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동빈 강
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1 J Korean Orthop Assoc 2006; 41: 다양한기질에서골수중간엽줄기세포의 3 차원배양및생체이식에의한골형성능 이청송 윤택림 김형근 노윤정 정은정 Three-dimensional Culture of Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells on Several Scaffolds and Osteogenic Potential of Cell-Scaffold Composite in Vivo Purpose: To determine the in vivo bone formation on an osteoblastic cells-scaffold composite and the best scaffold for bone formation. This study focused on the three-dimensional culture of osteoblastic cells using various tissue-engineered scaffolds and compared the suitability of those scaffolds. Materials and Methods: Mesenchymal stem cells were harvested from New Zealand white rabbits and were differentiated into osteoblastic cells. The expression of osteogenic proteins in osteoblastic cells was observed by RT-PCR and a phase of mineralization was checked using von Kossa staining. In addition, three-dimensional cultured osteoblastic cells-scaffolds composites using a variable scaffold were observed by scanning electron microscopy. The cell-scaffold composites were transplanted into athymic nude mice. X-ray, a histochemical study, and immunohistochemistry were used to evaluate the in vivo bone formation. Results: The mesenchymal stem cells proliferated quite well in the early phase and differentiated into osteoblastic cells by an inducing substance. The osteoblastic cells were observed as spindle and polygonal shapes and were mineralized. Expression of the osteoblastic proteins was observed continuously after 2-3 weeks. The amount of osteocalcin secretion increased for 6-7 weeks. The osteoblastic cells adhered more to the human and porcine bone than to the hydroxyapatite-scaffold. In the case of the PLGA scaffold, the cells proliferated and formed a net-like structure but did not adhere well. No Living cells were observed in the calcium alginate scaffold. However, after the in vivo transplant, abundant cells and new tissue were observed within the human bone, porcine bone, hydroxyapatite, and PLGA but not within the calcium alginate scaffold. Conclusion: In the three-dimensional cultures, natural bone was found to be a more effective and suitable scaffold for cell culture than the various synthetic polymers. Key W ords: Mesenchymal stem cell, Scaffolds, Osteogenesis, Osteocalcin 통신저자 : 윤택림전남화순군화순읍일심리 160 화순전남대병원관절센터 TEL: FAX: tryoon@chonnam.ac.kr * 본연구는산업자원부지방기술혁신사업 (RTI ) 지원으로수행되었음. Address reprint requests to 1037

