Polymer(Korea), Vol. 32, No. 1, pp 26-30, 2008 조직공학적바이오디스크의섬유륜재생을위한지지체특성평가 하현정ㆍ김순희ㆍ윤선중ㆍ박상욱ㆍ소정원ㆍ김문석 ㆍ이종문ㆍ강길선 ㆍ이해방 전북대학교고분자 BIN 융합연구팀, 한국화학연구원융합바이오연구센터 (2007년 8월 1일접수, 2007년 10월 23일채택 ) Evaluation of Various for Tissue Engineered Biodisc Using Annulus Fibrosus Cells Hyun Jung Ha, Soon Hee Kim, Sun Jung Yoon, Sang Wook Park, Jung Won So, John M. Rhee, Moon Suk Kim, Gilson Khang, and Hai Bang Lee BK-21 Polymer BIN Fusion Research Team, Chonbuk National University, 644-14, Dukjin, Jeonju 561-756, Korea Nanobiomaterials Lab, Korea Research Institute of Chemical Technology, P.O.Box 107, Yuseong, Daejeon 305-600, Korea (Received August 1, 2007; Accepted October 23, 2007) 초록 : 추간판디스크의섬유륜 (AF) 조직재생에적합한다양한담체를평가하기위해천연재료인소장점막하조직 (SIS) 과탈미네랄화된골분 (DBP) 을폴리 ( 락타이드-글리콜라이드 ) 공중합체 (PLGA) 와혼합하여담체 (PLGA/SIS, PLGA/DBP, PLGA/SIS/DBP) 를제조하였으며, PLGA 담체, PGA 메쉬, SIS 스폰지와비교하였다. 제조된담체의압축강도및 AF 세포를담체에파종하여콜라겐양과 DNA 량을측정하였으며, 이를누드마우스피하에이식후적출하여육안관찰과조직학적인평가를수행하였다. 압축강도측정에서 PLGA 와유사하게 PLGA/SIS, PLGA/DBP 에서도충분한강도를나타내었다. DNA 증가량에따른콜라겐양은 PLGA/SIS 에서가장높게나타났고, 면역화학염색을통해 PLGA/SIS, PLGA/SIS/DBP 에서글라이코스아미노글라이칸과콜라겐발현량이높음을확인하였다. Abstract: This study was designed to investigate the effect of hybridization of synthetic/natural materials for annulus fibrosus (AF) tissue regeneration in vitro and in vivo. The synthetic/natural hybrid scaffolds were prepared using PLGA (poly(lactic-co-glycolic) acid), SIS (small intestinal submucosa) and DBP (demineralized bone particles). PLGA, PLGA/SIS(20%), PLGA/DBP(20%) and PLGA/SIS (10%)/DBP(10%) scaffold were manufactured by solvent casting/salt leaching method. Compressive strength was measured. Rabbit AF cells were isolated, cultured and seeded into experimental groups. Hydroxyproline production and DNA quantity of AF cells on each scaffold was measured at 2, 4 and 6 weeks after in vitro culture. Cell-scaffold composites were implanted subcutaneously into athymic mice. After 1, 4 and 6 weeks postoperatively, specimens were taken and H&E, Safranin-O and type I collagen staining were carried