대한응급의학회지제 18 권제 1 호 Volume 18, Number 1, February, 2007 원 저 항산화제 Quercetin 이파라쿼트에유도되는세포손상에미치는효과 충북대학교의과대학응급의학교실 김 @ 훈ㆍ이석우 The Effects of Quercetin on Paraquatinduced cell Damage Hoon Kim, M.D., Suk-Woo Lee, M.D. Purpose: Paraquat (1,1-dimethy-4,4-bipyridinium dichloride, PQ) is a very effective and widely used herbicide which was introduced commercially in 1962. However, its toxic effects are often fatal to humans and animals through accidental or suicidal poisoning. Quercetin belongs to an extensive class of polyphenolic flavonoid compounds almost ubiquitous in plants and plant food sources. Quercetin is known as a strong free radical scavenger and an inhibitor of reactive oxygen species production. However, the effects of quercetin on paraquat-induced oxidative cell damage have not been investigated. Methods: This experiment was conducted in vitro using the HeLa Human cervival carcinoma cell line. The free radical scavenging activity of quercetin was assayed in cell free systems using a stable free radical, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Cytotoxicity was studied using the MTT method. Optical density was measured at 540 nm using an ELISA reader. We examined morphological changes in cells after drug treatment using an inverted microscope, and quercetin-induced apoptosis was investigated using an apoptotic DNA fragmentation assay and a caspase-3 activity assay. Results: Results of anti-dpph radical assay indicated that 책임저자 : 김 @ 훈충청북도청주시흥덕구개신동충북대학교병원응급의학교실 Tel: 043) 269-6080, Fax: 043) 269-6954 E-mail: nichekh2000@chungbuk.ac.kr 접수일 : 2006년 9월 21일, 1차교정일 : 2006년 10월 9일게재승인일 : 2006년 10월 11일 * 이논문은 2006학년도충북대학교학술연구지원사업의연구비지원에의하여연구되었음. 41 quercetin inhibited the production of DPPH radicals in vitro and that its radical scavenging activity was superior to the activities of both ascorbic acid and N-acetylcysteine. Incubation of HeLa cells with quercetin protected HeLa cells from paraquat-induced cytotoxicity according to the MTT assay. In the DNA fragmentation and caspase-3 activity assays, DNA ladders and caspase-3 concentrations characteristic of apoptosis appeared in quercetin-treated HeLa cells. Conclusion: The results of this study suggest that quercetin at less than a concentration of 100uM exhibits an inhibitory effect on paraquat-induced cell death, but that at concentrations of over 100 um, the protective effects against paraquat-induced cell damage were reduced due to its apoptotic effects. Key Words: Paraquat, Quercetin, Antioxidants Department of Emergency Medicine, College of Medicine, Chungbuk National University, Cheongjoo, Korea 서 파라콰트 (1,1-dimethy-4,4-bipyridinium dichloride) 는 1958년최초로개발된이후전세계적으로가장흔히사용되는유기염소계비선택성제초제로서국내에서는그람옥산, 속사포, 파라코등의이름으로시판되고있다. 