Research article ISSN 2234-7658 (print) / ISSN 2234-7666 (online) ph 4.3 과 ph 7.0 의과포화용액에서불소의농도가합성수산화인회석의결정성장에미치는영향 신한얼 1, 박성호 1, 박정원 2, 이찬영 1 * 1 연세대학교치과대학보존학교실 2 강남세브란스치과병원보존과 Effect of fluoride concentration in ph 4.3 and ph 7.0 supersaturated solutions on the crystal growth of hydroxyapatite Haneol Shin 1, Sung-Ho Park 1, Jeong-Won Park 2, Chan-Young Lee 1 * 1 Department of Conservative Dentistry, Yonsei University College of Dentistry, Seoul, Korea 2 Department of Conservative Dentistry, Gangnam Severance Hospital, Yonsei University College of Dentistry, Seoul, Korea Received December 17, 2011; Last Revision January 13, 2012; Accepted January 20, 2012. 1 Shin H, DDS, Graduate Student; Park SH, DDS, MSD, PhD, Professor; Lee CY, DDS, MSD, DDSc, Professor, Department of Conservative Dentistry, Yonsei University College of Dentistry, Seoul, Korea 2 Park JW, DDS, MSD, PhD, Associate Professor, Department of Conservative Dentistry, Gangnam Severance Hospital, Yonsei University College of Dentistry, Seoul Korea *Correspondence to Chan-Young Lee, DDS, MSD, DDSc. Professor, Department of Conservative Dentistry, Yonsei University College of Dentistry, 50 Yonsei-ro, Seodaemun-gu, Seoul, Korea 120-752 TEL, +82-2-2228-8701; FAX, +82-2-313-7575; E-mail, chanyoungl@ yuhs.ac Objectives: Present study was undertaken to investigate the crystal growth onto synthetic hydroxyapatite (HA) seeds in ph 4.3 and ph 7.0 supersaturated solutions with different fluoride concentrations. Materials and Methods: 8 groups of ph 4.3 and 7.0 calcium phosphate supersaturated solutions were prepared with different fluoride concentrations (0, 1, 2 and 4 ppm). Calcium phosphate precipitates yield crystal growth onto the HA seed surface while solutions flow. For evaluation of crystallizing process, the changes of Ca 2+, PO 4 3-, F - concentrations of the inlet and outlet solutions were determined. The recovered solid samples were weighed to assess the amount of minerals precipitated, and finally determined their composition to deduce characteristics of crystals. Results: During the seeded crystal growth, there were significantly more consumption of Ca 2+, PO 4 3-, F - in ph 4.3 solutions than ph 7.0 (p < 0.05). As fluoride concentration increased in ph 4.3 solution, Ca 2+, PO 4 3-, F - consumption in experimental solutions, weight increment of HA seed, and fluoride ratio in crystallized samples were increased. There were significant differences among the groups (p < 0.05). But in ph 7.0 solution, these phenomena were not significant. In ph 7.0 solutions, analyses of crystallized samples showed higher Ca/P ratio in higher fluoride concentration. There were significant differences among the groups (p < 0.05). But in ph 4.3 solution, there were not significant differences in Ca/P ratio. Conclusions: Crystal growth in ph 4.3 solutions was superior to that in ph 7.0 solutions. In ph 4.3 solutions, crystal growth increased with showed in higher fluoride concentration up to 4 ppm. (Restor Dent Endod 2012;37(1):16-23) Key words: Fluoride concentration; Hydroxyapatite; ph; Seeded crystal growth 서론 법랑질의초기우식과재광화현상은표면과표면하부에서무기질의용해와침착이동시에일어나는역동적인과정임이밝혀져있고이기전은인산칼슘염의용해도곡선을통해동력학적으로설명되고있다. 1,2 용해도곡선은각각의인산칼슘염의용해도를 ph 의변화에따라나타낸그래프로, 이곡선위쪽은과포화상태로광물이침착되는방향으로동력을받고, 곡선의아래는불포화상태로광물의소실이일어나는방향으로동력을받게된다. 구강내환경의계속적인변화로법랑질을둘러싸는유 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/ by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 16 Copyights 2012. The Korean Academy of Conservative Dentistry.
