Journal of Biomedical Engineering Research 39: 147-152 (2018) http://dx.doi.org/10.9718/jber.2018.39.4.147 학술논문 폐전이암에대한 Lipid Coated Polymeric Nanoparticles 에관한연구 박준영 1ǂ 박상효 2ǂ 조예림 1 정민지 2 김인우 2 강원준 1 기재홍 2 1 연세대학교의과대학신촌세브란스병원핵의학과, 2 연세대학교보건과학대학의공학부 Study of Lipid Coated Polymeric Nanoparticles for Lung Metastasis Junyoung Park 1ǂ, Sanghyo Park 2ǂ, Yerim Jo 1, Minji Jeong 2, Inwoo Kim 2, Wonjun Kang 1 and Jaehong Key 2 1 Department of Nuclear Medicine, Severance Hospital, Yonsei University College of Medicine 2 Department of Biomedical Engineering, College of Health Sciences, Yonsei University (Manuscript received 29 March 2018 ; revised 28 May 2018 ; accepted 26 June 2018) Abstract: Lung cancer and pulmonary metastasis are the leading cause of cancer mortality worldwide. Survival for patients with lung metastases is about 5%. Nanoparticles have been developed for the imaging and treatment of various cancers, including pulmonary malignancies. In this work, we report lipid coated polymeric nanoparticles (LPNs) with an average diameter of 154 nm. In vivo performance of LPNs was characterized using optical imaging system. We expect this nanoparticle can be used for finding lung cancer or lung metastasis. Eventually loading therapeutic drug with the nanoparticle will be utilized for cancer diagnosis and effective therapy at the same time. 147 Key words: Lung cancer, Lung metastasis, Lipid coated polymeric nanoparticles, Imaging I. 서론 미세먼지, 과체중, 신체활동부족, 흡연및고령화사회로인해전세계적으로암발생률및사망률이증가하고있다. 그중에서도특히폐암의발생률은전체암발생률중, 남성은 1위 (16%), 여성은 3위 (8.8%) 이고, 사망률은남성은 1위 (23.6%), 여성은 2위 (13.8%) 로매우높은수치를나타낸다 [1]. 폐암은증상이초기에나타나지않아조기진단이어렵고, 폐암전이가진행됨에따라효과적인치료방법이없어진단과치료에많은어려움이있다 [2]. 암치료의주된방법은외과적치료, 방사선치료, 항암화학요법이주를이 ǂ Contributed equally to this work. Corresponding Author : Jaehong Key Department of Biomedical Engineering, Yonsei University, 1 Yonseidae-gil, Wonju, Gangwon-do, 220-710, South Korea TEL: +82-33-760-2587 E-mail: jkey@yonsei.ac.kr 이연구는 2017 년도정부 ( 미래창조과학부 ) 의재원으로한국연구재단 (No. 2018R1D1A1B07042339), 바이오의료기술개발사업 (2016- M3A9B4919711), 2018 학년도연세대학교원주캠퍼스미래선도연구사업 (2018-62-0054) 의지원을받아수행된연구임. 루고있다. 가장대표적인항암화학제의경우정상세포와암세포의구분없이비특이적으로체내에분포함으로서암세포를죽일수있는충분한양의약물농도를얻기어려우며동시에정상세포에미치는독성으로인해부작용이발생해효과적인치료가이루어지지못하고있다 [3,4]. 이러한문제점을개선시키기위해나노입자를이용한약물전달시스템이활발히연구되고있다 [5]. 