발간사 폴리염화비페닐 (PCBs; PolyChlorinated Biphenyls) 은 1930 년대절연체등 으로사용하기위해인위적으로합성, 사용한물질로서 1970 년대그독성이 알려진이후생산 판매가금지된물질입니다. 그러나이들은화학적으로 안정한구조를갖고있어산업폐기물등을통하여환경에오염되면잘 분해되지않아국제적으로잔류성유기오염물질즉, POPs(Persistent Organic Pollutants) 물질로관리되고있습니다. 국제암연구소 (IARC; International Agency for Research on Cancer) 에서그룹 2A( 인체발암가능물질 ) 로분류하고있는 PCBs는환경에서먹이사슬을통하여식품에축적됨으로식품중 PCBs의관리는국민건강측면에서중요합니다. 따라서식품의약품안전청에서는 2011년 8월어류중 PCBs의기준규격및 어류중 PCBs 시험법 을신설하였습니다. 이에따라우리원에서는식품위생검사기관등분석업무실무자들에게도움이되고자폴리염화비페닐시험법실무해설서를발간하오니본책자가폴리염화비페닐분석업무를담당하고계시는모든분들에게많은도움이되시기를바랍니다. 2011. 8. 식품의약품안전평가원장김승희
1. PCBs 시험법실무해설서목적 1 2. 필요한시약및기구 2 3. PCBs 표준물질조제및관리 6 4. PCBs 분석시료전처리방법 10 4.1. 분석개요도 (Flow chart) 10 4.2. 검체처리 11 4.3 조지방추출 14 4.4. 회전감압농축기를이용한농축 18 4.5. 지방함량측정 19 4.6. 산성실리카겔을이용한지방분해 21 4.7. 다층실리카겔칼럼에의한정제 24 4.8. 질소농축기를이용한농축 27 5. 분석기기사용법 29 5.1. Method 작성 29 5.2. Data 분석 32
PCBs 시험법실무해설서 1. PCBs 시험법실무해설서목적 1. 목적 식품시료 ( 어류 ) 중폴리염화비페닐 (PCBs, Polychlorinated Biphenyls) 을분석함에있어, 시료채취, 추출, 정제그리고기기분석등제반절차의정확성과통일성및객관성확보가 PCBs 시험법실무해설서의목적이다. 본실무해설서를통하여다음과같은기대효과를추구하고자한다. - 국내폴리염화비페닐분석자들에게도움이되어모든식품의안전성확보 - 폴리염화비페닐분석기관등해당업무종사자들의분석기술수준향상 - 검사능력관리향상 - 폴리염화비페닐시험법의체계화및보급 2. 적용범위 가. 식품중어류, 패류나. 식품시료중 indicator PCBs로알려진폴리염화비페닐동족체 (PCB congeners) 7종을기체크로마토그래피 / 질량분석기 (GC/MS, gas chromatograph/mass spectrometer) 로분석하는방법에적용한다. - 1 -
PCBs 시험법실무해설서 2. 필요한시약및기구 1. 목적 분석에사용되는시약과기구를명시하고자한다. 2. 원리 폴리염화비페닐은용매제조시또는용기로부터포함될수있으므로사용하는모든용매를시험법상의비율로농축하였을때폴리염화비페닐 7종이검출되지않는지, 사용초자에서는검출되지않는지확인한다. 특히초자의경우가능한유리제품을사용하고플라스틱으로된제품의사용은줄인다. 3. 시약 1) 물 : 3차증류수 (18 MΩ 이상의순도를갖는것 ) 또는이와동등한것 2) 용매 : 잔류농약분석용또는이와동등한것 - n-헥산 (n - Hexane) - 진한황산 - 노난 (Nonane) - 디클로로메탄 (Methylene Chloride) 3) 시약 (Chemical) - 무수황산나트륨 (anhydrous sodium sulfate, Na 2 SO 4, PCB grade) : 특급이상 (400 에서최소 1시간이상구운것 ) 무수황산나트륨이적정수준이상의수분을포함한경우시료중의수분을충분히제거하지못하여시험시 PCBs의회수율이낮아지므로적절한조건으로처리되고보관되어야함 - 내부표준원액 : 13 C 12 동족체로된폴리염화비페닐 7 종의내부표준품 (MBP-07, Wellington) - 2 -
- 표준원액 : PCBs 7 종 Standard(BP-07, Wellington) - 28, 52, 101, 118,138, 153, 180(IUPAC number) - 다층실리카겔칼럼 : 안지름 25 mm, 길이 550 mm의정제용칼럼에 < 그림 1.> 과같이무수황산나트륨 2 g, 중성실리카겔 1 g, 산성실리카겔 5 g, 중성실리카겔 1g, 염기성실리카겔 3 g, 중성실리카겔 1 g, 무수황산나트륨 1 g의순서로충전한것 ( 또는이와동등이상의것 ) - 중성실리카겔칼럼 : 칼럼크로마토그래피용실리카겔 (100 200 mesh) 을유리칼럼에채우고메탄올, 헥산과디클로로메탄으로순으로용리세척하여 18 0 에서 8시간이상가열한후데시케이터에서방냉한다. 중성실리카겔은시험액중의극성, 비극성성분을제거한다. - 산성실리카겔 (44%, g/g): 중성실리카겔 100 g 에진한황산 78.9 g 를넣고 균일하게혼합한다. 산성실리카겔은시험액중의지방성분을분해한다. - 염기성실리카겔 (33%, g/g): 중성실리카겔 100 g 에 1N 수산화나트륨 49.2 g 를넣고균일하게혼합한다. 염기성실리카겔은시험액중의지방성분을분해한다. - 공시료 (Blank) 전체실험단계에서 PCBs 에의한오염여부를확인하기위하여사용한다. - 대조시료 (QC; Quality Control) 전체실험단계에서 PCBs 에의한회수율을측정하기위하여사용한다. - 3 -