Effect of fluoride on the crystal growth 체의조성이변화하면, 이에따라탈회와재광화가역동적으로일어나게된다. 따라서치아우식의예방및초기우식병소의재광화를위한연구가이러한인산칼슘염의동역학의이해에기본을두고있다는것은자명하다. 인산칼슘은치아와골조직의무기질을이루는주성분이며이중에서수산화인회석 (HA, hydroxyapatite) 은이러한광물질의원형으로사료된다. 법랑질은고도로광화된무기질로구성되어있으며 HA가용적비로 90-92% 의비율을차지한다. 3 따라서법랑질결정의광화작용을연구하는데있어합성 HA를이용한결정성장의기전을조사하는것은의미있는일이다. 광화기전을연구하는여러방법론중 Seeded crystal growth 실험모형은과포화용액에의한 HA의결정성장의관련인자를파악하는데적절하다고알려진실험방법이며많은연구자에의해이방법을이용한결정성장실험이이루어져왔다. 4-7 이실험모형은이미형성된법랑질결정에인접한좁은부위에서발생하는광화과정을재현한것으로, 일정속도로일정한농도의유액을흐르게함으로써법랑질결정을둘러싸는유체의생리적환경과유사하도록한것이다. 8 그러나반응주의국소부위에따라침전을위한용액조성이나이온의동력이다를수있으므로결정침전역학을정확히규명하기어려울수도있다. 그러나기존의같은모형을사용한연구및본연구를통해어느정도실험의유효성및일관성을보여, 이러한제한적요소는무시할수있을것이라사료된다. 또한이실험모형은치아법랑질의구조를재현하지못한다는점에서 acid buffer system에서치아절편을이용한재광화연구와는차이를보인다. 따라서법랑질의표층과표면하층의광화양상의차이, 광화깊이등에대한고찰은불가능하다. 그러나본모형을이용한연구방법은유체의이온조성에따른결정성장의기전과그역학을더심도있게이해하기에유용한실험방법이라사료된다. Seeded crystal growth 실험모형중, 소형반응주 (reaction column), 연동펌프 (peristaltic pump) 그리고양쪽 vessel을연결하는 tube로구성된간단한실험모형이 Mura-Galleli에의해소개되었으며이, 오, 권등에의해결정성장반응과정을평가하는데있어유용함이입증되었다. 8-11 또한이, 권등은이실험에서 seed로인간법랑질과합성 HA 두종류를사용하였는데, 이에따른결정의형태와양은 seed 의종류에관계없이그표면적에만영향을받음이밝혀졌다. 이를통해보아합성 HA를이용한연구는법랑질의결정침전역학을이해하는데유용할것으로사료된다. 한편, 법랑질의생물학적인광화작용을조절하는중요인자로칼슘, 인, 불소등 mineral을둘러싸고있는유체의이온조성, 단백질, 유기산등의유기질성분그리고포화도, 시간, ph 등의 mineral의침전역학에영향을끼치는여러조절인자들이알려져있고이들에대한많은연구가있어왔다. 12-14 이중불소는광화를촉진, 안정화시키는주요인자로알려져있는데, 이인산칼슘이수화물 (DCPD, dicalcium phosphate dehydrate) 나인산팔칼슘 (OCP, octacalcium phosphate) 등의가수분해를촉진하여 apatite의침전을유도하며, 직접 apatite 결정의수산화기를치환하여불화인회석 (FAp, fluoroapatite) 를형성하게되면, 구조와크기변화가관찰되며, 더높은정전기적결합을통해화학적으로더안정해지는것으로알려져있다. 15-19 그러나법랑질의광화를이루는가장좋은조건의불소농도에대해 서는이견이있다. 불소농도에따른결정성장비교연구에서이, 오, 권, Amjad와 Nancollas 등은 6 ppm 이하의범위에서불소농도가증가할수록결정성장량이증가한다고하였다. 9-11,20 한편, 치아시편을이용한재광화연구에서는 Ten Cate 등은불소가없는경우보다 1 ppm 의불소가포함되었을때 2배의재광화가일어났다고하였고, 한등은불소농도가 1 ppm이나 4 ppm일때보다 2 ppm일때재광화양상이가장뚜렷하다하였다. 21,22 그러나 Lammers 등은 2 ppm의불소가포함된실험군에서불소가포함되지않은군보다치아의재광화가유의하게적게일어났다고하였다. 23 또한 ph의변화에따른광화정도의차이에대한많은연구가있었으나역시이에대해의견일치에이르지못하고있다. 인간치아시편을이용한재광화연구에서 Feagin 등은법랑질표층의재광화와완충용액의 ph 증가사이에는비례적상관관계가있다하였고, Featherstone 등은법랑질의재광화에있어표층의과침착및추가적인탈회의가능성을최소로하는최적의 ph는 6.0 이라하기도하였다. 24,25 김등은 ph 4.0에서 ph 5.5 사이의완충용액에서의법랑질의재광화양상을비교하였는데 ph 5.5에서가장좋았다고하였다. 26 반면, 권등은 ph 6.0보다 ph 4.3의환경에서심부까지재광화가잘일어남을보고하였고, Yamazaki 등의실험에서도 ph 7.0보다 ph 4.8의환경에서심부까지재광화가일어나는것이관찰되었다. 27,28 또한, 송등은산성의환경에서재광화시에우식이진행되는확산경로가유지되어심부까지완충용액이확산될수있음을보고하였다. 29 위와같이불소와 ph 등이치아법랑질의광화작용에미치는영향에대한많은연구에도불구하고, 아직그기전에대한정확한이해나일치된의견의정립이아직이루어지지못하고있는상태이다. 이에치아의광화에있어불소와 ph의영향을알아보고자 ph 4.3과 ph 7.0 의과포화용액에서불소농도변화에따른법랑질인공우식절편의재광화양상을비교한연구가선행된바있다. 