(19)대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) (51) Int. Cl. C12Q 1/70 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) (11) 공개번호 (43) 공개일자 10-2007-0058503 2007년06월08일 (21) 출원번호 10-2007-7005912 (22) 출원일자 2007년03월14일 심사청구일자 없음 번역문 제출일자 2007년03월14일 (86) 국제출원번호 PCT/US2005/032710 (87) 국제공개번호 WO 2006/031870 국제출원일자 2005년09월14일 국제공개일자 2006년03월23일 (30) 우선권주장 60/522,310 60/665,130 2004년09월14일 2005년03월25일 미국(US) 미국(US) (71) 출원인 아고스 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 미국 노쓰 캐롤라이나 27704 더럼 테크놀로지 드라이브 4233 기린 비루 가부시키가이샤 일본 도쿄-도 츄오-구 신카와 2-쵸메 10-1 (72) 발명자 니콜레트, 찰스 미국 27703 노쓰 캐롤라이나주 더럼 알렌 무어 코트 5 체레파노바, 이리나 미국 27572 노쓰 캐롤라이나주 루즈몬트 샬로테스 마운틴 로드8923 해리스, 제이슨 미국 27707 노쓰 캐롤라이나주 더럼 웨스트 메이나드 로드 410 힐리, 도날드 미국 27572 노쓰 캐롤라이나주 루즈몬트 룩아웃 포인트 402 (74) 대리인 김영 장수길 전체 청구항 수 : 총 80 항 (54) 병원체의 균주 독립성 증폭 및 그에 대한 백신 (57) 요약 본 발명은 샘플, 바람직하게는 병원체 감염된 개체로부터의 샘플에 존재하는 임의의 병원체의 다중 변이체 (균주)의 핵산 증폭 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 병원체는 HIV와 같은 레트로바이러스이다. 증폭된 병원체 핵산은 샘플 에 존재하는 병원체 변이체를 확인하거나, 샘플에 존재하는 병원체를 정량화하는데에, 및 핵산 백신으로서, 또는 항원 제 시 세포 백신의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 핵산 또는 그에 의해 코딩되는 단백질은 항원 제시 세포를 형질감염/로딩시키는데 사용될 수 있다. 그 후, 로딩된 항원 제시 세포는 병원체 감염 치료용의 백신으로서 사용될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 핵산은 항원 제시 세포 내로 사전 로딩 없이 핵산 백신으로 서 직접적으로 사용될 수 있다. - 1 -
특허청구의 범위 청구항 1. 1종 이상의 병원체 폴리펩티드가 임의의 균주로부터 제시되지 않는, 개별 대상체에 존재하는 병원체의 다중 균주로부터의 1종 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 단리된 항원 제시 세포 (APC). 청구항 2. 제1항에 있어서, 상기 핵산이 병원체 폴리뉴클레오티드의 핵산 증폭으로부터 유래된 것인 APC. 청구항 3. 제2항에 있어서, 상기 병원체 폴리뉴클레오티드가 상기 병원체의 다중 균주 사이의 서열 변이성을 상쇄하도록 설계된 프 라이머를 사용하여 증폭된 것인 APC. 청구항 4. 제2항에 있어서, 상기 핵산이 RNA인 APC. 청구항 5. 제3항에 있어서, 상기 RNA가 시험관내 전사된 RNA인 APC. 청구항 6. 제1항에 있어서, 상기 APC가 수지상 세포인 APC. 청구항 7. 제1항에 있어서, 상기 병원체가 바이러스인 APC. 청구항 8. 제6항에 있어서, 상기 병원체가 레트로바이러스인 APC. 청구항 9. 제7항에 있어서, 상기 레트로바이러스가 HIV, HTLV 및 HCV로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 APC. 청구항 10. - 2 -
제9항에 있어서, 상기 병원체가 HIV이고, 상기 병원체 폴리펩티드가 gag 폴리펩티드, rev 폴리펩티드, vpr 폴리펩티드, env 폴리펩티드, nef 폴리펩티드, vpu 폴리펩티드, vif 폴리펩티드 및 pol 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터의 2종 이상 을 포함하는 것인 APC. 청구항 11. 제1항에 있어서, 상기 APC가 상기 대상체로부터의 것이거나 상기 대상체로부터 유래된 것인 APC. 청구항 12. 제1항에 있어서, 시험관내 전사된 CD40L mrna를 추가로 포함하는 APC. 청구항 13. 1종 이상의 병원체 폴리펩티드가 임의의 균주로부터 제시되지 않는, 개별 대상체에 존재하는 병원체의 다중 균주로부터의 병원체 폴리펩티드를 포함하는 단리된 항원 제시 세포 (APC). 청구항 14. 제13항에 있어서, 상기 항원 제시 세포가 수지상 세포인 APC. 청구항 15. 제13항에 있어서, 병원체가 바이러스인 APC. 청구항 16. 제15항에 있어서, 상기 바이러스가 레트로바이러스인 APC. 청구항 17. 제16항에 있어서, 상기 레트로바이러스가 HIV, HTLV 및 HCV로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 APC. 청구항 18. 제17항에 있어서, 상기 레트로바이러스가 HIV인 APC. 청구항 19. 제18항에 있어서, 상기 병원체 폴리펩티드가 gag 폴리펩티드, rev 폴리펩티드, vpr 폴리펩티드, env 폴리펩티드, nef 폴 리펩티드, vpu 폴리펩티드, vif 폴리펩티드 및 pol 폴리펩티드로 이루어진 HFV 폴리펩티드 군으로부터의 2종 이상을 포함 하는 것인 APC. - 3 -
청구항 20. 제1항의 APC 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 백신. 청구항 21. 제13항의 APC 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 백신. 청구항 22. 제20항의 백신을 병원체-감염된 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 병원체-감염된 환자의 치료 방법. 청구항 23. 제21항의 백신을 병원체-감염된 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 병원체-감염된 환자의 치료 방법. 청구항 24. 1종 이상의 병원체 폴리펩티드가 임의의 균주로부터 제시되지 않는, 병원체-감염된 개체로부터 수득되거나 유래된 항원 제시 세포를 상기 개체에 존재하는 병원체의 다중 균주로부터의 1종 이상의 병원체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로 형질 감염시키는 것을 포함하는 자가 백신의 제조 방법. 청구항 25. 제24항에 있어서, 상기 핵산이 상기 병원체의 다중 균주 사이의 변이성을 상쇄하도록 설계된 다수의 프라이머 쌍을 사용한 병원체 폴리뉴클레오티드의 핵산 증폭에 의해 유래된 것인 방법. 청구항 26. 제25항에 있어서, 상기 프라이머가 a. 전방향 프라이머 어닐링을 위한 제1 영역 및 역방향 프라이머 어닐링을 위한 제2 영 역 (상기 제1 및 제2 영역은 병원체의 오픈 리딩 프레임 및/또는 에피토프를 플랭킹함)을 선택하고, b. 상기 제1 및 제2 영역에 대한 후보 전방향 및 역방향 프라이머 (하나 이상의 상기 프라이머는 병원체의 다중 변이체 사 이의 서열 변이성을 상쇄하도록 설계됨)를 선택함으로써 선택되는 것인 방법. 청구항 27. 제24항에 있어서, 상기 항원 제시 세포가 수지상 세포인 방법. 청구항 28. 제27항에 있어서, 상기 수지상 세포가 미성숙 수지상 세포인 방법. - 4 -
청구항 29. 제28항에 있어서, 형질감염에 이어 상기 미성숙 수지상 세포를 성숙시키는 것을 추가로 포함하는 방법. 청구항 30. 제27항에 있어서, 상기 수지상 세포가 성숙 수지상 세포인 방법. 청구항 31. 제24항에 있어서, 상기 핵산이 CD40L을 코딩하는 mrna를 추가로 포함하는 것인 방법. 청구항 32. 서열 2, 3, 5 내지 15 또는 18의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV gag 전방향 프라이머; 및 서열 23 내지 25, 28 내지 31, 35, 39, 42, 43, 102 내지 105, 109 내지 112 또는 113의 올리고뉴클레오티드로 본질적으 로 이루어진 HIV gag 역방향 프라이머; 서열 45, 46, 47, 50 내지 52, 54 또는 55의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV vpr 전방향 프라이머; 서열 62, 63, 71 내지 73, 114 내지 120, 201 내지 203, 264 내지 272 또는 273의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이 루어진 HIV vpr 역방향 프라이머; 서열 75, 78 또는 85의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV rev 전방향 프라이머; 서열 92, 93, 97, 99 내지 101, 123 내지 125, 193, 194 또는 195의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV rev 역방향 프라이머; 서열 274 내지 279, 290 내지 292 또는 293의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV env 전방향 프라이머; 서열 157 내지 159, 280 내지 289, 294 내지 298 또는 299의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV env 역방 향 프라이머; 서열 367 내지 370 또는 371의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV nef 전방향 프라이머; 서열 300 내지 310 또는 311의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV vif 전방향 프라이머; 서열 312 내지 319, 329 내지 331 또는 332의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV vpu 전방향 프라이머; 서열 320 내지 328, 333 내지 335 또는 336의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV vpu 역방향 프라이머; 서열 337 내지 344, 356 내지 359 또는 360의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV pol 전방향 프라이머; 및 서열 345 내지 355, 361 내지 365 또는 366의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV pol 역방향 프라이머 로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머를 포함하는 조성물. - 5 -
청구항 33. a. 서열 1 내지 20, 162, 164, 168 및 169로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 gag 전방향 프 라이머; 및 b. 서열 21 내지 43, 102 내지 113, 172 및 173으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 gag 역 방향 프라이머 를 포함하는 조성물. 청구항 34. a. 서열 44 내지 58, 176 및 177로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 vpr 전방향 프라이머; 및 b. 서열 60 내지 73, 114 내지 122, 196 내지 203 및 264 내지 273으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드 를 포함하는 vpr 역방향 프라이머 를 포함하는 조성물. 청구항 35. a. 서열 138 내지 143, 147 내지 148, 160 내지 161, 204 및 367 내지 371로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레 오티드를 포함하는 nef 전방향 프라이머; 및 b. 서열 144 내지 146, 149 내지 153, 163 및 167로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 nef 역 방향 프라이머 를 포함하는 조성물. 청구항 36. a. 서열 130 내지 132, 134 내지 136, 274 내지 279 및 290 내지 293으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오 티드를 포함하는 env 전방향 프라이머; 및 b. 서열 133, 154 내지 159, 280 내지 289 및 294 내지 299로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함 하는 env 역방향 프라이머 를 포함하는 조성물. 청구항 37. a. 서열 74 내지 88, 180 및 183 내지 189로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 rev 전방향 프 라이머; 및 b. 서열 89 내지 101, 123 내지 129 및 190 내지 192로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 rev 역방향 프라이머 - 6 -
