194 Ki Nam Yoon, et al. Antioxidant Activities of Fruiting Bodies of Agaricus brasiliensis ORIGINAL ARTICLE Korean J Clin Lab Sci. 2015, 47(4):194-202 http://dx.doi.org/10.15324/kjcls.2015.47.4.194 pissn 1738-3544 eissn 2288-1662 Antioxidant, Anti-diabetic, Anti-cholinesterase, and Nitric Oxide Inhibitory Activities of Fruiting Bodies of Agaricus brasiliensis Ki Nam Yoon 1, Hyung Seok Jang 2, and Ga-Heon Jin 3 1 Department of Clinical Laboratory Science, Ansan University, Ansan 15651, Korea 2 Department of Pathology, Hanyang University Medical Center, Seoul 04763, Korea 3 Department of Ophthalmic Optics, Shinhan University, Uijeongbu 11644, Korea 신령버섯자실체메탄올추출물의항산화, 항당뇨및 Nitric Oxide 의저해효과 윤기남 1, 장형석 2, 진가헌 3 1 안산대학교임상병리과, 2 한양대학교병원병리과, 3 신한대학교안경광학전공 Agaricus brasiliensis, belonging to the family Agaricaceae of Agaricales, Basidiomycota, has been used for edible and medicinal purposes. This study was initiated to evaluate the antioxidant, anti-diabetic, and nitric oxide inhibitory activities of fruiting bodies of A. brasiliensis extracted with methanol. The HPLC analysis of phenolic compounds from the mushroom extracts identified 10 phenolic compounds including gallic acid, procatechuic acid, chlorogenic acid, ( )-epicatechin, vanillin, rutin hydrate, naringin, quercetin, formononetin, and biochanin-a. The free radical scavenging activities of methanol extract were lower than that of positive control, BHT. The chelating effects of methanol extract were significantly higher than those of the positive control, BHT at the all concentrations tested. The methanol extract exhibited the lower reducing power activities compared with the positive control at the 0.5 6.0 mg/ml concentration. The mushroom extract inhibited the -glucosidase activity by 54.48% and 78.43% at the 1.0 and 2.0 mg/ml while acarbose, the positive control, inhibited the -glucosidase activity by 51.77% and 81.81% at the same concentrations, respectively. Nitric oxide (NO) production in lipopolysaccahride (LPS) induced RAW 264.7 cells were inhibited by the methanol extracts in a concentration dependent manner. Therefore, it is concluded that fruiting bodies of A. brasiliensis contained natural antioxidant, anti-diabetic, and anti-inflammatory substances which can be useful for human health. Keywords: Agaricus brasiliens, Anti-diabetes, Anti-inflammation, Antioxidant Corresponding author: Ki Nam Yoon Department of Clinical Laboratory Science, Ansan University, Ansan 15651, Korea Tel: 82-31-400-708 E-mail: kinam@ansan.ac.kr This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Copyright 2015 The Korean Society for Clinical Laboratory Science. All rights reserved. Received: October 6, 2015 Revised: November 20, 2015 Accepted: November 23, 2015 서론 최근인구의고령화와각종사회적인스트레스, 그리고서구적으로변한식생활습관으로인해암, 치매, 당뇨병등의성인병은증 가추세여서현대의학이지속적으로발전함에도아직도성인병은우리의인류가반드시극복하고해결해야할과제로남아있다. 이러한어려운문제를해결하기위해생명과학, 약학, 의약분야의연구자들은천연물에서추출한물질을이용해부작용이적고효과가