2 1038 서론선천적인골형성부전증, 교통사고및여러가지재해에의한골손상, 감염이나암등에의한골결손, 노화혹은기타원인에의한뼈의위축등은모두심한장애나기형을일으킨다. 이에대한효과적인치료를위한골조직재건을위해조직공학적으로골대치물을생성하는새로운시도가활발히진행되고있다 8). 골조직공학의기본원리와방법은체외배양을통해증식및분화, 유도시킨골형성세포를생체적합성이좋고생체에서흡수될수있는지지체에부착하여만들어진세포-지지체복합물을다시생체이식하여지지체가흡수되는과정에서세포가새로운골조직을형성시킴으로써골결손을치유하는것이다 1). 이러한방법의골조직재건을위해서는골전구세포, 지지체와골유도성장인자등다양한조건들에대한연구가필요하며 10), 그중에서세포, 지지체및세포와지지체간의생체적합성에대한연구가골조직공학에서의기본적인문제이다 5). 현재골조직공학에이용되고있는세포에는골아세포, 배아줄기세포, 성체줄기세포등이있으나 4), 가장많은연구가진행되고있고효과적인것은골수유래줄기세포이다 16). 그러나골수중의미분화중간엽줄기세포는그양이극히적어골수세포의 % 밖에되지않으므로 6) 골조직공학에적용하려면골수중에서중간엽줄기세포만을분리배양하여증식분화시켜세포의양을늘려야한다. 따라서골아세포로의분화유도물질에대해서도많은연구가진행되었는데 dexamethasone, vitamin C, gylcerophosphate, vitamin D 3, basic fibroblast growth factor (bfgf), bone morphogenic protein (BMP), transforming growth factor- (TGF- ) 등이골형성분화유도에관여함이보고되었다 7). 현재골조직공학에서많이연구되고있는지지체에는천연골, 교원질, 산호, tricalciumphosphate (TCP), hydroxyapatite (HA), polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA), PLA와 PGA의복합물인 poly L-lactic-co-glycolic acids (PLGA) 그리고여러지지체들의복합물등이있다 11,13). 골조직공학에이용되는이러한지지체들은생체적합성이좋아체외배양시세포독성이없어야하며생체이식후면역거부반응이없어야하고, 삼차원적구조를가지고있어세포가부착증식할수있는공간이있어야하며, 표면활성이좋아야하고, 생분해 성이있어야하며, 가소성이있고, 일정한기계적강도가있어야하는등여러요구조건이부합되어야한다 1). 본연구에서는세포적합성이라는의미에서현재다양하게사용되고있는천연및합성고분자지지체의종류에따른세포-지지체간의상호작용을분석하고자하였다. 대상및방법 1. 가토골수에서의미분화중간엽줄기세포의분리배양생후 2-3개월의 kg 크기의건강한가토 10마리로부터골수를채취하였다. 헤파린이들어있는주사기로골수를 4 ml 채취하여동일한양의하트만용액에희석한후 1.077±0.001 g/ml 농도의 polysucrose 용액 3 ml에조심스럽게올려놓는다. 그리고 1,500 rpm 에서 20 분간원심분리하여단핵세포층을분리하고적혈구용혈완충액을처리하여세포의수율을증가시켰다. 세척후 10% fetal bovine serum (FBS) (Gibco) 과항생제가포함된 Dulbecco s Modified Eagle s Medium (DMEM) (Gibco) 에부유시켜 37 o C, 5% CO 2 배양기에서배양하였다. 3-5일간배양후부유해서자라는조혈모세포군은제거하고바닥에부착되어있는미분화중간엽줄기세포만을선택하여지속적으로배양하였다. 그후배양액은 2-3일에한번씩갈아주었다. 2주후세포가 80-90% 로증식하면 trypsin/edta 를처리하여세포를새로운플라스크에옮겨지속배양하였다. 미분화중간엽줄기세포의골아세포로분화를유도하기위하여계대배양제2대세포에 10 nm dexamethasone, 10 mm -glycerophosphate, 50 g/ml L-ascorbic acid를첨가하였다 5). 2. 형태학적연구배양중인세포는배양초기단계부터일정한간격으로위상차현미경 (Olympus, Japan) 을이용하여세포의성장, 증식과세포구조의형태학적인변화를관찰하였다. 또한슬라이드표본을만들어 hematoxylin & Eosin Y (H&E) 염색을실행하였다. 그리고세포의석회화를관찰하기위하여 von Kossa 염색을실시하였다. 광학현미경을이용하여세포의석회화정도를관찰하였다. 3. 역전사중합효소반응을이용한 mrna 의발현골아세포에의해생기는 osteocalcin, osteopontin,