out concerning formation of cartilagenous tissue. In vitro PLGA/SIS scaffold was evaluated for total collagen content(hydroxyproline/dna content) and PLGA scaffold was evaluated for compressive strength. Keywords: intervertebral disc regeneration, tissue engineering, natural-synthetic hybrid materials, annulus fibrosus cell, small intestinal submucosa. 서 요통은매우흔한증상으로약 80% 의사람이일생동안한번이 라도요통을경험하게된다고알려져있는데이중약 5% 의환자는만성적인요통에시달리게된다. 만성적인요통은여러가지원인에의해서발생할수있으며추간판 (IVD) 에의해발생하는경우는약 론 To whom correspondence should be addressed. E-mail: gskhang@chonbuk.ac.kr 40% 로요통의주된원인으로알려져있다. 1-4 대부분의환자는진통제및물리치료등보존적인요법에의해호전되지만이러한노력에도호전되지않고계속증상이지속되거나악화되는환자에대해서는수술적인요법이고려되고있다. 수술적요법에는추간판절제술, 척추융합술및추간판치환술등이있으나퇴행성변화가심하여골융합술을시행하는경우주위분절의퇴행성변화를가중시킬뿐아니라수술로인한합병증의가능성도높은것이사실이다. 이들의한계를극복하기위하여조직공학적추간판재생에대한연구가시작되었다. 5 생체조직공학이란생체에서완전히흡수되고세포와친 26
조직공학적바이오디스크의섬유륜재생을위한지지체특성평가 27 화력이있는생분해성고분자지지체와세포를체내에이식함으로써새로운실질적인조직을형성하게하는일련의기법이다. 추간판재생을위한지지체의재료로는폴리글리콜산 (PGA), 폴리락트산 (PLA), 그리고이들의락타이드글리콜라이드공중합체 (PLGA) 와같은 α-hydroxy acid 류가쓰이는데이들은미국식품의약품안전국에의해임상용으로승인된유일한합성고분자이며, 생체내에서분해되는물질로서뛰어난생체적합성을가지며분해속도를조절할수있는장점을가지기때문에생분해성다공성지지체로사용된다. 그러나 PLGA 가조직공학적추간판제조에이용되기위해서는 PLGA 에새로운기능성이좀더부여되어야한다. PLGA 의소수성은세포, 조직, 그리고혈액적합성에좋지않은영향을끼치게되며 PLGA 자체만으로는특정세포를원하는조직으로분화시킬수없다. 따라서이러한 PLGA 에친수성을가지고신경성장인자, 변환성장인자등과같은싸이토카인을함유하고있는천연재료를적용함으로써세포의증식과분화를유도하고조직합성을증가시킬수있다. 6-8 이러한세포적합성밎조직적합성을개선할생체재료로서돼지유래소장점막하조직 (small intestinal submucosa, SIS) 은다량의신생혈관성장을지원하고근골격구조체, 피부, 인체벽, 뇌경막, 방광, 그리고혈관을포함하는여러신체조직의구조적재형성을위한담체로유용하며파이브로넥틴, 헤파린, 콜라겐 (I, III, IV, V, 및 VI형 ), 섬유아세포성장인자 (bfgf) 와혈관내피세포성장인자 (VEGF) 를포함하는세포외기질로구성되어있다. 9,10 천연유래생체활성물질인탈미네랄화된골분 (demineralized bone particle, DBP) 은새로운뼈의성장에강력한유도체로작용한다. DBP 는뼈형성단백질 (BMP) 과같은골및연골형성사이토카인을함유하고있으며골결손부위에충전제로서임상적으로널리사용되고있다. 본연구에서는조직공학적방법으로조직적합성을향상시킬수있도록상기의생체재료가포함된 PLGA/SIS, PLGA/DBP, PLGA/ SIS/DBP, SIS 스폰지및 PGA 부직포에토끼의 AF3 세포를이식하였으며지지체에대한평가는 in vitro 에서생화학적평가와기계적물성평가를실시하였고, in vivo에서조직학적평가를실시하여제조된지지체내에서디스크 AF 조직의재생가능성을평가하였다. 11,12 실험 시약및재료. PLGA( 락타이드 / 글리콜라이드몰비, 75/25, Resomer RG 756, Boehringer Ingelheim Chem. Co. Ltd., Germany) 는평균분자량이 90000 g/mole인것을사용하였다. 