Korean J Clin Lab Sci. Vol. 47, No. 4, Dec. 2015 195 높은의약품을개발하기위해많은노력을기울이고있다. 버섯은곰팡이에속하는미생물로분류학상으로는담자균류와일부의자낭균류에속해있다. 지난 10여년간버섯을대상으로한연구에서버섯의자실체에는항산화, 항암, 항균, 항고혈압, 항당뇨, 항콜레스테롤, 면역증강, 항치매, 항비만등을나타내는다양한생리활성물질을함유하고있다는것이밝혀졌다. 특히페놀성화합물은식물계와미생물계에널리분포되어있는 2차대사산물의한종류로다양한분자량과구조를갖고있으며 hydroxyl기를갖고있어서거대분자인단백질이나효소에강하게결합하는특성때문에항산화, 항암, 항균, 항당뇨등의생리활성효과를나타낸다고보고되어있다 (Prasad 등, 2005). 버섯에함유된생리활성물질을적절히섭취하면우리의건강이증진되고또한산업적으로새로운의약품을개발할수있는가능성도높아지고있어최근이분야의연구가활발하게진행되고있다 (Wasser와 Weis, 1999; Um 등, 2010). 신령버섯 (Agaricus brasiliensis) 은담자균류 (Basidiomycota) 의주름버섯목 (Agaricales) 주름버섯과 (Agaricaceae), 주름버섯속 (Agaricus) 에속하는버섯으로브라질을비롯한남미와북미일부지역의땅위에군생하는낙엽부후균으로온도와습도가높아지면대량발생하는성질이있어서브라질아마존지역의원주민들은우기에이버섯을대량으로채취하여식용으로사용하고있다. 최근외국의연구지들이신령버섯의자실체에는항균, 항암, 항산화, 항고지혈증등을나타내는생리활성물질이함유되어있어건강에좋은식품으로보고하면서우리나라에서도이버섯의균주를외국으로부터도입하여인공재배를시작하고있으나국내에서는아직까지이버섯의생리활성에대한연구는많이이루어지지않고있는실정이다 (Mizuno, 2002; Carvajal 등, 2012). 따라서본연구에서는현재한약재시장에서판매되고있는신령버섯의자실체를구매하여이를건강식품으로안전하게이용할수있는지그가능성을알아보기위해신령버섯의자실체를메탄올을이용해추출물을만든뒤그추출물을이용해항산화, 항당뇨및 nitric oxide 에대한저해효과실험을수행하고그결과를보고하는바이다. 재료및방법 1. 실험재료실험에사용한신령버섯의자실체는 2014년 12월서울에소재한경동한약재시장에서구입하여인천대학교생명과학부 버섯균주은행 의동정을받은후 45 o C의건조기에서 48시간건조한후마쇄하여분말로만든뒤 80 o C의저온냉동고에보관하면서실험에사용하였다. 2. 성분의추출및분리 Shim 등 (2003) 의방법에따라건조한신령버섯자실체의분말에 80% 메탄올을이용해성분을추출하여실험에사용하였다. 즉, 50 g의신령버섯자실체의분말을 80% 의메탄올용액 (Duksan Pure Chemicals Co., Ansan, Korea) 1,000 ml에침지하여 48 시간동안상온에서 3회추출하고모은후 No. 2 여과지 (Avantec Toyo Co., Otowa, Japan) 로여과하고 40 o C에서 Eyela cool aca ca N-1000 회전감압농축기 (Eyela Co., Tokyo, Japan) 을이용하여감압농축하였다. 농축액내의여분의수분을제거하기위해 FDU-8612 동결건조기 (Operon Co., Gyeonggi-do, Korea) 를이용하여메탄올추출분말을얻었다. 3. 페놀성화합물의분석 High-performance liquid chromatography (HPLC) 를이용하여신령버섯자실체추출물의페놀성화합물분석을 Kim 등 (2008) 의방법을이용하여분석하였다. 실험에는 AllianceR HPLC system 2695 (Waters Co., Milford, MA, USA) 와 Waters 사의 2680, C18 column (4.6 mm 150 mm) 과 DAD detector을사용하여유속 0.8 ml/min, 컬럼온도 20 o C, 주입량 20 L로분석하였다. 이동상은 0.1% acetic acid가포함된증류수 (A) 와 0.1% acetic acid가포함된 acetonitrile (B) 로 A: 92% B: 8%-A: 0% B: 100% gradient조건으로분석하였다. 페놀성화합물의 detection wavelength 범위는 280 nm로하였으며, 실험에는총 20 종류의 standard phenolic compound 를사용했으며시료에함유된페놀성화합물의정성과정량은 standard chemicals 의 retention time 과고유의스펙트럼을비교하는프로그램을이용하여분석하였다. 4. 세포배양실험에사용한생쥐의대식세포인 RAW 264.7는서울대학교의한국세포주은행에서분양받았으며이세포의배양에는 Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM) 배지와 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 배지를각각기본배지로하여 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/mL penicillin 및 100 g/ml streptomycin 을첨가하여조제하여 37 o C, 5% 의 CO 2 배양기에서 3일배양하였다. 5. 버섯추출물의세포독성신령버섯자실체추출물의 RAW 264.7 세포에대한세포독성은 Mosmann (1983) 의방법에따라수행하였다. 지수기에도달한세포를 RPMI-1640 배지가분주된 96 plate well에 2 10 5 cell/ml 의농도로분주하고 24시간배양한후, 배지의상층액을제거하고
