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IDA Excellose handbook - Purification of polyhistidine tagged proteins - Looking for more detail Purification protocol? - Chelating Excellose Spin Kit - IDA MiniExcellose - IDA Excellose www.takara.co.kr Tel : 02-2081-2510 Fax : 02-2081-2500

Introduction 자사에서개발한 chelating resin 인 IDA Excellose 는 Ni 2+ 이온을고정화시켜세포배양액으로부터 6 X His-tagged protein 을정제할수있는제품입니다. 본제품은 native 혹은 denaturing 조건모두에서단백질의정제가가능하기때문에단백질의 3 차구조상의문제로발생할수있는 Ni 2+ 이온과 histidine tag 간의 affinity( 결합 ) 문제를해결할수있습니다. 일반적으로 denaturing 조건은정제할단백질이재조합균주로부터불용성 (inclusion bodies) 으로생산되었을때이용됩니다. 본제품에사용되는 IDA Excellose 는 membrane protein 이나 inclusion body 의형태로생산되는단백질을충분히가용화할수있는강력한 denaturants 나 detergents 와함께사용할수있습니다. IDA Excellose 는정제목적및스케일에따라다양한형태로제공되고있습니다. 제품 Chelating Excellose Spin Kit IDA MiniExcellose IDA Excellose 사용목적 소량의배양액 (1 ml ~ 10 ml) 으로부터단백질을정제 단백질정제조건을최적화하기위해한번에많은실험을수행 배양액 (20 ml ~ 100 ml) 으로부터단백질을정제 발현율이낮은단백질의정제조건을최적화하기위해한번에많은실험을수행 대량단백질의정제 Binding capacity* 75 mg/ spin column (final vol. of resin = 250 ml) ~ 1 mg/ column 300 mg/ resin ml 제품용량 20 rxns 52 rxns Cat. No. AEx-Cl-SK20 AEx-Cl-SK50 3 ml AEx-Cl-M03 10 ml 50 ml 100 ml AEx-Cl-1 AEx-Cl-2 AEx-Cl-3 *Binding capacity 를위해사용된단백질은 6XHis tagged protein(28 kda) 이발현되도록형질전환된균주로부터얻은 cell lysates 상태입니다.

Flow Chart of Process using Chelating Excellose Spin Kit Cell lysate Native condition Denaturing condition IDA Excellose Binding Washing Centrifuge Elution Pure 6xHis-tagged protein

Protocols of Chelating Excellose Spin Kit 크로마토그래피중에서가장정제효율이높은흡착 (affinity) 크로마토그래피는근래에가장많이일반적으로사용되고있는정제방법입니다. 그러나높은순도의단백질을얻고자한다면한가지방법혹은일률적인방법으로는불가능합니다. 대부분의경우, 최적의정제법을확립하기위해서는다소의시행착오를염두에두고행해져야합니다. 본메뉴얼에제공되는방법은가장일반적인정제조건입니다. 따라서정제하고자하는단백질을고순도로얻기위해서는정제조건의변화나다른정제시스템이도입되어지는것이바람직합니다. Kit contents Product Quantity Cat. No. Component Composition (1X 기준 ) 5 X Equilibration buffer 50 mm Tris-HCl (ph 8.0), 0.5 M NaCl, 10 mm imidazole Chelating Excellose Spin Kit (20) 20 rxn AEx-Cl- SK20 5 X Washing buffer 1 X Elution buffer 50 mm Tris-HCl (ph 8.0), 0.5 M NaCl, 20 mm imidazole 50 mm Tris-HCl (ph 8.0), 0.5 M NaCl, 250 mm imidazole Spin column 20 Collection tube 20 5 X Equilibration buffer 50 mm Tris-HCl (ph 8.0), 0.5 M NaCl, 10 mm imidazole Chelating Excellose Spin Kit (50) 52 rxn AEx-Cl- SK50 5 X Washing buffer 1 X Elution buffer 50 mm Tris-HCl (ph 8.0), 0.5 M NaCl, 20 mm imidazole 50 mm Tris-HCl (ph 8.0), 0.5 M NaCl, 250 mm imidazole Spin column 52 Collection tube 52