4. 기구 1) Meat Chopper ( 분쇄기 ) 2) 메스실린더 3) 핀셋 4) 속실렛추출기 (Soxhlet extractor) 5) 원통여지 (Cellulose type) 6) 비등석 7) 알루미늄호일 8) Chemical balance 9) Drying oven 10) Micro pippet 11) 둥근바닥플라스크 (Boiling flask) 12) 냉각기 13) Micro Syringe (1000μl, 500μl, 100μl, 10μl ) 14) 갈색시약병 (15mL, vials with solid-top screw Caps) 15) 종이와이퍼 16) 초음파세척기 (Sonicator) 17) 유기용매용세척병 18) 시약스푼 (Scoop) 19) 방독면 20) 유리깔때기 21) 스테인레스스틸쟁반 (Stainless steel tray) 22) 칼, 도마 23) 데시케이터 24) 막자및막자사발 25) 시료보관용 box 26) 비커 27) 유리솜 28) Heating mantle ( 가열기 ) 29) 감압회전농축기 (Vacuum controller, Rotary Evaporator, Heating bath) 30) 타이머 31) 파스퇴르피펫 - 4 -
32) 랙 (rack) 33) 질소농축기 or Turbo-Vap 34) 감압회전농축기용트랩 250 ml 35) PCBs 분석용바이알 36) 킴와이프스 37) Vortex mixer 38) GC/MS(Gas chromatography/mass spectrometer) - 5 -
PCBs 시험법실무해설서 3. PCBs 표준물질조제및관리 1. 목적 PCBs 분석에사용되는표준물질조제와관리에대하여표준화함으로써실험자간의 오차및물리적오차를최소화하여실험의정확성을기하고자한다. 2. 원리 PCBs 분석은방해성분이많고, 극미량의수준을분석함으로대상폴리염화비페닐 7종표준물질의탄소원소가동위원소로치환된표준물질을내부표준물질로사용하여정확하게정량하는방법으로다양한표준용액이존재함으로이들의정확한사용용도를이해하고정밀하게조제하여사용한다. 3. 적용범위 회수용표준물질, 내부표준물질, 정량용표준물질, 검량선작성용표준물질 4. 필요한시약및초자 1) 내부표준원액 : 13 C 12 동족체로된폴리염화비페닐 7종의내부표준품 2) 표준원액 : PCBs 7종 Standard - [ 표1] 참조 3) 노난 (Nonane) 4) Micro pippet, Micro Syringe(1000μl, 500μl, 100μl, 10μl ) 5) 15mL 갈색시약병 (15mL, vials with solid-top screw Caps) 5개 6) 알루미늄호일 1개 7) 종이와이퍼 1박스 - 6 -
5. 표준용액조제 1) 표준용액 : 폴리염화비페닐 7 종표준품을노난에녹여 1000 μg /ml 가되도록 한다 < 표 1>. 표 1. 분석대상폴리염화비페닐 (indicator PCBs 7 종 ) 의표준물질 동족체 IUPAC 번호 3 염화비페닐 2,4,4'-trichlorobiphenyl 28 4 염화비페닐 2,2,'5,5-tetrachlorobiphenyl 52 5 염화비페닐 6 염화비페닐 2,2',4,5,5'-pentachlorobiphenyl 101 2,3',4,4',5-pentachlorobiphenyl 118 2,2',3,4,4',5'-hexachlorobiphenyl 138 2,2',4,4',5,5'-hexachlorobiphenyl 153 7 염화비페닐 2,2',3,4,4',5,5'-heptachlorobiphenyl 180 2) 내부표준용액 : 13 C 12 동족체로된폴리염화비페닐 7종의내부표준품을노난에녹여 50 μg /ml 가되게한다. 3) 검량선작성용표준용액 : 표준용액과내부표준용액에노난을가해 < 표 2> 와같이표준용액을 5단계이상의농도범위 (0.1 ~ 5.0 μg /ml) 로조제한것을사용한다. 단, 검량선작성용표준용액들은직선성을유지하여야한다. - 7 -