196 Ki Nam Yoon, et al. Antioxidant Activities of Fruiting Bodies of Agaricus brasiliensis 신령버섯추출물을 25, 50, 100, 1,000, 2,000 g/ml 농도로각각의배지에 200 L 첨가하여 48시간동안배양하였다. 배양완료후상층액을제거하고각각의 well에 MTT 용액 (5 mg/ml in PBS) 10 L씩을첨가하고, 다시 37 o C, 5% 의 CO 2 배양기에서 4시간동안배양하여 MTT를환원시켰다. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylyetrazolium bromide (MTT) 의환원에의해각각의 well 에생성된보라색의 formazan 결정은 150 L의 DMSO로녹여 SpectraMax 340PC microplate reader (Molecular Devices Co., California, USA) 를이용해 540 nm 파장에서흡광도를측정하여추출물의세포독성을계산하였다. 6. DPPH 라디칼소거활성 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼소거활성은 Blois (1958) 의방법으로측정하였다. 시료를메탄올로녹여최종농도가 0.125, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 mg/ml이되도록정량하여 96 well plate에각각의시료를 100 L를주입하고. 동시에 0.3 mm DPPH 100 L를넣어총량이 200 L가되도록하였다. 실온에서 10분간반응시킨후 SpectraMax 340PC microplate reader (Molecular Devices Co., California, USA) 를이용해 540 nm 파장에서흡광도를측정하였다. DPPH 라디칼소거활성은시료용액의첨가군과무첨가군사이의흡광도차이를백분율로나타내었다. DPPH 라디칼소거활성 (%)=[1-( 첨가군흡광도 / 무첨가군흡광도 )] 100 7. 철이온제거효과철이온제거능실험은 Yena 등 (2002) 의방법에준하여수행하였다. 그원리는신령버섯추출물의항산화성분에의해 Fe 2+ 이온이제거되어더이상 ferrozine-fe 2+ 복합체를형성하지못하는것을기본으로하여측정하였다. 먼저각각의농도별로버섯추출물을준비하였다. 버섯추출물 2.0 ml에 2 mm FeCl 2 (Sigma Aldrich Co., St Louis, USA) 0.05 ml를혼합한후 5 mm의 ferrozine 0.2 ml를첨가하여반응시킨뒤메탄올 2.75 ml를가하여총용량이 5 ml가되도록하고 vortex mixer를이용하여강하게진탕한뒤 Optizen POP UV/VIS spectrophotometer (Mecasys Co., Daejeon, Korea) 를이용하여 562 nm에서반응액의흡광도를측정하여아래의계산식에의해철이온제거능을계산하였다. 양성대조군으로는 Butylated hydroxytoluene (BHT) 를사용하였다. Chelating effect on ferrous ions (%)=[(A control-a sample) / A control] 100 8. 환원력측정신령버섯추출물의환원력활성에대한실험은 Gulcin 등 (2003) 의방법에따라수행하였다. 시료 2.5 ml에 sodium ᅠphos- phate buffer (2.5 ᅠmL, 200 ᅠmM, ph 6.6) 와 1% potassium ferricyanide (2.5 ᅠmL) 를혼합시킨후혼합물을 50 o C에서 20분간 incubation한뒤 trichloroacetic acid (2.5 ml, 10%, w/v) 를첨가하여 650 g에서 10분간원심분리하였다. 원심분리한상층액 5 ᅠmL 에 3차증류수 5 ml와 1% ferric chloride ᅠ1 ᅠmL를첨가한후 Optizen POP UV/VIS spectrophotometer (Mecasys Co., Daejeon, Korea) 를이용하여 700 nm에서흡광도를측정하였다. 9. -amylase 저해효과측정 -amylase 저해활성측정은 Worthington (1993) 의방법을약간변형하여수행하였다. 버섯추출물 (0.125 2.0 mg/ml) 을 20 mm의 phosphate buffer (ph 6.9) 에녹여 200 L 준비하고, 200 L의 -amylase 용액 (0.5 U/mL) 에혼합하여 25 o C에서 10분간선배양후 1% 녹말용액 200 L를첨가하고 25 o C에서 30분간배양하였다. 이반응은 1.0 ml의 dinitrosalicylic acid reagent (1.0 g of 3.5-dinitrosalicylic acid in 20 ml of 2M NaOH+50 ml distilled water+30 g potassium sodium tartrate tetrahydrate) 를첨가하여중지시킨후증류수에녹여 100 ml의용량이되게하였다. 그후반응액이들어있는시험관을 water bath에서 5분간끓인후상온이될때까지식힌후분광광도계로 540 nm에서흡광도를측정하여 -amylase의활성이억제되는정도를계산하였다. 대조군은완충액만을사용하였으며, 양성대조군으로는 acarbose를사용하였다. 10. -glucosidase 저해효과측정 -glucosidase 저해효과실험은 Kim 등 (2013) 의실험을약간변형하여수행하였다. 추출물 (0.125 2.0 mg/ml) 을 100 mm의 phosphate buffer (ph 6.9) 에녹여 100 L 준비하고 1.0 U/mL의 -glucosidase 용액 100 L에혼합하여 37 o C에서 10분간배양후기질인 5.0 mm의 p-nitrophenyl- -D-glucospyranoside (pnpg) 용액 100 L를첨가하여 37 o C에서 10분간반응시킨후이반응액 20 L에증류수를첨가해 1.0 ml가되게희석한후 pnpg로부터유리되어나오는반응생성물인 p-nitrophenol을 Optizen POP UV/VIS spectrophotometer (Mecasys Co., Daejeon, Korea) 를이용하여 405 nm에서 -glucosidase 의저해활성을측정하였다. 양성대조군으로는 acarbose를사용하였다.