Preparation of the cell lysate 세포파쇄에앞서 SDS-PAGE 를통해정제하고자하는단백질의성질 ( 불용성단백질, 가용성단백질 ) 및단백질의발현율을확인합니다. 단백질의발현율이높은 (> 10 mg / liter) 가용성단백질인경우에는원래배양액의 5X 로농축되어져야합니다. 다시말해서정제하고자하는단백질이발현율높은가용성단백질이라면 10 ml의배양액은 2 ml의 buffer* 를첨가하여 sonication 한후에원심분리를통해상등액을회수하면됩니다. 만일발현율은높으나불용성단백질로발현된다면 sonication한후에얻어지는 pellet을강력한 denaturant( 8 M urea 혹은 6 M guanidine hydrochloride) 를포함하는 buffer 2 ml을첨가하여단백질을회수합니다. 단백질의발현율이낮은경우 ( 2 ~ 5 mg/liter), 원래배양액의 20X 로더높은농축이필요합니다. 메뉴얼에제공되는정제조건을이용할경우 buffer 는 equilibration buffer 를사용하시면됩니다. 만일정제하고자하는단백질용액과본메뉴얼에사용되는 equilibration buffer 가다르다면 1) 정제하고자하는단백질용액을 equilibration buffer 로바꾸거나혹은 2) Equilibration buffer 를단백질용액과같은 buffer system 으로바꿔서사용하시면됩니다. ex) 단백질용액 50 mm sodium acetate, 0.3 M NaCl, ph 6.0 일경우 -1) 처음부터 cell 을다시키워서 buffer system 을맞출수도있고 dialysis 를이용하여 buffer 교환할수있습니다. 2) Equilibration buffer : 50 mm sodium acetate, 0.3 M NaCl, 10 mm imidazole, ph 6.0 Washing buffer : 50 mm sodium acetate, 0.3 M NaCl, 20 mm imidazole, ph 6.0 Elution buffer : 50 mm sodium acetate, 0.3 M NaCl, 250 mm imidazole, ph 6.0

Native condition Denaturing condition (6,000 rpm, 15 min) Washing (50 mm Tris - HCl, 1 mm EDTA, ph 8.0) (6,000 rpm, 15 min) Washing (50 mm Tris - HCl, 1 mm EDTA, ph 8.0) (6,000 rpm, 15 min) (6,000 rpm, 15 min) (12,000 rpm, 20 min) Pellet (12,000 rpm, 20 min) Pellet denaturation Filtering (0.22 Filtering (0.22

Purification under native conditions Instrument and lab supplies Table top centrifuge, 1.5 ml microtubes, microtube rack Buffers Equilibration Buffer : 50 mm Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 10 mm imidazole, ph 8.0 Washing Buffer : 50 mm Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 20 mm imidazole, ph 8.0 Elution Buffer : 50 mm Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 250 mm imidazole, ph 8.0 1. Collection tube 에 spin column 을끼운후마이크로튜브랙에놓습니다. 2. IDA Excellose 를잘흔들어섞은후 0.5 ml 씩컬럼에분주합니다 (final resin vol. 0.25 ml). - 정확한양을분주하고싶으시다면 microtube 에 pipet 을이용하여 0.25 ml 의 D.W. 를첨가하여유성펜으로표시하고표시된만큼 IDA Excellose 를첨가하여 volume 을맞추어사용하시면됩니다. 3. 700 X g ( 약 2,000 rpm) 에서 2 분간원심분리한후 collection tube 안의 eluate 를 버립니다. 4. Equilibration buffer 를 0.5 ml 가한후 pipeting 을통하여잘섞어줍니다. 2 분간원심분리한후 collection tube 안의 eluate 를버립니다. 5. Spin column 에단백질용액을 0.5 ml 가하고 pipeting 을통하여잘섞어준후 2 분간상온에방치한후에 2 분간원심분리합니다. - 발현율이낮은단백질용액의경우 5 번과정을한번더반복하면정제 yield 를 높일수있습니다. - 10 mm imidazole 의첨가는니켈이온에다른 contaminant protein 이결합하는 것을막기위해서첨가된것입니다. 만일 SDS-PAGE 분석결과, 이조건에서 histidine tagged protein 의결합력이약하거나혹은결합이일어나지않는다면 imidazole 의농도를 1 5 mm 로낮춰서사용해야합니다. - 원심분리속도는매우중요합니다. 원심분리속도가너무높다면단백질용액과 resin 이접촉하는시간이짧아져서 binding capacity 가낮아질수있습니다. - 원심분리시간은단백질용액의농축된상태나점도에따라더많은시간이 소요될수도있습니다.