또한염화나트륨 (NaCl, Orient Chem. Co. Ltd., Korea) 은다공생성물질로사용하였는데, 분자체를사용하여입자크기를 180 250 μm 으로조절하였다. DBP 는 Urist 방법, SIS 는 Badylak 방법으로분리하였으며동결건조후동결분쇄기 (Metuchen, USA) 를이용하여입자의크기가 180 μm 이하가되도록동결분쇄하였다. 13,14 메틸렌클로라이드 (MC, Tedia Co. Inc., USA) 및이외의모든유기용매류는 HPLC 등급을사용하였다. PGA 는밀도 53.3 mg/cc, 두께 3.1 mm 의상용화된제품 (Albany International Research Co., NY, USA) 을구입하여가로 5 mm, 세로 5 mm의부직포로잘라서사용하였다. 용매캐스팅 / 염추출법을이용한지지체의제조. 본실험에사용한 Table 1. Various by means of the Solvent Casting/Salt Leaching Size of NaCl Volume of PLGA to NaCl (w/w) Content of SIS (wt%) Content of DBP(wt%) PL 10 - - PS 10 20-180 250 μm PD 10-20 10 10 10 천연 / 합성하이브리드담체는용매캐스팅 / 염추출법을이용하여제조하였다. 15 이를간단히설명하면 1 g의 PLGA 를 4 ml의 MC에용해하고실험에사용한생체재료인 SIS 및 DBP 는각실험군마다 PLGA 양의 20 wt% 가되도록첨가하여혼합용액을제조하였으며여기에다공형성물질인 NaCl 을 PLGA 의 10배가되는양을첨가하였다 (Table 1). 직경 5 mm, 높이 5 mm 크기의실리콘몰드에넣은후프레스를이용하여상온에서 60 kgf/cm 2 의압력으로 24 시간동안가압하였다. 제조된지지체는 3차증류수에서 48 시간동안 6시간마다교체함으로써 NaCl 을추출하였으며 8 mm Torr, -80 조건에서 48시간동안동결건조하였다. 여기서 SIS 가함유된 PLGA 지지체를 PLGA/SIS, DBP 가함유된것을 PLGA/ DBP 그리고 SIS 와 DBP 가함유된것을 PLGA/SIS/DBP 로명칭하였다. 기계적강도측정. 지지체의압축강도를측정하기위하여 universal testing machine(instron, model 8872, Darmstadt, Germany) 을사용하였다. 압축강도는 0.5 mm/min의속도로측정하였다. 16,17 섬유륜세포의분리및배양. 초대배양 AF 세포는생후 6주된뉴질랜드화이트토끼의 L1 L5 척추마디로부터분리하였다. 무균술식을통하여추간판으로부터 NP( 수핵 ) 조직과 AF( 수륜 ) 조직을따로분리하였다. 분리한 AF 조직은인산완충식염수로수회세척하였고, 이를 0.25 wt% 의콜라게네이즈 A(Roche, Indianapolis, USA) 로 6시간인큐베이션하였다. 콜라게네이즈를처리한조직은 100 μm 메쉬 (Falcon, USA) 를이용하여거르고, 이를 Ham's F12(Gibco BRL USA) 45%, Dulbecco's Modified Eagles Medium(Gibco BRL) 45%, FBS(Gibco BRL) 10% 및페니실린 -스트렙토마이신 1%(Gibco BRL) 이함유된배양액으로현탁액을만든후세포배양플라스크에분주하여 37, 5% CO 2 조건에서배양하였다. 이때 2 일에한번새로운배양액으로교체시켜주었다. AF 세포를계대배양 3회째까지실시하여충분한세포수를확보하였다. 생화학적분석. In vitro 상에서 AF 세포가파종된여섯가지지지체의히드록시프롤린의농도와 DNA 의양을측정하기위해서 AF3 세포를 2 10 5 세포 / 지지체농도로분주하였고이틀에한번씩새로운배양액으로교체하였다. 히드록시프롤린의농도를측정하기위하여 2주, 4주및 6주후에지지체를획득하여 4N HCl 을 400 μl 를넣고 120 로가열하여수화시킨후최종농도가 4 N이되도록동량의수산화나트륨을넣고 120 로반응시켰다. Chloraminet T Reagent(Sigma) 400 μl를첨가하고 25분동안방치시킨후 Enrlich's reagent(sigma) 를 500 μl 씩튜브에넣고 65 오븐에서 20 분동안반응시켰다. 그후, 96 웰에반응액을 100 μl 씩넣고, Polymer(Korea), Vol. 32, No. 1, 2008