표 2. 폴리염화비페닐의검량선작성용표준용액 ( 단위 : μg /ml) 표준액 IUPAC 번호 CS* 0.1 3 염화비페닐 4 염화비페닐 5 염화비페닐 6 염화비페닐 7 염화비페닐 CS 0.5 CS 1.0 CS 2.0 CS 5.0 28 0.1 0.5 1.0 2.0 5.0 28L* 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 52 0.1 0.5 1.0 2.0 5.0 52L* 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 101 0.1 0.5 1.0 2.0 5.0 118 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 101L* 0.1 0.5 1.0 2.0 5.0 118L* 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 138 0.1 0.5 1.0 2.0 5.0 153 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 138L* 0.1 0.5 1.0 2.0 5.0 153L* 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 180 0.1 0.5 1.0 2.0 5.0 180L* 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 CS* : 검량선작성용표준용액 (Calibration Standard Solution) L* : 동위원소로치환된 (Isotope Labeled Compound, 13 C 12 ) 내부표준물질 6. 표준물질관리 1) 구입된표준물질은냉장보관 (4 ) 한다. 2) 조제된표준물질은갈색표준물질보관병에담아냉장보관 (4 ) 한다. 단, 노난은냉장온도와실온간의온도변화에따른용매팽창이있을수있으므로반드시실험 30분전에사용하고자하는조제된표준물질을실온에방치한후실험에사용하여한다. - 8 -
7. 기타사항 1) 구입된표준물질은반드시구입날짜를기록한후관리한다. 2) 조제된표준물질은농도, 사용용매, 조제된날짜, 조제한실험자를반드시기록한다. 예 ) 1 표준품명 : PCBs 7종표준액 2 농도 : 5 μg / kg 3 사용용매 : 노난 (Nonane) 4 제조일자 : 2011. 5. 8 5 제조자 : 홍길동 - 9 -
PCBs 시험법실무해설서 4. PCBs 분석시료전처리방법 4.1. 분석개요도 (Flow chart) 1. 어류중 PCBs 분석개요도 (Flow chart) 시료 (10g) - 무수황산나트륨 50 170 g 으로혼합 - 수분제거를위해 30 분간방치 - 내부표준용액 LCS( 13 C-Labelled PCBs, 1 ppm) 100 μl첨가 추출 속실렛추출 ( 추출용매 =n-hexane:dichloromethane=1:3, 300mL) 18~24 시간 정제 - 다층칼럼크로마토그래피 - n-hexane 100 ml 로활성화 - 시료 loading 후 20 분간방치 - n-hexane 200 ml 로용출 sodium sulfate 2 g natural silica 2g acid silica 5 g natural silica 1g basic silica 3g natural silica 1g sodium sulfate 1g 농축 - 회전감압농축기로 5 ml 까지농축 - 노난을 1mL 첨가한바이알에옮겨질소농축기로 1 ml 까지농축 - 자연건조 GC / MSD 분석 < 어류중 7 PCBs 분석개요도 > - 10 -
PCBs 시험법실무해설서 4. PCBs 분석시료전처리방법 4.2. 검체처리 1. 목적 PCBs 분석시료에대한채취방법을표준화함으로써일관성있고대표성이있는시 료를채취하여 PCBs 실험에신뢰성을부여하고자한다. 2. 원리 PCBs 함량은시료부위별로다를수있으므로분쇄기를이용하여대상시료를 균질하게만든다음시험한다. 3. 대상 식품군분류는현행식품공전제3. 1. 28) 식품원재료에의함 1) 어류 : 갈치등 2) 패류 : 홍합등 3) 갑각류 : 새우등 4. 적용범위 가식부 5. 초자류 1) 분쇄기 : Meat chopper 2) 칼, 도마 3) 막자및막자사발 4) 스테인레스스틸쟁반 5) 시료보관용 box : 플라스틱재질로써 -30 까지보관가능한것 6) 킴와이프스 7) 시약스푼 : 30 cm, 여러개 ( 시료마다다른것을사용 ) - 11 -
8) 알루미늄호일 9) 초저온냉동고 (Deep freezer) 6. 방법 가. 채취시료기록구입대상시료는각각의식품종마다크기가상이함으로식품공전시료채취방법에따라식품종의일정크기를설정하여이에맞게구입한다. 1) 어류 - 갈치 : 전체길이통일 - 고등어 : 전체길이통일 - 건조멸치 : 전체길이대 중 소통일 2) 패류 - 홍합 : 전체모양중좌우최대길이통일 3) 갑각류 - 오징어 : 전체길이통일 나. 식품채취방법 1) 소형수산물 ( 몸무게약 500g미만의수산동물 ) : 무작위로 10마리를채취하여각각의가식부에서약 30g씩을취하여균질화한후이를검체로한다. 1마리의가식부가약 30g미만의경우가식부총량이약 300g에상당하는마리수를채취한다. 패류는소형수산물에준한다. 2) 중형수산물 ( 몸무게 500g이상 1.5kg미만의수산동물 ) : 무작위로 5마리를채취하여각각의가식부에서약 60g씩을취해이를검체로한다. 3) 대형수산물 ( 몸무게 1.5kg이상의수산동물 ) : 무작위로 3마리를채취하여각각의가식부에서약 100g씩을취해이를검체로한다. 다. 식품군별시료처리방법 1) 어류 : 고등어, 갈치등은머리, 지느러미, 뼈, 내장을제거하고가식부만 취하여분쇄기에넣어곱게간다. - 12 -