나노입자를활용하면항암제만투여했을때보다특정세포에특이적으로약물을전달할수있기때문에충분한양의약물농도를얻어효과적으로치료가가능하며부작용도줄일수있다 [6]. 예를들어, Huan Meng et al. 의연구는대표적인항암제 Doxorubicin 을단독으로투여하는것보다나노입자에적재하여투여하는것이치료효과가더높은것으로보고하였다 [7]. 또한, 나노입자를활용하면약물의안정성향상, 친유성및친수성약물모두를운반할수있다는장점이있으며, 현재나노입자를활용해임상에서치료용으로사용하고있다 [8,9]. 나노입자가암세포에전달되는메커니즘은 Enhanced Permeability and Retention (EPR) effect로설명되어진다 [10]. EPR effect란 Solid tumor에서의신생혈관의높
폐전이암에대한 Lipid Coated Polymeric Nanoparticles 에관한연구 - 박준영 박상효 조예림 정민지 김인우 강원준 기재홍 148 은혈관밀도와 tumor의혈관벽에존재하는내피세포의간극이넓은특성에따라 macromolecule의축적이용이한특성을나타낸다. 이를이용하면나노입자를활용한 anticancer therapy가가능하게된다 [11]. 한편, 20-200 nm의크기인나노입자가이러한 EPR effect에효과적이라고보고되어있다 [12]. 본연구팀에서보고한 lipid nanoparticle은이러한 EPR effect를이용하여암세포주변에효과적으로축적될수있고, 암진단및치료용으로활용될수있는가능성을보고하였다 [13-15]. 한편, 이러한입자가폐전이암모델에서의활용도에대해평가된적이없다. 따라서본연구에서는폐전이암모델에서의 lipid nanoparticle의활용가능성에관해실험하였다. 본연구에서는 Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) 를이용하여나노입자를합성하였고, positron emission tomography (PET) 진단에사용되는 zirconium-89 ( 89 Zr, t 1/2 = 78.41 h) 을표지하기위하여 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolnamine-deferoxamine (DFO-DSPE) 를사용하였다 [16]. 이러한입자의체내분포와폐전이암에대한약물전달체로서의가능성을평가하기위해서 Cyanine 5.5 (Cy5.5) 를입자에로딩하였다. 입자의안정한정도와입자가얼마나균일하게형성되었는지를나타내는지표인 polydispersity index (PDI) 를통해입자의안정성을평가하였다 [17]. 이외에도생성한나노입자가실제암조직에축적이되는지알아보기위해 squamous cell carcinoma 7-green fluorescent protein (SCC7-GFP) 편평상피암세포를이용하여폐전이암모델을준비하였고, 입자의축적률을평가하였다. 1. Materials II. 연구방법 입자를구성하는 Resomer RG 504 H, Poly (D,L-lactideco-glycolide) (PLGA) (acid terminated, lactide:glycolide 50:50, Mw 38,000-54,000) (719900 ALDRICH, SIGMA- ALDRICH Co, Saint Louis, MO, USA), Poly (ethylene glycol) dimethacrylate (PEG) (average Mn 750) (437468 ALDRICH, SIGMA-ALDRICH Co, Saint Louis, MO, USA), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolaminedeferoxamine (DFO-DSPE), Cyanine 5.5 NHS ester (Cy5.5) (27020, LUMIPROBE Co, Hunt Valley, FL, USA) 를구매하여합성을진행하였다. 2. DFO-LPNs 생산공정 나노입자는 Nanoprecipitation method를활용하여합성하였다 [15]. PEG solution (1.33 mm, 증류수용매 ), DFO-DSPE solution (133 mm, CHCl 3 +MeOH 용매 ), water 2.5ml 을혼합한후 probe type sonicator 를사용하여 homogenization하였다. 이러한혼합액에 PLGA solution (3.23µM, CHCl 3 용매 ) 을 drop-let 방식으로넣었다. 이혼합물을상온에서교반하면서유기용매를증발시킨후, 나노입자를염색하기위해 Cy5.5를추가하였다. Overnight 교반후, 원심분리시켜상층액을제거하여불순물과나노입자를분리하였다. 