30 이결과 ph 4.3에서는불소의농도가증가됨에따라심부와표면에서재광화가많이일어남이관찰되었고, ph 7.0에서는불소농도증가에따라비교적표면의재광화가우월하고심부의재광화가잘일어나지못하는양상을보였다. 본연구에서는위의재광화연구에이용된과포화용액의실험군을동일하게이용하여실험모형의유효성이이미밝혀진소형반응주를통한 seeded crystal growth 실험을시행하여관찰된광화양상을선행연구결과와비교하고자한다. 본연구는기존의치아시편을이용한연구에서각치아시편의불균일성, 법랑질의각위치에따른침투역학의차이등과같이광화에연관되는복잡한요소를단순화하여 HA에대한완충용액의직접적인결정성장역학을판단할수있을것이며, 치아시편에서어려운정량적분석을통해광화과정을이해하는데도움을받을수있을것이다. 따라서본연구의목적은포화도가동일하게설계된 ph 4.3과 ph 7.0, 두종류의과포화용액에서불소농도의변화가합성 HA를이용한 seeded crystal growth에미치는영향을정량적으로분석하는것이다. 연구재료및방법 Seed 재료의준비 Crystal growth 를위한 seed 로써합성된 HA 를이용한다. HA 현탁액 www.rde.ac 17
Shin H et al. (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA, 분자량 502.31) 에 3 차증류수를넣고원심분리기 (Micro 12, Hanil, Incheon, Korea) 를이용하여 3 회이상반복세척시행하였다. 이를약 24 시간동안동결건조기 (freeze dryer, Ilshin lab co., Seoul, Korea) 를이용하여동결건조후이분말을 seed material 로사용하였다. 실험용액의조제 Stock 용액의조제 30% 유산 (Lactic acid) 수용액 (Sigma-Aldrich Co., 분자량 90.08) 으로부터 1 M 의용액을, 염화칼슘 2 수화물 (CaCl 2.2H 2 O) 분말 (Sigma- Aldrich Co., 분자량 147.01) 과, 인산칼륨 (KH 2 PO 4 ) 분말 (Sigma-Aldrich Co., 분자량 136.09) 로부터각각 0.1 M 용액을조제하였다. 또한불화나트륨 (NaF) 분말 (Sigma-Aldrich Co., 분자량 41.99) 로부터 100 ppm (5.26 mm) 용액을조제하였다. 유산 stock 용액은 8 N 수산화칼륨 (KOH) 표준용액 (Sigma-Aldrich Co.) 및페놀프탈레인지시약 (Sigma-Aldrich Co.) 을이용하여적정하였고, 염화칼슘및인산칼륨 stock 용액은용액의칼슘및인산이온의농도를 ion chromatography (790 Personal IC, Metrohm, Herisau, Switzerland) 를통해정량분석하여확인하였다. 또한불화나트륨용액은 fluoride combination electrode (model 9609, Thermo scientific, Waltham, MA, USA) 를이용하여확인하였다. 실험용액의조제 Seeded crystal growth 를위한인산칼슘과포화용액을제조하기위하여준비한각 stock 용액으로부터계산된양만큼취하여사용하였고, 각용액에는방부제로써 3.08 mm 의아지드화나트륨 (NaN 3 ) 분말 (Sigma-Aldrich Co.) 을첨가하였다. 마지막으로 ph meter (Model 920A, Orion Research Inc., Beverly, USA) 계측하에수산화칼륨용액을첨가하여실험군에따라 ph 값이 4.3 과 7.0 이되도록조절하였다. 불소농도는각 ph 값마다 0, 1, 2, 4 ppm 으로변화를주어총 8 군의실험용액을조제하였다. 모든군의실험용액의포화도 (degree of saturation, DS) 는일정하도록설계되었다. 이렇게조제한실험용액은위의 stock 용액과같은방법으로각이온의농도를다시정량분석하여 Table 1 과같은농도를얻었고이를 seeded crystal growth 를위한실험용액으로사용하였다. Seeded crystal growth 실험모형 실험모형은 Mura-Galelli 가개발한것과동일하며, Figure 1 에도식화하였다. 8 실험모형은원래의실험용액을담은 vessel A, 실험용액을일정한유속으로흐르도록해주는연동펌프 (peristaltic pump, Masterflex 7524, Cole-Parmer, IL, USA), HA seed 가담긴반응주 (reaction column), 그리고반응주를통과한실험용액을포집하기위한 vessel B 로구성되어있다. 각각의부위는 Tygon tube (R-3603, Saint- Flow rate : 2-3 ml/hr Peristaltic pump HA Crystal (4 mg) Reaction column Rubber stopper Filter paper Vessel A : experimental solution Vesssel B : Solution after reaction Figure 1. Schematic illustration of experimental set-up. Table 1. Initial composition of experimental solutions Composition Concentration Group 1 Group 2 Group 3 Group 4 Group 5 Group 6 Group 7 Group 8 Lactic acid (mm) 10.00 10.00 10.00 10.00 0.00 0.00 0.00 0.00 Calcium (mm) 29.50 30.20 29.80 30.10 0.30 0.30 0.30 0.30 Phosphate (mm) 9.60 10.20 10.10 9.60 0.10 0.10 0.10 0.10 Sodium azide (mm) 3.08 3.08 3.08 3.08 3.08 3.08 3.08 3.08 ph 4.30 4.30 4.30 4.30 7.00 7.00 7.00 7.00 Fluoride (ppm) 0.00 1.00 2.00 4.00 0.00 1.00 2.00 4.00 18 www.rde.ac