6. 컬럼을통과한 flow-through fraction을 microtube에옮겨둡니다. 7. Washing buffer를 0.5 ml 가하고 pipeting을통하여잘섞어준후 2분간원심분리합니다 ( 필요시 2회더반복 ). - 발현율이높은단백질인경우 washing은 2회정도면충분합니다. 그러나발현율이낮은단백질의경우높은순도의단백질을얻기위해서 3회의 washing이필요합니다. 8. 컬럼을통과한 wash fraction을모아둡니다. 9. Elution buffer를 0.3 ml 가하고 pipeting을통하여잘섞어준후에원심분리합니다. - 효율적인 elution을위하여최소한첨가된 resin과동량의 buffer를첨가하여 pipeting으로충분히섞어준후원심분리합니다. 10. 컬럼을통과한 eluate를모아보관합니다. 11. SDS-PAGE를이용하여 purification yield를분석합니다. - 단백질용액과 flow-through fraction, wash fraction, elution fraction순으로 SDS-PAGE 걸어정제효율을분석합니다. 상기에언급된방법은일반적인방법으로서사용자의단백질결합특성에따라정제방법이달라질수도있습니다.

Purification under denaturing condition Instrument and lab supplies Table top centrifuge, 1.5 ml microtubes, microtube rack Buffers I - imidazole elution Equilibration Buffer : 50 mm Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 10 mm imidazole, 8 M urea, ph 8.0 Washing Buffer : 50 mm Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 20 mm imidazole, 8 M urea, ph 8.0 Elution Buffer : 50 mm Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 250 mm imidazole, 8 M urea, ph 8.0 Buffers II ph elution Equilibration Buffer : 6 M GuHCl, 0.1 M NaH 2 PO 4, 0.01 M Tris-HCl, ph 8.0 or 8 M urea, 0.1 M NaH 2 PO 4, 0.01 M Tris-HCl, ph 8.0 Washing Buffer : 8 M urea, 0.1 M NaH 2 PO 4, 0.01 M Tris-HCl, ph 6.3 Elution Buffer : 8 M urea, 0.1 M NaH 2 PO 4, 0.01 M Tris-HCl, ph 5.9 or 8 M urea, 0.1 M NaH 2 PO 4, 0.01 M Tris-HCl, ph 4.5 Urea는 ph에영향을주기때문에 buffer를만든후맨마지막에 ph를보정합니다. 1. Collection tube에 spin column을끼운후마이크로튜브랙에놓습니다. 2. IDA Excellose 를잘흔들어섞은후 0.5 ml 씩컬럼에분주합니다 (final resin vol. 0.25 ml). - 정확한양을분주하고싶으시다면 microtube에 pipet을이용하여 0.25 ml의 D.W. 를첨가하여유성펜으로표시하고표시된만큼 IDA Excellose 를첨가하여 volume을맞추어사용하시면됩니다. 3. 700 X g ( 약 2,000 rpm) 에서 2분간원심분리한후 collection tube안의 eluate를버립니다. 4. Equilibration buffer를 0.5 ml 가한후 pipeting을통하여잘섞어줍니다. 2분간원심분리한후 collection tube안의 eluate를버립니다. 5. Spin column에단백질용액을 0.5 ml 가하고 pipeting을통하여잘섞어준후 2분간상온에방치한후에 2분간원심분리합니다. - 발현율이낮은단백질용액의경우 5번과정을한번더반복하면정제 yield를높일수있습니다.

- 10 mm imidazole의첨가는니켈이온에다른 contaminant protein이결합하는것을막기위해서첨가된것입니다. 만일이조건에서 histidine tagged protein의결합력이약하거나혹은결합이일어나지않는다면 imidazole의농도를 1 5 mm로낮춰서사용해야합니다. - 원심분리속도는매우중요합니다. 원심분리속도가너무높다면단백질용액과 resin이접촉하는시간이짧아져서 binding capacity가낮아질수있습니다. - 원심분리시간은단백질용액의농축된상태나점도에따라더많은시간이소요될수도있습니다. 6. 컬럼을통과한 flow-through fraction을 microtube에옮겨둡니다. 7. Washing Buffer를 0.5 ml 가하고 pipeting을통하여잘섞어준후 2분간원심분리합니다 ( 필요시 2회더반복 ). - 발현율이높은단백질인경우 washing은 2회정도면충분합니다. 그러나발현율이낮은단백질의경우높은순도의단백질을얻기위해서 3회의 washing이필요합니다. 8. 컬럼을통과한 wash fraction을모아둡니다. 9. Elution buffer를 0.3 ml 가하고 pipeting을통하여잘섞어 2분간상온에방치한후에원심분리합니다. - 효율적인 elution을위하여최소한첨가된 resin과동량의 buffer를첨가하여 pipeting으로충분히섞어준후원심분리합니다. 10. 컬럼을통과한 eluate를모아보관합니다. 11. SDS-PAGE를이용하여 purification yield를분석합니다. - 단백질용액과 flow-through fraction, wash fraction, elution fraction순으로 SDS-PAGE 걸어정제효율을분석합니다. 상기에언급된방법은일반적인방법으로서사용자의단백질결합특성에따라정제방법이달라질수도있습니다.