28 하현정 ᆞ 김순희 ᆞ 윤선중 ᆞ 박상욱 ᆞ 소정원 ᆞ 김문석 ᆞ 이종문 ᆞ 강길선 ᆞ 이해방 Emax precision 마이크로플레이터리더 (Molecular Devices) 로 570 nm에서흡광도를측정하였다. 세포를파종한뒤 2주째에지지체를채취해 DNA 의양을측정하기위하여 axyprep TM multisoure genomic DNA miniprep kit(axygen Scientific, Inc. Union, USA) 로 DNA를분리하였고 spectrophotometer(biorad USA) 로정량하였다. 육안관찰. 생후 4주된면역결핍쥐 (BALB/c-nu mice, female, Jung-Ang Lab. Animal. Co., Korea) 의등쪽부분을 2 3 cm 절개하고 AF3 세포를 2 10 5 세포 / 지지체농도로파종시킨지지체를이식하였다. 이식후 1, 4 및 6주후에지지체를적출하여지지체의형태를관찰하였다 (Canon Powershot G6, Japan). 조직학적분석. In vivo 에서조직공학적바이오디스크로서의가능성을관찰하기위하여면역결핍쥐를이용하여실험하였다. 이식한지 1주및 4주후에각각의다양한지지체를적출하여 10% 의포르말린에고정하였으며, 고정된지지체를파라핀블록으로제작한후 4 μm로잘라코팅된슬라이드에부착하여 H&E, Safranin-O, Masson's trichrome 염색과제 I형교원질의확인을위한면역조직화학적염색을시행하였다. 현미경사진 (Nikon TE-2000, Japan) 은 150 배에서촬영하였다. 18-20 통계적분석. 각실험군들의평균값과표준편차를확인하였으며, 통계학적인분석은 Student's t-test 를수행하였다. 결과값이 P<0.05 일때충분한유의성을갖는것을기준으로하였다. 결과및토론 제조된지지체의기계적강도측정. AF 재생을위한생분해성고분자와천연재료로제조된지지체에대한기계적물성평가를위하여압축강도를측정하였다. 여타의재료가포함되지않은 PLGA 지지체의압축강도는 4.3±0.84 MPa 로써가장높은강도를보였으며, PLGA/SIS 의압축강도는 3.23±0.92 MPa, PLGA/DBP 의압축강도는 3.7±1.21 MPa, PLGA/SIS/DBP 의압축강도는 2.8 ±0.04 MPa, SIS 스폰지의압축강도는 0.09±0.01 MPa 그리고 PGA 부직포의압축강도는 0.08±0.03 MPa 이었다 (Figure 1). AF 조직은추간판에서 NP 조직을둘러싸고있는구조로자세에따라변하는추간판내의압력을유지시켜주는역할을하게된다. 사람이 20 kg 무게의물건을들어올릴때척추는물건을들어올리는사람체중의약 300% 의압력을받게된다. AF 조직의섬유질은 NP 조직안의유체에의해발생하는압력을지탱하는것과동시에상당한양의압축응력을전달한다. 21 본실험에서 SIS 스폰지와합성 PGA 부직포지지체의강도는 PLGA, PLGA/SIS, PLGA/ DBP 그리고 PLGA/ SIS/DBP 지지체에비해상당히낮은결과를보였으며, PLGA 지지체와 SIS 또는 DBP 를함유한 PLGA 지지체사이에통계적으로유의한압축강도의차이는없었다. 본실험에서사용한 SIS 또는 DBP 등의천연재료를함유한 PLGA 지지체는 PLGA 가부여하는압축강도와천연재료가부여하는생체활성도를동시에나타내어여타의담체보다바이오디스크로적합하다고사료된다. 생화학적분석. 각각의지지체에 AF 세포를파종하고 in vitro 에서 2주, 4주및 6주간배양후콜라겐합성시에생성되는히드록시프롤린의양을측정한결과 PLGA 지지체, PGA 부직포에비하여 PLGA/SIS, PLGA/DBP, PLGA/SIS/DBP 지지체및 SIS 스폰지에서 AF 세포의히드록시프롤린합성량이전기간에걸쳐높게관찰되었다 (Figure 2(a)). 