2) 패류 : 껍질을제거하고가식부만취한후철망위에올려놓고 1시간정도정치하여수분을제거한뒤칼로잘게다진다. 3) 갑각류 : 속뼈, 눈, 내장을제거하고가식부만취하여분쇄기에넣어곱게간다. 라. 시료처리후보관방법 1) 균질기로시료를미세하게균질화시킨후따로냉장보관한다. 가 ) 일부는수분함량실험을위해따로냉장보관한후즉시수분실험에착수한다. 나 ) 수분함량실험을제외한균질화된시료는동결건조한다. 2) 시료보관용 box(lock and lock) 에채취지역또는시료별로넣은후시료이름을명기한후냉동고또는 deep freezer(-25 ) 에분석전까지보관한다. 액상시료는사전세척, 건조한갈색유리용기에담아 sample name label을한후냉동고또는 deep freezer(-25 ) 에분석전까지보관한다. 마. Sample name label 표시방법 1) 채취지역명-어류명예 ) 서울가락시장-갈치 2) 시료채취날짜예 ) 2011.5.1 시료를즉시실험하는경우를제외하고시료는 -25 이하에서분석전까지 보관한다. - 13 -
PCBs 시험법실무해설서 4. PCBs 분석시료전처리방법 4.3 조지방추출 1. 목적 Soxhlet extraction 방법을이용하여식품중지방을추출하는방법을표준화하고 자한다. 2. 원리 PCBs는 lipophilic( 지용성 ) 특성이있으므로 PCBs를추출하기위해서는우선시료에서지방성분을추출하여야한다. 이때사용되는시료는주로비극성용매를사용하므로지방의추출효율을증진시키기위해서는시료중의수분함량을최소화시켜야한다. 3. 적용대상 어류 4. 필요한시약및기구 가. 시약 1) 디클로로메탄 (Methylene Chloride) 2) n-헥산 (n-hexane) 3) Pre-속실렛처리된무수황산나트륨 (Sodium sulfate, Anhydrous, PCB 분석용 ) Pre-속실렛처리된무수황산나트륨은순도가낮은무수황산나트륨의경우 PCBs에오염되거나불순물을포함할수있으므로비어있는속실렛장치에무수황산나트륨만넣어추출한다음건조하여만든다. 4) 표준물질 :Labeled Compound Stock Solution, 100ppb, 100μl ( 10) 5) 추출용매 : 디클로로메탄 n-헥산(3:1, v/v) 나. 초자및기구 1) 둥근바닥플라스크 500 ml, TS 24/40 10개 - 14 -
2) 냉각기 TS 55/50 10개 3) 속실렛추출기 : 윗부분TS 55/50, 아랫부분24/40 10개 4) 메스실린더 : 500 ml 1개 5) 마이크로실린지 HP 5182-3499, 10 μl 1개 5 μl 3개 6) 비커 100 ml 3개 250 ml 3개 7) 유리솜 Pre-속실렛한것 0.8 g 8) 원통여지 Pre-속실렛한것 43 123 mm 10개 9) 비등석약 0.5 g 10) Scoop : 30 cm 10개 11) 핀셋 : 30 cm 12개 12) 알루미늄호일 13) 실험노트 14) 저울 : Top loading balance(0.4~2100g) 15) 가열기 : Heating mantle(500ml용 ), 5개 16) 회전감압농축기 (Vacuum controller, Rotary Evaporator, Heating bath) < 속실렛추출기 > 5. 실험방법 1) 냉동된시료를실온에서완전히해동시킨다 ( 약 4시간소요 ). 2) 수기의무게를칭량하여 notebook에기록한다. 3) 실험대에알루미늄호일을광택이없는부분을위로하여깐후, 필요한초자를나열하여시료라벨을붙인다. 속실렛추출기와둥근바닥플라스크및냉각기는한 set로공시료, 시료및대조시료에구분하여사용한다. ( 예공시료는빨강색라벨, 시료는흰색라벨, 대조시료는파랑색라벨로표시한다.) - 15 -
교차오염을방지하기위해공시료, 시료, 대조시료용용기를구분사용한다. 4) 추출용매 ( 디클로로메탄 n-헥산 = 3:1, v/v) 3 L를만든다. 5) 둥근바닥플라스크마다비등석을약 0.5 g씩칭량하여넣고추출용매 300 ml를넣은후속실렛추출기와연결한다. 이때, 비등석의무게를실험노트에기록한다. 조지방함량을측정하기위해미리플라스크의무게를측정하여기록한다. 6) Pre-속실렛한무수황산나트륨적당량을알루미늄호일에칭량한다 ( 시료양의 4배정도, 50 170 g) 7) 균질화된시료약 10 g을막자사발에취한다. 시료가막자사발의벽에묻는것을방지하기위해무수황산나트륨을일부먼저넣은다음그위에시료를넣는다. 8) 무수황산나트륨을가하여막자로저어수분을제거한다음속실렛추출장치용원통형여지로옮긴다. 9) 핀셋을사용하여원통여지를속실렛추출기에넣고유리솜을원통여지의시료위에살짝얹고알루미늄호일로속실렛추출기의입구를덮는다. 9) 따로시료를넣지않은무수황산나트륨을공시료및대조시료로하여속실렛추출장치용원통형여지에넣고, 각각동일한농도의내부표준첨가용액을첨가한다.( 대조시료에는표준용액별도첨가 ) 10) 가열기의전원을켜고추출용매가끓기시작하면 1초당 1 2방울 (5cycle/hr) 이떨어지도록가열기 ( 온도조절기 ) 의온도눈금을맞춘다. 11) 속실렛추출장치를이용하여추출용매 300 ml로 18~24 시간동안시간당 3~4 번의환류속도로추출한다. 12) 추출이끝나면가열기의전원을끄고실온으로냉각시킨다. 13) 만질수있을정도로완전히식으면 Cool flow를끄고냉각기를분리한다. 속실렛추출기와둥근바닥플라스크냉각기의물기를완전히제거한후속실렛추출기와둥근바닥플라스크를냉각기로부터분리한다. 14) 각기다른핀셋으로원통여지를꺼낸다. 15) 속실렛추출기를기울여남아있는추출액을둥근바닥플라스크에잘따른다. 16) 속실렛추출기와둥근바닥플라스크를분리한다. 17) 농축전까지둥근바닥플라스크의입구를알루미늄호일로덮어둔다. 18) 추출액을 35 이하의수욕상에서 10 ml까지감압농축한후질소농축기를이용하여농축하여조지방을측정한다. - 16 -