Protocols of IDA MiniExcellose Before starting 메뉴얼에제공되는 IDA MiniExcellose 방법은원심분리기대신중력을이용한다는부분만다를뿐앞서설명한 Chelating Excellose Spin Kit 사용방법과유사합니다. 본메뉴얼에제공되는방법은가장일반적인정제조건입니다. 따라서사용자의단백질결합특성에따라정제조건이달라질수도있습니다. Composition of IDA MiniExcellose Column cap Excellose resin End cap Frits Test tube Buffers Equilibration Buffer : 50 mm Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 10 mm imidazole, ph 8.0 Washing Buffer : 50 mm Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 20 mm imidazole, ph 8.0 Elution Buffer : 50 mm Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 250 mm imidazole, ph 8.0 1. Column cap과보존액을제거합니다. 2. End cap을제거하고컬럼을 test tube와연결하여랙에고정합니다. - 제품에첨가된 test tube들은컬럼과연결시압력이걸리는것을막기위하여 tube 위쪽에작은구멍이뚫어져있습니다. 3. Equilibration buffer 6 ml을컬럼에분주합니다. 4. 중력에의하여모아진 equilibration buffer를버립니다. 5. 3, 4 단계를한번더반복합니다. 6. 컬럼에단백질샘플을가하고컬럼을통과한 flow-through fraction을 tube에모아둡니다. - 발현율이낮은단백질용액의경우 6번과정을한번더반복하면정제 yield를높일수있습니다.

7. 컬럼을새 tube와연결한후, washing buffer 6 ml 를가합니다. 8. 컬럼을통과한 wash fraction을 tube에모아둡니다. - 발현율이높은단백질인경우 washing은 2회정도면충분합니다. 그러나발현율이낮은단백질의경우높은순도의단백질을얻기위해서 3회의 washing이필요합니다. 9. Elution buffer를 3 ml 가하고컬럼을통과한 eluate를모아보관합니다. - 효율적인 elution을위하여최소한첨가된 resin과동량이상의 buffer를첨가하여 elution 합니다. - 본제품에공급되는 tube의상단부에는작은구멍이뚫어져있는관계로 eluate를보관할때는새로운 tube로옮겨서보관해주시기바랍니다. 10. SDS-PAGE를이용하여 purification yield를분석합니다. - 단백질용액과 flow-through fraction, wash fraction, elution fraction순으로 SDS-PAGE 걸어정제효율을분석합니다. 상기에언급된방법은일반적인방법으로서사용자의단백질결합특성에따라정제방법이달라질수도있습니다.

Protocols of IDA Excellose Batch protocol Instrument and lab supplies Column, LC system Buffers Equilibration Buffer : 50 mm Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 10 mm imidazole, ph 8.0 Washing Buffer : 50 mm Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 20 mm imidazole, ph 8.0 Elution Buffer : 50 mm Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 250 mm imidazole, ph 8.0 1. Resin 을필요한양만큼분주합니다. - Resin 의양은메스실린더나눈금이있는 tube 를이용해측정합니다. 2. Resin 안에있는기포를충분히제거합니다 (degasing). 3. IDA Excellose 를기포가들어가지않도록컬럼안쪽에유리막대를대고천천히 유리막대를따라흐르도록합니다. 4. Resin 이충분히가라앉으면 LC system 과연결합니다. 5. 충진한 resin 에 resin volume 의 3 ~ 5 배정도의 D.W. 를흘려줍니다. 6. Equilibration buffer 를 resin volume 의 5 배정도를흘려 resin 을충분히평형화 시킵니다. 7. Column 에단백질용액을가하여 resin 과단백질용액이결합되도록합니다. - Packing 한 resin volume 의 binding capacity 를고려하여적절한단백질용액을 loading 합니다. - 10 mm imidazole 의첨가는니켈이온에다른 contaminant protein 이결합하는 것을막기위해서첨가된것입니다. 만일 SDS-PAGE 분석결과, 이조건에서 histidine tagged protein 의결합력이약하거나혹은결합이일어나지않는다면 imidazole 의농도를 1 5 mm 로낮춰서사용해야합니다. 8. Washing buffer 를 resin volume 의 5 배정도로흘려결합하지않은단백질과 contaminant protein 을제거합니다. - Washing buffer 에첨가된 20 mm imidazole 은니켈이온에약하게결합된다른 contaminant protein 을제거해서최종단백질의 purity 를높이기위해사용된 것입니다. 만일 SDS-PAGE 분석결과, 이조건을거쳐 elution 된 histidine tagged protein 의순도가높지않으면 imidazole 의농도를 50 mm 로높여서사용하면 보다정제된 histidine tagged protein 을회수할수있습니다.