강한독성으로소량에서도인체에흡수되면치명적이어서약물중독에의한사망원인으로는최고를차지하며우리나라에서는연간 500 명이상의사망자가발생한다고알려져있다 1). 파라쿼트의독성작용은세포내에서 cytochrome P 450 reductase, glutathione reductase 등의효소에의한파라쿼트이온의순환적환원으로활성산소종인 superoxide radicals의과다생성으로세포막지방과산화 (lipid peroxidation), apoptosis 유도등이발생하여산화적세포독성이발생하게된다 2). 이러한이유로다양한항산화제가파라쿼트의중요한치료방법으로인식되고있다. 현재급성파라콰트중독의치료를위한다양한시도가이루어지 론
42 / 대한응급의학회지 : 제 18 권제 1 호 2007 고있으며, 위세척, 이뇨제사용혹은혈액관류등의고식적인방법과함께유해활성산소종제거를위한항산화제들로 tocopherol, ascorbic acid 등의비타민계항산화제, metatonin, glutathione, metallothionein, N-acetylcysteine, liposomal antioxidants 등이있고 chelating agents로 desferoxamine hydroxypyridin-4-one, 그리고 superoxide radicals 제거와관련된효소인 Superoxide dismutase 흡인치료등이현재임상적으로사용또는연구되고있다. 하지만 ascorbic acid, tocopherol 등의비타민성항산화제를제외하고천연물에서추출되는항산화물질들에대하여서는파라쿼트에유도된과도한활성산소종에의한산화적세포독성에미치는효과에대해서많은연구가되고있지않다. 현재까지보고된대표적인천연물성분의항산화물질들로는 caffeic acid, ferulic acid 등의페놀산류, catechine 같은탄닌류, kampferol, quercetin 등의플라보노이드류그리고카로티노이드류등의화합물들이다. 이중 quercetin은토마토, 사과, 양파등에풍부한플라보노이드류계통의화합물중하나로서강력한항산화효과가있는것으로알려져있다 3-5). 이러한플라보노이드류계통의화합물은활성산소종으로부터얻어지는자유전자 (free electrons) 를안정화할수있는데이는 quercetin 분자구조에있는자유수산화기 (hydroxyl group) 가 peroxynitrite 같은활성산소종을제거하는역할과 Fanton 반응에의해발생하는활성산소종생성에기여하는금속이온을흡착하는특별한구조를가졌기때문이다 5-6). 또한 Hanasaki 등 7) 은 xanthine oxidase 에의한 superoxide radicals 발생을억제함으로서항산화효과가있다고설명하고있다. 하지만 quercetin이파라쿼트에의해유발된유해활성산소종발생과관련된세포손상에대하여어떠한작용을하는지에대하여아직까지연구된바가없다. 이에우리는항산화기능을가진것으로알려진천연물성분중대표적인 quercetin이 in vitro 상에서파라쿼트로유도된세포손상에대한효과를분석하고, 임상적으로파라쿼트의치료제로사용중인 ascorbic acid, N-acetylcysteine 등과항산화능과파라쿼트유도성세포손상에미치는영향을조사하기위해본실험을시행하게되었다. 대상과방법 Eagle medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin 등은 Gibco-BRL사에서구입하였고, ECL protein detection kit, nitrocellulose membrane은 Amersham (Arlington Heighs, IL) 사에서구입하였다. 그외의다른시약들은특급의것을사용하였다. 2. 세포의배양본실험에는 HeLa cells를사용하였으며, penicillinstreptomycin (100ug/ml), 10% heat-inactivated FBS를첨가한 DMEM을배양액으로 5% CO 2, 37 C 에서배양하였으며, 배양접시의바닥면이 70~80% 에도달하면계대배양을시행하였으며모든실험에는계대배양 10 번이내의세포를사용하였다. 3. 세포증식능검사 (MTT assay) 96-well microtiter tissue culture plate (Falcon) 에 HeLa 세포를 103 cells/well로분주하고다양한농도의 paraquat 또는 quercetin을처리하여 5% CO 2, 37 C 에서일정시간동안배양하였다. 배지를제거한후 0.5 mg/ml MTT용액 1 ml을넣고 5% CO 2, 37 C 에서 2시간동안배양하였다. PBS로 2회세척한후 DMSO 200 ul를넣고 30분후 ELISA Microreader 550 (Biorad, USA) 장비를이용하여 540 nm에서흡광도를측정하였다. 상대적흡광도 (Relative absorbance) 는약물농도별흡광도를대조군 ( 약물미처리군 ) 의흡광도로나눈값으로계산하였다. 4. 항산화활성측정항산화활성은 DPPH를이용하여시료의 free radical 소거능을측정하였다 8). 즉에탄올에용해시킨 100 um DPPH용액을 100 ul 씩 96 well plate에분주하고여기에약물을농도별로제조한후 100 ul씩첨가하여최종반응용액이 200 ul로한후 30분간반응을시켰다. 