3 1039 osteonectin, type I collagen, alkaline phosphatase (ALP) 의 mrna 발현을통하여골아세포로의분화여부를확인하였다 9). 배양한세포를 TRIzol용액을이용하여 total RNA를분리하였다. 분리된 1 g의 total RNA에 M-MLV 역전사효소를이용하여 cdna 를합성하였다. 중합효소연쇄반응은 1 l의 cdna, 0.2 M 의각 primer, 1 PCR buffer, 10 mm dntp mix 와 1 unit Taq polymerase를혼합하여총 50 l 의반응액을 PCR system (GenAmp PCR System 9600, Perkin Elmer) 에서시행하였다. 증폭프로그램은 95 o C에서 5분간전처리한후 94 o C에서 15초, 60 o C에서 15초동안결합반응을유도하여 72 o C에서 30초동안연장반응이일어나도록하고마지막으로 72 o C에서 10분동안 post-extension을시행하였다. 각각의반응조건으로 -actin은 25회, osteocalcin, osteopontin, osteonectin, type I collagen, ALP에대해서는 30회반응시켰다. 중합효소반응생성물은 1.8% 아가로우스겔에전기영동한후 ethidium bromide로염색하여확인하였다. 4. ELISA 를이용한 osteocalcin 의정량세포의증식에따른골아세포의특징단백질마커인 osteocalcin의생성을 osteocalcin EIA Kit (Takara, Japan) 를이용하여정량하였다 35). 2주간격으로 개의세포를 48시간동안배양한후세포배양상청액을수집하였다. 수집한상청액을 mouse monoclonal anti- Gla-osteocalcin 항체가코팅된 plate에첨가한후 2시간동안상온에서배양하였다. 완충용액으로세척후 peroxidase가표지된 2차항체를부착하고 1시간동안상온에서배양한후세척을하고기질을첨가하여발색을유도하였다. 최종적으로 1 N H 2 SO 4 를첨가하여반응을정지시키고, 신속하게 ELISA plate reader를통하여 450 nm에서흡광도를측정하였다. 본실험은 3회반복시행하였다. 5. 세포-지지체의 3차원배양본연구에서는세포지지체용담체로초저온냉동멸균처리한사람뼈, 인제대학교에서제조가공된돼지뼈, KIST 에서합성한 PLGA 지지체, 상품화된 HA 지지체, 그리고아주대학교에서합성한칼슘알긴산염지지체를사용하였다. 실험전모든지지체는 ethylene oxide 가스로 60 o C에서 18시간동안멸균하였다. 세포배양지지체는 cm로가공하여, 실험전미리세포배양액에넣어두어지지체내부에까지배지가침투하도록하였다. 6-well plate에지지체를넣고미분화중간엽줄기세포를 개씩분주하였으며 0.4% trypane blue 염색법을이용하여세포수를측정하였다. 37 o C, 5% CO 2 의배양기에서 3시간동안배양하여세포의부착을유도한후분화유도물질을첨가한배지를넣어주고 7일간지속배양하였다. 세포배양액은 3-4일마다교체하였다. 6. 주사전자현미경을이용한세포의부착및증식관찰세포-지지체복합체는배양 7일째에무혈청배지로 3 차례세척하여 2% glutaraldehyde와 2% paraformaldehyde가포함된 0.05 M cacodylate buffer (ph 7.2) 에 4 o C에서 2시간고정하고 0.2 M sodium cacodylate buffer (ph 7.2) 로반복세척한후 1% osmium tetroxide에 1시간처리하였다. 에탄올로단계적으로탈수한후임계점건조법 (critical point drying technique) 으로완전히건조한후 30 nm 금입자를이용하여코팅하고주사전자현미경 (Jeol JSM-35, Japan) 을이용하여지지체내에서세포의부착및증식을관찰하였다. 7. 세포-지지체복합체의생체내이식본연구에는생후 4개월된누드마우스를이용하였다. 누드마우스를게로란 (( 주 ) 일동제약 ) 을이용하여흡입마취시킨후수술부위를포타딘으로소독하고등부위에 0.5 cm의절개부를만들어 7일간배양한세포-지지체복합체를이식하였다. 실험기간동안누드마우스는항온항습장치에서사육하였다. 8. 형광염색을통한생체내세포생존가능성의분석분리배양한골아세포가생체내에서생존이가능한지, 또한신생조직이이식된세포에서기인하여형성된것인지를관찰하기위하여세포에형광물질인 PKH26을염색하여 PLGA 지지체에 3차원배양을실시하였다. 이렇게형성된세포-지지체복합체를누드마우스에이식한후 4주가지난후에이식조직을고정하여형광현미경 (Nikon, Japan) 으로관찰하였다.