또배양 6주후각각의지지체의 DNA 량을측정한결과 DNA 합성량은 PLGA/SIS/DBP(2.75 μm/ml), Hydroxyproline(mg/mL) 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 2wks 6wks PL PS PD SIS PGA Scaffold (a) 6 3.0 Compressive stress(mpa) 5 4 3 2 1 0 PL PS PD SIS PGA Figure 1. Compressive stress of various type scaffolds in vitro(pl; PLGA, PS; PLGA/SIS, PD; PLGA/DBP ; PLGA/ DBP/SIS, SIS; SIS sponge, PGA; PGA nonwoven mesh, denotes significant difference with compared with PL, P<0.05). DNA content(μg/ml) 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 PL PS PD SIS PGA (b) Figure 2. (A) Hydroxyproline concentration of various types of scaffolds after 2, 3 and 4 weeks in vitro. (B) DNA quantification of various types of scaffolds after 2 weeks in vitro ( denotes significant difference with compared with PL,,, P<0.05). 폴리머, 제 32 권제 1 호, 2008 년
조직공학적바이오디스크의섬유륜재생을위한지지체특성평가 29 1wk 1wk PL 6wks PL PS PD SIS PGA Figure 3. Gross observation of various scaffold in vivo. PGA(1.85 μm/ml), PLGA/DBP(0.59 μm/ml), SIS(0.53 μm/ml), PLGA(0.10 μm/ml) 그리고 PLGA/SIS(0.06 μm/ml) 순이었다 (Figure 2(b)). 세포의증식률이증가함에따라서 DNA 의합성량이증가한다. 18 세포의증식률을측정하는 MTT 분석결과에서지지체에따른 AF 세포의증식률의정도는 6주에 PLGA/SIS/DBP 지지체에서가장높았다 (data not shown). 1개의 DNA 에서합성되는히드록시프롤린의양을측정한결과에서는 PLGA/SIS/DBP 지지체에서가장높았다. 이는 SIS 또는 DBP 가부여하는생체활성물질이지지체안에서 AF 세포의증식과콜라겐의합성에도움을준다고사료된다. 생체내이식된세포 -지지체복합체의육안관찰. AF 세포를파종한 PLGA, PLGA/SIS, PLGA/DBP, PLGA/SIS/DBP 지지체, SIS 스폰지및 PGA 부직포가생체내에서어떠한형태변화를일으키는지알아보기위해이식후 1주, 4주및 6주후에세포-지지체복합체를적출하여육안으로관찰하였다 (Figure 3). 1주에서는모든지지체가원래의크기와형태를유지하였으나 PGA 부직포는시간이지남에따라급격한부피의손실을나타내었다. 이에비해 PLGA, PLGA/SIS, PLGA/DBP 및 PLGA/SIS/DBP는관찰 6주까지도형태및모양에큰변화가관찰되지않았다. 천연재료로만이루어진 SIS 스폰지역시형태및크기가유지되었다. 생체조직공학적지지체는완전하게조직이재생될때까지세포외기질을합성할수있는공간을세포에게제공하고안정된속도로생분해되어야한다. 22 따라서빠른분해속도를보이는 PGA 부직포의경우 AF 세포에의해조직형성의시간을제공하지못하기때문에 AF 조직재생을위한지지체로서적합하지않다고사료된다. 조직학적분석. 본실험에서사용한지지체의생체내에서 AF 조직재생가능성을평가하기위하여 AF 세포가분주된지지체를누드마우스의피하에이식한후 1주및 4주후에적출하였다. 실제디스크의주요구성성분이지지체 -세포복합체에서생성되고있는지를조직학적염색을통해확인하였다 (Figure 4). 글라이코스아미노글라이칸합성정도를 Safranin-O 염색을통하여관찰한결과 PLGA, PLGA/SIS, PLGA/SIS/DBP 지지체및 PGA 부직포에서 Safranin-O 에의해붉은색으로염색된부분이넓게관찰되었으며 SIS 스폰지에서는관찰되지않았다. Masson's trichrome 염색을통하여콜라겐의합성정도를측정한결과 PLGA/SIS, PLGA/ SIS/DBP 지지체에서푸른색으로염색된콜라겐부분을관찰할수있었다. PLGA, SIS 스폰지, PGA 부직포에서는관찰되지않았다. 