를 포함하는 조성물. 청구항 38. a. 서열 74 내지 88, 180 및 183 내지 189로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 rev 전방향 프 라이머; 및 b. 서열 144 내지 146, 149 내지 153, 163 및 167로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 nef 역 방향 프라이머 를 포함하는 조성물. 청구항 39. a. 서열 300 내지 311로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 vif 전방향 프라이머; 및 b. 서열 60 내지 73, 114 내지 122, 196 내지 203 및 264 내지 273으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드 를 포함하는 vpr 역방향 프라이머 를 포함하는 조성물. 청구항 40. a. 서열 312 내지 319 및 329 내지 332로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 vpu 전방향 프라 이머; 및 b. 서열 320 내지 328 및 333 내지 336으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 vpu 역방향 프 라이머 를 포함하는 조성물. 청구항 41. a. 서열 337 내지 344 및 356 내지 360으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 pol 전방향 프 라이머; 및 b. 서열 345 내지 355 및 361 내지 366으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 pol 역방향 프 라이머 를 포함하는 조성물. 청구항 42. 프로모터 및 코자크(Kozak) 서열을 포함하는 5' 부분, 및 서열 206 내지 218, 372 내지 386 및 387로 이루어진 군으로부 터 선택된 서열로 본질적으로 이루어진 3' 부분을 포함하는 프라이머. - 7 -
청구항 43. 제41항에 있어서, 상기 프로모터가 T7 프로모터 또는 SP6 프로모터인 프라이머. 청구항 44. 대략 30 내지 100 T 뉴클레오티드를 갖는 폴리T 올리고뉴클레오티드를 포함하는 5' 부분, 및 서열 220 내지 268로 이루 어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 3' 부분을 포함하는 프라이머. 청구항 45. a. 제33항 내지 제40항 및 제41항 중 어느 한 항의 조성물; 및 b. 열안정성 DNA 폴리머라제, 역전사효소, 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 및 CD40L mrna로 이루어진 군으로부 터 선택된 1종 이상의 시약 을 포함하는, HIV의 다중 변이체의 증폭용 키트. 청구항 46. HIV DNA의 다중 변이체를 제33항 내지 제40항 및 제41항 중 어느 한 항의 프라이머 조성물을 사용하여 증폭하는 것을 포 함하는, HIV 앰플리콘의 균주-독립성 제조 방법. 청구항 47. 제46항에 있어서, 상기 HIV DNA가 HIV 게놈 RNA 또는 HIV mrna의 역전사에 의해 제조된 cdna를 포함하는 것인 방 법. 청구항 48. 제47항에 있어서, 상기 HIV DNA의 다중 변이체가 단일 HIV-감염된 인간으로부터 단리되거나 유래된 것인 방법. 청구항 49. a. 서열 1 내지 18, 162, 164, 168 및 169로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 gag 전방향 프라이머; 및 서열 21 내지 43, 172 및 173으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 gag 역방향 프라이머; 서열 44 내지 56, 176 및 177로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 vpr 전방향 프 라이머; 및 서열 60 내지 73, 196 내지 199 및 200으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 vpr 역방향 프라이머; - 8 -
서열 138 내지 143, 160 내지 161, 204, 367 내지 370 및 371로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포 함하는 1종 이상의 nef 전방향 프라이머; 및 서열 144 내지 146, 163 및 167로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 nef 역방향 프라이머; 서열 130 내지 132, 274 내지 278 및 279로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 env 전방향 프라이머; 및 서열 133, 154 내지 156, 280 내지 288 및 289로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상 의 env 역방향 프라이머; 서열 74 내지 86, 180 및 183 내지 188 및 189로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상 의 rev 전방향 프라이머; 및 서열 89 내지 101, 190, 191 및 192로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 rev 역방 향 프라이머; 서열 74 내지 86, 180 및 183 내지 188 및 189로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상 의 rev 전방향 프라이머; 및 서열 144 내지 146, 163 및 167로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 nef 역방향 프라이머; 서열 300 내지 306 및 307로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 vif 전방향 프라이 머; 및 서열 60 내지 73, 196 내지 199 및 200으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 vpr 역방향 프라이머; 서열 312 내지 318 및 319로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 vpu 전방향 프라 이머; 및 서열 320 내지 327 및 328으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 vpu 역방향 프 라이머; 및 서열 337 내지 343 및 344로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 pol 전방향 프라이 머; 및 서열 345 내지 354 및 355로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 1종 이상의 pol 역방향 프라이 머 로 이루어진 군으로부터 선택된 전방향 및 역방향 프라이머 쌍을 사용하여 HFV DNA의 다중 변이체를 증폭시킴으로써 일 차 앰플리콘을 생성하고; b. 상기 일차 앰플리콘을 전방향 프로모터 프라이머, 및 5' 폴리T 꼬리를 포함하는 역방향 프라이머를 사용하여 증폭시켜 증폭된 발현 카세트를 생성하고; c. 상기 발현 카세트를 전사하여 HIV RNA를 생성하는 것 을 포함하는, HIV RNA의 균주 독립성 제조 방법. - 9 -
청구항 50. 제49항에 있어서, 상기 HIV DNA가 HIV 게놈 RNA 또는 HIV mrna의 역전사에 의해 제조된 cdna인 방법. 청구항 51. 제49항에 있어서, 상기 프로모터가 T7 프로모터 또는 SP6 프로모터인 방법. 청구항 52. 제49항에 있어서, 상기 전방향 프로모터 프라이머가 상기 프로모터에 대해 최적화된 코자크 서열 3'를 포함하는 것인 방 법. 청구항 53. 제52항에 있어서, 상기 최적화된 코자크 서열이 CCACCAATGG (서열 59)인 방법. 청구항 54. 항원 제시 세포를 제49항의 방법에 의해 생성된 RNA와 접촉시키는 것을 포함하는, 항원 제시 세포의 로딩(loading) 방법. 청구항 55. 1종 이상의 병원체 폴리펩티드가 임의의 균주에 의해 제시되지 않는, 대상체에 존재하는 병원체의 다중 균주로부터의 1종 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 백신. 청구항 56. 제55항에 있어서, 상기 핵산이 RNA인 핵산 백신. 청구항 57. 제55항에 있어서, 상기 핵산이 DNA인 핵산 백신. 청구항 58. 제55항에 있어서, CD40L을 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 핵산 백신. 청구항 59. 제55항에 있어서, 상기 핵산이 제49항의 방법에 따라 제조된 것인 핵산 백신. - 10 -
청구항 60. 제55항에 있어서, 상기 핵산이 상기 병원체의 다중 균주 사이의 변이성을 상쇄하도록 설계된 다수의 프라이머 쌍을 사용한 병원체 폴리뉴클레오티드의 핵산 증폭에 의해 유래된 것인 핵산 백신. 청구항 61. 제55항에 있어서, 병원체가 바이러스인 핵산 백신. 청구항 62. 제61항에 있어서, 상기 바이러스가 레트로바이러스인 핵산 백신. 청구항 63. 제62항에 있어서, 상기 레트로바이러스가 HIV, HTLV 및 HCV로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 핵산 백신. 청구항 64. 제63항에 있어서, 상기 레트로바이러스가 HIV인 핵산 백신. 청구항 65. 제64항에 있어서, 상기 병원체 폴리펩티드가 gag 폴리펩티드, rev 폴리펩티드, vpr 폴리펩티드, env 폴리펩티드, nef 폴 리펩티드, vpu 폴리펩티드, vif 폴리펩티드 및 pol 폴리펩티드로 이루어진 HFV 폴리펩티드 군으로부터의 2종 이상을 포함 하는 것인 핵산 백신. 청구항 66. 제60항에 있어서, 상기 프라이머가 a. 전방향 프라이머 어닐링을 위한 제1 영역 및 역방향 프라이머 어닐링을 위한 제2 영 역 (상기 제1 및 제2 영역은 병원체의 오픈 리딩 프레임 및/또는 에피토프를 플랭킹함)을 선택하고, b. 상기 제1 및 제2 영역에 대한 후보 전방향 및 역방향 프라이머 (하나 이상의 상기 프라이머는 병원체의 다중 변이체 사 이의 서열 변이성을 상쇄하도록 설계됨)를 선택함으로써 선택되는 것인 핵산 백신. 청구항 67. 제55항의 핵산 백신을 병원체-감염된 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 감염의 치료 방법. 청구항 68. 제66항에 있어서, 상기 병원체가 HIV인 방법. - 11 -
청구항 69. 제66항에 있어서, 상기 병원체가 HCV인 방법. 청구항 70. a. 병원체의 제1 균주 및 제2 균주로부터의 폴리뉴클레오티드를 조합하여 혼합물을 형성하고; b. 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하여 제1 앰플리콘 및 제2 앰플리콘 (상기 제1 앰플리콘은 상기 제1 균주로부터의 폴리 펩티드를 코딩하고, 상기 제2 앰플리콘은 상기 제2 균주로부터의 상응하는 폴리펩티드를 코딩함)을 생성하는 것 을 포함하는, 병원체의 2종 이상의 균주로부터의 1종 이상의 폴리펩티드를 제시하는 병원체 앰플리콘의 생성 방법. 청구항 71. 제70항에 있어서, 1종 이상의 병원체 폴리펩티드가 임의의 균주로부터 제시되지 않는 것인 방법. 청구항 72. 제70항에 있어서, 상기 병원체가 레트로바이러스인 방법. 청구항 73. 제72항에 있어서, 상기 레트로바이러스가 HIV인 방법. 청구항 74. 제70항에 있어서, 상기 병원체가 HIV이고, 상기 폴리펩티드가 gag 폴리펩티드인 방법. 청구항 75. 제70항에 있어서, 상기 병원체가 HIV이고, 상기 폴리펩티드가 vpr 폴리펩티드인 방법. 청구항 76. 제70항의 방법에 의해 생성된 병원체 앰플리콘을 포함하는 조성물. 청구항 77. 제70항에 있어서, 상기 증폭이 상기 병원체의 다중 균주 사이의 변이성을 상쇄하도록 설계된 프라이머를 사용하여 수행되 는 것인 방법. 청구항 78. - 12 -