Effect of fluoride on the crystal growth Gobain, OH, USA) 로연결하였으며각연결부위는누수가없도록테프론테이프와파라핀필름으로단단히체결하였다. 반응주는 1 cc 일회용주사기의실린더를절단하여사용하였다. 반응주는실린더헤드가아래로향하도록바닥에수직으로고정하였다. 실험용액은연동펌프에의해일정유속 ( 평균 2.5 ml/hr) 으로위쪽에서주입되어반응주를통과하고실린더헤드를통해빠져나가게된다. 반응주의바닥부위에는거름종이 (Advantec, Toyo, Tokyo, Japan) 를위치시켜그위로결정이침전되도록하였고, 거름종이를고정시키기위하여크기가맞는고무링을사용하였다. 반응주내에는 seed 로써준비된 HA 분말을거름종이위에위치시켰다. 미량저울 (microbalance, MC-5, Sartorius, Goettingen, Germany) 을이용하여질량을측정하여각각 4 mg 의 HA 가 seed 로사용되었다. 이실험모형을이용한 seeded crystal growth 실험은대기압하의실온에서 48 시간동안지속하였으며연동펌프를통한실험용액의투입유속은 2-3 ml/hr 사이값으로일정하게유지하였다. 같은실험을한군당 10 차례반복하여시행하였다. 실험을마친후에는반응주를통과하고포집된용액 (vessel B) 의칼슘, 인산및불소이온의농도를측정하여투입전의실험용액의값과비교하였다. 여기서측정된투입전후의이온농도의감소값, 즉, 이온소모량을계산하여군간의차이를비교하였다. 또한결정침전반응후얻어진결정표본은다시동결건조시킨후질량을측정하여성장한결정의무게를계산하였다 (Figure 2). 마지막으로얻어진결정표 HA seed Seeded crystal growth 4.0 mg 4.0 + α mg α mg (a) (b) (b) - (a) Figure 2. Schematic illustrations of calculating the amounts of crystal growth. (a) Amounts of seed crystals oriinally placed in the reaction column; (b) Weighed amounts of solid sampe recovered at the end of experiment; (b)-(a) Difference between (b) and (a), amounts of crystal growth. 본은결정 5 mg 당 700 µl 의 3 N perchloric acid(hclo 4 ) 용액 (Sigma- Aldrich Co.) 의비율로용해시켜이를 ion chromatography 를통해각분자의몰농도를측정함으로써이루어졌다. 표본과같은질량의합성 HA 를과염소산에용해시켜여기에서측정된인의몰농도를기준값 1 로하여각표본의성분의양을나타내었다. 또한각표본에서 Ca/P 비율을계산하여이값을확인하였다. 통계분석 실험을통해측정된결과자료를 SPSS Statistics 18.0 (PASW Statistics) 프로그램을이용하여분석하였다. 불소농도와 ph 값, 두변수에대한군간의차이를검정하기위해이원변량분석 (Two-way ANOVA) 을사용하였다. 두변수간교호작용이있을경우에는일원변량분석 (One-way ANOVA) 으로집단간차이를비교하였다. 유의차발생시사후검정으로 Tukey test 를실시하였으며가설검증을위한유의수준은 0.05 로하였다. 결과 실험용액의성분변화측정 결정침전반응후, 실험용액의각이온의소모량을측정하여분석한결과를 Table 2 에첨부하였다. 실험용액의칼슘이온소모량 Two-way ANOVA 를이용하여칼슘이온의소모량을분석한결과실험군에서 ph 와불소농도두변수사이에교호작용이있었다 (p < 0.001). 이에 one-way ANOVA 를이용하여각군간의차이를비교하였다. ph 가 4.3 인실험용액에서 ph 가 7.0 인실험용액보다모든불소농도에서유의하게더많은칼슘이온의소모량을보였다 (p < 0.05). 한편, ph 가 7.0 으로조절된실험용액에서는불소농도차에따른칼슘이온의소모량에유의한차이가없었다. 