아의교합면과열 구는산부식과전색과정을방해하는 plaque와 debris가없어야한다. 뿐만아니라소수성인 Bis-GMA 계통의치면열구전색제가열구표면에접착하기위해서는충분한방습이가장중요한요소라할수있다. 타액의존재는산부식처리된법랑질에견고하게달라붙어형성된미세공포 (microporosities) 를다시개방시키지못한다. 그만큼열구내침투도도떨어지게 220
대한소아치과학회지 35(2) 2008 된다. Buonocore와 Cueto는산부식처리된법랑질표면이타액성분을쉽게흡수해서표면에너지를감소시키고그결과접착에불리한표면을만들므로타액에의한접촉을막아야한다고하였다 16). 소와와열구형태또한전색제를위치시키고적용시키는데영향을줄수있다 28,29). 이에따른오차를줄이고자비교적깊이와형태가일정한소구치를사용하였다 30). 변연부에서의미세누출을방지하기위해서는전색제가소와열구의변연높이의충전이이뤄져야한다. 첫째, 치면열구전색제가중합되는동안수축 (1.5-4%) 이일어나기때문에치면열구전색제가많은면적을덮을수록변연부위의변형이더많이일어날것이다. 이러한수축이표면에서의부착에나쁜영향을주게될것이다. 특히, sealant가덮고있는표면에서 4-5mm당 60-200 μm의선상수축을일으킬것이다. 이러한변위가 sealant와법랑질사이의계면을분리시키는힘으로작용하고변연실패를일으키게되는것이다. sealant가변연에맞게충전된경우에는면적이작기때문에최소한의선상변위를유발할것이다. 끝으로와동형성없이산부식후법랑질에대한부착은치면에기계적인열구성형술을시행한것에비해상대적으로약하며, gap형성과전색제가과충전되는실패를야기할수있다고하였다 31). 자가산부식접착제를사용하는경우술식에덜민감하고편리하여사용이증가하는추세이다. 그러나여전히법랑질에서의접착강도는논의의대상이되고있다 32). 법랑질에서 30-40% 의인산부식을통해얻을수있는접착강도는약 20MPa이다. 본연구에서사용된 Clearfil SE Bond (Kuraray Medical Inc., Okayama, Japan) 의표층법랑질에대한미세인장강도는약 18.7±4.6 Mpa로나타났으며자가산부식접착제중강한접착강도와유지력있는산부식양상을만든다고보고된바있다33). acidic primer와 bonding 성분중법랑질의 calcium ion과 chelation 반응을일으키는 2개의 hydroxyl group을가지는접착력이좋은 MDP(=10- methacryloyloxydecyldihydrogen phosphate) 라는 functional monomer를가지는특징이있다. acidic primer 내의 MDP가법랑질표면을탈회시키는동안형성된미세공포내로침투하고 bonding 내의 MDP와광조사시공중합을일으킨다 32). 이에법랑질에서인산부식을시행한경우보다는미약하나전색제의접착에유리할것으로사료되어선정하였다. 대개어린아이들에게시행하는치면열구전색에서접착제를도포하는추가과정은전색과정을더시간이많이들고어렵게만든다. 전색제하방에접착제를사용하는것은시간의증가와유지력향상에대한불확실성때문에여전히이견들이있다. Feigal 등은전색제와접착제를함께사용하는경우치면에젖음성을가지는친수성 primer를도포하고접착제를바른뒤중합하면소수성전색제의침투를돕고이는수분이있는환경에서결합강도의증가와미세누출의감소를가져온다고보고하였다 34,35). 그러나 Autio-gold는재료들의점도와조성의다양성때문에접착제와연계하여더심도있는조사가필요하다고하 였다 34,36). 본연구에서미세누출도는열구성형술을시행하고자가산부식접착제를적용한제 IV이 II, III군보다더낮게나타났으며전자현미경을통한산부식양상의관찰에서는 I군이가장두드러지게나타났고 II, III군의주사전자현미경관찰을통해자가산부식접착제만으로는산부식능력이부족하다는점을알수있었다. 법랑질에서인산부식을통해자가산부식접착제를통한부식보다불규칙적이면서깊은미세공포를형성할수는있으나전색제의점성과흐름성으로인하여그깊이만큼 resin tag가형성되지는않는다. 자가산부식전색제는산부식을일으키는 acidic primer가부착에도관여하기때문에탈회된깊이만큼중합될접착제가침투할수있게젖음성을증가시켜혼성화 (hybridization) 의질을향상시킨다고한다 37). 표층법랑질에대해인산부식을통하여얻을수있는혼성층의깊이는 8-10 μm이며, acidic primer를통해얻을수있는깊이는보다얕지만 2-4μm로전반적으로균일하게형성된다. 그리고하방법랑질에대한산부식형태는두부식제모두미세형태학적으로큰차이가없이나타났다고한다 19). 최근까지법랑질에형성된미세공포내로의 resin tag 형성의정도가부식된법랑질결합의주요한요소로간주되어왔다. 그러나투과형전자현미경 (TEM) 을통한관찰에서자가산부식접착제를이용하여형성된 resin tag에서법랑미세결정 (crystallite) 내부로침투하거나미세결정사이공간을채우는 nano-retentive interlocking을관찰할수있었다 26). 이는비록많은보고에서결합강도가인산부식을통한접착보다다소낮지만주사전자현미경을통해관찰된불명확한산부식양상에도불구하고미세누출도가높지않음을설명할수있을것으로사료된다. 인장강도나전단강도는응력이집중되는것에대한저항정도를의미한다. 결합표면적이증가할수록강도는증가하는것이고미세누출을줄이기위해서는전반적인혼성층의형성이중요할것으로사료된다 38). Kanemura 등은아무런처치를하지않고자가산부식접착제를도포한경우는법랑질에서적절한유지력을얻기에불충분한부식상이관찰되었으나표면을기계적으로제거하고도포한경우는 32% 인산을이용한경우와유사한부식상이관찰되었음을보고한바있다 21,39). 치면열구전색술을시행하기전법랑질의기계적전처리방법으로는 air polishing, air abrasion, bur를이용한열구성형술등이있다. air polishing, air abrasion은고압의분사력에의해구강내에분사시입자의제거가어렵다. 그러나레진연마용 bur나 diamond point 또는열구확장용 fissurotomy bur 를이용한열구성형술은형태학적으로입구가좁고깊은소와열구를넓혀준다 40). 건전치질을파괴하는공격적인술식이라는비난을받지만조기우식증의진단과열구내유기물의제거를용이하게하며부식액과전색제의열구내침투도를증가시키 221