나중무게에서처음에기록해놓은플라스크의무게를차감하여조지방 함량을측정한다. < 회전감압농축기 > - 17 -
PCBs 시험법실무해설서 4. PCBs 분석시료전처리방법 4.4. 회전감압농축기를이용한농축 1. 목적 지방추출후의용매제거를위한회전감압농축과정을표준화하고자한다. 2. 원리 PCB 28 등저염소 PCBs의경우고염소 PCBs와비교하여끓는점이상대적으로낮아용매를모두제거할경우저염소 PCBs의회수율이감소될수있으므로모든용매를제거하지않고일정양의용매를남김으로써보다회수율손실을방지할수있다. 3. 적용대상 추출이끝난용매 4. 필요한시약및기구 1) 회전감압농축기 (Vacuum Controller, Rotary evaporator, Heating bath) 2) 냉각기 5. 실험방법 1) 냉각기의온도를 4 가되도록미리기기를 ON 한다. 2) Heating bath에물을적당량채우고온도가 35 가되도록한다. 3) Glass assembly에 receiving flask를연결하고 trap에 flask를 adapter로고정시켜 rotation drive에연결한다.(flask를 rotary evaporator에연결 ) 4) 수기가 heating bath에적당히잠기도록조절하고 120 rpm(200 mb) 으로맞춘뒤 vacuum controller의압력을 0.08 MPa가되게하여회전감압농축기를 on 시켜서농축을시작한다. 5) 수시플라스크에용액이약 2 ml 남으면 quick-action jack을올려 flask를원위치시킨뒤 rotation drive에서분리시키고, flask입구를호일로덮어둔다. - 18 -
PCBs 시험법실무해설서 4. PCBs 분석시료전처리방법 4.5. 지방함량의측정 1. 목적 시료의지방함량을측정하기위한과정을표준화하고자한다. 2. 적용대상 Soxhlet extraction 등추출을끝내고회전감압농축과정을마친시료 3. 원리 어류중 PCBs의기준 규격은생물무게 (Fresh weight) 을기준으로측정하게되어있으나시료의지방함량은타시료와의오염도비교등유용하게사용됨으로조지방을측정한다. 4. 필요한시약및기구 1) 아세톤 (Acetone) : 30mL 80mL 2) 팁 : 200 μl 3) 킴텍스 4) 타이머 5) 저울 (Top loading balance; 0.4~2,100g) 6) 질소농축기 5. 실험방법 1) 질소농축기에새로운팁을끼운다. 2) 회전감압농축이끝난시료를질소농축기 (bomb: 30psi) 1.5psi로 20분간농축한후 30분간데시케이터안에보관한후칭량한다. 이동작을항량될때까지반복한다. ( 건조전후의칭량차가 0.1% 이하를항량으로한다.) 이때질소농축과정에서발생한수기표면의수증기등수기의무게를변화시 - 19 -
킬수있는이물질은아세톤으로잘닦아제거한후무게를측정한다. 3) 항량을다음의식에따라정확히계산하여실험노트에기록한다. 지방함량 (%) = 항량 (g) - ( 수기 + 비등석 )(g) 시료무게 (g) 100-20 -
PCBs 시험법실무해설서 4. PCBs 분석시료전처리방법 4.6. 산성실리카겔을이용한지방분해 1. 목적 PCBs 분석을위한시료전처리시분석방해물질특히지방성분을분해하기위한과정을표준화하고자한다. 2. 원리 PCBs 분석을위해추출한조지방은기기분석시방해물질로작용할수있으므로황산등을사용하여산분해시켜줄수있다. 특히실리카겔에미리산을결합시켜사용함으로서위험물질인황산을보다안전하게조작할수있다. 3. 적용대상 농축을마친용액 4. 필요한시약및기구 가. 시약 1) 산성실리카겔 300 800 g 2) n-헥산 (n-hexane) 1.8 2.0 L 3) Pre-속실렛이된무수황산나트륨 200 g 나. 초자및기구 1) 농축용둥근바닥플라스크 TS 24/40, 250 ml 10개 2) 분액여두 250 ml 10개 3) 유리깔때기 OD 90 mm 10개 4) 트랩 250 ml 3개 5) Scoop: 12 ml 1개 6) 파스퇴르피펫 9"(229 mm) 20개 7) Pre-Soxhlet된유리솜 0.7 g 8) 핀셋 30 cm 2개 - 21 -