1040 9. 방사선학적검사세포-지지체복합체가이식된누드마우스는 2주간격으로방사선검사를하여생체내에서의골형성여부를관찰하였다. 10. 면역조직화학염색세포-지지체복합체생체이식후골형성을검증하기위하여골아세포의특이적단백질인 osteocalcin을면역조직화학염색을실행하였다.

4 방사선학적검사세포-지지체복합체가이식된누드마우스는 2주간격으로방사선검사를하여생체내에서의골형성여부를관찰하였다. 10. 면역조직화학염색세포-지지체복합체생체이식후골형성을검증하기위하여골아세포의특이적단백질인 osteocalcin을면역조직화학염색을실행하였다. 채취한조직은 10% 중성포르말린에고정한후파라핀을이용하여파라핀블록을제작한후 4 m 두께로잘라서 Probe-on Plus slide (Fisher Scientific, USA) 에부착시키고충분히건조시켰다. 파라핀절편은탈파라핀과탈수과정을거친후 Autoblocker (Research Genetics, USA) 로내재성 peroxidase를억제시켰다. 면역조직화학적염색상관찰될수있는비특이적인항원항체반응을억제하기위하여일차항체를부착시키기전에 protein blocker (Research Genetics, USA) 로 45 o C에서 3분간반응시켰다. 일차항체인 osteocalcin 에대한항체는 1 200으로희석하여실온에서 2시간동안반응시키고, 완충액으로씻은후이차항체인 biotin이부착된 anti-mouse IgG (Sigma, USA) 에 45 o C에서 7분간반응시켰다. 검출계는 streptavidin 이부착된 horseradish peroxidase (SRT-HRP) 를이용하였는데, 45 o C에서 7분간반응시켰고완충액으로씻은후발색시켰다. 양성반응을관찰하기위한발색제는 diaminobenzidine을이용하였다. 발색반응이끝난다음양성반응은 hematoxylin으로대조염색을시행한후 Universal Mount (Research Genetics, USA) 로봉입하여관찰하였다. 결과 1. 생체외환경에서골수중간엽줄기세포의골형성능골아세포의특이단백질인 osetocalcin, osteonectin, osteopontin, type I collagen 및 ALP의발현을관찰하기위하여역전사중합효소반응을시행하였다. 배양초기인 2주에 type I collagen, osteonectin, osteopontin, ALP의발현이관찰되었으나, osteocalcin은 3주이상의장기배양에서발현이관찰되었다. 세포의장기적인배양 (7-8주 ) 에서는모든단백질의발현이관찰되었다 (Fig. 1). 배양시간에따라세포에의해생성되는 osteocalcin Fig. 1. 의양은 5주까지증가하는양상을나타내었으나그변화정도는크지않았다. 5주부터 7주사이에는급격한증가세를보였으며, 8주째에다시급격히감소하여장기배양에서는더이상증가하는양상을보이지않았다. 2. 지지체에서의세포의부착및증식 - 세포의 3차원배양생체외환경에서세포-돼지뼈지지체복합체를 H&E 염색한결과, 세포는지지체에잘부착하였으며, 지지체중앙내부에까지침투되어고루분포되었으며증식이이루어지고있었다. 하지만골형성의양상은관찰되지않았다. 세포-사람뼈복합체에서의세포의형태를주사전자현미경을이용하여관찰한결과방추형의모양을나타내었고, 사람뼈는배양한세포로고루덮여있어우수한세포지지체의역할을하고있음을확인하였다 (Fig. 2A). 세포 -돼지뼈복합체에서는세포가돼지뼈에존재하는내공사이에풍부하게부착하여자라나고있었으며세포의형태도다각형의모양을나타내고있어세포가전체적으로건강하고균일한양상을보였다 (Fig. 2B). 세포-HA 복합체에서세포의양은사람뼈나돼지뼈에비하여다소적었으며, 세포는대부분방추형의모양이었으며, 일부는원형으로비교적균일하지않은양상을나타내었다 (Fig. 2C). 세포-PLGA 복합체에서세포는지지체주변에거

1041 다양한 기질에서 골수 중간엽 줄기세포의 3차원 배양 및 생체이식에 의한 골형성능 A B D C E Fig. 2.

