구강내점막과유리피판에사용되는피부의 rete ridge에관한 2차원및 3차원적구조연구 안강민 정헌종 1 김윤태 팽준영 신영민 성미애 박희정 명 훈 황순정 최진영 정필훈 김명진 이종호 서울대학교치과대학구강악안면외과학교실, 1 건국대학교의과대학소아과 Abstract (J. Kor. Oral Maxillofac. Surg. 2005;31:143-149) 2D AND 3D STRUCTURAL STUDY OF RETE RIDGE IN ORAL MUCOSA AND SKIN PADDLE OF VARIOUS FREE FLAPS Kang-Min Ahn, Hun-Jong Chung 1, Yoon-Tae Kim, Jun-Young Paeng, Young-Min Shin, Mi-Ae Sung, Hee-Jung Park, Hoon Myoung, Soon-Jung Hwang, Jin-Young Choi, Pill-Hoon Choung, Myung-Jin Kim, Jong-Ho Lee Department of Oral and Maxillofacial Surgery, College of Dentistry, Seoul National University 1 Department of Pediatrics, Chung-Ju Medical Hospital, Kon-Kuk University Objects : With the advancement of tissue engineering techniques, the effort to develop bioartificial mucosa have been actively delivered. The problem we met with this technique is the lack of mechanical strength between kerationocyte layer and dermal layer, where in the normal skin and mucosa, they are tightly bound with rete ridge structure. The purpose of this study is to understand the 2D and 3D structure of rete ridge of mucosa and skin paddle for rendering more biomimetic structure to the artificial mucosa. Materials and Methods : Oral mucosa and skin from the patients who received the oral surgery and maxillofacial reconstruction were harvested. The epidermis was separated from the dermis after treating with dispase for 12-16 hours. H & E staining was performed for 2D(dimensional) structure study and confocal LASER and SEM study were performed for 3D structure. Mean height(sc) and arithmetic mean deviation(sa) of all surface height were calculated. Results : The average height of rete ridge of skin flap was between 67.14 μm and 194.55 μm. That of oral mucosa was between 146.26 μm and 167.51 μm. Pressure bearing area and attached gingiva of oral mucosa showed deeper rete ridges. Conclusion : To obtain the adequate strength of artificially cultured keratinocyte skin and mucosa flap, it is necessary to imitate the original skin and mucosa structure, especially rete ridge. Through this study, 2D and 3D rete ridge structure of normal mucosa and skin was obtained. These results can be used as basis for substrate morphology for keratinocytes culture. Key words : Rete ridge, Oral mucosa, Free flap, Keratinocyte culture, 3D structure Ⅰ. 서론 조직공학기술이발달하면서인공피부와점막을배양하여피부결손부나점막또는각막의재건을시도하는연구가활발하게이루어지고있다 1). 조직공학의재료로서는배양된세 이종호 110-768 서울특별시종로구연건동 28 서울대학교치과대학구강악안면외과학교실 Jong-Ho Lee Dept. of OMFS, College of Dentistry, Seoul National University # 28 Yeongun-dong, Jongno-gu, Seoul, 110-768, South Korea Tel : 82-2- 2631-3813 E-mail : leejongh@plaza.snu.ac.kr 포나생체재료 (biomaterial) 들을각각혹은복합적으로사용하고있으며피부와점막의재건에는자가상피의배양과함께진피층의재현에도많은노력을기울이고있다. 