9) 알루미늄호일 10) 회전감압농축기 11) 초음파추출기 12) 타이머 5. 실험방법 1) 후드안의격자에분액여두 10개를장착한다. 2) 분액여두와수기에시료라벨을각각붙인다. 3) 농축용수기위에유리깔때기를얹고분액여두와유리깔때기에유리솜을무수황산나트륨이빠져나오지않을정도로적당량넣고무수황산나트륨 20 g 을넣는다. 4) 유리깔때기는알루미늄호일로막아두고분액여두에시료의지방 1 g당산성실리카겔 10 g을넣고표면이수평이되도록한다. 시료의지방함량이 3 g 미만일때에는 30 g을사용하도록한다. 5) 파스퇴르피펫을사용하여 n-헥산 3 ml로실리카겔표면을적셔준다. 6) 시료에 n-헥산 3 ml ( 지방이많을경우 6~9 ml) 를넣고충분히초음파추출 (40 ) 한다음분액여두에시료가묻지않도록실리카겔표면에넓게주입한다. 이러한조작을두번더반복한다. 7) n-헥산 10 ml로플라스크를충분히세척하여초음파추출 (40 ) 한다음실리카겔표면에주입하여 20분간반응시킨후 n-헥산 130 ml를가한다.( 산성실리카겔을 60 g 이상사용하였을경우에는 n-헥산 150 ml를가하도록한다.) 8) n-헥산이 1방울 / 초의속도로떨어지도록분액여두의 stopcock을열고유리깔때기의무수황산나트륨을통과시켜수기에받는다. 9) n-헥산이모두유출되면 stopcock을완전히열고 n-헥산 10 ml로분액여두의표면과유리깔때기및무수황산나트륨의표면을충분히적신다음세척한다. 10) 회전감압농축기 (30, 120 rpm, 냉각수 4, 190 mb) 로시료가끓지않도록주의하면서농축한다 ( 약15분 ). 용매를약 5mL 남긴다. - 22 -
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PCBs 시험법실무해설서 4. PCBs 분석시료전처리방법 4.7. 다층실리카겔칼럼에의한정제 1. 목적 PCBs 분석을위한용액의전처리시정제를하기위한다층실리카겔칼럼을만드 는방법을표준화하고자한다. 2. 원리 중성실리카겔, 산성실리카겔, 염기성실리카겔이동시에충진된다층칼럼크로마토그 래피를사용하여다양한불순물을한번에정제할수있도록한다. 3. 적용대상 지방분해를마친용액 4. 필요한시약및기구 가. 시약 1) 용매세척된실리카겔 200 g 2) 산성실리카겔 3) 염기성실리카겔 4) n-헥산 (n-hexane, PCBs 용 ), 3 L 5) Pre-속실렛이된무수황산나트륨 70 g 나. 초자및기구 1) 농축용둥근바닥플라스크 TS 24/40, 250 ml 10개 2) 분액여두 250 ml 10개 3) 유리깔때기 OD 90 mm 10개 4) 트랩 250 ml 3개 5) Scoop: 12 ml 1개 - 24 -
6) 파스퇴르피펫 9"(229 mm) 20개 9) Pre-Soxhlet된유리솜 0.7 g 10) 핀셋 30 cm 2개 12) 알루미늄호일 13) 회전감압농축기 14) 초음파추출기 5. 실험방법 1) 유리여과판 (glass frit) 이장착되거나또는유리섬유를충진한칼럼을수직이되도록고정시키고 stopcock을잠근다. 2) 다층실리카겔칼럼 1) : 칼럼안에아래부터 1g 무수황산나트륨 ; 1 g 중성실리카겔 ; 3 g 염기성실리카겔 ; 1 g 중성실리카겔 ; 5 g 산성실리카겔 ; 2 g 중성실리카겔 ; 2 g 무수황산나트륨순서대로채운다. 이때에먼저넣은실리카겔층이충분히충진된후다음층을넣는다. 각층의충진물질의표면이일수평이되도록한다. 시료의상태에따라같은비율로양을증가시켜사용할수있다. 무수황산나트륨 2g 중성실리카겔 2g 산성실리카겔 5g 중성실리카겔 1g 염기성실리카겔 3g 중성실리카겔 1g 무수황산나트륨 1g < 다층실리카겔칼럼 > 3) n- 헥산 100 ml 를넣어다층크로마토그래피칼럼을활성화시킨다. 4) 코크를열어 n- 헥산이무수황산나트륨위로 0.5 cm 높이까지되도록헥산을 1) 황산처리와실리카겔칼럼을동시에할수있는방법이다. 일반적으로가장많이사용되는방법이며황산처리를한후사용되기도한다. - 25 -
흘린다. 코크를닫고 250 ml 플라스크를칼럼아래에둔다. 5) 농축된시료를 1회용파스퇴르피펫을이용하여칼럼내벽에묻지않게조심해서무수황산나트륨층과근접한거리에서넣어준다. 코크를열어 1초에한방울의속도로용출시킨다. 6) 시료가있었던용기에 6~7 ml 헥산을넣어용기를헹군세척액을칼럼에넣는다. 이과정을두차례더반복한다. 칼럼에넣을때각세척액이충분히칼럼을통과하면상층이마르기전에다음세척액을넣는다. 7) 130 ml의 n-헥산을시료가있었던용기에넣고잘흔들어준다. 사용하던피펫은용기안의 n-헥산으로여러번세척한후이세척액을칼럼에넣는다. 8) 시료의용출이모두끝난후산성실리카겔층의색이전부검게변하면새로운다층실리카겔칼럼을만들어정제과정을반복한다. 만약이를무시하고실리카겔칼럼을다시거치지않으면, 기체크로마토그래피기기분석에서피크분리가잘되지않는다. 이런경우, 농축된극소량의시료에다시 n-헥산을넣어실리카겔칼럼을거쳐야하는번거로움이발생한다. 그러나산성실리카겔층의색이일부분만변하면반복하지않아도된다. - 26 -
PCBs 시험법실무해설서 4. PCBs 분석시료전처리방법 4.8. 질소농축기를이용한농축 1. 목적 정제후시료의질소농축과정을표준화하고자한다. 2. 원리 질소농축시농축할바이알에미리끓는점이높은노난을일정량첨가하여 PCBs 가 증발되는것을방지한다. 3. 적용대상 회전감압농축후정제를마친용액 4. 필요한시약및기구 가. 시약 1) n-헥산 (n-hexane) 2) 노난 (Nonane) 3) 실린지첨가용내부표준물질 (ISS) 나. 초자및기구 1) PCBs 분석용바이알 2) 비커 50mL 3) 마이크로피펫 200μl 4) 마이크로피펫용팁 5) 랙 6) 실린지 10μl 7) 킴와이프스 8) 질소농축기또는 Torbo-Vap 9) Vortex mixer - 27 -