(B) Cell-porcine bone complex structure. (C) Cell-hydroxyapatite complex structure. (D) CellPLGA complex structure.

체의 표면에 밀착하기보다는 내공 사이에 그물망을 형성 방사선 검사상 세포-사람뼈, 세포-돼지뼈, 세포-HA 하며 증식하고 있는 것으로 관찰되었다(Fig. 2D).

나타나지 않았으며 점차 생분해되어 4주에 이르러서는 주변 조직과의 뚜렷한 차이를 관찰할 수 없었다(Fig. 3. 생체 내에서 세포-지지체 복합체의 골형성 4B).

5 1041 다양한 기질에서 골수 중간엽 줄기세포의 3차원 배양 및 생체이식에 의한 골형성능 A B D C E Fig. 2. Scanning electron microscopy image shows the cellscaffolds complex. (A) Cell- human bone complex structure. (B) Cell-porcine bone complex structure. (C) Cell-hydroxyapatite complex structure. (D) CellPLGA complex structure. (E) Cell-calcium alginate complex structure. 미줄처럼 풍부하게 자라나고 있었지만, 이들 세포는 지지 지 않고 4주까지 잘 증식하고 있음을 알 수 있었다(Fig. 3). 체의 표면에 밀착하기보다는 내공 사이에 그물망을 형성 방사선 검사상 세포-사람뼈, 세포-돼지뼈, 세포-HA 하며 증식하고 있는 것으로 관찰되었다(Fig. 2D). 세포- 복합체는 비슷한 모양이었는데, 시간의 진행에 따른 석회 칼슘알긴산염 복합체에서는 지지체가 세포배양액에서 화의 변화를 관찰할 수는 없었으나, 이식된 조직이 주변 신속하게 분해되어 지지체 자체의 pore를 관찰할 수 없 조직에 점차 융합되고 있음을 관찰하였다(Fig. 4A). 세포- 었으며, 세포는 증식하지 못하였고 괴사 및 고사된 세포 PLGA 복합체에서는 뼈 조직과 유사한 골 조직의 음영이 잔여물만 확인되었다(Fig. 2E). 나타나지 않았으며 점차 생분해되어 4주에 이르러서는 주변 조직과의 뚜렷한 차이를 관찰할 수 없었다(Fig. 3. 생체 내에서 세포-지지체 복합체의 골형성 4B). 세포-칼슘알긴산염 복합체는 이식 직후 칼슘에 의 생체이식 후 세포가 잘 부착하여 증식하는지를 알아보 한 hard tissue 음영이 미약하게 관찰되었으나, 시간이 기 위하여 형광 염색을 한 결과 잘 부착하여 증식하고 있 지나면서 주변 조직에 흡수되어 뚜렷한 이식 부위의 석회 음을 형광물질의 발광을 통해 관찰할 수 있었으며, 이식 화 및 골 형성여부를 관찰할 수 없었다(Fig. 4C). 4주 동 한 주변부에서 중심부보다 더 많은 형광물질의 발현이 관 안의 이식기간에 세포-지지체 복합체를 통한 신생 골 조 찰되었다. 이로써 이식된 골아세포가 생체 내에서 사멸하 직의 형성을 유도할 수 없었다.

6 1042 이청송 윤택림 김형근 외 2인 Peripheral side Central area Fig. 3. The immunofluorescence shows the in vivo distribution of transplanted cells ( 10). 10 PO 2w 4w A PO 2w 4w B PO 2w 4w C Fig. 4. The X-ray shows transplanted cell-scaffolds complex. (A) The transplanted cells in human bone show hard bone tissue. (B) The transplanted cells in PLGA does not show bone tissue. (C) The transplanted cells in the calcium alginate does not show bone tissue. 생체 내 이식된 세포-지지체 복합체의 H&E 염색 결과 한 세포가 존재하고 있었으며, 신생조직이 활발하게 형성 지지체에 따라 다소 차이를 보였다. 세포-사람뼈와 세포- 되었다. 4주간의 실험기간에 이식 부위의 석회화를 관찰 돼지뼈 복합체를 이식한 결과 이식 부위 전체적으로 풍부 할 수는 없었으나, 지지체와 세포의 부착면에 풍부하게