Korean J Clin Lab Sci. Vol. 47, No. 4, Dec. 2015 197 11. Nitrite (NO) 생성저해효과측정 NO 생성저해효과는면역이나염증반응에널리사용되는쥐의대식세포인 RAW 264.7 세포를 Ryu 등 (2003) 의방법을이용해측정하였다. DMEM 배지가들어있는 96 well plate에쥐의대식세포인 RAW 264.7 세포를 5 10 4 cell/well로분주하고 12시간배양후신령버섯추출물을 0, 0.5, 1.0 및 2.0 mg/ml의농도로 1시간전처리한후 LPS를 1 g/ml의농도로처리하고ᅠ24시간동안배양하였다. 배양후 100 L의상층액을취한후동량의 Griess reagent (Sigma Co., St. Louis, MO, USA) 100ᅠ L 를넣어총량이 200 L가되도록하고상온에서 10분간반응시킨후생성된 NO의양을 SpectraMax 340PC microplate reader (Molecular Devices Co., California, USA) 를이용하여 540 nm에서흡광도를측정하였다. NO의농도는아질산염의표준곡선을이용해구하였다. 12. 통계처리본연구결과는 SPSS version 20.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 통계프로그램을이용하여분석하였다. 실험은각실험군간 3회이상반복실험을통하여얻은각각의결과를각실험군의평균 ± 표준편차 (mean±sd) 로나타내었다. 각시료농도군에대한통계 적유의검정은대조군과비교하여 Student s t-test 후, p<0.05 수준에서통계적으로유의성있는결과로표시하였다. 결과 1. 추출물의페놀성화합물의분석본실험에서신령버섯자실체의메탄올추출물의 HPLC 페놀성화합물분석에사용한표준시약은 gallic acid, homogentisic, procatechuic acid, (+)-catechin, chlorogenic acid, ( )-epicatechin, ( )-epigallocatechin gallate, caffeic acid, vanillin, rutin hydrate, p-coumaric acid, ferullic acid, naringin, myricetin, resveratrol, quercetin, naringenin, kaempferol, formononetin, biochanin-a 등 20 종류가사용되었으며, HPLC 분석결과분석된페놀성화합물은 Fig. 1과같이 gallic acid, procatechuic acid, chlorogenic acid, ( )-epicatechin, vanillin, rutin hydrate, naringin, quercetin, formononetin, and biochanin-a 등 10종류가분석되었고, 각각의함량은 12.67 g/g, 12.62 g/g, 37.1 g/g, 0.88 g/g, 3.88 g/g, 5.12 g/g, 25.82 g/g, 7.5 g/g, 3.01 g/g, 3.52 g/g이었으며총함량은 102.12 g/g이었다 (Fig. 1). Fig. 1. HPLC analysis of phenolic compounds. (A) standard compounds; (B) Agaricus brasiliensi 1, gallic acid; 2, homonogentisic acid; 3, procatechuic acid; 4, (+)-catechin; 5, chlorogenic acid; 6, ( )-epicatechin; 7, ( )-epigallocatechin gallate; 8, caffeic acid; 9, vanillin; 10, rutin hydrate; 11, p-coumaric acid; 12, ferullic acid; 13, naringin; 14, myricetin; 15, resveratrol; 16, quercetin; 17, naringenin; 18, kaempferol; 19, formonoentin; 20, biochanin-a.