제77항에 있어서, 상기 프라이머가 서열 1, 4, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 26, 27, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 40, 41, 44, 48, 49, 53, 56, 57, 58, 60, 61, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 74, 76, 77, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 94, 95, 96, 98, 106, 107, 108, 121, 122, 126 내지 156, 160 내지 167, 175, 177, 178, 183 내지 192, 196 내지 200 및 204의 프라이머로부터 선택된 것인 방법. 청구항 79. 서열 1, 4, 16, 17, 19 또는 20의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV gag 전방향 프라이머; 서열 21, 22, 26, 27, 32, 33, 34, 36, 37, 38, 40, 41, 106, 107 또는 108의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV gag 역방향 프라이머; 서열 44, 48, 49, 53, 56, 57 또는 58의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV vpr 전방향 프라이머; 서열 60, 61, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 121, 122, 196 내지 199 또는 200의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어 진 HIV vpr 역방향 프라이머; 서열 74, 76, 77, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 86, 87, 88, 183 내지 188 또는 189의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어 진 HIV rev 전방향 프라이머; 서열 89, 90, 91, 94, 95, 96, 98, 126 내지 129, 190, 191 또는 192의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV rev 역방향 프라이머; 서열 130 내지 132, 134, 135 또는 136의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV env 전방향 프라이머; 서열 154, 155 또는 156의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV env 역방향 프라이머; 서열 133의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV env 역방향 프라이머; 서열 138 내지 139, 147 내지 148, 160 내지 161 또는 204의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV nef 전방 향 프라이머; 서열 140 내지 142 또는 143의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV nef 전방향 프라이머; 및 서열 144 내지 146, 149 내지 152 또는 153의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV nef 역방향 프라이머 로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머를 포함하는 조성물. 청구항 80. 서열 16 및 17의 프라이머를 포함하는 gag 전방향 프라이머 조성물; 서열 32, 33 및 34의 프라이머를 포함하는 gag 역방 향 프라이머 조성물; 서열 36 내지 38, 40 및 41의 프라이머를 포함하는 gag 역방향 프라이머 조성물; 서열 138, 139 및 204의 프라이머를 포함하는 nef 전방향 프라이머 조성물; 서열 140 내지 143의 프라이머를 포함하는 nef 전방향 프라이 머 조성물; 및 서열 144 내지 146의 프라이머를 포함하는 nef 역방향 프라이머 조성물로 이루어진 군으로부터 선택된 HFV 프라이머 조성물. 명세서 기술분야 - 13 -
본 발명은 병원체의 균주-독립성 증폭 방법 및 환자-특이적 백신 및 관련된 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 실 시양태는 HIV 및 HCV와 같은 레트로바이러스에 대한 환자-특이적 백신에 관한 것이다. 배경기술 많은 병원체는 급속하게 돌연변이되고 재조합되므로, 효과적인 백신의 생산을 곤란하게 한다. 이러한 문제는 바이러스 병 원체, 특히 HIV와 같은 RNA 바이러스에서 가장 우세하다. HIV 감염된 개체는 다중 HIV 균주를 가질 수 있으며, 전형적으 로 다중 HIV 유사종을 갖는다. HIV-I과 같은 병원체로 감염된 개체의 치료를 목적으로 하는 치료 전략은 항-바이러스에 내성인 바이러스 균주의 발달로부터 상기 약물의 수많은 부작용에 이르기까지 막대한 난점에 직면하며, 이러한 요법의 계 속적인 투여가 곤란하고 비싸지게 한다. 몇몇 치료적 HIV 백신이 개발되었으나, 상기 백신의 임상적 시험은 거의 효능을 나타내지 않았다. 상기 백신의 성공 부재 에 대한 한 가지 설명은 HIV 바이러스 게놈의 컨센서스 서열을 포함하는 면역원으로서 바이러스 벡터의 사용이다. 컨센서 스 서열의 존재는 반드시 이종 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는데 있어서 서열의 효능을 입증하지는 않는다. 컨센서 스 서열과 자가 감염 HIV 균주 사이의 다양성의 여전히 높고 증대하는 수준 때문에, HIV-I 아형 B 컨센서스 서열을 기재 로 한 백신 또는 항-바이러스 시약은 HIV 감염을 적당하게 치료할 수 없다. 더욱이, 상기 바이러스 벡터-기재 백신은 항원 프로세싱 및 제시라는 점에서 면역계의 가장 효과적인 세포, 즉 수지상 세포를 표적화하지 않을 것이다. 다수의 간행물은 HIV에 대한 백신으로서 HIV 핵산 또는 펩티드로 로딩(loading)된 항원 제시 세포의 용도를 암시하였다. 예를 들어 문헌 [Huang et al. J Infect. Dis. 2003 187:315-319]은 리포솜-복합체화된 HFV 단백질로 로딩된 수지상 세 포 및 이러한 로딩된 세포의 백신으로서의 가능한 용도를 개시하고 있다. 문헌 [Weissman et al. J Immunol 2000 165:4710-4717]은 단일 클로닝된 HIV gag 서열을 코딩하는 mrna로 수지상 세포를 형질감염시켜, MHC 부류 I 및 II 분 자에 대한 항원성 gag 펩티드의 전달 및 시험관내에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응을 유도하는 것을 개시하고 있다. 미 국 특허 제5,853,719호 및 미국 특허 제6,670,186호 (네어(Nair) 등)는 자가 항원 제시 세포의 시험관내 로딩용으로 환자 로부터 단리된 종양 또는 병원체로부터 유래된 RNA의 용도, 및 그의 백신으로서의 용도가 기재되어 있다. 그러나, 총 병원 체 RNA로 로딩된 항원 제시 세포를 사용한 환자의 백신화는 환자에서 병원체 로딩 양을 증가시킬 수 있다. 주어진 병원체의 모든 변이체, 특히 HIV의 모든 변이체로부터의 핵산을 증폭할 수 있는 프라이머를 선택하는데 있어서의 곤란성이 인지되었다. HIV 게놈의 특이적 영역의 증폭은 생체내에서 바이러스의 낮은 정확도 역전사효소 및 면역 선택에 의해 유발되는 HIV 게놈의 높은 돌연변이율로 인해 복잡해진다. 그럼에도 불구하고, 다중 HFV 변이체로부터의 HIV 게놈 의 특정 영역을 증폭할 수 있는 프라이머가 개발되었다. 예를 들어 문헌 [Abravaya et al. J Clinical Microbio 2000 38:716-723]에는 혈장에서 HIV-1 군 M 아형 A, B, C, D, E, F 및 G, 및 군 O 및 HIV-2 RNA를 검출하는 다중 PCR 분석 에 사용하기 위한 pol 유전자에 보존된 서열에 표적화된 HIV-1-특이적 및 HIV-2-특이적 프라이머 및 프로브, 및 이러한 분석법을 사용하여 혈액 공급의 안정성을 개선하는 것이 개시되어 있다. 문헌 [Christopherson et al. Nucleic Acids Res 1997 25:654-658]에서는 gag의 142 염기쌍 영역을 증폭하는 RT- PCR에 대한 내부 프라이머-HIV-1 주형 미스매치의 효과를 논의하고 있다. HIV-I 주형 및 프라이머 28 내지 30 염기 길 이 사이의 5 내지 6개 (2 내지 4개가 아님)의 미스매치는 RT-PCR의 수율을 유의하게 감소시켰다. 프라이머는 미스매치 를 축적하기 위해 전형적으로 사용되는 것보다 길게 설계되었다. 보다 일탈된 HIV-I 아형 A 및 E의 증폭의 감소된 효율은 어닐링 온도를 50 로 저하시키고, 온도가 점차 증가하는 역전사 단계를 실시함으로써 4배 내지 10배 개선될 수 있었다. 또한, 5-메틸시토신으로 시토신을 치환하거나, 가변 염기의 위치에서 이노신을 치환하면 상동성 및 가장 일탈하는 HIV-I 주형 사이의 생성 수율이 4배 미만의 차이를 초래하였다. T에서 종결된 프라이머는 C, G 또는 T로 매치되거나 미스매치 될 경우 증폭을 가능하게 하였다. 문헌 [Michael et al. J Clin Microbiol 1999 37:2557-2563]은 HIV-I gag 유전자의 155 뉴클레오티드 서열의 증폭을 위 한 프라이머를 개시하고 있다. 프라이머는 아형 A 내지 G의 30 HIV-I 단리체에 대한 상동성을 최대화하고, 프라이머의 3' 말단 근처의 프라이머 미스매치에 대한 HIV-I을 최소화하도록 선택되었다. 증폭 동안 어닐링 온도를 저하시켜 미스매치 내성을 증가시켰다. 최적화된 프라이머 및 증폭 조건은 이전에 이용가능한 시험에 비해 검출된 HIV-I RNA의 양을 증가시 켰지만, 아형 A, D, F 및 G를 과소표시하였고, 아형 H 및 J의 구성원을 함유하지 않았다. 미국 특허 제6,001,558호에는 다중 HIV-I 단리체로부터의 LTR 및 pol 영역, 및 다중 HIV-2 단리체로부터의 LTR, pol 및 env 영역의 짧은 단편 (200 염기쌍 미만)을 증폭하기 위한 다중 프라이머의 용도가 개시되어 있다. 그 후, 다중 프로브 를 사용하여 증폭 생성물을 검출하였다. 프라이머/프로브 조합물은 군 M 및 O로부터의 HIV-1 단리체, 및 2가지 HIV-2-14 -
단리체를 검출할 수 있었다. HIV-I의 고도로 보존된 서열에 상응하는 프라이머를 하기 범주: 1) 증폭된 PCR 생성물의 길 이가 200 염기쌍을 초과할 수 없었는데, 이는 보다 적은 생성물은 보다 큰 생성물에 비해 보다 효과적인 증폭되었기 때문 이며, 다른 반응 조건에 대해 덜 민감하기 때문이고; 2) 프라이머 세트는 증폭된 생성물 검출용의 기능적 프로브 영역을 증 폭해야만 하고; 3) 프라이머의 3' 말단 근처의 미스매치는 5' 말단 근처의 미스매치보다 훨씬 덜 선호될 것이고; 4) 3' 말단 안정성, 길이 (약 23 내지 31 뉴클레오티드), GC 함량 및 다른 프라이머 및 프로브와의 상호작용에 대한 다른 범주에 의해 선택하였다. 미국 특허 제6,194,142호에는 HIV-I Bru, HIV-I MaI 및 HIV-I Eli, HIV-2 ROD의 gag, pol 및 env 유전자와 SIV MAC 균주 사이, 및 HIV-2 ROD 및 SIV MAC의 nef2, vif2 및 vpx 유전자 또는 HIV-I Bru, HIV-I MaI 및 HIV-I Eli의 env, nefl, vifl 및 vpr 유전자 사이에 보존된 서열에 상응하는 프라이머 상을 사용한 시험관내 진단 HIV-I, HIV-2 및 SIV 감염 을 위한 방법이 개시되어 있다. HIV 변이체 및 SIV에 상응하는 변이체 뉴클레오티드와 프라이머의 혼합물을 PCR 반응에 동시에 사용하였다. 미국 특허 제6,232,455호에는 31 HIV-I 군 M (아형 (A, B 및 D) 및 HIV-2 A 및 B 아형의 군 O 단리체 및 14개 단리체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프라이머/프로브 세트가 개시되어 있다. HIV-I 컨센서스 프라이머/프로브 세트는 HIV-I의 검출에 대해 특이적인 반면, HIV-2 컨센서스 프라이머/프로브 세트는 HIV-2의 검출에 대해 특이적이다. 미국 특허 제6,531,588호에는 환자에서 다중 HIV 유사종로부터의 pol의 0.7 kb, 1.57 kb 또는 2.1 kb 영역의 증폭 후, 적 절한 요법을 결정하고 약물 내성을 모니터링하는데 사용하기 위한 환자-특이적 HIV 유전자형 정보를 결정하기 위한 시퀀 싱을 위한 프라이머가 개시되어 있다. 미국 특허 출원 제2003/0148280호에는 순환 재조합 형태 (아형 사이의 재조합을 지칭하는 CFR)을 비롯한 이른바 모든 HIV-I 군 M, N 및 O 균주의 검출을 위한 프라이머 세트 및 프로브 및 군간 재조합이 개시되어 있다. 프라이머는 HIV-I gag p24 (399 bp 앰플리콘), pol 인테그라제 (864 bp 앰플리콘), 및 env gp41 면역우세 영역 (IDR; 369 bp 앰플리콘)에 대해 표적화된다. 