그러나 ph 가 4.3 인실험용액은불소의농도가 2 ppm 인 3 군과불소의농도가 4 ppm 인 4 군사이를제외하고유의하게불소농도가높아짐에따라많은칼슘이온소모량을보였다 (p < 0.05). Table 2. Changes in compositions of the experimental solution after experiments (Mean ± SD, n = 10) ph F (ppm) Group Changes in experimental solution (inlet-outlet) ΔCa (mm) ΔP (mm) ΔF (ppm) 4.3 0 1 1.27 ± 0.50 a 1.83 ± 0.28 a NM 1 2 2.26 ± 0.61 b 3.56 ± 0.35 b 0.73 ± 0.07 a 2 3 3.91 ± 0.48 c 3.31 ± 0.40 b 1.43 ± 0.09 b 4 4 4.09 ± 0.32 c 4.00 ± 0.41 c 3.35 ± 0.09 c 7.0 0 5 0.01 ± 0.01 d 0.06 ± 0.00 d NM 1 6 0.07 ± 0.00 d 0.07 ± 0.01 d 0.23 ± 0.07 d 2 7 0.08 ± 0.00 d 0.07 ± 0.01 d 0.19 ± 0.09 de 4 8 0.09 ± 0.00 d 0.08 ± 0.00 d 0.02 ± 0.07 e SD, standard deviation; NM, not measurable, no fluoride was added to the experimental solutions. Different letters denote statistically different (p < 0.05). www.rde.ac 19
Shin H et al. 실험용액의인산이온소모량 Two-way ANOVA 를이용하여인산이온의소모량을분석한결과실험군에서 ph 와불소농도두변수사이에교호작용이있었다 (p < 0.001). 이에 one-way ANOVA 를이용하여각군간의차이를비교하였다. ph 가 4.3 인실험용액에서 ph 가 7.0 인실험용액보다모든불소농도에서유의하게더많은 P 이온의소모량을보였다 (p < 0.05). 한편, ph 가 7.0 인실험용액에서는불소농도차이에따른인산이온의소모량에유의한차이가없었다. 그러나 ph 가 4.3 인실험용액에서는불소농도가 1 ppm 인 2 군과 2 ppm 인 3 군사이를제외하고모든군간에유의하게불소농도가높아짐에따라많은인산이온의소모량을보였다 (p< 0.05). 실험용액의불소이온소모량 Two-way ANOVA 를이용하여불소이온의소모량을분석한결과실험군에서 ph 와불소농도두변수사이에교호작용이있었다 (p < 0.001). 이에 one-way ANOVA 를이용하여각군간의차이를비교하였다. 불소가포함되지않은 1 군과 5 군을제외한다른 6 개의실험군의불소이온소모량을비교하였다. ph 가 4.3 인실험용액에서 ph 가 7.0 보다첨가된불소농도에관계없이유의하게더많은불소이온의소모량을보였다 (p < 0.05). 한편, ph 가 7.0 인실험용액에서의불소이온의소모량은불소농도가 1 ppm 인 6 군과 4 ppm 인 8 군사이에만유의차가존재하였고 (p < 0.05), 6 군에서더많은소모량을보였다. 그러나 ph 가 4.3 인실험용액에서는 1, 2, 4 ppm 으로불소농도가높아짐에 따라불소이온의소모량이유의하게많아졌다 (p < 0.05). Seed 의질량증가량측정 결정침전반응후, 반응주내표본의결정성장량을측정하기위해시편을동결건조시킨후미량저울을이용하여다시질량을측정하였다. 이값에서실험전의 seed 질량을빼서 seed 의질량증가량을측정하였다. 증가량을분석한결과를 Table 3 에첨부하였다. Two-way ANOVA 를이용하여질량증가량을분석한결과, ph 와불소농도두변수사이에교호작용이있었다 (p < 0.001). 이에 one-way ANOVA 를이용하여각군간의차이를비교하였다. 각각의실험용액을통해결정침전반응시행후 seed 의질량증가량은불소의농도가 0 과 1 ppm 일때는 ph 가 4.3 과 ph 7.0 간에유의한차이가없었다. 그러나농도가 2 ppm 과 4 ppm 인경우에는 ph 가 4.3 인군에서 ph 가 7.0 인군보다유의하게더많은질량증가량을보였다 (p < 0.05). ph 가 4.3 인실험용액에서는불소농도가증가함에따라 seed 의질량이유의하게증가하였으나 ph 가 7.0 인군에서는불소농도가 0 인 5 군과 4 ppm 인 8 군사이에만유의한차이를보였다 (p < 0.05). 결정침전표본의성분분석 결정침전반응후의표본의칼슘, 인, 불소성분비를분석한결과를 Table 4 에첨부하였다. Table 3. Weight increments of the HA seed after crystal growth (Mean ± SD, n = 10) ph F (ppm) Group Amounts of solid(mg) Before After Δweight Increase rate (%) 4.3 0 1 4.00 4.34 0.34 ± 0.32 a 8.50 1 2 4.01 5.89 1.88 ± 0.82 b 46.88 2 3 4.00 7.81 3.81 ± 1.29 c 95.25 4 4 4.00 9.97 5.97 ± 0.82 d 149.25 7.0 0 5 3.99 4.35 0.36 ± 0.30 a 9.02 1 6 4.00 5.15 1.15 ± 0.54 ab 28.75 2 7 4.00 5.21 1.21 ± 0.27 ab 30.25 4 8 4.01 5.50 1.49 ± 0.41 b 37.16 SD, standard deviation. Different letters denote statistically different (p < 0.05). Table 4. Molecular ratio in crystallized samples (Mean ± SD, n = 10 ) ph F (ppm) Group