198 Ki Nam Yoon, et al. Antioxidant Activities of Fruiting Bodies of Agaricus brasiliensis 2. 세포독성신령버섯의자실체추출물이독성효과를나타내는지알아보기위해신령버섯자실체의메탄올추출물을 25, 50, 100, 1,000 및 2,000 g/ml의다양한농도로 RAW 264.7 대식세포에처리한후배양하여 MTT 방법을이용해세포의생존율을조사하였다. 실험결과 RAW 264.7 세포는메탄올추출물 25, 50, 100, 1,000 g/ml 의농도에서생존율이각각 138.33, 143.46, 141.24, 109.24% 로나타나대조군에생존율이높아서세포를증식시키는효과가있는것으로나타났다. 그러나 2,000 g/ml의농도에서는세포의생존율이 55.80% 로나타나신령버섯자실체추출물이약간의독성을나타내는것으로사료되었다 (Fig. 2). 3. DPPH 라디칼소거활성신령버섯메탄올추출물의 DPPH 소거활성은 0.125 mg/ml의농도에서 30.38% 로나타나양성대조군인 BHT의 96.19% 에비해매우낮았으나 1.0과 2.0 mg/ml의농도에서라디칼소거능이각각 94.53% 와 93.54% 로증가되어동일한농도에서의 BHT의소거활성에비해각각 2.02% 와 3.43% 의낮은소거활성을보였다 (Fig. 3). 타났다 (Fig. 4). 5. 환원력메탄올추출물 0.5 mg/ml 농도에서의환원력은 0.304이었고이농도에서의 BHT 환원력은 2.65로높았으며 6.0 mg/ml의농도에서버섯추출물의환원력은 1.54였고 BHT는 2.73를나타내신령버섯자실체추출물의환원력은동일한농도에서양성대조군에비해매우낮았다 (Fig. 5). 따라서신령버섯메탄올추출물의환원력은실험에사용한 0.5 6.0 mg/ml 범위의농도에서양성대조군인 BHT에비해모두낮았다. 6. -amylase 저해효과메탄올추출물은 1.0 mg/ml와 2.0 mg/ml의농도에서 -amylase에대한저해활성이각각 37.11% 와 63.55% 로나타나서양성대조군으로사용한 acarbose의동일농도에서의저해효과 4. 철이온제거효과 신령버섯메탄올추출물의철이온제거활성실험결과, 추출물의농도 0.125 2.0 ᅠmg/mL 범위의모든농도에서양성대조군으로사용한 BHT에비해철이온의제거능이높게나타났다. 추출물 1.0 mg/ml와 2.0 mg/ml의농도에서의철이온제거활성은각각 90.95% 와 93.55% 로나타나양성대조군인 BHT의 60.45% 와 69.84% 에비해철이온제거효과가각각 30.5% 와 23.71% 높게나 Fig. 3. Scavenging activities of methanol extract from fruiting bodies of Agaricus brasiliensis against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl. Fr.MeOH, fraction extracted with 80% methanol; BHT, butylated hydroxytoluene. The values are expressed as means±sd (n=3). ***p 0.001; *p<0.05 vs. BHT group. Fig. 2. In vitro cell cytotoxicity of methanol and hot water extracts from fruiting bodies of Agaricus brasiliensis against RAW 264.7 cells. Fr.MeOH, fraction extracted with 80% methanol; Fr.HW, fraction extracted with methanol. Fig. 4. Chelating effect of methanol from fruiting bodies of Agaricus brasiliensis. Fr.MeOH, fraction extracted with 80% methanol; BHT, butylated hydroxytoluene. The values are expressed as means±sd (n=3). ***p 0.001 vs. BHT group.
Korean J Clin Lab Sci. Vol. 47, No. 4, Dec. 2015 83.69%와 89.91%에 비해 각각 저해 수치가 낮았다(Fig. 6). 199 mg/ml와 2.0 mg/ml로 처리한 실험군의 NO 생성량은 각각 26.32 mg/ml과 324.04 M를 나타내 신령버섯 메탄올 추출물을 7. -glucosidase 저해 효과 1.0 mg/ml와 2.0 mg/ml의 농도로 RAW 264.7 세포에 처리 했을 추출물 1.0 mg/ml와 2.0 mg/ml의 농도에서 -glucosidase 에 대한 저해 활성이 각각 54.48%와 78.43%로 나타났으며, 양성대 때 NO 생성량이 각각 38.72%와 44.02% 감소시키는 효과가 있는 것으로 나타났다(Fig. 8). 조군으로 사용한 acarbose는 동일한 농도에서 각각 51.77%와 81.81%의 저해 효과를 보였다(Fig. 7). 고 찰 8. Nitric oxide (NO) 생성 저해 효과 본 연구 결과 신령버섯의 자실체에서 추출된 102.12 g/g의 페 RAW 264.7 대식세포에 신령버섯 자실체의 메탄올 추출물을 처 놀성 화합물은 Lee 등(2014)이 능이버섯 자실체를 60%의 에탄올 리한 후 염증 매개 물질인 lipopolysaccharide (LPS)를 처리하여 을 이용해 추출한 총 페놀성 화합물의 함량 162.30 g/g에 것에 비 RAW 264.7 세포에서 NO의 생성이 저해되는 실험을 수행하였다. 