항원 제시 세포 백신 또는 핵산 백신의 제조를 위한 개체에 존재하는 병원체의 다중 종으로부터의 특정 폴리펩티드를 코딩 하는 증폭된 자가 병원체 핵산을 사용하는 가능성은 상기 간행물의 어디에도 암시되지 않았다. 본 발명은 자가 감염 병원 체를 치료하기 위한 환자 특이적 백신을 개발하고, 추가의 이점도 제공하기 위한 오래 느껴져온 필요에 요점을 둔다. 발명의 요약 본 출원인은 샘플, 바람직하게는 병원체 감염된 개체로부터의 샘플에 존재하는 임의의 병원체의 다중 변이체 (균주)의 핵 산 증폭 방법을 발견하였다. 바람직한 실시양태에서, 병원체는 HIV와 같은 레트로바이러스이다. 증폭된 병원체 핵산은 샘 플에 존재하는 병원체 변이체를 확인하고, 샘플에 존재하는 병원체를 정량화하는 데에, 및 핵산 백신으로서, 또는 항원 제 시 세포 백신의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 핵산은 항원 제시 세포를 형질감염 (로딩)시키는데 사용될 수 있다. 그 후, 로딩된 항원 제시 세포는 병원체 감염 치료용의 백신으로서 사용될 수 있다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 핵산은 항원 제시 세포 내로의 사전 로딩 없이 핵산 백신으로서 직접적으로 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 a. 전방향 프라이머 어닐링을 위한 제1 영역 및 역방향 프라이머 어닐링을 위한 제2 영역 (상기 제1 및 제2 영역은 병원체의 오픈 리딩 프레임 및/또는 에피토프를 플랭킹함)을 선택하고, b. 상기 제1 및 제2 영역에 대한 후보 전방향 및 역방향 프라이머 (하나 이상의 상기 프라이머는 병원체의 다중 변이체 사 이의 서열 변이성을 상쇄하도록 설계됨)를 선택하는 것을 포함하는, 병원체의 다중 변이체의 증폭에 적합한 프라이머의 선 택 방법을 제공한다. 바람직하게는, 후보 전방향 및 역방향 프라이머는 길이가 200 뉴클레오티드 초과인 증폭 생성물, 보다 바람직하게는 길이 가 225, 250, 300 이상인 뉴클레오티드를 생성하도록 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 증폭된 핵산은 mrna를 생성하기 위한 유효한 생체내 또는 시험관내 전사를 위한 전사 및 전사 신호를 함유하고, 그 후 시험관내 또는 생체내에서 번역될 수 있다. 본 출원인은 또한 핵산, 바람직하게는 본 발명의 방법 에 의해 생산된 mrna를 사용한, 항원 제시 세포, 바람직하게는 수지상 세포의 로딩 방법을 제공한다. 로딩된 항원 제시 세포는 병원체 감염의 치료용의 백신으로서 유용하다. - 15 -
따라서, 또다른 측면에서, 본 발명은 포유동물에 존재하는 병원체의 다중 균주 (변이체)로부터의 1종 이상의 항원을 코딩 하는 다수의 핵산으로 형질감염된 항원 제시 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 핵산은 병원체의 상기 변이체 사이의 변 이성을 상쇄하도록 설계된 다수의 프라이머 쌍을 사용한 병원체 폴리뉴클레오티드의 핵산 증폭으로부터 유래될 수 있으 며, 상기 병원체 핵산은 상기 포유동물로부터의 것이거나 그로부터 유래된다. 본 발명은 또한 개체를 감염시키는 병원체의 다중 변이체의 대표적인 핵산으로 로딩된 항원 제시 세포의 제조 방법, 및 본 발명의 백신을 사용한 병원체 감염된 개체의 치료 방법을 제공한다. 바람직한 항원 제시 세포는 수지상 세포이다. 일 측면에서, 본 발명은 포유동물에 존재하는 병원체의 다중 변이체로부터의 1종 이상의 항원을 코딩하는 다수의 핵산 및 제약상 허용되는 담체를 포함하며, 상기 핵산은 병원체의 상기 변이체 사이의 뉴클레오티드 서열 변이성을 상쇄하는 다수 의 프라이머 쌍을 사용한 병원체 폴리뉴클레오티드의 핵산 증폭에 의해 유래된 것인 핵산 백신을 제공한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 (a) 병원체의 제1 및 제2 균주로부터의 폴리펩티드를 배합하여 혼합물을 형성하고; (b) 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하여 제1 앰플리콘 및 제2 앰플리콘 (상기 제1 앰플리콘은 상기 제1 균주로부터의 폴리펩티드를 코딩하고, 상기 제2 앰플리콘은 상기 제2 균주로부터의 상응하는 폴리펩티드를 코딩함)을 생성하는 것을 포함하는, 병원 체의 2종 이상의 균주로부터의 1종 이상의 폴리펩티드를 제시하는 병원체 앰플리콘의 생성 방법을 제공한다. 이러한 앰플 리콘은 항원 제시 세포의 형질감염용, 및 시험관내 번역된 병원체 폴리펩티드 생산용의 핵산 백신으로서 사용될 수 있다. 병원체의 다중 균주로부터의 표적화된 병원체 유전자 및 그의 단편을 증폭하는 능력으로 인해 병원체 DNA 또는 RNA 게 놈, RNA 바이러스의 전장 cdna 카피 등과 같은 총 병원체 핵산을 정제하거나 증폭할 필요가 회피된다. 예를 들어, 유전자 가 핵산 단편의 형태로 존재하든 인접하는 병원체 게놈으로서 존재하든, 핵산 백신으로서 또는 APC 내로의 로딩용으로 완 전 HIV 게놈을 제공하는 것은 감염성 바이러스의 재구축을 초래할 수 있었다. 또한, 특정 병원체 핵산 또는 폴리펩티드 (예 를 들어 HIV nef 또는 vpr)는 특히 항원 제시 세포에 대해 유해한 효과를 가질 수 있다. 유해한 효과를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리펩티드 또는 핵산은 제거되거나 다른 병원체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 대해 보다 적은 몰 비율로 존재 할 수 있다. 따라서, 다중 병원체 균주로부터의 병원체 폴리펩티드를 제시하지만 완전한 병원체 게놈보다 덜 제시하거나 병원체 단백질의 전부보다 덜 코딩하는 핵산을 포함하는 백신을 제공함으로써, 지속성 감염, 바이러스 유전자 또는 단백질 의 구조적 발현과 같은 병원체 감염이 회피될 수 있다. 유해한 병원체 폴리뉴클레오티드 및 단백질이 또한 회피될 수 있다. 따라서, 본 발명은 1종 이상의 병원체 폴리펩티드는가 임의의 균주로부터 제시되지 않는, 존재하는 병원체의 다중 균주로 부터의 1종 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다. 핵산은 1종 이상의 개체에 존재하는 다중 병원체 균주로부터의 폴리펩티드를 제시할 수 있다. 증폭된 병원체 핵산은 1종 이상의 병원체 감염된 개체로부터의 생물 학적 샘플에 존재하는 병원체 핵산으로부터 직접적으로 생성될 수 있거나, 병원체의 클로닝된 단리체로부터 생성될 수 있 다. 따라서, 일 측면에서, 본 발명은 1종 이상의 병원체 폴리펩티드가 임의의 균주로부터 제시되지 않는, 개별 대상체에 존 재하는 병원체의 다중 균주로부터의 1종 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 단리된 항원 제시 세포 (APC)를 제공한다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, 증폭된 병원체 핵산은 시험관내에서 번역되며, 환자를 백신화하는데 직접적으로 사용되 거나, APC를 로딩하는데 사용된다. 병원체 폴리펩티드 또는 이러한 펩티드로 로딩된 APC는 제약상 허용되는 담체와 함께 백신으로서 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 1종 이상의 병원체 폴리펩티드가 임의의 균주로부터 제시되지 않는, 병원 체의 다중 균주로부터의 병원체 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 1종 이상의 병원체 폴리펩티 드가 임의의 균주로부터 제시되지 않는, 개별 대상체에 존재하는 병원체의 다중 균주로부터의 병원체 폴리펩티드를 포함 하는 단리된 APC를 제공한다. 일 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 병원체 폴리펩티드가 임의의 균주로부터 제시되지 않는, 병원체-감염된 개체로부 터 수득되거나 유래된 항원 제시 세포를 상기 개체에 또는 1종 이상의 다른 개체에 존재하는 병원체의 다중 균주로부터의 1종 이상의 병원체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로 형질감염시키는 것을 포함하는 자가 백신의 제조 방법을 제공한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 병원체-감염된 포유동물로부터 수득되거나 유래된 항원 제시 세포를 상기 포유동물에 존재하 는 병원체의 다중 변이체로부터의 1종 이상의 항원을 코딩하는 핵산으로 형질감염시키는 것을 포함하며, 상기 핵산은 병 원체의 상기 변이체 사이의 변이성을 상쇄할 수 있는 다수의 프라이머 쌍을 사용한 병원체 폴리뉴클레오티드의 핵산 증폭 에 의해 유래된 것인, 자가 백신의 제조 방법을 제공한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 a. 포유동물에 존재하는 병원체의 다중 변이체를 상기 병원체의 다중 변이체를 증폭하여 증폭 된 병원체 DNA를 생성할 수 있는 다수의 프라이머 쌍을 사용하여 증폭하고; - 16 -
b. 임의로 상기 증폭된 병원체 DNA를 전사하여 병원체 RNA를 생성하고; c. 상기 병원체 DNA 또는 상기 병원체 RNA를 상기 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 병원체 감염된 포유동물의 치 료 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 임의의 병원체의 핵산을 증폭하는데 사용될 수 있다. 또한, 증폭된 생성물을 로딩하여 로딩된 병원체 (예 를 들어 로딩된 바이러스)를 측정할 수 있으며, 이를 시퀀싱하여 개체 내의 병원체 진화를 결정할 수 있다. 바람직한 실시 양태에서, 병원체는 HCV의 HIV이다. 본 발명은 서열 1 내지 58, 60 내지 161 및 172 내지 371로 본질적으로 이루어진 HIV의 다중 변이체의 증폭을 위한 프라이머를 제공하며, 프라이머는 서열 1 내지 58, 60 내지 161 및 172 내지 371로 이 루어진 군으로부터 선택된 핵산에 대해 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어지고, 프라이머 쌍은 서열 1 내지 58 및 서열 60 내지 371로 이루어진 군으로부터 선택된 프라이머의 조합물, 및 서열 1 내지 58 및 60 내지 371에 대해 75% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산을 포함하며, 이러한 프라이머 쌍을 함유하는 키트를 제공한 다. 키트는 또한 열안정성 DNA 폴리머라제, 역전사효소, 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 및 CD40L mrna를 포 함하나 이에 제한되지 않는 1종 이상의 시약을 함유할 수 있다. 일 측면에서, 본 발명은 HIV DNA의 다중 변이체를 본 발 명의 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 증폭하는 것을 포함하는, HIV 서열의 균주-독립성 증폭 방법을 제공한다. 일 측면에서, 본 발명은 감염된 환자의 고유한 바이러스 종(들)에 의해 발현된 다중 한정된 HIV 단백질 변이체에서 지정된 치료적 면역 반응을 유도하는 HIV에 대한 자가 백신을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 자가 바이러스로부터 유래된 다중 HIV 항원을 코딩하는 RNA로 형질감염된 자가 생체외 생성된 성숙한 수지상 세포로 이루어진 환자-특이적 백신을 제공한다. 발명의 상세한 설명 본 발명은 샘플에 존재하는 병원체의 대부분 또는 전부의 변이체로부터의 핵산을 증폭하는 방법에 관한 것이다. 프라이머 조성물, 증폭된 생성물 및 그의 유도체는 개체에 존재하는 병원체 변이체의 확인 및 정량에서, 및 병원체 감염의 치료 또는 예방용의 핵산 백신 및 세포 기재 백신으로서의 용도를 갖는다. 본 개시사항 전반에 걸쳐, 다양한 간행물, 특허 및 공개된 특허 명세서가 확인 인용에 의해 참고된다. 상기 간행물, 특허 및 공개된 특허 명세서의 개시사항은 본 발명이 관련된 분야의 상태를 보다 완전히 기재하기 위해 본 개시사항에 참고로 도입 된다. 그러나, 다른 모순되는 충돌이 있는 경우에는, 본 명세서가 지배할 것이다. 본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는다면, 당업자의 범위내인 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생 화학 및 면역학의 통상적인 기술을 이용한다. 이러한 기술은 문헌에 완전히 설명되어 있다. 