제 I 교원질염색을통하여교원질의증가정도를관찰한결과 PLGA/SIS, PLGA/SIS/DBP 지지체에서 PLGA, PLGA/DBP, PS PD SIS PGA Figure 4. Photomicrographs from H&E histological sections of annulus fibrosus cell seeded various type of scaffolds implanted on the back of nude mice after 1 week and 4 weeks in vivo. SIS 스폰지, PGA 부직포에비하여교원질의증가가관찰되었다 (Figure 5). 또한 in vitro에서히드록시프롤린의양이 PLGA/ SIS 지지체에서가장높게형성되었다. 생체내에이식하였을때 SIS 스폰지형태의지지체는 SIS 가가지는충분한생체활성도를나타내지못하였다. 이는 PLGA 가부여하는압축강도를 SIS 스폰지가가지지못하기때문으로사료되고 SIS, DBP 의생체활성도에 PLGA 의강도를가진 PLGA/SIS 또는 PLGA/SIS/DBP 지지체가 AF 조직재생에적합한지지체라고사료된다. 23,24 Polymer(Korea), Vol. 32, No. 1, 2008
30 하현정 ᆞ 김순희 ᆞ 윤선중 ᆞ 박상욱 ᆞ 소정원 ᆞ 김문석 ᆞ 이종문 ᆞ 강길선 ᆞ 이해방 PL PS PD SIS PGA Safranin-O Masson s Type 1 trichrome collagen Figure 5. Photomicrographs from Safranin-O, Masson's trichrome and Type I collagen immunohistochemical staining sections of annulus fibrosus cells seeded various types of scaffolds implanted on the back of nude mice after 4 weeks in vivo. 결 본연구에서는생분해성고분자인 PLGA 와천연재료인 SIS, DBP 를포함한천연 / 합성하이브리드담체를제조하여 AF 재생에적합성을평가하였다. AF 재생을위한바이오디스크로서천연재료가생화학적조직학적특징을증가시키지만천연재료로만이루어진지지체의경우에는충분한압축강도를가지지못하여실제디스크에이식하였을경우에디스크에가해지는압력을견딜수없기때문에생화학적조직학적특성을유지하기가어렵다. 따라서천연재료의생체적합성과 PLGA 의압축강도를가진천연 / 합성하이브리드담체인 PLGA/SIS, PLGA/SIS/DBP 가 AF 조직재생에가장적합한지지체라사료되며현재디스크의 NP 조직재생에적합한지지체에대한평가를진행중에있다. 감사의글 : 본연구는세포응용사업단 (SC3100) 지원으로이루어졌으므로이에감사드립니다. 론 참고문헌 1. E. J. Carragee and M. Hannibal, Orthop. Clin. North. Am., 35, 7 (2004). 2. G. Khang, E. J. Kim, S. H. Kim, K. S. Park, C. H. Whan, Y. S. Yang, M. S. Kim, and H. B Lee, Tissue. Eng. Regen. Med., 2, 20 (2005). 3. G. Khang, M. S. Kim, B. H. Min, I. W. Lee, J. M. Rhee, and H. B. Lee, Tissue. Eng. Regen. Med., 4, 376 (2006). 4. H. Mizuno, A. K. Roy, C. A. Vacanti, K. Kojima, M. Ueda, and L. J. Bonassar, Spine, 29, 1290 (2004). 5. C. A. Seguin, M. D. Grynpas, R. M. Pillar, S. D. Walden, and R. A. Kandal, Spine, 29, 1299 (2004). 6. G. Khang, C. S. Park, J. M. Rhee, S. J. Lee, Y. M. Lee, M. K. Choi, and H. B. Lee, Macromol. Res., 9, 267 (2001). 