그리고 ELISA Microreader 550을이용하여 540 nm에서흡광도를측정하였고 DPPH의환원에의한흡광도감소를통해각약물의항산화활성을측정하였다. 1. 실험재료 5. 세포형태변화관찰 본실험에사용된 paraquat, quercetin, bovine serum albumin, dimethyl sulfoxide, tetrazolium bromide, DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl) 은 Sigma (St. Louis, MO) 사에서, Dulbeco s modified 100 mm dish에 HeLa 세포를 6 10 5 개씩담고 24 시간동안배양한후대조군 ( 약물미처리군 ), 파라쿼트만처리한군, 파라쿼트와 quercetin을처리한군으로분리하여 5% CO 2, 37 C 배양기에서 48시간동안배양한후,
김 @ 훈외 : 항산화제 Quercetin 이파라쿼트에유도되는세포손상에미치는효과 / 43 inverted microscopy를이용하여세포수와형태변화양상을관찰하였다. 6. Apoptotic DNA Fragmentation assay Quercetin에의해 apoptotic DNA fragmentation이일어나는지검색하기위해 DNA fragmentation assay를수행하였다. 즉 100 mm dish에 HeLa 세포를 5 10 5 개씩담고 24시간동안배양한후 0 um( 대조군 ) 과 50 um( 저농도 ), 200 um( 고농도 ) quercetin을처리하고 5% CO 2, 37 C 에서 24 시간동안배양하였다. 그리고세포를수확한다음차가운 PBS 를넣고원심분리하여배지를제거한후침전된세포를 25 mm EDTA, 0.5% SDS, 0.1 ug/ml proteinase K가첨가된 100 mm Tris-HCl (ph 8.0) 를이용하여 resuspension 한후 60 C 에서 12 시간동안반응시켰다. Phenol/chloroform(1:1) 과 chloroform/isoamyl alcohol(1:24) 을이용하여 DNA 를추출하였다, 이에 95% ethanol을첨가하고원심분리하여 DNA 를침전시키고상층액을제거한후 1시간동안반응시켜 RNA를완전히가수분해시키고 1.6% agarose gel에 5 ug의 DNA 를전기영동하여 DNA ladder를확인하였다. (10 mm Tris-HCl, 0.5% Triton X-100, 10 mm EDTA, ph 8.0) 로 lysis 시킨후 30 분간얼음에서방치한후효소반응 buffer (100 mm HEPES, 10 mm DTT, 10% sucrose, 0.1% CHAPS, 0.1% BSA) 에 cell lysate를첨가한후 100uM Ac-DEVD-AFC (caspase-3에대한 substrate) 을첨가하여 37 에 4시간동안반응시켰다. 그다음효소반응후방출되는 fluorescent는 spectrofluorimeter (Perkin Elmer LS-50B) 를이용하여 400~505 nm에서측정하였다. 8. 통계처리오차범위를줄이기위해동일동시조건에서세포증식능검사, 항산화활성측정, Caspase-3 activity assay를 6회시행한후평균값과표준편차를분석하였고평균값에대한 t- 검정으로유의성을각각확인하였다. 결과 1. HeLa 세포에서의파라쿼트에의한세포독성 7. Caspase-3 activity assay Quercetin에의한 HeLa 세포의 caspase-3 활성변화를관찰하기위해 caspase-3 activity assay를시행하였다. 즉 6 well plate에 HeLa 세포를 1 10 5 cells로 plating하여 24시간동안배양한후 0 um( 대조군 ) 과 50 um( 저농도 ), 200 um( 고농도 ) quercetin을처리하고.5%co 2, 37 C 에서 24 시간동안배양하였다. 그리고세포를수확한다음원심분리후세포를모아 TTE buffer 파라쿼트농도별로 HeLa 세포에미치는독성정도를평가하기위해파라쿼트를농도별로처리한후 24, 48, 72 시간에서의세포독성을측정한결과, 100 um 농도에서는 24시간내 95% 이상의세포손상이관찰되었고, 1 um 농도에서는약물처리후 48 시간부터 50% 정도의세포독성이발생하기시작하였으며 10 um 농도에서는 48 시간에서 95% 이상의세포손상이확인되었다 (Fig. 1). 2. 항산화활성측정 Quercetin 이항산화능을가진파라쿼트의치료제 N- Fig. 1. Cytotoxic activity of paraquat in HeLa cells. HeLa cells were treated with various concentrations of paraquat for the indicated times. Cytotoxicity was determined by MTT assay, and relative absorbance comparing with control group without paraquat treatment was calculated according to doses of paraquat. Fig. 2. DPPH Assay Radical scavenging effect of quercetin, ascorbic acid, and n-acetylcysteine on DPPH radical production were investigated according to concentrations of each drugs.