이러한피부와점막의상피와진피의경계에는 rete ridge 가발달하여있으며압력을많이받는경우와비교적단단한조직일수록골 (ridge) 의높이가깊게관찰된다 2). 이러한 rete ridges 는피부나점막의기계적인지지역할을할뿐만아니라상피각화세포의성장과분화에도영향을미치는것으로생각되고있다. 상피와진피사이에는기저막이양측을분리하여진피층의섬유모세포 (fibroblast) 가표피로가는것을막는동시에염증세포와신경의침투는가능하게하는선택적인차단막의역할을한다. 이러한막은평면구조로되어있지않고많은골과함입 (invagination) 을가지고있다. Rete ridge 에대한 3 차원적인연구는동 본연구는보건복지부보건의료기술진흥사업의지원에의하여이루어진것임 ( 과제고유번호 : 03-PJ1-PG3-20500-0025). 143
대구외지 2005;31:143-149 물조직으로한정되어왔으며 McMillan 등 3) 은 hamster 의 buccal pouch 조직을 EDTA 로분리후주사전자현미경으로관찰하여정상조직에서 rete ridges 가관찰됨을밝혔다. Moore 등 4) 은역시 hamster 의 buccal pouch 조직을 EDTA 로분리하여 rete ridge 의형태가태생 4 주까지는단순형이 90% 이상이며 18 개월이지나면복잡형이주를이룬다고하였다. 하지만현재까지인체조직에관한 3 차원적인 rete ridges 연구는전무한상태이다. 조직공학적인점막의재건의목표는인체와가장유사한점막을재건하는것으로이는상피뿐만아니라진피층을재현하여야하고 3 차원적인구조역시생체와유사한구조를가져야한다. 본연구에서는구강내점막과구강내재건에주로사용되는피판의조직을이용하여조직슬라이드를만들어서 2 차적인구조를관찰하였으며표피와상피를분리하는효소처리를통하여 rete ridge 의모양과높낮이그리고 3 차원적인구조의평균깊이수치를구하여추후인공점막이나피부의제작시기초자료로활용하고자하였다. Ⅱ. 재료및방법 1. 조직의채취및 H&E 염색 조직은 2 군으로나누었으며첫째군은구강내조직으로구강암이나기타다른구강내병소제거술을시행한환자에서적출된부위에서정상조직을일부채취하여조사하였다. 상악과하악의부착치은 (attached gingival), 전정점막그리고협점막을조사하였으며, 다른군은구강내재건에주로사용되어지는피부피판에서여분의조직을이용하였으며전완피판, 족배피판, 비골피판, 광배피판, 대흉근피판을이용하였다. 채취한조직은 6 시간이내에 DMEM 용액에담아서이동하였으며, 2 차원적인구조를관찰하기위하여조직일부를 10% 포르말린용액에고정한후 H&E 염색을시행하였다. 나머지조직은에탄올에넣고소독하였으며 PBS 를이용하여 3 회세척을하였다. 진피하방의지방과근육조직을제거한뒤상피층의분리를위하여표피를밑으로진피를위쪽으로하여 Dispase solution (Dispase II-neutral protease, grade II, Boehringer Mannheim, Germany) 을 1 mg (dispase)/ ml (PBS) 농도로사용하였고 4 에서 14 16 시간처리한후마이크로핀셋을이용하여진피와표피를분리하였다. 이때조직이잘분리되지않으면추가로 dispase 용액에 incubation 하였으며총처리시간은 20 시간을넘지않도록하였다. 2. 3 차원구조연구 (1) 공초점레이저주사 (Confocal LASER) 상피조직을분리한후 rete ridge 가있는부분이위를향하게하여코르크판에고정하였으며공초점레이저 (LMS 5 PASCAL, Karl Zeiss, Germany) 를이용하여 3 차원적인구조를화면으로재구성하였다. 조직은광학현미경 100 배배율에서관찰하여 rete ridge 가대표적으로나타나는부위를선택한후 1 mm2의면적을스캔하여 3 차원적재구성을하였으며이때표면거칠기를측정후평균적인높낮이를구하여 rete ridge 의평균깊이및거칠기를구하였다. Sc 는모든 rete ridges 높이의평균을나타내고, Sa 는모든높이의산술평균편차 (arithmetic deviation) 을나타낸다. (2) 주사현미경 (SEM) 공초점레이저검사가끝나고나면주사현미경관찰을위하여조직을 2.5% glutaraldehyde 용액에전고정한후 phosphate buffer 로수세하였으며 1% osmium tetroxide 로후고정을시행하였다. Graded ethanol 로탈수하였으며, ion-sputtering coater(e5400, BIO- RAD) 로 gold-palladium 을코팅한후주사현미경 (JEOL 840A, Japan) 으로관찰하였다. 주사현미경관찰시배율은 70 배, 150 배, 200 배, 400 배를사용하였으며, 저배율에서 rete ridge 가특징적으로나타나는부위를임의로선택하여 3 군데촬영하였다. 1. 유리피판 Ⅲ. 결과 (1) 전완피판 H&E 염색 ( 100) 에서는편평한형태의기저막을보였으며, rete ridge 는비교적덜발달하였다 (Fig. 1). 200 배로관찰한 SEM 사진에서는분화구모양의함몰이관찰되었으며분화구모양 Fig. 1. H&E, SEM photograph and Confocal LASER scan of Radial forearm skin 144