3. DFO-LPNs 의특성분석 이연구에서 Zeta sizer (Nano zs90, Malvern Instruments, UK) 를이용하여나노입자의평균크기, 표면전하 (zeta potential), PDI 를측정하였다. 이러한특성외에도 Nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) 을이용하여 PLGA, PEG, DFO-DSPE가실제로합성한나노입자에존재하는지알아보았으며, Transmission electron microscopy (TEM) 을이용하여 DFO-DSPE가실제로합성한나노입자의표면에존재하는지알아보았다. 4. SCC7-GFP 세포및배양 암세포배양은 10% fetal bovine serum (FBS, GibcoBRL Co., USA) 과 1% 의페니실린-스트렙토마이신, minimal essential medium (MEM) (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) 을혼합하여사용하였다. 세포는 37 o C, 5% CO 2 조건의배양기에서배양하였다. 5. 실험동물 본연구에서실시한동물실험은연세의료원동물실험윤리위원회의승인 ( 승인번호 : 2015-0046) 을받았으며, 실험동물의관리와사용에관한관리규정을준수하였다. 실험동물은 7주령의암컷 Balb/c 누드마우스를 ( 주 ) 오리엔트 ( 성남, 한국 ) 으로부터구입하였다. 실험동물실에서 1주일동안사육하여안정화시킨후상태가양호한 5마리를선별하여실험하였다. SCC7-GFP 세포를 1 10 7 개 /ml로희석한후 30 gauge 1/2 바늘을이용하여 Balb/c 누드마우스의꼬리정맥내에 0.1 ml를주사하였다. 종양세포주입후 14일째미세전산화단층촬영 (micro-computed tomography, micro- CT) (NFR Polaris-G90, NanoFocus Ray Co., JeonJu, Korea) 을이용하여종양의해부학적위치를확인하였다. 통계적유의성을위해모든경우에대하여 3회반복실험하였다. 6. 소동물광학생체영상 폐전이종양마우스에서의광학생체영상은 IVIS spectrum imaging systems (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA) 을사용하여획득하였다. 폐전이종양마우스를 2% isoflurane으로호흡마취시킨후, 1 mg/
Journal of Biomedical Engineering Research 39: 147-152 (2018) ml으로희석된 Cy5.5-DFO-LPNs 100 µl (n = 3) 를꼬리정맥을통하여주사하였다. 주사후 6시간및 24시간경과후, 마우스에서혈액, 간, 심장, 폐, 비장, 신장, 근육을적출한후발광영상을획득하였다. 획득한영상자료는 Living Imaging Software version 4.4 (Caliper Life Science) 를이용하여분석하였다. 정량분석을위하여각장기별로관심영역 (Region of interest) 을설정한후, 관심영역내에서발생하는광자방출량을 radiant efficiency ([photons/sec/cm 2 / sr]/[µw/cm 2 ]) 로측정하여분석하였다. 분은안쪽을향하게된다. 그림 1B는 DFO-LPNs 나노입자의평균크기및분포도와 zeta potential, PDI 값의크기를나타내었다. DFO-LPNs의평균크기는 154.1nm, zeta potential은 30.1 mv로음전하를띄고 PDI는 0.191 Ⅲ. 연구결과및고찰 1. DFO-LPNs의물리적특성그림 1A 는합성한나노입자가어떤구조로결합되어있는지를나타내는모식도이다. 일반적으로 PLGA와 PEG는자기조립 (self-assembly) 형태로결합하며, sonication을해주는이유는물과유기용매를잘혼합하기위함이다. 또, 이모든과정은 water 상에서진행하기때문에 DFO- DSPE의 hydrophilic 성질을띄고있는 head 부분이바깥쪽을향하며, 반대로 hydrophobic 성질을띄고있는 tail 부 그림 2. NMR 결과 ( 빨간선 : DFO-LPNs, 검은선 : LPNs). Fig. 2. Result of NMR (red line : DFO-LPNs, black line : LPNs). 149 그림 1. 나노입자의크기분석 (A. 나노입자의모식도, B. Dynamic light scattering (DLS) 결과, C. TEM 결과 ). Fig. 1. Size analysis of DFO-LPNs (A. schematic illustration of DFO-LPNs, B. result of Dynamic light scattering (DLS), C. result of TEM).