5. 실험방법 1) Torbo-Vap을이용하여 40, 7~9 psi에서 0.5mL까지농축한다.( 약 70분 ) 2) 질소농축기의질소유출대에시료와동일하게이름표를붙이고마이크로피펫팁을끼운후미리노난을 1 ml 첨가한바이알을장착한다. 3) 농축된시료를마이크로피펫을사용하여 ( 시료라벨확인 ) 바이알로옮긴다. 4) 팁끝부분이바이알의입구에걸칠정도의깊이가되도록질소유출대를내리고, 시료가흔들리지않도록질소를완만하게주입하면서농축한다. (45, 1 psi, 30 psi) 5) 마이크로피펫을이용하여헥산 200 μl로 Turbo Vap Tube를세척하여바이알에조심스럽게옮기면서완전히농축한다. 1회더반복한다. 6) 농축이끝나면바이알외벽에맺힌수증기를깨끗이닦아낸후랙에옮기고시료라벨을표시한다. 7) 최종적으로마이크로피펫을이용하여헥산 200 μl를넣어주어전용캐비넷안에서자연건조시킨다. 8) 다음날바이알의노난을제외한용매가모두휘발되면 Vortex Mixer로잘혼합하여 GC/MS로분석한다. 9) 만일농축후그다음날기기분석이어려울경우마개만하여보관해두고분석전에이를다시마개를제거한후내부표준용액을각각첨가한후분석한다. - 28 -
PCBs 시험법실무해설서 5. 분석기기사용법 5.1. Method 작성 1. 목적 식품중어류에서염화비닐비페닐의정확한분리를위하여기기조건을명기한다. 보유하고있는 GC 의종류및버전에따라다를수있음 2. 작동순서 1) Method Edit entire method를선택하여분석조건을설정한다. 2) Injector : Volume을 1.0으로설정한다. 3) Inlets : Mode를 splitless, gas를 He, heater를 280 C로맞춰준다. 4) Columns : Mode를 constant flow, detector를 MSD, flow를 1 ml/min로설정한다. 5) Oven : 칼럼의초기온도를 100 로설정후 ramp 1에 15 /min, 200, 3 min, ramp 2에 2 /min, 250, 5 min을각각입력후 post run에 300, 3 min을입력한다. 6) Aux : Heater의 set point에 300 을입력한후 type 을 MSD 로바꾸어준다. 7) Instrument MS temperatures로가서 MS Source 와 MS Quad를각각 250, 180으로맞춰준다. < GC-MSD > - 29 -
3. 기기분석조건 1 Instrument 2 Column type 3 Injection type and temperature Splitless/280 Agilent Technologies 6890N/5975 MSD HP-5MS 30 m x 0.25 mm I.D. x 0.25 µm film 4 Column temperature program 5 Carrier gas 100 200 (15 /min, hold 3min) 250 (2 /min, hold 5min) 300 (5 /min, hold 3min) Helium (1.0 ml/minute) 6 Injection volume 1µL 7 Solvent delay 3 min. 8 MS Source temperature 250 9 MS Quadrupole temperature 180 10 MS Mode SIM(Selected Ion Monitoring) < Column temperature program > < Parameter > - 30 -
4. 특성이온 표 1. 대상물질및이온세기의이론비 동족체 3염화비페닐 4염화비페닐 5염화비페닐 6염화비페닐 7염화비페닐 IUPAC Number 특성이온 M + (M+2) + (M+4) + 28 256.0 258.0 28L * 268.0 270.0 52 289.9 291.9 52L * 301.9 303.9 101 325.9 327.9 118 325.9 327.9 101L * 337.9 339.9 118L * 337.9 339.9 138 359.8 361.8 153 359.8 361.8 138L * 371.8 373.8 153L * 371.8 373.8 180 393.8 395.8 180L * 405.8 407.8 이론비 (M + /(M+2) + 또는 (M+2) + /(M+4) + 1.02 0.77 1.53 1.23 1.02 L * : 동위원소로치환된 (Labeled Compound, 13 C 12 ) 내부표준물질 1) 위의조건에서얻어진시험용액의크로마토그램상의각피크를표준용액의표준물질및내부표준물질피크의머무름시간과비교할때일치하여야하며, 측정한선택이온 2개의이온세기비율 (M/M+2 혹은 M+2/M+4) 은 < 표 1> 에나타난이론비에대하여 ±20% 이내이어야한다. 