고인산으로도부식시키기어려운무소주법랑질 (prismless enamel) 의제거를가능하게하여접착에유리한표면적을증가시켜효과적인산부식을도모할수있다 41). 본실험에서자가산부식접착제의도포시간을 20초, 40초시행한경우의비교시시간의증가에따른미세누출도의유의차는나타나지않았다. 이는산성도가동일한 acidic primer를시간을증가시켜적용하였으나제조회사에서추천하는 20초이후로는 acidic primer가탈회시키고확산되는정도가더이상증가되지않는것으로사료된다. 게다가 acidic primer 내의 monomer를완전히제거하기위해서는에탄올 (ethanol) 에 5 분간담궈야제거가가능한데본실험에서는도포후증류수로수세를시행하여 20초적용한 II군과 40초적용한 III군간의차이를감소시키는요인으로작용하였을수있다. 치면열구전색제의연구가다른수복물질에비해활발히이뤄지지못하는이유중하나로절편형성의어려움을들수있다. 현재통상적으로사용되는연마기는회전식으로한방향으로만삭제되어절편의파절이빈번히일어나고연마된두께또한일정하지않다. 고가의다방향성절편연마기의보급이시급한실정이다. 이를종합해볼때법랑질과전색제간의혼성층형성을돕는것이미세누출의방지에도움이된다고할수있다. 뿐만아니라열구성형술을시행하여인산부식후에도탈회되기어려운표층의무소주법랑질층을제거할수있는열구성형술과같은전처리과정을간과할수없다. 향후미세누출이발생한부위의투과형전자현미경을이용한관찰이추가적으로필요할것으로사료된다. Ⅴ. 결론본연구는통상적인방법으로 35% 인산으로산부식후전색술을시행한경우와자가산부식접착제를사용하여도포한경우의미세누출도를염색액의침투도를비교하고주사전자현미경을이용한산부식상관찰을통하여다음과같은결론을얻었다. 1. 열구성형술을시행후자가산부식접착제를도포한군은인산부식 20초를시행한군과자가산부식접착제를 20초, 40초도포한군보다미세누출도가더낮았다. 2. 자가산부식접착제를제조회사의지시에따라 20초간도포한군과 40초로늘려도포한군간에미세누출도의유의차가없었다. 3. 주사전자현미경관찰시전형적인산부식양상은인산부식 20초군에서만관찰되었다. 이상의결과를종합하여볼때법랑질과전색된재료간의전반적으로균일하게형성된혼성층을만들어내고이를위하여열구성형술을시행하는것이치면열구전색술에서미세누출을줄이는데효과적인것으로사료된다. 참고문헌 1. Going RE, Haugh LD, Grainger DA, et al. : Four year clinical evaluation of a pit and fissure sealant. J Am Dent Assoc, 95:972-981, 1977. 2. Handelman SL, Buonocore MG, Heseck DJ : A preliminary report on the effect of fissure sealant on bacteria in dental caries. J Prosthet Dent, 27:390-392, 1972. 3. Handelman SL, Washburn F, Wopperer P : Two year report of sealant effect on bacteria in dental caries. J Am Dent Assoc, 93:967-970, 1976. 4. Ripa LW : The current status of pit and fissure sealant. A review. J Can Dent Assoc, 51:367-375, 1985. 5. Silverstone LM : Laboratory studies on the demineralization and remineralization of natural and artificial lesion in human dental enamel in vitro. Effect of calcium concentration if the calcifying fluid. Aust Dent J, 25:163-168, 1980. 6. Adair SM : The role of sealants in caries prevention programs. J Calif Dent Assoc, 31:221-227, 2003. 7. Bohannan HM, Disney JA, Graves RC, et al. : Indications for sealant use in a community-based preventive dentistry program. J Dent Educ, 48:45-55, 1984. 