사이는편평한구조가보였다. 이분화구모양의 rete ridge 의 Sc 는약 194.55 μm이며 Sa 는 11.12 μm였다. (2) 족배피판족배피판의피부는 H&E 상에서경도의불규칙한 rete ridge 가관찰되었으며, 전완피판에비하여서는기계적인자극이높은부위이기때문인것으로사료되었다 (Fig. 2). 역시분화구모양의 rete ridge 가관찰되었으며, 저배율 SEM( 40) 에서약 1mm 간격의긴 ridge 가보였다 (Fig. 3). 이 ridge 는격자모양을 하고있었으며비교적일정한간격을유지하고있었다. Rete ridge 의숫자도전완피판보다많이보였으며 Sc 는 126.01 μm을 Sa 는 15.32 μm를나타내었다. (3) 비골피판비골피판은비교적 weight bearing 이없는부위로 rete ridge 가덜발달한것을관찰할수있었으며, 분화구모양의함몰도드물게관찰되었다 (Fig. 4). Sc 는 67.14 μm이며 Sa 는 7.72 μm로얕은것을알수있었다. Fig. 2. H&E, SEM photograph and Confocal LASER scan of dorsalis pedis flap skin Fig. 3. SEM( 70) of dorsalis pedis flap skin Fig. 4. H&E, SEM photograph and Confocal LASER scan of fibular flap skin 145
대구외지 2005;31:143-149 (4) 광배피판광배피판의피부는몸통의넓은부위를차지하고있으며지방이많은경우피부가겹쳐지는부위가많다. H&E 염색에서비교적불규칙하고굴곡이많은것으로관찰되었으며분화구모양의함몰도많이관찰되었고크기는다양하다. Sc 는 102.28 μm였으며 Sa 는 12.82 μm였다. (5) 대흉근피판대흉근피판은광배근피판에비하여 rete ridge 의발달이적었 으며, 비교적평탄한면을관찰할수있었다. Sc 는 75.32 μm, Sa 는 12.82 μm를보였다. 2. 구강점막 (1) 상악각화치은상악의부착치은은비교적 rete ridge 가발달하여있었으며, 이부분역시음식의마찰이다른부위보다많은곳이라기계적인자극이많은부위에강도를높이기위하여발달한것으 Fig. 5. H&E, SEM photograph and Confocal LASER scan of latissimus dorsi muscle flap skin Fig. 6. H&E, SEM photograph and Confocal LASER scan of skin paddle of pectoralis major muscle flap. Fig. 7. H&E, SEM photograph and Confocal LASER scan of maxillary attached gingival. 146
로사료되었다. Rete ridge 의깊이는비교적편차가컸으며 Sc 는 146.26 μm를 Sa 는 22.62 μm를보였다. (2) 하악각화치은하악각화치은역시 rete ridge 가발달하여있으며 Sc 는 157.53 μm을보이고 Sa 는 22.78 μm을보였다. (3) 협점막협점막은비교적 rete ridge 가발달하여있으며 300-400 μm간격 으로큰 ridge 가발달하여있었으며 Sc 는 167.51 μm을보이고 Sa 는 20.76 μm였다. (4) 전정점막 (Vestibular mucosa) 상악구순과전정의경계부에서채취한조직으로서 rete ridge 가발달하여있으며, 깊이도구강내다른부위와비교하여깊은것을알수있었다. Sc 는 205.55 μm였으며 Sa 는 33.20 μm로서가장깊은수치를보였다. Fig. 8. H&E, SEM photograph and Confocal LASER scan of mandiblular attached gingiva. Fig. 9. H&E, SEM photograph and Confocal LASER scan of buccal mucosa Fig. 10. H&E, SEM photograph and Confocal LASER scan of vestibular mucosa. 147
대구외지 2005;31:143-149 Table 1. Sc and Sa Value of oral mucosa and flap skin FA DPA Fib LD PM MxA MnA BM Vesti Sc( μm ) 194.55 126.01 67.14 102.28 75.32 146.26 157.53 167.51 205.55 Sa( μm ) 11.12 15.32 7.72 12.82 12.82 22.62 22.78 20.76 33.20 (FA : forearm skin, DPA : dorsalis pedis skin, Fib : lower leg skin of fibular skin, LD : latissimus dorsi skin, PM : pectoralis major skin, MxA : maxillary attached gingiva, MnA : mandibular attached gingiva, BM : buccal mucosa, Vesti : vestibular mucosa) Ⅳ. 고찰 상피층과진피층은기저막 (basal lamina) 로분리되어있으며정상적인조직에서기저막의두께는피부에서는 50-90 nm, 신장의사구체 (glomerulus) 에서는 240-340 nm를정도이다. 기저막으로분리된상피는전체적으로편평한형태가아닌다양한깊이의물결모양굴곡 (rete ridge) 을보이고조직이감당하는압력이나마찰이심한정도에따라그깊이의차이를관찰할수있다 5). 최근이러한 rete ridge 를재생하여상피를배양하려는시도가있었으나막연하게그골의높이를정하여배양하였다 6). 인체조직특히점막에관한기저막과 rete ridge 에관한연구는 SEM 을통한연구가있었으나그수준이미미하였고기저막과 rete ridge 의기능에관한연구는전무하였다. 