해서는 낮았으나 갈색먹물버섯 자실체에서 추출한 총 페놀성분 실험결과 LPS를 처리하지 않은 군에서 생성된 NO의 농도는 6.79ﾠ 26.58 g/g에 비해서 약 6.11배 높은 것으로 나타났다. M이었고 LPS만 처리한 군의 NO 농도는 42.95ﾠ M를 나타내 무 또한 신령버섯 자실체 추출물을 안전하게 이용할 수 있는지 알 처리군에 비해 약 6.33배 증가하였다. 그러나 메탄올 추출물을 1.0 Fig. 5. Reducing power of methanol extract from fruiting bodies of Agaricus brasiliensis. Fr.MeOH, fraction extracted with 80% methanol; BHT, butylated hydroxyltoluene. The values are expressed as means±sd (n=3). Values are expressed as mean±s.d (n=3). ***p 0.001 vs. BHT group. Fig. 6. -amylase inhibitory activity fruiting bodies of Agaricus brasiliensis. with 80% methanol. Acarbose used for are expressed as mean±s.d (n=3). group. of methanol extract from Fr.MeOH, fraction extracted positive control. The values ***p 0.001 vs. Acarbose Fig. 7. -glucosidase inhibitory activity of methanol extract from fruiting bodies of Agaricus brasiliensis. Fr.MeOH, fraction extracted with 80% methanol. Acarbose used for positive control. The values are expressed as means±s.d (n=3). *p 0.05 vs. Acarbose group. Fig. 8. Inhibitory effects of methanol extract from fruiting bodies of Agaricus brasiliensis on LPS-induced nitric oxide production in RAW 264.7 cells. Accumulated nitric oxide in the culture medium was determined by the Griess method. Fr.MeOH, fraction extracted with 80% methanol. The values are expressed as means±sd (n=3). **p 0.001; **p 0.01 vs. Control group; ###p 0.001; ##\p 0.01 vs group treated with LPS.
200 Ki Nam Yoon, et al. Antioxidant Activities of Fruiting Bodies of Agaricus brasiliensis 아보기위해신령버섯자실체의메탄올추출물의세포독성실험을수행하였다. 실험결과 RAW 264.7 세포에추출물을 25 1,000 g/ml 농도로처리했을때대조군에비해생존율이높게나타나이농도범위에서는세포독성이전혀나타나지않았고, 추출물의농도를 2,000 g/ml로높였을때 RAW 264.7 세포의생존율이 55.80% 로나타났으며, 추출물의농도를증가시킴에따라농도의존적으로 RAW 264.7 세포의생존율은점차감소하는경향을보였다. 신령버섯자실체메탄올추출물 DPPH 라디칼소거활성은 0.125 2.0 mg/ml 농도범위에서양성대조군으로사용한 BHT에비해전농도구간에서활성이조금낮았으나 1.0 mg/ml와 2.0 mg/ml 농도에서각각 90% 이상으로소거활성이매우높았다. 본실험결과노랑느타리의자실체를 3 종류의용매를이용해추출한물질을 5 mg/ml로희석한농도에서확인한 DPPH 라디칼소거활성 46.6 68.4% 에비해서크게높았으며 Alam 등 (2011) 이보고한새송이자실체의메탄올과열수추출물의 2 mg/ml 농도에서의 DPPH 소거능 88.46% 와 84.45% 에비해신령버섯메탄올추출물의 DPPH 소거활성은이미보고된다른식용버섯과비교해크게높거나또는유사한것으로나타났다. 철이온이식물이나미생물의추출물에의해제거되는기본원리는이들생물체의추출물에함유되어있는항산화성분이 Fe 2+ 이온을제거하여더이상 ferrozine-fe 2+ 복합체를형성하지못하는것에기인하는것이다. 신령버섯추출물의철이온제거활성은 0.125 2.0 mg/ml의모든실험농도에서양성대조군인 BHT에비해크게높았다. 본실험결과는 Mau 등 (2004) 과 Tsai 등 (2006) 이보고한버들송이와잎새버섯자실체의열수추출물 20ᅠmg/mL의농도에서나타난철이온제거능 87.5% 와 45.8% 에비해서높아서신령버섯의철이온제거항산화효과는버들송이와팽이에비해우수한것으로나타났다. 신령버섯의자실체추출물은동일한농도에서양성대조군에환원력이크게떨어지는것으로나타났으나추출물의농도를증가시킴에따라환원력은비례해서증가하는것으로나타났다. Mau 등 (2004) 은잎새버섯의자실체메탄올추출물 5 mg/ml의농도에서환원력이 0.37이었다고보고했는데이수치는본실험의 4 mg/ml 의추출물환원력 1.142에비해낮았다. Alam 등 (2012) 은아위버섯자실체의메탄올과열수추출물의환원력이 4.0 mg/ml 농도에서각각 1.078과 0.802를나타낸다고보고하여동일한농도에서신령버섯의메탄올추출물농도의환원력에비해조금낮게나타났다. 