상기 방법은 하기 간행물에 기 재되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (1989)]; [CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al. eds. (1987))]; [the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.)]; [PCR: A PRACTICAL APPROACH (M. MacPherson et al. IRL Press at Oxford University Press (1991))]; [PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (MJ. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995))]; [ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL (Harlow and Lane eds. (1988)) ]; [USING ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL (Harlow and Lane eds. (1999))]; 및 [ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney ed. (1987))]을 참조한다. 정의 본원에 사용된 특정 용어는 하기 정의된 의미를 가질 것이다. 본 명세서 및 특허청구범위에 사용된 단수 형태 관사 ("a", "an" 및 "the")는, 내용이 명백히 달리 지시하지 않는다면 복수 참조물을 포함한다. 예를 들어, "세포"라는 용어는 그의 혼 합물을 비롯한 복수의 세포를 포함한다. 모든 수치적 표시, 예를 들어 ph, 온도, 시간, 농도 및 분자량 (범위 포함)은 0.1의 증가량으로 (+) 또는 (-)로 다양하다. 모 든 수치적 표시에 "약"이라는 용어가 선행된다고 항상 명백히 언급되지는 않는다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본원에 기 재된 시약은 단지 설명적이며 이러한 등가물이 당업계에 공지되었다고 항상 명백히 언급되지는 않는다는 것이 이해되어야 한다. - 17 -
"증폭"은 표적 핵산 서열의 다중 카피를 생성하는 프라이머 및 핵산 폴리머라제를 사용한 핵산 증폭 절차를 지칭한다. 이러 한 증폭 반응은 당업자에게 공지되어 있으며, 중합효소 연쇄 반응 (PCR, 미국 특허 제4,682,195호, 제4,683,202호 및 제 4,965,188호 참조), RT-PCR (미국 특허 제5,322,770호 및 제5,310,652호 참조), 리가제 연쇄 반응 (LCR, EP 0 320 308 참조), NASBA 또는 유사한 반응, 예를 들어 미국 특허 제5,399,491호에 기재된 TMA 및 gap LCR (GLCR, 미국 특 허 제5,427,202호)을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 핵산 표적이 RNA일 경우, RNA는 역전사효소를 사용하여 상 보적 DNA 가닥 내로 먼저 카피될 수 있다 (미국 특허 제5,322,770호 및 제5,310,652호 참조). "앰플리콘"은 증폭 절차를 사용하여 합성된 핵산을 지칭한다. "항원"이라는 용어는 당업계에 널리 이해되어 있으며, 면역원성인 물질, 즉 면역원을 포함하며, 면역원 또는 항원의 임의의 다양한 여러 가지 제제를 포함한다. "항원 제시 세포 (APC)"라는 용어는 면역계의 특이적 효과기 T 세포에 의해 인지가능 한 항원-MHC 복합체의 형태인 1종 이상의 항원을 제시할 수 있는 세포의 부류를 지칭한다. APC로는 대식세포, B-세포 및 수지상 세포, 예를 들어 미성숙 수지상 세포, 성숙한 수지상 세포, 형질세포형 수지상 세포 및 랑게르한스 세포를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 "본질적으로 이루어진"이라는 용어는 조합의 임의의 필수적으로 유의한 다른 요소를 배제하는 것을 의미할 것이다. 따라서, 본원에 정의된 바와 같은 요소로 본질적으로 이루어진 조성물은 단리 및 정제 방법, 생물학적 완충제 및 제약상 허용되는 담체, 예를 들어 인산염 완충 염수, 보존제 등으로부터의 추적성 오염물을 배제하지 않을 것이다. 프라이 머 및 참조 올리고뉴클레오티드의 내용에서 사용될 경우, "본질적으로 이루어진"이라는 용어는 프라이머가 참조 뉴클레오 티드의 5' 말C 에 10개 초과의 추가의 뉴클레오티드 잔기, 및 참조 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 10개 초과의 추가의 뉴클레오티드 잔기를 갖지 않는 것을 의미할 것이다. 예를 들어, 서열 X의 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 프 라이머는 서열 X의 5' 말단에 0 내지 10개의 추가의 뉴클레오티드, 및 서열 X의 3' 말단에 1 내지 10개의 추가의 뉴클레오 티드를 가질 수 있다. 바람직하게는, 참조 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 프라이머는 참조 올리고뉴클레오티 드의 각각의 5' 및 3' 말단에 5, 6, 7, 8 또는 9개 이하의 추가의 뉴클레오티드를 갖는다. 가장 바람직하게는, 참조 올리고 뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 프라이머는 참조 올리고뉴클레오티드의 각각의 5' 및 3' 말단에 1, 2, 3 또는 4개 이 하의 추가의 뉴클레오티드를 갖는다. 본원에 사용된 서열 X, 서열 Y 및 서열 Z로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 프라 이머를 포함하는 조성물은 각각의 올리고뉴클레오티드의 5' 및/또는 3' 말단 상에 0 내지 10개의 추가의 뉴클레오티드를 갖는 서열 X, 서열 Y 및 서열 Z의 올리고뉴클레오티드의 하나 또는 임의의 조합물을 함유할 수 있다. 조성물 자체가 이러 한 프라이머를 포함하며, 또한 추가의 요소를 함유할 수 있다. 본원에 사용된 "상응하는 폴리펩티드"는 병원체 유전자의 상이한 대립유전자 또는 그의 단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 이다. 가설적인 예에서, 바이러스의 균주 X는 각각 폴리펩티드 A, B, C 및 D를 코딩하는 4개의 유전자 a, b, c 및 d를 갖는 다. 바이러스의 균주 Y는 각각 폴리펩티드 A', B', C' 및 D'를 코딩하는 a', b', c' 및 d'로 표시된 동일한 4개의 유전자의 상 이한 대립유전자를 코딩한다. 따라서, A 및 A'는 상응하는 폴리펩티드이며, B 및 B'는 상응하는 폴리펩티드, 등이다. 폴리 펩티드라는 용어는 전장 단백질 뿐만 아니라 그의 단편 둘다를 지칭한다. 본원에 사용된 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 mrna로 전사되고 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭 한다. 폴리뉴클레오티드가 진핵생물의 게놈 DNA로부터 유래될 경우, 발현은 mrna의 스플라이싱을 포함할 수 있다. 발 현에 필요한 조절 요소는 RNA 폴리머라제에 결합하는 프로모터 서열 및 리보솜 결합을 위한 번역 개시 서열을 포함한다. 예를 들어, 박테리아 발현 벡터는 lac 프로모터 및 전사 개시를 위한 프로모터와 같은 프로모터, 리보솜 결합을 위한 샤인- 달가노 서열, 및 번역의 개시를 위한 시작 코돈 AUG를 포함할 수 있다 ([Sambrook et al. (1989)] 상기 문헌). 유사하게, 진핵세포 발현 벡터는 RNA 폴리머라제 II에 대한 이종성 또는 상동성 프로모터, 하류 폴리아데닐화 신호, 시작 코돈 AUG, 및 리보솜의 분리를 위한 종결 코돈을 포함할 수 있다. 이러한 벡터는 상업적으로 수득될 수 있거나 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 일반적으로 벡터의 구축에 대해 하기 본원의 방법에 기재된 서열에 의해 조립될 수 있다. "유전적으로 변형된"이라는 용어는 외래 유전자 또는 핵산 서열을 함유하고/거나 발현하여, 다시 세포 또는 그의 조상의 유 전자형 또는 표현형을 변형시키는 것을 의미한다. 다시 말하면, 이는 세포의 내인성 뉴클레오티드에 대한 임의의 추가, 결 실 또는 붕괴를 지칭한다. "HIV RNA"는 게놈 HIV RNA 및 HIV mrna 뿐만 아니라, 본 발명의 방법에 의해 제조된 HIV 앰플리콘의 전사에 의해 생 성된 RNA를 의미한다. - 18 -
"HIV 변이체" 또는 "HIV의 변이체" 또는 "HIV 균주"는 HIV-I 및 HIV-2, HIV-I 군 M, N 및 O, HIV-I 아형 A1, A2, B, C, C, F1, F2, G, H, J 및 K를 비롯한 모든 HIV 아형 (분기군), 분기군의 변이체, 그의 모든 유사종 및 순환 재조합 형태를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 "균주"라는 용어는 단일 뉴클레오티드에 의해 상이한 2개의 HIV 단리체가 HIV의 2개의 상이한 "균주"로 고려될 것으로 사용된다. 군이라는 용어는 HIV-I 계통 M, N 및 O를 지칭하는데 통상적으로 사용된다. 아형이라는 용어는 군 내의 주요 분기군을 지칭하는데 사용된다. 아형 내의 추가의 서열 변이성이 있다. 순환 재조합 형태 (CRF)는 HIV 유행병에 중 요한 역할을 하는 재조합 계통을 기재한다. CRF 구성원은 유사한 또는 동일한 모자이크 구조를 공통적으로 공유하며, 즉 이들은 동일한 재조합 사건(들)로부터 내려간다. HIV의 순환 재조합 형태는 하기를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는 다. 상기 CRF의 기재 및 지도 및 HIV 서열에 대한 링크는 Wv.lanl.gov/content/Hv-db/CRFs/CRF.html에서 발견할 수 있다. 유사하게, "병원체 변이체" 또는 "병원체의 변이체" 또는 "병원체 균주" 또는 "병원체의 균주"는 병원체의 모든 변이체를 지 칭하며, 환자에 존재할 수 있는 변이체, 돌연변이체 및 병원체의 재조합을 포함한다. 본원에 사용된 단일 뉴클레오티드에 의해 상이한 병원체의 2가지 변이체는 병원체의 2가지 상이한 균주로 간주된다. 본원에 사용된 "생체내" 유전자 전달, 유전자 전달, 유전자 요법 등은 인간 또는 비-인간 포유동물과 같은 유기체의 신체 내로의 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 직접적 도입을 지칭하는 용어이며, 그에 의해 외인성 폴리뉴클레오티 드는 유기체에 생체내로 도입된다. "단리된"이라는 용어는 구성요소, 세포로부터 분리되고, 다르게는 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체 또 는 그의 단편이 자연에서 통상적으로 관련되는 것을 의미한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드에 대해, 단리된 폴리뉴클레오 티드는 통상적으로 염색체와 관련된 5' 및 3' 서열로부터 분리된 것이다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 비-천연 발생 폴리 뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체 또는 그의 단편은 그의 천연 발생 반대물로부터 구별하기 위해 "단리"를 필요로 하지 않는다. 또한, "농축된", "분리된" 또는 "희석된" 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체 또는 그 의 단편은 부피당 분자의 농도 또는 수가 그의 천연 발생 반대물의 것보다 초과로 "농축되거나" 덜 "분리된" 그의 천연 발생 반대물로부터 구별가능하다. 그의 일차 서열에서 또는 예를 들어 그의 당화 패턴에 의해 천연 발생 반대물과 상이한 폴리 뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체 또는 그의 단편은 그의 단리된 형태에 존재할 필요가 없는데, 이는 이것 이 그의 일차 서열에 의해, 또는 별법으로 그의 당화 패턴과 같은 또다른 특징에 의해 그의 천연 발생 반대물로부터 구별가 능하기 때문이다. 본원에 개시된 각각의 본 발명에 대해 명백히 언급되지는 않았지만, 하기 및 적절한 조건하에서 개시된 각각의 조성물에 대한 상기 실시양태의 전부는 본 발명에 의해 제공된다. 따라서, 비-천연 발생 폴리뉴클레오티드는 단리 - 19 -