폐전이암에대한 Lipid Coated Polymeric Nanoparticles 에관한연구 - 박준영 박상효 조예림 정민지 김인우 강원준 기재홍 150 이다. PDI가 0.1 이하에대해서는입자가 monodisperse하다고정의하고, 0.1 이상에서는 polydisperse하다고알려져있다. 예를들어, Masarudin et.al. 의연구에서 PDI가작을수록균일하게분포된나노입자를 Atomic Force Microscopy (AFM) 에서관찰하였고, PDI값이 0.5이상이면 aggregated nanoparticles로보고하였다 [17]. 따라서 DFO-LPNs는균일하게분포하고안정적으로합성되있음을알수있다. 그림 1C는입자의 TEM 사진이다. DFO- DSPE가나노입자를 7.56nm의두께로코팅하고있는것을확인할수있다. 그림 2 는 DFO-LPNs 의 NMR spectrum 을나타내었다. 그래프에서 PLGA는 1.6 ppm, PEG는 3.65 ppm, DFO- DSPE는 2.0 ppm에서피크가나타난다. 따라서, DFO- LPNs는나노입자를구성하는 PLGA, PEG, DFO-DSPE 를모두함유하고있는것으로확인되었다. 2. 폐전이종양마우스모델 꼬리정맥내 SCC7-GFP 세포를주입한후 14일의사육후 micro-ct를이용하여종양의해부학적위치를확인한결과대조군에서는전혀종양형성이이루어지지않았으나, SCC7-GFP 세포를주입한실험군에서는폐내종양의 그림 3. Micro-CT 를이용한정상폐와폐전이암의영상. Fig. 3. Normal lung and lung metastasis image by micro-ct. 형성을관찰할수있었다 ( 그림 3). 타장기로의전이여부를확인하기위하여안락사시킨후해부를시행하여주요장기를채취후 IVIS spectrum을이용하여 GFP의발현 (Excitation: 465/Emission: 520) 을획득하였다. Ex vivo 영상에서혈액, 간, 심장, 비장, 신장, 근육에서는 GFP 발현이관찰되지않았으나폐에서만 GFP 발현이관찰되었다. 정상마우스모델과비교하였을때폐전이종양마우스모델에서만폐에서 GFP 발현이관찰되어폐전이가성공적으로진행된것을확인할수있었다 ( 그림 4). 3. DFO-LPNs의생체분포폐전이종양모델을이용하여 DFO-LPNs의생체분포를평가하였다. DFO-LPNs에 Cy5.5를표지후폐전이종양마우스에 100 µg의 Cy5.5-DFO-LPNs를정맥내주사하였고, 6시간과 24시간경과후주요장기를적출하여광학영상을획득하였다 ( 그림 5A). 주요장기의 ex vivo imaging에서 Cy5.5-DFO-LPNs는간에가장많이축척되었다는것을확인할수있었다. 폐에서의광자방출량을 radiant efficiency ([photons/sec/cm 2 /sr]/[µw/cm 2 ]) 로변환하여측정한결과에서는투여후 6시간에 8.2 ± 2.5에서 24시간후 6.5 ± 1.7로감소하였으나, 간에서의형광량은투여후 6시간에 30.5 ± 4.5에서 24시간후 41.7 ± 5.6으로증가하였다 ( 그림 5B). 비장에서는투여후 6시간에 3.1 ± 0.2 에서 24시간후에도 2.9 ± 0.1로큰변화없이일정량을유지하였다. Cy5.5-DFO-LPNs 투여후 24시간에 IVIS spectrum을이용하여폐에서의 GFP의발현과 Cy5.5 의형광 (Excitation: 675/Emission: 720) 영상을획득후 Living Imaging Software의 spectral unmixing tools을활용하여융합하였다 ( 그림 6). 융합영상에서 GFP의발현과축적된 Cy5.5- DFO-LPNs에서방출되는 Cy5.5의형광의분포가유사한것을확인할수있었다. Ⅳ. 결론 그림 4. IVIS 스펙트럼을이용한정상및암전이주요장기들의 GFP 발현영상. Fig. 4. GFP expression image in major organs using the IVIS spectrum. 본연구에서는긴반감기를가진방사선동위원소 89 Zr을적재하기위한 DFO-LPNs를생산하였다. 합성한나노입자의기본적인특성인평균크기, 표면전하, 안정성정도를측정한결과 DFO-LPNs의평균크기는 154.1 nm로 EPR effect에적합한크기이고, zeta potential은 30.1 mv, PDI는 0.191 이었다. 또한 NMR spectrum 분석을통해합성한나노입자가 PLGA, PEG, DFO-DSPE로구성되었다는점을확인하였고, TEM의영상에서 DFO-DSPE가나노입자에 7.56 nm의두께로코팅된것을확인하였다. 폐전이종양마우스모델을 micro-ct를통해종양의형성