따라서신령버섯자실체의메탄올추출물의환원력은양성대조군인 BHT에비해서낮았지만잎새버섯이나아위버섯의환원력에비해서는높았다. -amylase는탄수화물인전분이나글리코겐등의 -D-(1,4)- glucan 결합을분해하는가수분해효소로탄수화물을포도당, 맥아당, 덱스트린등으로전환한다. 다음단계의효소에의해체내에흡수되기쉬운형태의포도당으로분해되어생물체는이를에너지원으로이용해살아갈수있다. 그러나이러한분해효소들이과도하게작용하면혈액내의당이급격하게상승하게되면서당뇨와비만등의질병이유발될수있다. 따라서이러한성인병의예방과치료를위해전분의분해에중요한역할을하는 -amylase와 -glucosidase 와같은효소의활성을조절하고제어할필요성이있다 (Lee 등, 2010). 본실험에서신령버섯추출물의 -amylase에대한저해활성은양성대조군으로사용한 acarbose에비해모든실험농도에서낮았으나 1.0 2.0 mg/ml 농도에서 60% 이상으로나타나이버섯의자실체를섭취하면초기단계의당뇨병예방에도움이될수있을것으로사료된다. -glucosidase는 -amylase가탄수화물을가수분해하여맥아당및덱스트린등으로전환한물질을작은창자에서바로흡수가가능한포도당으로전환시키는가수분해하는소화효소이다. 본실험에서양성대조군으로사용한 acarbose는당뇨 2형의환자에처방되는 -amylase와 -glucosidase의저해활성이매우높은경구투여제로방선균인 Actinoplanes sp. 균주의발효를통해생산되고있다. Acarbose 가경구투여되면흡수된탄수화물의소화와흡수가지연되어체내의급격한혈당의상승을지연시켜당뇨병을완화시키는효과가나타나는것으로보고되어있다 (Mahmud 등, 1999). 본실험결과신령버섯자실체의메탄올추출물은 0.125 1.0 mg/ml 범위의농도에서양성대조군인 acarbose에비해저해활성이조금높았으나 2.0 mg/ml의농도에서만저해활성이조금낮았다. NO는염증유발에중요한역할을하는활성산소종의하나로 inos (nitric oxide synthase) 에의해 L-arginine 으로부터생성된다. 본실험에서는세포염증유발실험에가장많이사용되는 LPS 를처리한 RAW 264.7 세포에서의 NO 생성에대한신령버섯자실체의메탄올추출물의저해효과를측정하였다. 실험결과, 추출물을투여한 RAW 264.7 세포군에서의 NO 생성량은미처리군에비해급격하게낮아지는경향이나타나는것으로확인되었다. Nguyen 등 (2013) 은흰망태버섯자실체의메탄올추출물을 2 mg/ml 농도로처리한실험군의 NO의발생은 81.2% 대폭감소한다고보고하여본실험에서의 NO 감소량에비해저해효과가높았다. Kang (2012) 에의하면팽이버섯열수추출물을 RAW 264.7 세포에처리한후 1 g의 LPS를처리하였을때 NO의생성량은유의성있게저해되었으며, NO 생성량은추출물의농도증가에따라농도의존적으로비례하여감소한다고보고하였다. 본실험에서도신령버섯추출물의처리농도가높아짐에따라 RAW 264.7 세포내에
Korean J Clin Lab Sci. Vol. 47, No. 4, Dec. 2015 201 서의 NO의생성량도점차감소하여앞에서의보고와유사한경향을보였다. 따라서본실험을통해신령버섯의자실체추출물에는항산화효과를나타내는폴리페놀, 당뇨병의치료에이용되는 -amylase 와 -glucosidase 저해물질, 그리고염증을저해하는물질을함유하고있는것으로나타났으나이들추출물의효과를좀더실용적으로규명하기위해서는생쥐나쥐등의동물을이용한실험이진행되어야할것으로사료되었다. 요약신령버섯 (Agaricus brasilliensis) 는식용과약용으로사용되고있는담자균류에속하는버섯이다. 본연구에서는신령버섯의자실체를메탄올과열수를이용해추출한물질의항산화, 항당뇨및 nitric oxide 생성저해효과에대한실험을수행하였다. 고속액체크로마토그래피를이용해이버섯자실체추출물의페놀성화합물을분석한결과 gallic acid, procatechuic acid, chlorogenic acid, ( )-epicatechin, vanillin, rutin hydrate, naringin, quercetin, formononetin, biochanin-a 등총 10종류의페놀성화합물이확인되었다. 항산화효과실험에서메탄올추출물의 DPPH radical 소거능은양성대조군으로사용한 BHT에비해낮았지만비교적효과가우수하였으며, 철이온제거항산화효과는메탄올추출물이양성대조군인 BHT에비해모든실험농도에서유의성있게높았다. 환원력의경우이버섯의추출물은양성대조군에비해모두모든농도에서효과가낮게나타났다. 항당뇨실험에서 -glucosidase 에대한메탄올추출물의저해효과는 1.0 mg/ml와 2.0 mg/ml의농도에서각각 54.48% 와 78.43% 를보여양성대조군인 acarbose의 51.77% 과 81.81% 에비해조금낮았다. 염증저해효과실험에서 RAW 264.7 대식세포가배양되고있는배지에신령버섯자실체의메탄올과열수추출물을각각전처리한후염증매개물질인 LPS를투여하여메탄올과열수추출물의 NO 생성저해효과를조사한결과추출물의농도가증가함에따라대식세포에생성된 NO의양이감소하는경향을나타내어높은농도에서저해효과가우수한것으로나타났다. 따라서신령버섯의자실체에는항산화, 항당뇨, 및항염증효과를나타내는천연물질이함유되어있어서이를섭취할경우건강에유용한것으로생각되었다. Acknowledgement: None Funding: None Conflict of intereat: None References 1. Alam N, Yoon KN, Lee KR, Lee JS, Lee TS. Phenolic compounds concentration and appraisal of antioxidant and antioxidant and antityrosinase activities from the fruiting bodies of Pleurotus eryngii. Adv Environ Biol. 2011, 5:1104-1113. 