9. Elution Buffer를 resin volume의 5배정도로흘려줍니다. 10. 컬럼을통과한 eluate를모아보관합니다. 11. SDS-PAGE를이용하여 purification yield를분석합니다. - 단백질용액과 flow-through fraction, wash fraction, elution fraction순으로 SDS-PAGE 걸어정제효율을분석합니다. 상기에언급된방법은일반적인방법으로서사용자의단백질결합특성에따라정제방법이달라질수도있습니다. Regeneration & storage 1. 충진한 resin에 resin volume의 5 배정도의 D.W. 를흘려줍니다. 2. Column에다시 resin volume의 5배내지 10배정도의 50 mm EDTA, 0.5 M NaCl 용액을흘려 resin에붙어있는니켈이온을제거합니다. 3. EDTA 용액을제거하기위하여다시 resin volume의 5 배정도의 D.W. 를흘려줍니다. 4. 50 mm 니켈용액을 resin volume의 5 배정도로흘려 resin을다시 recharging 시킵니다. 5. Resin volume의 5 배정도의 D.W. 를흘려 resin에결합하지않은니켈이온을제거합니다. 6. 곧바로사용하기위해서는 equilibration buffer를흘려 resin을충분히평형화시킨후정제실험을진행합니다. 만일장기간보관할시에는 20% ethanol 용액을흘려미생물로부터 resin을보호합니다.

Troubleshooting Guide 단백질이 IDA Excellose 와결합하지않는경우 1) 6XHis tag 의존재유무확인 Sequencing 을통해 sequence 확인및 reading frame 체크한다. 2) 6XHis tag 이단백질구조상안으로숨은경우 3) 결합조건이적합하지않은경우 Denaturing condition 으로정제과정을수행한다. Tagging 위치를변화시키다 (N- 말단혹은 C- 말단등 ). 모든용액과 buffer 의 ph 가같은지확인 (resin 을평형화시킨 buffer 와단백질용액의 ph 가다른경우결합이일어나지않으며 aggregation 이발생할수도있음 ) 한다. 특히 urea 가첨가된겨우 urea 는 ph 에영향을주므로실험전에 ph 를측정한다. 단백질이 washing 과정중에용출되는경우 1) Washing buffer 의문제적합한 ph 인지확인한다. Imidazole 의농도를낮추거나 ph 를올린다. 2) 6XHis tag 이단백질구조상안으로약간숨은경우 Washing buffer 를변화 (imidazole 혹은 ph) 시켜정제를수행한다. Denaturing condition 으로정제과정을수행한다. 정제과정중단백질이침전되는경우 1) 온도문제정제과정중온도가너무낮은경우에발생할수있으며상온에서다시실험을수행한다. 2) 단백질자체문제단백질이상당히 hydrophobic 한성질을가지고있다면 단백질이 elution 과정중에용출되지않는경우 0.1% Triton X-100, 혹은 0.1% Tween 20, 10 ~ 20 mm b- mercaptoethanol 등을첨가해주는것이좋으며실험에사용되는모든 buffer 에도첨가해주어야한다. 1) Elution 조건확인 Imidazole 의농도를높이거나 ph 를낮춘다. 단백질이 elution 과정중에다른많은 contaminant protein 과함께용출된경우 1) Washing buffer 문제 Imidazole 의농도를 50 mm 까지높여서실험을수행한다. 2) 단백질들간의 interaction 문제 ~ 20 mm b-mercaptoethanol 을첨가하여 S-S 결합을약화시킨다. Salts 혹은 detergents 의농도를높여준다. Washing buffer 에 ethanol 이나 glycerol 을첨가해서 washing 을수행한다.