7. S. J. Lee, G. Khang, Y. M. Lee, and H. B. Lee, J. Biomater. Sci., Polym. Ed., 13, 197 (2002). 8. E. K. Jeon, G. Khang, J. M. Rhee, and H. B. Lee, Polymer (Korea), 25, 893 (2001). 9. S. F. Badylak, R. Record, and K. Lindberg, J. Biomater. Sci., Polym. Ed., 9, 863 (1998). 10. G. Khang, J. M. Lee, P. K. Shin, I. Y. Kim, B. Lee, I. W. Lee, and H. B Lee, Macromol. Res., 10, 158 (2002). 11. Y. K. Ko, S. H. Kim, J. S. Jeong, H. J. Ha, S. J. Yoon, J. M. Rhee, M. S. Kim, H. B. Lee, and G. Khang, Polymer (Korea), 31, 14 (2007). 12. S. Y. Chuang, R. M. Odono, and T. P. Hedman, Clinical Biomech., 22, 14 (2007). 13. M. R. Urist, Science, 150, 893 (1965). 14. S. L. Voytik-Harvin, A. O. Brightman, M. R. Kraine, B. Wasiner, and S. F. Badylak, J. Cell. Biochem., 67, 478 (1997). 15. J. W. Jang, B. Lee, S. H. Kim, C. W. Han, M. S. Kim, S. H. Cho, H. B. Lee, and G. Khang, Polymer(Korea), 28, 382 (2004). 16. H. Mizuno, A. K. Roy, V. Zaporojan, C. A. Vancanti, M. Ueda, and L. J. Bonassar, Biomaterials, 27, 362 (2006). 17. C. A. Niosi and T. R. Oxland, Spine, 4, 202S (2004). 18. Y. Sun, M. Hurtig, R. M. Pilliar, M. Grynpas, and R. A. Kandel, Orthopaedic Res., 19, 1078 (2001). 19. H. J. Ha, S. H. Kim, S. J. Yoon, Y. K. Ko, E. K. Lee, Y. S. Son, M. S. Kim, J. M. Rhee, G. Khang, and H. B. Lee, Tissue. Eng. Regen. Med., 3, 416 (2006). 20. S. H. Kim, S. J. Yoon, J. W. Jang, M. S. Kim, H. B. Lee, and G. Khang, Polymer(Korea), 30, 14 (2006). 21. K. S. Park, C. M. Jean, S. J. Yoon, K. D. Hong, S. H. Kim, M. S. Kim, J. M. Rhee, H. B. Lee, and G. Khang, Polymer (Korea), 29, 501 (2005). 22. L. E. Freed, J. C. Marquis, A. Nohria, J. Emmanual, A. G. Mikos, and F. Langer, J. Biomed. Mater. Res., 27, 11 (1993). 23. B. S. Choi, S. H. Kim, S. J. Yoon, H. J. Ha, M. S. Kim, Y. I. Yang, Y. S. Son, J. M. Rhee, H. B. Lee, and G. Khang, Tissue. Eng. Regen. Med., 3, 295 (2006). 24. K. S. Kim, M. H. Cho, H. H. Ahn, S. B. Song, S. J. Seo, M. S. Kim, B. Lee, G. Khang, and H. B. Lee, Tissue. Eng. Regen. Med., 4, 168 (2007). 폴리머, 제 32 권제 1 호, 2008 년