된 천연 발생 폴리뉴클레오티드로부터 별개의 실시양태로서 제공된다. 박테리아 세포에서 생산된 단백질은 천연에서 생산 된 진핵 세포로부터 단리된 천연 발생 단백질로부터의 별개의 실시양태로서 제공된다. 항원 제시 세포와 같은 단리된 포유 동물 세포는 포유동물에서 그의 정상적인 위치로부터 분리되거나 제거된다. "항원 제시 세포 (APC)의 로딩"은 항원, 그의 에피토프, 펩티드, 단백질, 또는 상기를 코딩하는 핵산의 APC에 의한 하적을 지칭한다. APC는 시험관내에서 또는 동일계내에서 로딩될 수 있다. "mrna"는 번역가능한 RNA이다. mrna는 리보솜 결합 부위 및 시작 코돈을 함유할 것이다. 바람직하게는, mrna는 또 한 5' 말단, 정지 코돈 및 폴리A 꼬리를 함유할 것이다. "다중 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)"은 2 이상의 표적 서열이 프라이머의 다중 상을 사용하여 단일 증폭 반응에서 동시에 증폭되는 PCR의 변이체이다. 비-제한적 예로서, 다중 증폭은 상이한 유전자, 단일 유전자의 상이한 대립유전자 및 단일 유전자의 상이한 단편의 증폭 반응을 포함한다. 다중 PCR 조건의 최적화 방법은 문헌 [Abravaya et al. J Clinical Microbiol 2000 38:716-723]; [Kremer at al. J Clin Microbiol 2004 42:3017-3022]; [Garcia-Canas et al. Electrophoresis 2004 25:2219-2226]; 및 [Markoulatos et al. J Clin Lab Anal 2003 17:108-12] (이들의 내용은 참 고로 도입됨)에 개시되어 있다. 본원에 사용된 "병원체"는 임의의 질병 유발 유기체 또는 바이러스, 및 그의 약독화된 유도체를 지칭한다. "제약 조성물"은 조성물을 시험관내, 생체내 또는 생체외 진단 또는 치료 용도에 적합하게 하는 불활성 또는 활성의 담체와 활성 성분의 조합물을 포함하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체"라는 용어는 인산염 완충 염수 용액, 물, 및 유/수 또는 수/유 에멀젼, 및 다양한 종류 의 습윤제와 같은 에멀젼과 같은 임의의 표준 제약 담체를 포함한다. 조성물은 또한 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있다. 담체, 안정화제 및 보조제의 예에 대해서는 문헌 [Martin REMINGTON'S PHARM. SCL, 18th Ed. (Mack Publ. Co., Easton (1990))]을 참조한다. "유효량"은 유효 이익 또는 목적하는 결과에 충분한 양이다. 유효량은 하나 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있다. "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산 분자"라는 용어는 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭하는데 호환적으로 사 용된다. 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 및/또는 그의 유사체를 함유할 수 있다. 뉴클레 오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며, 공지되거나 비공지된 임의의 기능을 수행할 수 있다. "폴리뉴클레오티드" 라는 용어는 예를 들어 단일-가닥, 이중-가닥 및 삼중 나선 분자, 유전자 또는 유전자 단편, 엑손, 인트론, mrna, trna, rrna, 리보솜, cdna, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머를 포함한다. 또한, 천연 핵산 분자에 대해, 본 발명의 핵산 분 자는 또한 변형된 핵산 분자를 포함할 수 있다. "프라이머"는 증폭 반응에 사용될 수 있는, 길이가 9 내지 150 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 서열 X로 본질적으로 이루어진 프라이머는 서열 X의 5' 말단 상에 10개 이하의 추가의 뉴클레오티드, 및 서열 X의 3' 말단 상에 10 개 이하의 추가의 뉴클레오티드를 가질 것이다. "전방향 프라이머"는 센스 가닥 또는 번역된 mrna의 서열에 상응하는 핵 산 내로 RNA 폴리머라제 또는 DNA 폴리머라제에 의해 연장될 수 있는 프라이머를 의미한다. "역방향 프라이머"는 센스 가닥 또는 번역된 mrna에 상보적인 핵산 내로 RNA 폴리머라제 또는 DNA 폴리머라제에 의해 연장될 수 있는 프라이머 를 의미한다. "프라이머 쌍"은 증폭 반응에 사용되어 앰플리콘을 생성할 수 있는 전방향 및 역방향 프라이머를 지칭한다. "RNA"라는 용어는 임의의 길이의 리보뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭하며, 리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티 드 유사체는 포스포디에스테르 결합에 의해 함께 결합된다. "RNA"라는 용어는 예를 들어 단일-가닥, 이중-가닥 및 삼중 나선 분자, 일차 전사체, mrna, trna, rrna, 시험관내 전사체, 시험관내에서 합성된 RNA, 분지된 폴리리보뉴클레오티 드, 임의의 서열의 단리된 RNA 등을 포함한다. 서열 사이의 상동성 또는 서열 동일성 (본원에서 호환적으로 사용되는 용어)의 계산은 하기와 같이 수행된다. 2개의 아미 노산 서열, 또는 2개의 핵산 서열의 동일률 (%)을 결정하기 위해, 서열을 최적 비교 목적으로 정렬한다 (예를 들어, 갭을 제1 및 제2 아미노산 중 하나 또는 둘다, 또는 최적 정렬을 위한 핵산 서열에 도입할 수 있고, 비-상동성 서열을 비교 목적 으로 무시할 수 있음). 상이한 길이의 2개의 프라이머 또는 후보 프라이머의 정렬시, 보다 짧은 프라이머의 길이는 보다 긴 - 20 -
서열의 길이의 60% 이상, 보다 바람직하게는 70%, 80%, 90%, 100% 이상이어야 한다. 프로모터 프라이머 (예를 들어 T7 프로모터 프라이머) 및 폴리 dt 프라이머 사이의 동일률 (%)를 비교하기 위한 목적으로, 비-코딩 영역을 비교로부터 제외한다. 비-코딩은 오픈 리딩 프레임 밖의 영역을 의미한다. 그 후, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에 서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 아미노 산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유될 경우, 분자는 상기 위치에서 동일하다 (본원에 사용된 아미노산 또는 핵산 "동일 성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"과 동등함). 2개의 서열 사이의 동일률 (%)은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필 요가 있는 갭의 수, 각각의 갭의 길이를 고려한, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다. 서열의 비교 및 2개의 서열 사이의 동일률 (%)의 결정은 수학적 알고리듬을 사용하여 달성될 수 있으며, 바람직한 실시양 태에서, 2개의 아미노산 서열 사이의 동일률 (%)은 블로스섬(Blossum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 길이 중량을 사용한 GCG 소프트웨어 패키지에서의 GAP 프로그램 (월드와이드웹 상에서 gcg.com에서 이용가능함)으로 도입된 니들맨 및 운쉬 ([J. Mol. Biol. (1970) 48:444-453]) 알고 리듬을 사용하여 측정된다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 동일률 (%)은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용한 GCG 소 프트웨어 패키지에서의 GAP 프로그램을 사용하여 측정된다. 파라미터 (및 실시자가 무슨 파라미터가 분자가 본 발명 내 인지 결정하는데 적용되어야 하는지를 확신하지 못하는 경우 사용되어야 할 것)의 특히 바람직한 세트는 12의 갭 오픈 패 널티, 4의 갭 연장 패널티, 및 5의 프레임쉬프트 갭 페널티를 갖는 블로스섬 62 스코어링 매트릭스를 사용하는 것이다. 2개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 동일률 (%)은 PAM 120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패 널티를 사용한 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)으로 도입된 이. 마이어스(E. Meyers) 및 더블유. 밀러(W. Miller)의 알고리듬 을 사용하여 결정될 수 있다. 본원에 기재된 핵산 및 단백질 서열은 공개 데이타베이스에 대한 조사를 수행하기 위해, 예를 들어 다른 족 구성원 또는 관 련된 서열을 확인하기 위한 "의문 서열"로서 사용될 수 있다. 이러한 조사는 문헌 [Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol., 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 조사를 NBLAST 프로그램, 스코어=100, 단어길이=12로 수행하여 본 발명의 병원체 핵산 분자 및 프라이머에 상동성인 뉴클레오 티드 서열을 수득할 수 있다. BLAST 단백질 조사를 XBLAST 프로그램, 스코어=50, 단어길이=3으로 수행하여 본 발명의 EPLIN 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적으로 갭화 정렬을 수득하기 위해, 갭화 BLAST 를 문헌 [Altschul et al., (1997) 핵산 Res., 25(17):3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 갭화 BLAST 프로그램을 이용할 경우, 각각의 프로그램 (예를 들어 XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있 다. ncbi.nlm.nih.gov를 참조한다. HIV와 같은 급속히 돌연변이되는 병원체는 백신화기에 어려운 표적을 제시한다. 병원체에 대한 이전의 백신화 전략은 공 통적인 균주 또는 컨센서스 서열에 대해 지정되었다. 그러나, 상기 전략은 급속하게 돌연변이되거나 재조합되는 병원체에 대한 예방 또는 치료 효과를 제공하는데 실패했으며, 병원체 표적은 고도로 가변성일 수 있다. 자가 HIV 백신, 특히 환자를 감염시키는 모든 변이체를 동시에 표적화할 수 있는 것과 같은 자가 병원체 백신의 개발은 치료제의 새로운 패러다임을 제 공한다. 개체에서 특정 병원체 항원 제시에 대한 면역 반응을 지시하는 백신으로 병원체 감염된 개체를 치료하는 능력은, 개체가 바이러스 청소를 매개하거나 바이러스 로딩을 저해하는 능력이 거의 없거나 전혀 없는 것으로 지금까지 나타난 이 전의 HIV 백신과 같은 컨센서스 항원에 대해 지정된 백신보다 유용한 것으로 입증되어야 한다. 본 발명의 목적은 개체 내에 존재하는 병원체 변이성을 상쇄하는 개인화된 세포 또는 핵산 백신을 사용한 병원체의 환자- 특이적 백신화 전략을 제공하는 것이다. 상기 전략은 감염된 대상체로부터의 병원체 핵산의 증폭, 및 환자-특이적 백신에 서의 이러한 증폭된 병원체 물질 또는 그의 유도체의 용도에 의존한다. 증폭된 병원체 핵산 또는 그의 유도체 (예를 들어 시험관내 전사 생성물, 시험관내 전사/번역 생성물, 또는 이러한 증폭된 핵산을 함유하는 벡터)는 자가 또는 동종간 핵산 백신으로서 사용될 수 있거나, 수지상 세포 (DC)와 같은 자가 항원 제시 세포 (APC) 내로 로딩될 수 있고, 그 후 환자에게 투여된다. 또한, 증폭된 생성물은 감염된 개체에 존재하는 병원체 변이체를 확인하고 치료 개입의 효과를 모니터링하는데 사용될 수 있다. 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 및 다른 핵산 증폭 기술은 관심의 특정 병원체 항원을 코딩하는 DNA를 수득하는 편리하고 효 과적인 방법이다. 그러나, 일부 병원체, 특히 HIV와 같은 레트로바이러스 병원체의 높은 돌연변이 빈도 때문에, 이는 본 발 명 이전에는 개체 환자에 존재할 수 있는 병원체 변이체의 표적화된 영역을 신뢰할 만하게 증폭할 수 있는 PCR 프라이머 를 설계하는 중요한 기회였다. 예를 들어, 코딩 영역을 플랭킹하는 HIV 서열에 상당히 적은 이종성이 있다 하더라도, 절대 적으로 보존된 영역은 관심의 각각의 유전자에 대한 단일 유니버셜 프라이머 쌍의 설계를 가능하게 하도록 존재하지 않는 - 21 -