기저막은다음의다양한역할을하는것으로추정되고있으며첫째, 기저막은진피층의섬유모세포가상피층으로가거나상피층의각화세포가진피로이동하는것을방지하며면역세포나항원전달세포 (antigen-presenting cell) 그리고영양분의이동은허용하는선택투과성막 (semipermeable membrane) 의기능을한다. 상피층은혈관이없기때문에영양분의공급은기저막을통하여공급이되며대사물질의교환이일어난다. 둘째, 기저막은창상의치유시각화세포의이동과분화를조절하는유도체의역할을한다 7). 그러므로조직공학적으로상피를배양할때는인체조직과유사한형태의 rete ridge 및기저막을만드는것이중요하다. 최근연구에서각화세포의배양시 rete ridge 부위에서는각화세포가더욱층화 (stratification) 가잘되는것을관찰할수있으며, 이는세포사이의접촉과세포와기질간의상호작용에의한것으로생각되었다. Rete ridge 의가장깊은부위에는각화세포의성장이활발하게일어나고있는부분으로사람의손바닥상피에서성장하고있는기저세포의 80% 이상이 rete ridge 의깊은부위에위치하는것을관찰이되었다 8). 최근조직공학의발달은다양한인간의조직이나장기의대체물을인공적으로만드는데공헌해왔으며 Rheinwald 와 Green 이 9,10) 처음으로인간의각화세포를배양한발표이후로인공피부가필요한화상이나만성궤양, 반흔조직제거술, 백반증등여러가지질환에인공배양한피부의대체가능성에대한많은연구가행하여졌다. 이러한노력은구강내점막의대체에도많은영향을주어서구강각화세포의배양을이용한구강점막의재건이시도되어져왔다 11,12). 최근에는구강내점막을 이식하거나배양한뒤이식하여구강내재건을구강점막으로하고자하는노력이있어왔다 13,14). 하지만배양된구강각화세포의조작이힘들고쉽게뭉쳐지는결함이있어서이식에어려움이많았다. 이의극복을위하여하방에콜라겐스폰지나젤혹은인체양막을기질로이용하여배양하는것이연구되고있다 1,15). 하지만이러한하방의기질에결합하는강도역시만족할만한결과를얻지못하였다. 이러한대표적원인의하나가평탄한면에배양을하는것이라할수있다. 실제인체피부나점막에는 rete ridge 가발달하여있어서특히압력을많이받는곳이나체중을지탱하는부위는깊이가깊은것을관찰할수있다 16). 그러므로인공점막이나피부를제작할때이러한 rete ridge 를재현하는것이기계적인결합을증가시켜줄것이라판단된다. Pins 등 6) 은 rete ridge 를재현하기위하여 polyimide chip 에 LASER 를이용하여 40-310 μm의깊이로홈을파서음각을만들었으며여기에 collagen-gag sponge 를 lamination 하였다. 이상방에각화세포를배양한결과피부각화세포의층화는 250-350 μm의깊이에서가장좋은결과를보인다고하였다. 본연구에서는 3 차원적인 rete ridge 의형태를관찰할수있도록상피층과진피층을효소인 dispase 를처리하여분리한후 Confocal LASER 를이용하여 3 차원재구성을하였다. 과거동물조직을이용한 rete ridges 의 3 차원적인연구는주로 EDTA-trypsin 을이용하여상피를분리하였으나 dispase 는 EDTA, collagenase, pronase 등과달리세포막에손상을주지않고상피세포를분리할수있어서상피세포의생존에영향을주지않으면서기저막을분리할수있는장점이있다 17,18). 본연구에서는상피층의제거후 rete ridge 의변형을최소화하기위하여 dispase 로상피를분리후 30 분이내에 confocal LASER 의촬영을하였으며, confocal LASER 촬영후 2.5% Glutaraldehyde 로즉시고정하였다. 본연구에서시행한 H&E 염색사진과주사전자현미경사진에서전체적인 rete ridge 의윤곽을파악할수있었다. 분화구모양으로관찰되는부분은 rete ridge 가발달된곳으로피부피판의경우는비교적평탄하고넓은모양을관찰할수있었으며, 구강점막의각화치은인부착치은은좁고깊은 rete ridge 를관찰할수있었다. Confocal LASER scan 을통하여 3 차원재구성시각 rete ridge 의높이의평균과편차를구할수있었으며이는추후에 rete ridge 를음각한주형을만들때기초자료로쓰일수있는각점막및피부피판의평균깊이를알수있게하였다. 148
주사전자현미경으로저배율로관찰시족배피판의경우 0.5-1 mm간격으로일정한 ridge 도관찰되었으며이는다른전완피판이나비골피판에서는관찰되지않았다. 이는족배피판부위가다른부위보다좀더자극이나압력이큰부위이기때문에발달한것으로생각되었다. Ⅴ. 결론 1. 구강내점막과두경부재건에주로사용되는피부피판의 2 차원및 3 차원구조를관찰하였으며, 피부의경우압력을받는부위나무게를지탱하는부위의 rete ridge 가깊으며구강내점막의경우저작압이가해지는부위가깊은수치를보였다. 2. 생체와비슷한인공점막또는인공피부의제작을위하여원래점막이나피부조직에서관찰되는구조를최대한모방하여야하며, 본연구에서시행한 2, 3 차원적구조연구는각화세포의배양에사용되는기질을인체에최대한가깝게제작할수있는기초자료로유용하게사용될수있을것으로사료되었다. 참고문헌 1. Nakamura T, Endo K, Cooper LJ, Fullwood NJ, Tanifuji N, Tsuzuki M, et al: The successful culture and autologous transplantation of rabbit oral mucosal epithelial cells on amniotic membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci 2003;44(1):106-16. 2. King RE, Altini M, Shear M: Basal cell extensions in human oral mucosa. J Oral Pathol 1979;8(3):140-6. 