Molecular ratio in crystallized samples Ca P F Ca/P 4.3 0 1 1.57 ± 0.13 0.96 ± 0.01 0.01 ± 0.01 a 1.64 ± 0.14 a 1 2 1.66 ± 0.09 1.00 ± 0.01 0.25 ± 0.09 b 1.66 ± 0.10 a 2 3 1.71 ± 0.08 1.00 ± 0.01 0.38 ± 0.09 c 1.71 ± 0.08 a 4 4 1.68 ± 0.07 1.02 ± 0.01 0.50 ± 0.08 d 1.65 ± 0.07 a 7.0 0 5 1.36 ± 0.05 0.95 ± 0.01 0.00 ± 0.01 a 1.44 ± 0.05 b 1 6* 1.38 ± 0.06 0.96 ± 0.00 0.12 ± 0.02 e 1.45 ± 0.07 b 2 7 1.63 ± 0.10 0.98 ± 0.01 0.14 ± 0.02 e 1.67 ± 0.11 a 4 8* 1.80 ± 0.12 0.97 ± 0.01 0.17 ± 0.03 e 1.86 ± 0.12 c SD, standard deviation. * 1 sample is missed in two groups (groups 6 and 8, n = 9). Different letters denote statistically different (p < 0.05). 20 www.rde.ac
Effect of fluoride on the crystal growth 결정침전표본의불소성분비결정표본의상대적불소의양을 Two-way ANOVA 를이용하여분석한결과, ph 와불소농도두변수사이에교호작용이있었다 (p < 0.001). 이에 one-way ANOVA 를이용하여각군간의차이를비교하였다. 실험용액의불소농도가 0 인 1 군과 5 군사이를제외하고 ph 가 4.3 인실험용액에의한결정침전표본에서 ph 가 7.0 인표본보다유의하게더많은불소량이측정되었다 (p < 0.05). 한편, ph 가 4.3 인실험용액에의한결정침전표본에서의불소량은모든군사이에유의한차이를보였으며 (p < 0.05), 실험용액의불소농도가증가할수록더큰값을나타냈다. 그러나 ph 가 7.0 인용액에의한표본에서의불소량은불소가포함되지않은실험용액인 5 군만다른세군보다유의하게낮게측정되었으며 (p < 0.05), 다른측정치들은차이를보이지않았다. 결정침전표본에서 Ca/P 성분비결정표본의 Ca/P 비율을 Two-way ANOVA 를이용하여분석한결과, ph 와불소농도두변수사이에교호작용이있었다 (p < 0.001). 이에 one-way ANOVA 를이용하여각군간의차이를비교하였다. 실험용액의불소농도가 0 과 1 ppm 인경우에는 ph 4.3 의실험용액에의한결정표본의 Ca/P 가 ph 7.0 의경우보다높았다 (p < 0.05). 그러나실험용액의불소농도가 2 ppm 인경우 ph 4.3 과 ph 7.0 의군간에는유의차가없었으며, 4 ppm 인경우에는반대로 ph 4.3 군이 ph 7.0 군보다낮았다 (p < 0.05). ph 4.3 인실험군간에는불소농도변수에따른차이가발견되지않았으며, ph 7.0 인실험군에서는불소농도가 0 인 5 군과 1 ppm 인 6 군사이를제외하면각실험군사이에차이가있었으며 (p < 0.05), 불소농도가증가할수록 Ca/P 비율이높게측정되었다. 총괄및고찰 본연구에사용된실험모형은과포화상태의실험용액을 seed material이놓인소형반응주에일정한속도로통과시킴으로써일어난결정성장반응을평가하고그조절인자들을밝히기위한것이다. 본연구에서는 ph 4.3과 ph 7.0로조절된용액에서불소의변화에따른결정성장을정량적으로분석하였다. 본실험모형을이용한기존의연구는 amelogenesis 기전을이해하기위해시행된경우가많아실험에사용된과포화용액의조성은대부분 porcine의 amelogenesis 과정의 enamel fluid 를기준으로제작된칼슘 1.0 mm, 인산 3.0 mm, ph 7.2-7.4 정도로맞추어진경우가많았다. 8-11 그러나본연구는치아의재광화기전을이해하기위해본결정성장모형을이용하였으며, 기존에사용된용액의포화도는법랑질의재광화연구에직접적용하기에는다소높다. 곽, 이, 박등은치아절편을이용한재광화연구에서더낮은포화도를보이는완충용액에서더심부까지재광화가일어남을보고하였다. 31-33 따라서본실험모형을이용한연구에서는치아절편을이용한재광화연구에서치아절편에서의유효성이이미증명된과포화완충용액의조성을그대로이용하여진행되었다. 30 본연구에서재광화의양상을정량적으로분석하는것은세가지방법으로이루어졌다. 첫번째로실험후포집된용액의각이온농도를분석하여각이온의소모량을측정하였다. 여기서측정된이온의소모량만큼의각이온이결정성장에참여하였다고볼수있고, 이를통해 결정성장반응에참여한이온의양을간접적으로알아볼수있다. 두번째는결정성장반응전후의 seed 의무게차이를통해결정성장량을측정하는방법이고, 세번째는반응후얻어진결정표본의성분을분석하여결정이일어나는양상, 결정의특성을분석하는것이다. 이온소모량에있어각 ph 에따른이온소모양상의차이가명확했다. 칼슘과인산이온의경우 ph 4.3 이 ph 7.0 의경우보다현저히많은이온소모량을보였고, ph 4.3 의경우에는불소농도의변화에따른두이온의소모량의변화가비교적명확하였으나 ph 7.0 의경우에는불소농도변화에따른차이가없었다. 따라서 ph 7.0 보다 ph 4.3 에서더많은양의칼슘, 인산이온이재광화에투입되며, 실험용액의불소농도에따른영향도더크다고할수있을것이다. 