7 A B 40 C D Fig. 5. 존재하는세포로인한신생미숙골이관찰되었다 (Fig. 5A). 세포-HA 복합체를이식한경우 HA와세포의경계면에뚜렷한분리가나타났으며, 세포분포부위와섬유아조직등이복잡하고불규칙적으로존재하고있었다 (Fig. 5B). 세포-PLGA 복합체를이식한경우에는풍부한세포가이식부위에분포하여새로운조직이생성되고있었으며, 또한 PLGA 지지체는생체내에서서서히분해되어신생조직으로대체되고있었다 (Fig. 5C). 세포- 칼슘알긴산염복합체를이식한경우에는적은양의세포와칼슘결정체를관찰할수있었다. 그러나다른지지체에비하여상대적으로적은양의세포가관찰되었으며, 신생조직의분포도낮았다. 또한알긴산염성분이점차적으로분해되고있었으나이부위가 PLGA에서처럼신생조직으로대체되는양상은관찰되지않았다 (Fig. 5D). 골모세포의특이적단백질인 osteocalcin에대하여면역 Fig. 6. A B

8 1044 조직화학염색결과세포와사람뼈, 돼지뼈, HA, PLGA 등지지체의복합체에서는면역조직화학염색이양성을나타내었으나세포-칼슘알긴산염복합체에서는세포가관찰되지않고있으며면역조직화학염색은음성을나타내었다 (Fig. 6). 고찰역전사중합효소반응을통한세포의골형성능을측정한결과배양초기부터 type I collagen과 osteopontin, osteonectin, ALP의발현은분화하지않은상태의미분화줄기세포에도어느정도존재하고있음을말해준다. 그러나 osteocalcin은분화유도물질을첨가하여 3주이상의장기배양을통해어느정도세포의분화가이루어졌을때비로소발현되었으며단백질의생성량은 7주까지꾸준히증가하였는데 5-7주에서급격한증가를보였다. 이는골아세포에의해생성되는 type I collagen 이 osteonectin, osteopontin, ALP에의한석회화가진행되고, 그이후분화유도물질에의하여 osteocalcin 의생성이촉진되었을것이라고추정할수있으며골아세포의골형성기능에있어서 osteocalcin이골재건에중요한관련이있음을시사한다. 골형성세포들이살아가면서골을형성하기위해서는기질또는세포들이적당한위치에서증식분화할수있는지지체와같은골전도물질이필요하며이는생체이식후생체와의결합, 그리고장기적인결과에도영향을주는것으로알려져있다 14). 사람뼈는해면골을초저온냉동처리한것으로세포가활발하게증식하고있었으며, 이식부위의석회화현상은관찰할수는없었으나지지체와세포의근접면에풍부하게존재하는세포로인한신생미숙골의양상을관찰할수있어우수한세포지지체의역할을하고있음을확인하였다. 돼지뼈는돼지의해면골을 1,300 o C에서 2시간동안고온열처리하여제작하였으며세포는돼지뼈의내공사이에서풍부하게자라나고있었으며, 세포의형태도골아세포의형태를나타내고있었고, 생체이식후세포- human bone chip 의경우와비슷한양상을나타내었다. 상품화된 HA는평균내공이 m 인망상구조로인간의해면골과유사한장점이있으며, 천연골의무기질과동일한성분으로압축강도는높지만인장력이낮아서부서지기쉬우며강도와흡수율이다양하다는단점 이있다. De Kok 등 3) 은골수줄기세포- HA/TCP 지지체복합체를개의체내에이식하여 4주후조직학적검사를통하여골형성을관찰하였다고보고하였다. 칼슘-알긴산염은해조류에서추출된알긴산과 CaCl 2 의복합체로서내공의크기는 m 였다. Yang 등 15) 은골수줄기세포-칼슘알긴산염복합체를주사기로가토피하에이식하여 4주에는완전한골형성을관찰할수없었으나, 8주와 12주에는골형성을관찰할수있었으며 endochondral ossification의형식으로골형성이일어나는것을관찰하였다고하였다. 본연구에서는세포가지지체에부착증식하지못하였고, 생체이식후신생조직또한관찰되지않았는데이는칼슘-알긴산지지체의제작과실험방법이달랐기때문이라생각한다. 생분해성고분자인 PLGA는 PLA와 PGA를 70 30의비율로혼합하였으며, 지지체표면의친수성을높이기위하여 NaOH로처리하여제조하였고, 내공크기가 m 으로실제해면골과유사한형태를가지고있었다. 생분해성고분자들은골전도효과는좋지않지만생체적합성이좋고, 봉합사등과같이이미생체재료로많이사용되어그안전성이이미입증되었으며, 쉽게원하는형태로의제조가용이하며용해시간과성장인자들의방출을조절할수있는장점등으로향후골형성유도물질로서사용가능성이높다. Ochi 등 12) 은골수유래골형성세포를 PLGA-collagen sponge 에부착하여골대치물로이용하여좋은임상결과를보고하였다. Osteocalcin 에대한면역조직화학염색결과세포-칼슘알긴산염복합체에서는음성을나타내었고기타다른지지체에서는양성을나타내었는데이는 H&E염색결과와부합되며칼슘알긴산염지지체를제외한기타지지체에서골모세포가부착생장하면서골형성이이루어지고있음을시사한다. 이와같이세라믹 pore 등과같은물질에자가골전구세포를체외에서성장시키는것은몇가지장점이있다. 첫번째로이식편표면에세포생착이최대화되어전구세포들이균등하게덮인해면구조를형성하게되며, 두번째로한번세포가이식편에부착하게되면여러가지성장인자의추가에따라생체에이식되기이전에도세포들은 HA의표면에서유골성기질을형성하기시작하여골조직분화가촉진될수있으며, 세번째로생분해성고분자는혈관침식, 지속적인골형성분화그리고신속한골유