2. Blois MS. Antioxidant determination by the use of a stable free radical. Nature. 1958, 181:1199-1200. 3. Carvajal AE, Koehnlein EA, Soares AA, Eler GJ, Nakashima ATA, Bracht A, et al. Bioactives of fruiting bodies and submerged culture mycelia of Agaricus brasiliensis (A. blazei) and their antioxidant properties. LWT-Food Sci Technol. 2012, 46:493-499. 4. Gulcin I, Buyukokuroglu ME, Oktay M, Kufrevioglu OI. Antioxidant and analgesic activities of turpentine of Pinus nigra Arn. subsp. pallsiana (Lamb.) Holmboe. J. Ethnopharmacol. 2003, 86;51-58. 5. Kang HW. Antioxidant and anti-inflammatory effects of extracts from Flammulina velutipes (Curtis) Singer. J Kor Soc Food Nut. 2012. 41:1072-1078. 6. Kim MY, Seguin P, Ahn JK, Kim JJ, Chun SC, Kim EH, et al. Phenolic compound concentration and antioxidant activities of edible and medicinal mushrooms from Korea. J Agric Food Chem. 2008, 56:7265-7270. 7. Kim HS, Kim TW, Kim DJ, Lee JS, Kim KK, Choe M. Antioxidant activities and -glucosidase inhibitory effect of water extracts from medicinal plants. Korean J Med Crop Sci. 2013, 21(3): 197-203. 8. Lee YL, Yen M, Mau JL. Antioxidant properties of various extracts from Hypsizigus marmoreus. Food Chem. 2007b, 104: 1-9. 9. Lee SJ, Song, EJ, Kim KBWR, Lee CJ, Jung JY, Kwak JH, et al. Inhibitory Effects of Sargassum thunbergii ethanol extract against -amylase. Kor J Fish Aquat Sci. 2010, 43(6):648-653. 10. Lee HJ, Do JR, Jung SK, Kim HK. Physiological properties of Sarcodon aspratus extracts by ethanol concentration. J Kor Soc Food Sci Nutr. 2014, 43(5):656-660. 11. Mahmud, T, Tornus I, Egelkrout E, Woif E, Uy C, Floss HG, et al. Biosynthetic studies on the -glucosidase inhibitor acarbose in Actinoplanes sp.; 2-epi-5-epi-valiolone is the direct precursor of the valienamine moiety. J Amer Chem Soc. 1999, 121: 6973-6983. 12. Mau JL, Chang CN, Huang SJ, Chen CC. Antioxidant properties of methanolic extracts from Grifola frondosa, Morchella esculenta, and Termitomyces albuminosus mycelia. Food Chem. 2004. 87:111-118. 13. Mizuno T. Medicinal properties and clinical effects of culinary medicinal mushroom Agaricus blazei Murrill (Agaricomycetidae). Int J Med Mushrooms. 2002, 4:299-312. 14. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Immunol Meth. 1983, 65:55-63. 15. Nguyen TK, Shin DB, Lee KR, Shin PG, Cheong JC, Yoo YB, et al. Antioxidant and anti-inflammatory activities of fruiting bodies of Dyctiophora indusiata. J Mushroom Sci Prod. 2013, 11(4): 269-277. 16. Prasad NK, Divakar S, Shivamurthy GR, Aradhya SM. Isolation of a free radical scavenging antioxidant from water spinach
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