인산칼슘염의용해도는 ph 가증가함에따라감소한다. 따라서동일한포화도로맞추어진본실험모형에서 ph 4.3 의경우에 ph 7.0 의경우보다칼슘과인산이온의농도가 100 배가량높았다. 본실험에서 ph 가 4.3 인실험용액에서더많은이온의소모량을보인것, 즉, 더많은결정의침착이일어난것이실제로 ph 가낮은환경에서이온의침전되는 driving force 가더강한것인지, 단지더많은이온이용액내에존재하기때문에더많은양의결정이침착된것인지정확히알기는어렵다. 이를알아보기위해서 ph 와이온구성에변화를준추가적인연구가필요할것으로사료된다. 반응후불소이온소모량역시 ph 4.3 과 7.0 에서전혀다른양상으로나타났다. ph 4.3 에서는실험용액내에포함된대부분의불소가소모되는양상을보였고, 소모된불소이온의양은각군마다유의차가존재했다, 그러나 ph 7.0 에서는모든군사이에차이가없었으며그소모량도매우적었다. 또한반응후결정표본의성분분석에서불소의비율도이에상응하는결과를보였다. ph 4.3 에서는결정표본내의불소성분비가실험용액의불소농도가올라감에따라유의하게상승하는양상을보였으나 ph 7.0 에서는유의한차이를보이지않았다. 실제로 ph 4.3 의조건에서는실험용액에용해되어있던대부분의불소가결정성장과정에서결정에직접침착되었으며, ph 7.0 에서형성된결정에는불소의침착이일정량에그쳤다. 권등은첨가된불소농도에관계없이결정형성에소모된불소이온의양은일정하다하였다. 9 그러나본실험에서는권등의실험조건인 ph 7.3-7.4 와유사한 ph 7.0 의조건에서는소모된불소이온의양이불소농도변화에따른유의한차이가없고, 그양도매우적었으나, ph 4.3 의조건에서는실험용액에포함된불소이온의대부분이소모되는, 즉불소농도가증가함에따라소모된불소이온의양이증가하는, 서로다른양상을보였다. 용액내의불소이온은그농도나다른용액의조성에따라 apatite 등과반응할수있으며, 이를통해 F-OH 교환이일어나 fluorohydroxyapatite 를형성할수있다. 이러한반응의정도에는불소농도가영향을미친다고하였으며, 높은산성도도용액내의 CaF 2, 혹은 phosphate containing CaF 2 유사물질을더많이형성하고이들이불소이온의 reservoir 로작용해더많은불소가반응에참여할수있도록한다고하였다. 34-36 본연구에서산성의환경인 ph 4.3 에서더활발한불소의이온침착이일어난원인은이를통해추측해볼수있을것이다. 결정반응후질량상승을통한결정반응량의추정에있어서도이온소모량의결과와같은맥락의결과를얻을수있었다. ph 4.3 에서는불소의농도가증가함에따라유의하게높은질량증가량이측정되었고, ph 7.0 에서는유의한증가가나타나지않았다. ph 4.3 에서불소 www.rde.ac 21
Shin H et al. 의농도가증가함에따라더활발한결정성장이일어나지만, ph 7.0 에서불소의농도는결정성장의양에있어큰영향을주지못함을짐작할수있다. 그러나얻어진결정표본의성분분석을통해 ph 7.0의환경에서얻어진결정이불소농도의변화에따라서로다른특성을가지게되는것을확인할수있었다. 결정에서 Ca/P 분자비를확인한결과 ph 4.3에서는군에따른차이가유의한차이를보이지않는것에비해 ph 7.0에서는불소농도가 0, 1 ppm일때는다른군들보다유의하게작은 Ca/P 값을보이다가불소농도가 2 ppm, 4 ppm으로상승하면서유의한 Ca/P의증가를보였다. 이는불소농도가낮은상태에서는낮은 Ca/P 비율을가진화합물의인산칼슘결정이침착되다가, 불소농도가높은상태에서는높은 Ca/P 비율을가진인산칼슘으로결정성장이이루어짐을의미하는것이다. 생물학적으로 apatite의형성과정에서전구체로서몇가지상의인산칼슘염이존재하게되는데, amorphous tricalcium phosphate (ACP), DCPD, OCP 등이그것이다. 이들중 DCPD, OCP 등은 HA만큼안정하지못하며, 생리적환경에서 HA로가수분해될수있으나이전환과정에있어서의역학은여러조절인자의영향을받는다. 37 불소는이러한전구체들의가수분해를촉진하여 HA로변환시키는역할을하는것으로알려져있다. 16,18,38 DCPD, OCP 의각각의 Ca/P 값은각각 1과 1.33으로 HA의 1.67보다작다. 따라서본실험에서 ph 7.0에서 Ca/P가불소의농도에따라증가하는것으로보아저농도의불소에서는이러한전구체의형태로결정이침착되다가고농도의불소의환경에서불소가이러한전구체를 HA로전환시키는데기여하여결정의조성이변환되는것으로사료된다. ph 7.0의경우와는다르게, ph 4.3에서는결정의분석결과비교적높은값의 Ca/P 값이전불소농도에걸쳐유의차없이나타났고, 이값은 HA의 Ca/P 값인 1.67과큰차이가없었다. 따라서 ph 4.3에서만들어진결정은 apatite와같이 Ca/P가높은형태가큰비율을차지할가능성이높을것으로사료된다. 본연구의결과포화도가동일할경우, 중성 ph인 7.0보다산성인 ph 4.3에서결정성장이촉진되었으며, ph 4.3에서불소이온의농도에따라더큰영향을받는것으로나타나, 불소농도가증가함에따라많은결정침착이관찰되었다. 이를통해볼때산성조건의재광화용액의사용은임상적으로의의가있을것으로사료된다. 또한산성의조건에서더깊이까지완충용액이확산될수있음을증명한송의연구등을참고하여볼때산성의조건의재광화용액은표면뿐아니라심부까지재광화가가능할수있을것으로추론할수있고이는본연구에서사용된과포화용액을이용하여치아시편의재광화를연구한송의연구결과와일치하는것이다. 