2) 머무름시간 (retention time) 확인및그룹화 (grouping) 조건확립 : 분석하고자하는목적에따라검량선작성표준물질이나시료를이용하여분석대상물질의머무름시간을확인한다음, 이를토대로그룹화시간및그룹화개수등을정한다. 사이클시간은각선택이온들의거주시간 (dwell time) 의합과각선택이온들사이를이동하는시간 (shift time) 의합을더한값이다. 1회사이클시간은 1초이내로한다. 3) 질량검정 : 질량분석기의질량검정은주로 PFTBA(perfluorotributylamine) 를사용하며사용하는기종에따라기준이되는값을만족하여야한다.( 예, m/z 69 (100%), m/z 219 (>50%), m/z 502 (>3%) 등 ) - 31 -
PCBs 시험법실무해설서 5. 분석기기사용법 5.2. Data 분석 1. 목적 분석한시료에대한정성, 정량방법을표준화하고자한다. 2. 작동순서 [Data 분석방법 ] 1) 분석한 Data file을불러온다. 2) Chromatogram Extracted ion chromatogram 으로가서 PCBs의질량과내부표준물질의질량값을입력한다. 3) Chromatogram Auto integrate 눌러준다. 4) Chromatogram Percent Report를눌러주면각피크에대하여면적값이표기가된다. [ 정성시험 ] 1) 질량분석피크가 < 표 1> 에제시된선택이온질량및이론적동위원소이온비와일치하여야한다. 2) 각이온의 m/z 값에해당하는모든 PCBs의크로마토그램피크에대한신호대잡신호의비 (signal-to-noise ratio; S/N) 가시료의경우 3 이상, 정량용표준물질에대해서는모든 PCBs의 S/N 비가 10 이상이되어야한다. - 32 -
표 1. 염소원자수에의한이론적동위원소이온비 염소원자 m/z Theoretical ratio Control limits for Isotope Ratio 1 M/M+2 3.13 2.66 3.60 2 M/M+2 1.56 1.33 1.79 3 M/M+2 1.04 0.88 1.20 4 M/M+2 0.77 0.65 0.89 5 M+2/M+4 1.55 1.32 1.78 6 M+2/M+4 1.24 1.05 1.43 7 M+2/M+4 1.05 0.89 1.21 8 M+2/M+4 0.89 0.76 1.02 9 M+2/M+4 0.77 0.65 0.89 10 M+4/M+6 1.16 0.99 1.33 3) 측정한두개의선택이온피크의면적비가표의범위안에들거나검량선작성시중앙점 (CS 3 ) 에서의동위체면적비에대하여 ±15% 이내에있어야한다. 4) 이성질체피크가겹쳐 (overlap) 나타나고방해물질이존재할수있기때문에위의기준을모두만족시키지못하거나, 고염화물에서염소가한개이상떨어져나와같은머무름시간에검출되면저염화물의농도가과대평가되어잘못된농도를보고할수있다. 이와같이정성을하기가모호한경우숙련된분석자의판단으로 PCBs가존재하는지아닌지를판단하여야한다. 5) 모든 PCBs들은위의기준을모두만족해야한다. 만약위의조건을모두만족시키지못할경우 PCBs로보고해서는안된다. 만약방해물질로인하여정성이어려울경우남은시료를재추출하여정제과정을더거친후에다시분석해야한다. - 33 -
[ 정량시험 ] 검량선작성용표준용액의각각표준물질의피크면적 (A S ) 과내부표준물질피크면적 (A IS ) 에대한비 [A S /A IS ] 를 Y 축으로하고표준물질의농도를 X 축으로하여검량곡선을작성하고, 시험용액에서얻어진폴리염화비페닐의피크면적과내부표준물질의면적비 [A SAM /A SAMIS ] 를 Y축에대입하여각각의폴리염화비페닐농도를계산한후 7종의폴리염화비페닐 7종의합을폴리염화비페닐 7종 (indicator PCBs 7 종 ) 농도로한다. 1) PCBs의정량은추출전시료에첨가한동위원소 ( 13 C 12 ) 치환체내부표준물질을이용한상대검량선법을이용한다. 13 C 12 치환체 PCBs와시료중의 PCBs가추출, 정제과정및기체크로마토그래피에서유사한특성을나타내므로시료추출전, 농도를알고있는 13 C 12 치환된 PCBs를포함한내부표준물질을첨가함으로써분석과정에서발생할수있는손실을고려하여농도를구할수있다. 2) 시료중의분석대상물질의농도는아래식에의해구한다. 폴리염화비페닐농도 (C, ng/g) = P V Ms P V Ms : 검량선에서구한폴리염화비페닐농도 (ng/ml) : 최종부피 (ml) : 시료채취량 (g) 폴리염화비페닐 7 종농도 (ng/g) = C i C i : i 동족체의폴리염화비페닐의농도 (i = PCB 28, 52, 101, 118, 138, 153, 180) - 34 -
식품중폴리염화비페닐시험법 실무해설서 2011 년 8 월일인쇄 2011 년 8 월일발행 발행인김승희 편집위원장 이광호 편집위원 김미혜, 서정혁, 박성국, 백옥진 강영운, 이준구, 최훈, 이준배 도움을주신분 발행처 한국기초과학지원연구원서정주식품의약품안전평가원 363-951 충북청원군강외면오송생명2로 187 전화 043-719-4251, 전송 043-719-4250