44 / 대한응급의학회지 : 제 18 권제 1 호 2007 acetylcysteine과 ascorbic acid와의항산화활성비교를위해 DPPH radical 소거효과를검토한결과 quercetin 이 N-acetylcysteine과 ascorbic acid 보다높은항산화활성을보였다. Queretin은 100 um 이상의농도에서비슷한정도의항산화활성을보였으며, ascorbic acid는농도가증가하면서비례적으로항산화활성이증가하는양상이관찰되었다 (Fig. 2). 3. 파라쿼트에유발된세포독성에대한항산화제 quercetin 과 ascorbic acid 의영향 DPPH에서높은항산화활성을보인 qucercetin과 ascorbic acid가파라쿼트에유도된세포손상에미치는효과를관찰하기위해 10 um의파라쿼트처리후 4시간후에동일농도별로 quercetin과 ascorbic acid를처리후 36 시간후에분석한결과, 25 um, 50 um에서는 quercetin이 ascorbic acid보다높은세포보호효과가관찰된반면, 150 um에서는 quercetin보다 ascorbic acid가통계학적으로유의한세포보호효과가관찰되었다 (Fig. 3). 4. 파라쿼트와 quercetin 에의한 HeLa 세포의형태학적변화 10 um 파라쿼트를처리한 4시간후에 HeLa 세포와 quercetin 50 um를처리한후 36 시간배양후위상차현미경으로관찰한결과 quercetin 50 um을함께처리한군에서파라쿼트만처리한군과비교하여생존세포수가의미있게많았다 (Fig. 4). Fig. 3. Effects of quercetin and ascorbic acid on paraquatinduced cytotoxicity HeLa cells were treated with 10 um paraquat and after 4 hour, various doses of quercetin and ascorbic acid were treated. cytotoxicity was determined by MTT assay. 5. Apoptotic DNA Fragmentation assay Quercetin이고농도에서세포보호효과감소원인이 apoptosis 유도와관련이있는지를조사하기위하여대조 A B C Fig. 4. Effects of paraquat & quercetin treatment on the morphology of HeLa cells. HeLa cell were incubated at 37 C for 36 hour. The morphology of the cells was observed under phase contrast microscopy ( 300). (A) no drug treatment (B) only 10 um paraquat treatment (C) 10 um paraquat treatment & 50 um quercetin treatment
김 @ 훈외 : 항산화제 Quercetin 이파라쿼트에유도되는세포손상에미치는효과 / 45 군 ( 약물미처리군 ), 50 um( 저농도 ), 200 um( 고농도 ) quercetin 처리군간의 DNA Fragmentation assay 시행결과, 대조군과 50 um( 저농도 ) quercetin 군에서는 DNA ladder가관찰되지않았으나, 200 um( 고농도 ) quercetin 군에서는 DNA ladder가관찰되었다 (Fig. 5). 6. Caspase-3 activity assay Quercetin이고농도에서세포보호효과감소원인이 caspase-3 활성관련 apoptosis 유도와관련이있는지를조사하기위하여 HeLa 세포에대조군 ( 약물미처리군 ), 50 um( 저농도 ), 200 um( 고농도 ) quercetin 처리군간 caspase-3 활성을분석한결과, 200 um( 고농도 ) quercetin 처리군이대조군 ( 약물미처리군 ) 과 50 um( 저농도 ) 보다의미있는 caspase-3 활성도증가를보였다 (Fig. 6). 고찰과도한활성산소를중화하기위하여다양한항산화제가파라쿼트의중요한치료로사용되고있고더효과적인항산화 제의개발은파라쿼트의치료의임상적적용에중요한역할을할것이다. 이러한관점에서천연물에존재하는다양한항산화능을가진화학물을활용한새로운접근이필요하여본실험을시행하게되었다. 