3. McMillan MD, Kerr MA: A light and scanning electron microscope study of epithelial thickenings and rete ridges in the adult hamster cheek pouch. Arch Oral Biol 1990;35(3):235-40. 4. Moore RJ, McMillan MD, Gilbert RT: A scanning electron microscopic study of rete ridges in the cheek pouch of normal young, adult and aged Syrian hamsters. Arch Oral Biol 1992;37(5):337-41. 5. Klein-Szanto AJ, Schroeder HE: Architecture and density of the connective tissue papillae of the human oral mucosa. J Anat 1977; 123(1):93-109. 6. Pins GD, Toner M, Morgan JR: Microfabrication of an analog of the basal lamina: biocompatible membranes with complex topographies. Faseb J 2000;14(3):593-602. 7. Vracko R: Basal lamina scaffold-anatomy and significance for maintenance of orderly tissue structure. Am J Pathol 1974;77(2):314-46. 8. Lavker RM, Sun TT: Epidermal stem cells. J Invest Dermatol 1983;81(1 Suppl):121s-7s. 9. Rheinwald JG, Green H: Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell 1975;6(3):331-43. 10. Kumagai N, Nishina H, Tanabe H, Hosaka T, Ishida H, Ogino Y: Clinical application of autologous cultured epithelia for the treatment of burn wounds and burn scars. Plast Reconstr Surg 1988;82(1):99-110. 11. Izumi K, Takacs G, Terashi H, Feinberg SE: Ex vivo development of a composite human oral mucosal equivalent. J Oral Maxillofac Surg 1999;57(5):571-7; discussion 77-8. 12. Ueda M, Ebata K, Kaneda T: In vitro fabrication of bioartificial mucosa for reconstruction of oral mucosa: basic research and clinical application. Ann Plast Surg 1991;27(6):540-9. 13. Lauer G, Schimming R: Tissue-engineered mucosa graft for reconstruction of the intraoral lining after freeing of the tongue: a clinical and immunohistologic study. J Oral Maxillofac Surg 2001;59(2):169-75; discussion 75-7. 14. Lauer G, Schimming R, Frankenschmidt A: Intraoral wound closure with tissue-engineered mucosa: new perspectives for urethra reconstruction with buccal mucosa grafts. Plast Reconstr Surg 2001; 107(1):25-33. 15. Yannas IV, Burke JF, Gordon PL, Huang C, Rubenstein RH: Design of an artificial skin. II. Control of chemical composition. J Biomed Mater Res 1980;14(2):107-32. 16. Bale E, White FH: Quantitative light and electron microscopical studies of the epithelial-connective tissue junction in intraoral mucosae. J Microsc 1982;128 (Pt 1):69-78. 17. Takami Y, Matsuda T, Yoshitake M, Hanumadass M, Walter RJ: Dispase/detergent treated dermal matrix as a dermal substitute. Burns 1996;22(3):182-90. 18. Stenn KS, Link R, Moellmann G, Madri J, Kuklinska E: Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. J Invest Dermatol 1989;93(2):287-90. 149