Journal of Biomedical Engineering Research 39: 147-152 (2018) 그림 5. SCC7-GFP 종양을가진마우스의절개된기관에대한체외광학영상 (A. Cy5.5-DFO-LPNs 정맥주사후 6 시간, 24 시간후마우스의절개된기관에대한 IVIS 영상, B. 절개된기관의형광정량화 ). Fig. 5. Ex vivo optical imaging of SCC7-GFP tumor-bearing mice (A. Representative IVIS images at 6 h and 24 h after intravenous injection of Cy5.5-DFO-LPNs, B. Fluorescence quantification, expressed as the radiant efficiency ± standard deviation (SD)). 151 그림 6. Cy5.5-DFO-LPNs 주입 6 시간후의해부된폐조직의체외광학영상. Fig. 6. Representative ex vivo optical imaging of lung tissue 6h after intravenous injection of Cy5.5-DFO-LPNs. 을관찰하였다. 타장기로의전이여부를 IVIS spectrum을이용해 GFP의발현을확인해본결과혈액, 간, 심장, 비장, 신장, 근육에서는 GFP 발현이관찰되지않았으며폐에서만 GFP 발현이관찰되어폐전이종양마우스모델이확립되었음을확인할수있었다. 폐전이종양마우스모델에 Cy5.5-DFO-LPNs를투여후 6시간과 24시간경과후주요장기를적출하여영상을획 득하였다. 주요장기중간에가장많이축적이된것을확인할수있었다. 폐에서는 6시간후에 8.2 ± 2.5 에서 24시간후 6.5 ± 1.7로감소하였으나, 간에서의형광량은투여후 6시간에 30.5 ± 4.5에서 24시간후 41.7 ± 5.6으로증가하였다. IVIS spectrum을이용하여관찰한영상을보면폐의암조직에서발현하는 GFP와 Cy5.5-DFO-LPNs에서발현하는 Cy5.5의위치가유사한것을확인할수있었다.
폐전이암에대한 Lipid Coated Polymeric Nanoparticles 에관한연구 - 박준영 박상효 조예림 정민지 김인우 강원준 기재홍 152 기존나노입자에관한선행연구에따르면 Free Cy5.5 역시암주변에축적되는것으로보고되어있지만나노입자를통해전달된 Cy5.5의경우, EPR effect로인하여약 3.8 배에서 13배더많은양이암주변및암세포에축적된것으로보고되었다 [18,19]. 또한, 본연구팀의선행연구에서폐전이암이형성되지않은모델과본연구에서의폐전이암모델의실험결과를바탕으로비교하였을때, 간대비폐의축적률이약 7.6% 더높은것을확인할수있었다 [13,14]. 따라서, 본연구의 LPNs는 Lung metastasis에대한약물전달체로서의활용가능성을나타내었다. 따라서본연구결과를바탕으로 DFO-LPNs는방사선영상을이용한폐질환진단및치료를위한나노입자로평가될계획이다. 참고문헌 [1] L.A. Torre, F. Bray, R. L. Siegel, J. Ferlay, J. Lortet-Tieulent, and A. Jemal, Global cancer statistics, 2012, CA Cancer J Clin, vol. 65, pp. 87-108, 2015. [2] F.R. Hirsch, W.A. Franklin, A.F. Gazdar, and P. A. Bunn, Jr., Early detection of lung cancer: clinical perspectives of recent advances in biology and radiology, Clin Cancer Res, vol. 7, pp. 5-22, 2001. [3] L. Brannon-Peppas and J.O. Blanchette, Nanoparticle and targeted systems for cancer therapy, Advanced Drug Delivery Reviews, vol. 64, pp. 206-212, 2012. [4] S.S. Feng and S. Chien, Chemotherapeutic engineering: Application and further development of chemical engineering principles for chemotherapy of cancer and other diseases, Chemical Engineering Science, vol. 58, pp. 4087-4114, 2003. [5] T.M. Allen and P. R. Cullis, Drug delivery systems: entering the mainstream, Science, vol. 303, pp. 1818-22, 20.04. [6] O.C. Farokhzad and R. Langer, Impact of nanotechnology on drug delivery, ACS Nano, vol. 3, pp. 16-20, 2009. [7] H. Meng, M. Xue, T. Xia, Z. Ji, D.Y. Tarn, J.I. Zink, et al., Use of size and a copolymer design feature to improve the biodistribution and the enhanced permeability and retention effect of doxorubicin-loaded mesoporous silica nanoparticles in a murine xenograft tumor model, ACS Nano, vol. 5, pp. 4131-44, 2011. [8] M.E. Davis, Z.G. Chen, and D.M. Shin, Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer, Nat Rev Drug Discov, vol. 7, pp. 771-82, 