8. Feigal RJ : Sealant and preventive restorations: review of effectiveness and clinical changes for improvement. Pediatr Dent, 20(2):85-92, 1998. 9. Brown LJ, Selwitz RH : The impact of recent changes in the epidemiology of dental caries on guidelines for the use of dental sealants. J Public Health Dent, 55:274-291, 1995. 10. 이상호 : 치면열구전색의유지력. 대한소아치과학회지, 33:336-346, 2006. 11. Simonsen RJ : Retention and effectiveness of dental sealants after 15 years. J Am Dent Assoc, 122:34-42, 1991. 12. Primosch RE, Barr ES : Sealant use and placement techniques among pediatric dentists. J Am Dent Assoc, 132:1442-1451, 2001. 13. 이상호, 이창섭, 이난영 : 소아의치아수복. 조선대학교출판부, 광주, 2005. 14. 현홍근, 김정욱, 이상훈 : 법랑질표면처리방법에따른치면열구전색제의미세누출에관한비교연구, 대한소아치과학회지, 28:512-519, 2001. 15. Hannig M, Grafe A, Atalay S, et al. : Microleakage 222
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Abstract THE EVALUATION OF MICROLEAKAGE OF PIT AND FISSURE SEALANT BY USAGE OF SELF-ETCHING ADHESIVE SYSTEM Hyun-Jin Kim, Nan-Young Lee, Sang-Ho Lee Department of Pediatric Dentisty, College of Dentistry, Chosun University The purpose of this study was to evaluate the effectiveness of fissurotomy and double application time of acidic primer of self-etching adhesive system of acid treatment on enamel surfaces for prevention of microleakage of pit and fissure sealants. The microleakage of pit and fissure sealants was evaluated by measuring the penetration depth of methylene blue solution. Specimens were divided by 4 groups according to the method of treatment. Group I: 35% phosphoric acid etching, 20 seconds. Group II: Priming with self-etching primer, 20 seconds. Group III: Priming with self-etching primer, 40 seconds. Group IV: Priming with self-etching primer, 20 seconds, after fissurotomy. The etched pattern produced on enamel was observed using a scanning electron microscope. Obtained data were analysed statistically using Kruscal-Wallis test followed by Mann-Whitney test for comparison of groups. The results are as follows: 1. Microleakage scores of group IV priming with self-etching primer 20 seconds after fissurotomy was the lowest. 2. Microleakage scores between group II and group III were not shown significant difference. 3. Enamel for 20 seconds etching with 35% phosphoric acid was observed the most effective etching pattern. And the etching pattern on the fissure enamel with self-etching adhesive 20 seconds after fissurotomy was more prominent than group II, III only using self-etching primer. Key words : Pit and fissure, 35% phosphoric acid etching, Microleakage, Self-etching adhesive system 224