다. 따라서, 본 발명의 방법은 관심의 병원체 유전자의 핵산 증폭을 위한 전방향 및 역방향 항원-특이적 프라이머의 풀 (pool) 또는 그의 일부분을 사용하여, 감염된 개체에 존재하는 병원체의 대부분 또는 전부의 균주가 하나 이상의 전방향 및 역방향 프라이머와 반응하여 다양한 표적 서열의 증폭을 허용하도록 한다. 본 발명은 프라이머 어닐링 부위에서 병원체 핵산 사이의 변이성을 상쇄하는 다중 프라이머 쌍 및 증폭 조건을 사용한 병 원체 핵산의 균주-독립성 핵산 증폭 방법을 제공한다. 상기 방법을 사용하면, 감염된 개체에 존재하는 병원체의 본질적으 로 모든 변이체로부터의 모든 또는 표적화된 부분을 증폭할 수 있다. 개체에 존재하는 병원체 변이체의 전부 또는 대부분 의 증폭은 감염된 개체에 존재하는 변이체를 확인하고 정량화하는데 사용될 수 있는 앰플리콘을 생성한다. 이러한 앰플리 콘 또는 그의 유도체는 병원체 감염을 치료하고/거나 감염된 개체에 존재하는 병원체 변이체를 확인하는 세포-기재 백신 또는 핵산 백신에 사용될 수 있다. 상기 증폭된 생성물 (앰플리콘)은 직접적으로 사용되거나, 동일계내 또는 시험관내에서 APC, 바람직하게는 자가 APC 내로 로딩하기 위한 번역가능한 RNA로 전환될 수 있다. 전사체로부터 제조된 앰플리콘 및 시험관내 전사체는 핵산 백신으로서 사용될 수 있다. 이러한 시험관내 전사체로부터 제조된 시험관내 번역된 폴리펩티드 는 폴리펩티드 백신으로서 및 APC의 로딩용으로 사용될 수 있다. 병원체 핵산의 균주-독립성 증폭의 중요한 측면은 프라이머 및 증폭 조건의 선택이다. 본 출원인은 병원체 핵산의 상이한 영역을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍의 선택 방법을 발견하였다. 균주-독립성 방식으로 HIV와 같은 가변성 병원체로부터의 선택된 표적 항원을 증폭하기 위해, PCR 프라이머의 풀을 전략적으로 선택하여 의도된 표적의 신뢰할 만한 증폭 및 존재 하는 변이체의 동시 공동-증폭을 보증할 수 있다. 증폭을 위한 표적에 대한 자가 항원의 수 및 선택은 2가지 주요 인자에 대해 서술될 수 있다: (1) 표적 유전자의 실질적인 영역은 관리가능한 복잡성을 갖는 프라이머의 풀을 사용한 핵산 증폭을 따라야 하며, (2) 바람직하게는, 표적 항원의 발현 은 DC와 같은 표적 APC의 생물학에 부정적인 영향을 주지 않는다. 총 병원체 핵산 이외에 병원체 핵산의 특정 영역을 증 폭함으로써, 대부분의 면역원성 단편을 코딩하는 영역을 선택하고, 면역계에 대한 부정적인 효과를 가질 수 있는 영역을 회피할 수 있다. 예를 들어, 수지상 세포의 억제에 관여하는 HIV nef 유전자의 일부분은 억제를 담당하는 nef의 영역을 증 폭하지 않는 프라이머를 선택함으로써 회피될 수 있다. 병원체의 공지된 변이체에 상응하는 다중 프라이머는 표적 좌위에 혼성화하기 위해 설계될 수 있다. 그러나, 프라이머 복 잡성을 관리하기 위해, 먼저 공지된 병원체 변이체 사이의 보존된 뉴클레오티드 서열을 결정하는 것이 유용하다. 병원체 핵산의 보존된 영역에 혼성화되는 프라이머의 선택은 개체에 존재하는 병원체의 모든 또는 대부분의 변이체의 증폭을 보 증하는데 필요한 프라이머의 수를 감소시킨다. 프라이머 선택에서 또다른 중요한 고려사항은 공지된 변이체 어닐링 부위 에 프라이머 서열의 3' 반에서 미스매치가 회피되거나 최소화되어야 하지만, 3' 말단 미스매치된 T는 전형적으로 증폭에 나쁜 영향을 갖지 않는다는 점이다. 잔류하는 3' 미스매치는 어닐링 온도의 저하에 의해 상쇄될 수 있다. 프라이머 서열의 5' 반의 미스매치는 내성이며, 어닐링 온도의 저하에 의해 상쇄될 수 있다. 증폭 반응 조건은 비-특이적 증폭을 회피하면서 감염된 개체에 존재하는 모든 병원체 변이체의 증폭을 허용하도록 최적화될 수 있다. 따라서, 본 발명의 프라이머 및/또는 방법을 사용한 증폭은 개체에 존재하는 병원체의 모든 변이체의 확인 및 정량을 가능하게 한다. 반대로, 이전의 당분야의 방법은 전형적으로 단일 병원체 변이체가 확인되었기 때문에 존재하는 병원체의 양을 과소평가하였다. HIV의 다중 변이체를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍의 선택에 대한 상기 및 하기 실시예에 기재된 방법은 임의의 병원체의 다중 변이체를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 선택하는데 적용가능하다. 본원에 기재된 프라이머 선택 방법은 전방향 프라 이머 어닐링에 대한 제1 영역 및 역방향 프라이머 어닐링에 대한 제2 영역 (여기서, 상기 제1 및 제2 영역은 병원체의 오픈 리딩 프레임 및/또는 에피토프를 플랭킹함)을 선택하는 단계; 및 상기 제1 및 제2 영역에 대한 후보 전방향 및 역방향 프라 이머 (여기서, 하나 이상의 상기 프라이머는 병원체의 다중 변이체 사이의 서열 변이성을 상쇄하도록 설계됨)를 선택하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일 실시양태에서, 프라이머는 감염된 포유동물에 존재하는 병원체의 다중 변이체로부터의 핵산을 증폭하는 상 기 방법에 의해 설계된다. 그 후, 증폭된 핵산은 동일한 병원체 감염된 포유동물을 치료하는 자가 핵산 백신에 사용될 수 있다. 별법으로, 증폭된 핵산은 병원체의 의해 감염된 여러가지 포유동물을 치료하는 동종간 핵산 백신으로서, 또는 감염 을 예방하는 예방 백신으로서 사용될 수 있다. 예방 용도를 위해, APC 로딩된 핵산 백신 또는 핵산은 하나 이상의 개체로 부터 단리되거나 유래된 병원체 핵산으로부터 제조된 앰플리콘을 사용하여 제조될 수 있다. 따라서, 일 실시양태에서, 본 발명은 (a) 병원체의 제1 및 제2 균주로부터의 폴리뉴클레오티드를 조합하여 혼합물을 형성 하고; (b) 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하여 제1 앰플리콘 및 제2 앰플리콘 (상기 제1 앰플리콘은 상기 제1 균주로부터 의 폴리펩티드를 코딩하고, 상기 제2 앰플리콘은 상기 제2 균주로부터의 상응하는 폴리펩티드를 코딩함)을 증폭하는 단계 를 포함하는, 병원체의 2종 이상의 균주로부터의 1종 이상의 폴리펩티드를 제시하는 병원체 앰플리콘의 생성 방법을 제공 - 22 -
한다. 예를 들어, 제1 및 제2 균주로부터의 폴리뉴클레오티드는 1종 이상의 병원체 감염된 개체, 1종 이상의 병원체 배양 물, 클로닝된 병원체 또는 클로닝된 병원체 핵산으로부터 수득될 수 있다. 이러한 앰플리콘의 시험관내 전사에 의해 생성 된 앰플리콘 및 RNA는 핵산 백신으로서 및 항원 제시 세포의 로딩에 유용하다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 포유동물에 존재하는 병원체의 다중 변이체로부터의 1종 이상의 항원을 코딩하는 다수의 핵산 및 제약상 허용되는 담체를 포함하며, 상기 핵산은 병원체의 상기 변이체 사이의 변이성을 상쇄할 수 있는 다수의 프 라이머 쌍을 사용한 병원체 폴리뉴클레오티드의 핵산 증폭에 의해 유래된 것인 핵산 백신을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 핵산 백신을 상기 병원체-감염된 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 감염의 치 료 방법을 제공한다. 유사하게, 본 발명은 포유동물에 존재하는 병원체의 다중 변이체로부터의 1종 이상의 항원을 코딩하는 다수의 핵산을 제 약상 허용되는 담체와 배합하며, 상기 핵산은 병원체의 상기 변이체 사이의 변이성을 상쇄할 수 있는 다수의 프라이머 쌍 을 사용한 병원체 폴리뉴클레오티드의 핵산 증폭에 의해 유래된 것인 핵산 백신의 제조 방법을 제공한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 1종 이상의 병원체 폴리펩티드가 임의의 균주로부터 제시되지 않는, 개별 대상체에 존재 하는 병원체의 다중 균주로부터의 1종 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 단리된 항원 제시 세포 (APC)를 제 공한다. 가설적인 예에서, 바이러스는 폴리펩티드 A, B 및 C를 코딩하는 총 3개의 유전자, a, b 및 c를 갖는다고 가정한다. 상기 바이러스는 급속하게 돌연변이되며, 바이러스의 2가지 균주는 감염된 환자로부터 단리된 균주 X 및 Y이다. 균주 X는 폴리펩티드 A', B' 및 C를 코딩하는 대립유전자 a', b' 및 c'를 갖는다. 균주 Y는 a *, b * 및 c * 로 표시되며 변이체 폴리펩티드 A *, B * 및 C * 를 코딩하는 동일한 유전자의 상이한 대립유전자를 갖는다. 상기 구체화된 바와 같이, 상기 항원 제시 세포는 병원체의 다중 균주 (예를 들어 바이러스의 균주 X 및 Y)로부터의 1종 이상의 병원체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함 하지만, 1종 이상의 병원체 폴리펩티드는 임의의 균주를 제시하지 않는다. 이는 APC가 3개의 유전자 중 하나 또는 2개의 각각의 대립유전자를 제시하는 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있음을 의미한다. 예를 들어, APC는 A', A *, B' 및 B * 를 코 딩하지만, C 또는 C * 는 코딩하지 않는 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 여기서, 임의의 균주로부터 제시되지 않는 병 원체 폴리펩티드는 C 또는 C * 가 제시되지 않는 폴리펩티드 C이다. 본원에 사용된 폴리펩티드라는 용어는 전장 단백질 및 그의 단편 둘다를 지칭한다. APC는 A', A *, B', B *, 및 C 및 C * 의 상응하는 단편을 함유할 수 있지만, C 및 C*의 전부는 함 유하지 않는다. 모든 병원체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 사용하는데 비해 상기 접근법의 이점은 감염성 병원체의 재구 축을 회피한다는 점이다. 추가의 이점은 환자에게 또는 항원 제시 세포에게 유해할 수 있는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 특이적으로 회피될 수 있다는 점이다. 본 발명의 핵산 백신은 포유동물에게 투여하기에 적합하다. 바람직한 실시양태에서, 포유동물은 영장류이며, 가장 바람직 하게는 인간이다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 핵산 백신은 병원체 폴리뉴클레오티드가 유래된 특정 포유동물에게 투여 된다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에서, 병원체 폴리뉴클레오티드는 감염된 환자로부터 단리되며, 핵산 백신은 상기 환 자에게 투여된다. 본 발명의 핵산은 병원체의 다중 변이체로부터의 1종 이상의 항원을 코딩하는 다수의 핵산을 포함한다. 핵산은 단일 또는 이중 가닥 RNA 또는 DNA일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 핵산은 RNA이며, 가장 바람직하게는 핵산은 mrna이다. 본 발명의 핵산 백신은 이들이 투여되는 포유동물에서 1종 이상의 세포 유형에서 발현될 수 있어야 한다. 발현은 핵산이 직접적으로 번역될 수 있거나 (예를 들어 번역가능한 RNA), 번역가능한 mrna를 생성하도록 전사될 수 있고/거나 (예를 들어 프로모터 및 시작 코돈에 이어진 오픈 리딩 프레임을 포함하는 DNA), 도입되는 포유동물 세포의 게놈 내로 통합되어 전사될 수 있음 (예를 들어 선형 DNA, DNA 벡터, RNA 바이러스 벡터 및 DNA 바이러스 벡터)을 의미한다. 번역가능한 mrna는 생체내 전사 (일차 또는 프로세싱된 전사체로서)에 의해, 또는 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 백신에 사용되는 핵산은 RNA이며, 가장 바람직하게는 mrna이다. 병원체라는 용어는 질환의 병인에 관여하는 임의의 바이러스 또는 유기체 및 그의 약독화된 유도체를 지칭한다. 이러한 병 원체로는 박테리아, 원충, 진균 및 바이러스 병원체, 예를 들어 헬리코박터(Helicobacter), 예를 들어 헬리코박테 파일로리 (Helicobacter pylori), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 엔테로박터(Enterobacter), 캄필로박터 (Campylobacter), 다양한 미코박테리아, 예를 들어 미코박테리움 레프래(Mycobacterium leprae), 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 브루셀라 (Brucella) 종, 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 스타필로코커스(Staphylococcus), 예를 들어 에스. 아 우레우스(S. aureus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 클로스트리듐(Clostridum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), - 23 -