29,30 이번연구에서는침전결정반응후남은시편을분석하는데그양이제한적인관계로그결정의화학적조성비를통해서그특징을간접적으로추측해보는것에그쳤다. 따라서이후의실험에서는이러한결정의특성을보다정확히분석하기위하여 X-ray 회절분석, FTIR 및 SEM 영상분석등의평가방법들이병행되는것이좋겠다. 또한, ph와불소이온의농도변화에따른침전역학의차이를더명확히고찰하기위해용액조성을변화시킨추가적인연구가필요할것으로사료된다. 결론 중성 ph 인 7.0 보다산성인 ph 4.3 에서결정성장이촉진되었으며, ph 4.3 에서불소이온의농도에따라더큰영향을받는것으로나타나, 불소농도가증가함에따라많은결정침착이관찰되었다. References 1. Margolis HC, Moreno EC. Kinetic and thermodynamic aspects of enamel demineralization. Caries Res 1985; 19:22-35. 2. Aoba T. Solubility properties of human tooth mineral and pathogenesis of dental caries. Oral Dis 2004;10:249-257. 3. Robinson C, Brookes SJ, Bonass WA, Shore RC, Kirkham J. Enamel maturation. Ciba Found Symp 1997;205:156-170. 4. Nancollas GH, Mohan MS. The growth of hydroxyapatite crystals. Arch Oral Biol 1970;15:731-745. 5. Aoba T, Moreno EC. Preparation of hydroxyapatite crystals and their behavior as seeds for crystal growth. J Dent Res 1984;63:874-880. 6. Barone JP, Nancollas GH, Tomson M. The seeded growth of calcium phosphates. The kinetics of growth of dicalcium phosphate dihydrate on hydroxyapatite. Calcif Tissue Res 1976;21:171-182. 7. Eanes ED. The influence of fluoride on the seeded growth of apatite from stable supersaturated solutions at ph 7.4. J Dent Res 1980;59:144-150. 8. Mura-Galelli MJ, Narusawa H, Shimada T, Iijima M, Aoba T. Effects of fluoride on precipitation and hydrolysis of octacalcium phosphate in an experimental model simulating enamel mineralization during amelogenesis. Cells Mater 1992;2:221-230. 9. Kwun JW, Kim KY, Lee SJ, Jung IY, Lee CY. The effect of the supersaturated solutions containing high concentrations of fluoride on seeded crystal growth. J Korean Acad Cons Dent 1999;24:330-336. 10. Lee CY, Aoba, T. Seeded crystal growth onto enamal mineral and synthetic hydroxyapatite in dilute supersaturated solutions containing low concentration of fluoride. J Korean Acad Cons Dent 1995;20:818-826. 11. Oh SY, Jung IY, Kum KY, Lee CY. Effects of fluoride concentration and seed material on seeded crystal growth. J Korean Acad Cons Dent 1997;22:560-574. 12. Iijima M, Moradian-Oldak J. Control of apatite crystal growth in a fluoride containing amelogenin-rich matrix. Biomaterials 2005;26:1595-1603. 13. Fan Y, Nelson JR, Alvarez JR, Hagan J, Berrier A, Xu X. Amelogenin-assisted ex vivo remineralization of human enamel: effects of supersaturation degree and fluoride concentration. Acta Biomater 2011;7:2293-2302. 14. Matsumoto T, Okazaki M, Inoue M, Sasaki J, Hamada Y, 22 www.rde.ac
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