9 1045 합을유도하는다양한생체활동성인자들을첨가하여효과적이고골결손부위에따른성형이용이한조골세포- 고분자복합체를만들수있다는점이다. 결론본연구에서는가토골수줄기세포를채취하여분리배양하고분화유도물질을첨가하여골아세포로분화시켜여러가지지지체에부착배양하였으며세포-지지체복합체를다시생체이식하여골형성능을관찰하였다. 골수중간엽줄기세포는골조직공학의주요한세포자원이며밀도구배원심분리법은골수에서중간엽줄기세포를분리하는간단하고효과적인방법이다. 골수중간엽줄기세포는 dexamethasone, -glycerophosphate, L-ascorbic acid 의작용하에분화유도되어다양한골형성관련단백질을발현하였으며여러가지지지체에부착시켜생체이식하여 in vitro와 in vivo에서세포의부착증식과골형성능에대한관찰을통하여 4주간의단기추시상자연골이다른지지체에비하여세포배양에보다효과적이며생체내석회화유도에적합함을확인하였다. 참고문헌

10 1046 = 국문초록 = 목적 : 대상및방법 : 결과 : 결론 : 색인단어 :

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α α α α α α α α 太陰調胃湯加減方 dbdb 마우스 肝에 대한 아디포사이토카인 및 발현에 미치는 영향 SREBPs 와 섞어서 하고 마커 또한 하여 전기 영동을 하였다 전기영동을 한 후에 에 를 쪼여서 각 를 확인하였다 이 를 프로그램을 이용해 수치화하 여 분석하였다 肝 조직 동결 절편 분리한 조직은 로 시간 동안 고정 시킨 후 에 세척한 후 물기를