이번실험에서는 HeLa 세포를이용하여세포독성을조사하였으며, 파라쿼트를농도별로세포에처리한결과, 1 um 처리후 48 시간후부터세포독성이확인되어대략 50% 의세포생존률감소가확인되었고 10 um 처리시에는 24 시간에서도세포독성이발생하기시작하였으며 48 시간에는 90% 이상의세포생존감소가확인되어농도와시간에의존적인세포독성을보였다. 또한현미경의세포형태변화에서도파라쿼트처리후 36 시간에정상의 50% 이상의세포손상을확인할수있었다. 이는많은연구들에서다양한세포주에서파라쿼트의농도와시간의존성세포독성과유사한소견이다 9-12). Quercetin은과일, 채소, 다양한식물등에풍부하게함유된 polyphenolic flavonoid 에속하는다양한생물학적효과를가진화합물이다. 현재 quercetin의작용기전에관한 in vitro 상연구는주로항암작용에초점을맞추어많은연구가이루어지고있으며, 유방암, 대장암, 위암, 두경부암, 백혈병, 폐암, 흑색종, 난소암세포주등다양한세포주에서다양한농도에서암세포의성장을억제한다고보고되고있다 13-17). 이러한암세포성장의분자기전으로변이형 P53 의발현을억제하여세포분열단계에서 G2-M 단계에서세포를정지시키거나, tyrosine kinase, Ras 단백질억제를통한세포분열을억제, 그리고 heat shock protein 들을억제하여암세포생존을억제하게하는것으로알려져있다 13-18). 이번실험에서 HeLa 세포에서도 200 um의농도처리시에 apoptotic DNA fragmentation assay에서 DNA ladder 가관찰되고 caspase-3 activity assay 상 caspase-3 활성이대조군보다 3배이상증가하 Fig. 5. Effects of quercetin on DNA fragmentation in HeLa cells HeLa cell were incubated at 37 C for 24h in the absence (0 um) and presence (50 um & 200 um) of quercetin. Total genomic DNA was extracted and electrophoresed on 1.6% agarose gel. Fig. 6. Caspase-3 activity assay 200 um quercetin induced activation of casapase-3 more than those of control (No treatment of quercetin) & 50 um quercetin in HeLa cells.
46 / 대한응급의학회지 : 제 18 권제 1 호 2007 는것을보면고농도의 quercetin에서는 HeLa 세포에서 apoptosis 유도성세포독성을보이는것을알수있었다. 이로인해저농도 quercetin에서보인활성산소종중화에의한세포보호효과가감소하는결과를보였던것으로사료된다. Jeong 등 19) 은 quercetin이 cell-free system 과 human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) 에서Cu +2 에의해산화된 LDL 에유도된 apoptosis를억제하고강력한항산화제로서세포의생존율을증가시킨다고보고하고있으며, Chen 등 20) 은 rat glioma C6 cells에서 quercetin이 H 2O 2 활성산소종에의한 apoptosis와 chemical anoxia에의한 apoptosis 모두를억제한다고발표한바있다. 이번실험에서 quercetin의항산화활성을평가하기위한 DPPH assay에서항산화제로현재파라쿼트의중심치료약물로사용하고있는 ascorbic acid 또는 N-acetylcysteine 보다낮은농도에서도높은항산화활성을보였다. 이러한낮은농도의 quercetin이가진높은항산화활성이파라쿼트에의한활성산소종유도성세포손상을막고세포생존을높인것으로사료된다. 흥미로운점은 ascobic acid는농도가증가함에따라항산화능이비례적으로서서히증가하는양상이었으며, 800 um 농도에서의효과가 quercetin 100 um에서보인항산화활성과비슷한정도를나타내었다. 이는 quercetin의경우낮은농도에서도활성산소종을제거하는능력이 ascobic acid, N- acetylcysteine 보다높은강력한항산화제임을시사한다고평가할수있다. 