2008. [9] V. Jenning, A. Gysler, M. Schafer-Korting, and S. H. Gohla, Vitamin A loaded solid lipid nanoparticles for topical use: occlusive properties and drug targeting to the upper skin, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, vol. 49, pp. 211-218, 2000. [10] H. Maeda, J. Wu, T. Sawa, Y. Matsumura, and K. Hori, Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review, J Control Release, vol. 65, pp. 271-84, 2000. [11] J. Fang, H. Nakamura, and H. Maeda, The EPR effect: Unique features of tumor blood vessels for drug delivery, factors involved, and limitations and augmentation of the effect, Adv Drug Deliv Rev, vol. 63, pp. 136-51, 2011. [12] F. Danhier, To exploit the tumor microenvironment: since the EPR effect fails in the clinic, what is the future of nanomedicine?, Journal of Controlled Release, vol. 244, pp. 108-121, 2016. [13] S. Aryal, J. Key, C. Stigliano, J.S. Ananta, M. Zhong, and P. Decuzzi, Engineered magnetic hybrid nanoparticles with enhanced relaxivity for tumor imaging, Biomaterials, vol. 34, pp. 7725-32, 2013. [14] S. Aryal, J. Key, C. Stigliano, M.D. Landis, D.Y. Lee, and P. Decuzzi, Positron emitting magnetic nanoconstructs for PET/MR imaging, Small, vol. 10, pp. 2688-96, 2014. [15] C. Stigliano, J. Key, M. Ramirez, S. Aryal, and P. Decuzzi, Radiolabeled Polymeric Nanoconstructs Loaded with Docetaxel and Curcumin for Cancer Combinatorial Therapy and Nuclear Imaging, Advanced Functional Materials, vol. 25, pp. 3371-3379, 2015. [16] G. Fischer, U. Seibold, R. Schirrmacher, B. Wängler, and C. Wängler, 89Zr, a radiometal nuclide with high potential for molecular imaging with PET: chemistry, applications and remaining challenges, Molecules, vol. 18, pp. 6469-6490, 2013. [17] M.J. Masarudin, S.M. Cutts, B.J. Evison, D.R. Phillips, and P.J. Pigram, Factors determining the stability, size distribution, and cellular accumulation of small, monodisperse chitosan nanoparticles as candidate vectors for anticancer drug delivery: application to the passive encapsulation of [14C]- doxorubicin, Nanotechnology, science and applications, vol. 8, p. 67, 2015. [18] Y. Hao, Y. Huang, Y. He, J. Peng, L. Chen, X. Hu, et al., The evaluation of cellular uptake efficiency and tumor-targeting ability of MPEG PDLLA micelles: effect of particle size, RSC Advances, vol. 6, pp. 13698-13709, 2016. [19] S.S. Pedrosa, P. Pereira, A. Correia, and F.M. Gama, Targetability of hyaluronic acid nanogel to cancer cells: In vitro and in vivo studies, Eur J Pharm Sci, vol. 104, pp. 102-113, 2017.