이에우리는높은항산화활성을보인 quercertin과 ascorbic acid가파라쿼트에의한세포독성에작용하는효과를알아보고자 HeLa 세포에 10 um를처리한다음 4 시간후에 quercetin 농도별로처리하고 36시간후에 paraquat 만처리한대조군과비교하여세포생존정도를평가하였을때, quercetin은 25 um에서파라쿼트만처리한대조군에비해가장높은세포생존을보였고농도가증가함에따라세포생존률이비례적으로감소하는양상을보였다. 하지만 quercetin 농도가 25 um에서 100 um 사이에서는대조군에비교하여의미있는생존증가가관찰되었다. 반면 ascorbic acid를처리한경우에는대조군과비교해의미있는세포생존을보였지만, 25 um과 50 um 에서는 quercetin보다낮은세포생존을보였다. 하지만 100 um과 150 um 에서는오히려 quercetin 처리시보다높은세포생존률을나타냈다. 이에 quercetin의높은농도에서 apoptosis에의한세포독성이원인인지를파악하기위해 apoptotic DNA fragmentation assay를실시한결과 50 um quercetin 처리시관찰되지않던 DNA Ladder가 200 um quercetin 처리시에서관찰되었고, caspase-3 activity assay에서 HeLa 세포에 50 um quercetin 처리한것보다 200 um quercetin 처리시의미있는 caspase -3 활성도증가를보였다. caspase-3는 proenzyme 형태인 procaspase-3로세포내에존재하다가 apoptotic signal을받아활성화된 caspase-8, 또는 caspase-9에의해활성화형태로변화하므로 caspase-3의활성증가는 apoptosis 발생을시사한다. 그러므로 HeLa 세포에서파라쿼트에대한 quercetin 의세포보호작용이고농도에서적은이유는 quercetin에의한 apotsosis 유도로인한것으로판단된다. Chen 등 20) 이 glioma C6 세포주에서 quercetin을농도별로처리한후세포독성정도를평가하였을때 200 um에서의미있는세포생존률감소가관찰되었고 H 2O 2 처리와 chemical anoxia 상태에서 quercetin을처리하였을때 25 um과 50 um에서 quercetin을처리하지않은대조군과비교하여의미있는세포생존을보고하였다. 또한 apoptotic DNA fragmentation assay상에서 H 2O 2 처리와 chemical anoxia에의한 DNA ladder 발생을 25 um과 50 um에서 apoptosis를억제한다고보고한바있다. 아직까지 quercetin의세포효과는강력한항산화제로서의역할과 apoptosis를유발하는항암작용으로서의효과로상반된주장이많다. 본실험에서는다양한농도의파라쿼트처리후각농도별다른 quercetin 농도에서 apoptosis assay, MTT assay 등이시행되지못했고, 단지 HeLa 세포에서이루어진제한점이있어향후다양한세포주를이용한추가적인연구가필요할것으로사료되며더나아가 in vivo에서의효과에대한조사가필요할것이다. 결 이번연구는 HeLa 세포에서 paraquat의세포독성과관련되어 quercetin의효과를분석한것이다. 먼저 HeLa 세포에서 paraquat의세포독성은농도와시간에비례적으로증가하는양상을보였다. 항산화활성능력은 quercetin이전반적으로 ascorbic acid, N-acetylcysteine 보다더높았으며 HeLa 세포에서 quercetin은낮은농도에서는 ascorbic acid 보다우수한세포보호효과가확인되었고높은농도에서는 apoptosis에의한세포독성을보여서농도에따른다른효과가나타나는것으로판단된다. 론 참고문헌 01. Lee EY, Kim YT, Yang JO, Hong SY. Long-term prognosis of paraquat-induced lung injury. J Korean Soc Emerg Med 2003;65:308-14. 02. Suntres ZE. Role of antioxidants in paraquat toxicity. Toxicology 2002;180:65-77.
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