플라스모듐(Plasmodium), 레이쉬마니아(Leishmania), 트리파노소마(Trypanosoma), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), HCV, HPV, CMV, HTLV, 헤르페스 바이러스 (예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스 1형, 단순 헤르페스 바이러스 2형, 코 로나바이러스, 바리셀라-조스터 바이러스, 및 엡스테인-바르(Epstein-Barr) 바이러스), 유두종 바이러스, 인플루엔자 바 이러스, B형 간염 바이러스, 소아마비 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스 및 풍진 바이러스를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 방법은 바이러스 병원체, 바람직하게는 레트로바이러스 병원체, 가장 바람직하게는 HIV 및 HCV와 같은 매우 가변성인 병원체로부터의 핵산의 증폭에 특히 유용하다. 병원체의 변이체 또는 균주는 병원체의 임의의 유도체를 지칭한다. 이러한 유도체는 병원체의 돌연변이, 재조합 또는 재조 합 조작에 의해 발생할 수 있다 (또는 발생되었을 수 있다). 예를 들어 HVF의 변이체는 공지된 및 비-확인된 HIV 변이체 를 포함하며, HIV-I 군 M, N 및 O, HIV-I 분기군 A1, A2, B, C, C, F1, F2, G, H, J 및 K를 비롯한 모든 HIV 아형 또는 분 기군, 분기군의 변이체, HIV-2의 모든 변이체, 및 그의 모든 재조합체 및 유사종을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. "병원체의 다중 변이체" 또는 "병원체의 다중 균주"는 감염된 개체에 존재하는 병원체의 변이체를 포함하는 것으로 의도된 다. 병원체의 다중 변이체는 개체에 동시에 또는 별개로 도입될 수 있다. 별법으로, 다중 병원체 변이체는 돌연변이 및/또 는 재조합을 통해 개체 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에서, 병원체는 레트로바이러스, 바람직하게 는 HIV이다. 하나의 감염된 개체에 존재하는 병원체 (HIV)의 다중 변이체는 상기 개체에 존재할 수 있는 임의의 HIV를 포 함할 수 있으며, 이러한 경우, HIV의 다중 변이체는 HIV-I 군 M, N 및 O의 임의의 또는 모든 군을 비롯한 HIV-I, 및 그의 아형, 분기군 및 유사-변이체, 뿐만 아니라 HIV-2 및 그의 변이체, 및 아직 확인되지 않은 HIV의 부류를 포함한다. 항원은 1종 이상의 면역원성 에피토프를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 증폭된 핵산은 하나 이상 의 오픈 리딩 프레임, 또는 하나 이상의 오픈 리딩 프레임의 일부분을 코딩할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에서, 병원체는 HIV이고, 증폭된 핵산은 감염된 개체에 존재하는 HIV의 각각 또는 적어도 대부분의 변이체로부터의 1종 이상의 HIV 폴리펩티드의 하나 이상의 오픈 리딩 프레임 또는 그의 일부분을 코딩한다. 바람직한 HIV 폴리펩티드는 gag, rev, nef, vpr 및 env 및 그의 단편 또는 에피토프이다. 바람직한 vpr의 단편 (참조 서열로서 NC 001802를 사용함)은 뉴클레오 티드 5105 내지 5320 (vpr 아미노산 잔기 1 내지 72를 코딩함); 5138 내지 5320 (vpr 아미노산 잔기 12 내지 72를 코딩 함); 5105 내지 5165 (vpr 아미노산 잔기 1 내지 20을 코딩함) 및 5138 내지 5165 (vpr 아미노산 잔기 12 내지 20을 코 딩함); 및 다른 HIV 변이체의 상응하는 단편을 코딩한다. 추가의 바람직한 vpr 단편은 잔기 25 내지 40, 29 내지 37, 30 내 지 38, 31 내지 39, 31 내지 50, 34 내지 42, 41 내지 49, 52 내지 62, 53 내지 63, 55 내지 70, 59 내지 6 및 62 내지 70이 다. 추가의 단편 및 에피토프는 인터넷 http 사이트 상에서 이용가능한 HIV 분자 면역학 데이타베이스에서 발견할 수 있으 며, 그 내용은 참고로 도입된다. 병원체 폴리뉴클레오티드는 1종 이상의 병원체 항원 또는 에피토프를 코딩하는 핵산의 증폭을 위한 주형 또는 주형의 공 급원이다. 병원체 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 비-제한적 예로서, 병원체 폴리뉴클레오티드는 병원체 게놈과 같은 DNA, DNA 벡터 또는 단편, 또는 병원체의 숙주의 게놈 내로 통합된 병원체 DNA일 수 있다. 병원체 폴리뉴 클레오티드가 DNA일 경우, 이는 본 발명의 방법에 따른 증폭을 위한 주형으로서 직접적으로 사용될 수 있다. 병원체 폴리뉴클레오티드는 또한 스플라이싱되거나 비-스플라이싱될 수 있는 병원체 게놈 (예를 들어 레트로바이러스 게 놈) 또는 병원체 mrna의 형태인 RNA일 수 있다. 예를 들어 HIV의 경우, 핵산은 숙주 게놈의 통합된 바이러스 DNA에 상 응하거나 숙주 게놈 내로 바이러스 통합 전의 세포에 존재하는 HIV cdna에 상응하는 DNA일 수 있다. HIV RNA는 바이 러스 복제 동안 바이러스 입자 또는 숙주 세포로부터 단리된 바이러스 RNA 게놈의 형태일 수 있으며, 또한 스플라이싱되 거나 비-스플라이싱된 HIV mrna의 형태일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 병원체 RNA는 HIV 비리온으로부터 단리된 게놈 RNA이다. 병원체 폴리뉴클레오티드가 RNA인 경우, 이는 역방향으로 전사되어 cdna를 생성할 수 있고, 이는 그 후 핵산 증폭용의 주형으로서 기능할 수 있다. 바람직하게는, 병원체 폴리뉴클레오티드는 감염된 개체에 존재하는 다중 병원체 변이체로부터의 것이거나, 그로부터 유래 된다. 본 내용에서, "으로부터 유래된"은 핵산이 병원체 또는 병원체 핵산을 함유하는 세포(들)로부터 적어도 부분적으로 정제되거나, 핵산이 병원체 핵산으로부터 증폭된 것을 의미한다. 개체에 존재하는 다중 병원체 변이체로부터 핵산을 유도 함으로써, 생성된 백신은 개체에 존재하는 병원체의 모든 변이체를 잠재적으로 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 선택된 프라이머를 사용한 핵산 증폭에 의해 생성된 일차 앰플리콘은 병원체 항원 또는 그의 에피 토프를 코딩하는 DNA를 포함할 것이다. 일차 앰플리콘은 추가의 변형 없이 핵산 백신에 사용될 수 있다. 별법으로, 일차 앰플리콘은 핵산 백신, 바이러스 백신에 사용하기 위한, 또는 APC 내로 로딩하기 위한 발현 카세트 또는 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 일차 DNA 앰플리콘은 시험관내 전사용의 주형으로서 기능하도록 변형된다. - 24 -
주형 DNA 서열 (예를 들어 PCR 생성물)을 전사하기 위해, 주형은 RNA 폴리머라제 결합 부위 또는 프로모터를 함유해야 한다. 또한, 진핵 세포에서 효과적인 전사를 위해, 전사된 RNA는 바람직하게는 5' 캡, ATG 번역 개시 코돈을 포함하는 코 자크 서열 및 3' 말단에 폴리아데닐화된 서열을 함유한다. 바람직하게는, 전사된 RNA는 또한 번역 정지 코돈 (UAA, UAG 또는 UGA)을 함유한다. 프로모터, 코자크 서열, 시작 및 정지 코돈과 같은 상기 전사 및 번역 신호의 일부는 표적 병원체 핵산의 주형에 존재할 수 있으며, PCR 또는 다른 증폭 반응 동안 증폭될 수 있다. 별법으로, 상기 서열은 증폭의 임의의 단 계에 사용되는 전방향 및 역방향 프라이머에 포함될 수 있다. 의도되는 백신이 동일계내 투여를 위한, 또는 APC 내로의 로딩을 위한 mrna 백신일 경우, 5' 네스팅된 프라이머에 함유 되는 프로모터 서열은 시험관내 전사에 적합해야 한다. 시험관내 전사에 적합한 프로모터 및 시험관내 전사 방법은 당업자 에게 공지되어 있다. 비-제한적 예로서, 바람직한 프로모터는 T7 프로모터 및 SP6 프로모터와 같은 시판되는 RNA 폴리 머라제에 상응하는 것들이다. 다른 유용한 프로모터는 당업자에게 공지되어 있다. 의도되는 백신이 표적 세포 내에서 전사 용으로 의도되는 핵산을 함유할 경우, 5' 프라이머 서열에 함유되는 프로모터는 의도되는 표적 세포에서 활성인 것이어야 한다. 또한, 백신이 표적 세포 내에서 전사용으로 의도되는 핵산을 함유할 경우, 프로모터 및 번역 개시 신호는 전방향 프 라이머 내로 혼입된 주형으로부터, 또는 발현 카세트 내로 앰플리콘을 삽입함으로써 증폭될 수 있다. 바람직하게는, 프로 모터는 시판되는 시험관내 전사 키트를 사용한 효과적인 전사를 허용한다. 시험관내 전사 및 번역 방법은 당업자에게 공지 되어 있다 (예를 들어 U.S. 2003/0194759 참조). 전형적인 시험관내 전사 반응에서, DNA 주형은 모든 4개의 리보뉴클레 오시드 트리포스페이트 및 m 7 G(5')ppρ(5')G와 같은 캡 디뉴클레오티드 또는 ARCA와 같은 캡 유사체의 존재하에서 박테 리오파지 RNA 폴리머라제를 사용하여 전사된다. 프로모터 및 번역 개시 신호는 일차 증폭 동안 사용되는 프라이머에, 또는 후속 라운드에 사용되는 네스팅된 프라이머에 포함될 수 있다. 증폭의 임의적인 이차 라운드에 사용되는 프라이머용의 어닐링 표적인 일차 증폭 반응에 사용되는 것과 동일할 수 있거나, 이는 일차 앰플리콘에 대해 부위 내부 ("네스팅")일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 증폭의 일차 또는 이차 (바람직하게는 이차) 라운드에 사용되는 전방향 프라이머는 프로모터 (예를 들어, T7 프로모터)를 코딩하는 5' 비혼 성화 영역 ("오버행"), 및 일차 앰플리콘의 안티센스 가닥에 상보적인 3' 영역을 포함할 것이다. 전형적으로, 전방향 프라이 머는 또한 코자크 서열, 바람직하게는 최적화된 코자크 서열, 예를 들어 염기 5' CCACCATGG (서열 59)를 함유할 것이 며, 밑줄친 ATG는 번역 개시 코돈이다. ATG 시작 코돈을 포함하는 코자크 서열은 이러한 서열이 일차 앰플리콘에 존재하 는가에 따라 전방향 프라이머의 5' 오버행 영역내, 또는 프라이머의 3' 어닐링 영역내일 수 있다. 또한, 일차 앰플리콘이 최 적 코자크 서열보다 적을 경우, 이는 완전히 상보적인 코자크 서열은 아니지만 최적성을 갖는 전방향 프라이머를 사용함으 로써 최적화될 수 있다. 바람직하게는, 전방향 프라이머의 3' 위치는 개시자 ATG 코돈 또는 일차 증폭 동안 증폭된 대부분 의 5' 코딩 서열의 바로 하류 서열에 대해 본질적으로 상보적일 것이다. 역방향 프라이머는 바람직하게는 시험관내 전사 동 안 폴리아데닐화를 위한 주형으로서 기능할 그의 5' 말단에 5' 폴리T 오버행을 함유한다. 역방향 프라이머의 3' 반은 일차 증폭 반응에서 단리된 센스 서열에 대해 상보적일 것이다. 적절한 번역 정지 코돈이 일차 앰플리콘에 존재하지 않을 경우, 이는 역방향 프라이머의 5' 오버행 부분에 포함될 수 있다. 그 후, 상기 기재된 것과 같은 프라이머를 사용한 증폭에 의해 수득된 이차 앰플리콘은 m 7 G 캡 또는 ARCA와 같은 그의 유사체의 존재하에서 시험관내 전사 반응에서 주형으로서 기능 할 수 있다 (U.S. 2003/0194759 참조). 따라서, 또다른 실시양태에서, 본 발명은 a. 포유동물에 존재하는 변이체의 다중 변이체의 핵산을 병원체의 다중 변이체를 증폭할 수 있는 다수의 프라이머 쌍을 사 용하여 증폭하여 증폭된 병원체 DNA를 생성하고; b. 임의로 상기 증폭된 병원체 DNA를 전사하여 병원체 RNA를 생성하고; c. 상기 병원체 DNA 또는 병원체 RNA를 상기 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 병원체 감염된 포유동물의 치료 방 법을 제공한다. 핵산 백신을 대상체에 제제화하고 전달하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Scheel et al. Eur J Immunol (2204) 34:537-547]; [Hoerr et al. (2000) Eur J Immunol 30:1-7]; [Liu et al (2002) Vaccine 20:42-48]; [Riedl et al. (2002) J Immunol 168:4951]; [Riedel et al. (2004) J Mol Med 82:144]; 미국 특허 제5,783.567호; 미국 특허 제6,603,998호; EP0880360; EP1083232 (이들의 내용은 참고로 도입됨)를 참조한다. 투여 경로는 국소 전달, 피부 의 전기천공, 뿐만 아니라 피부, 피하, 진피내, 점막 및 점막내 투여 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. - 25 -
일차 또는 이차 앰플리콘, 또는 핵산 백신으로서 시험관내 전사된 RNA를 사용하는데 대한 별법으로서, 이러한 핵산을 항 원 제시 세포 내로 시험관내에서 로딩할 수 있다. 그 후, 로딩된 항원 제시 세포는 백신으로서 사용하기에 적합하다. 따라서, 또다른 실시양태에서, 본 발명은 포유동물에 존재하는 병원체의 다중 변이체로부터의 1종 이상의 항원을 코딩하 는 다수의 핵산으로 형질감염된 항원 제시 세포를 포함하며, 상기 핵산은 병원체의 상기 변이체 사이의 변이성을 상쇄할 수 있는 다수의 프라이머 쌍을 사용한 병원체 폴리뉴클레오티드의 핵산 증폭으로부터 유래되고, 상기 항원 제시 세포 및 상기 병원체 핵산은 상기 포유동물로부터의 것이거나 그로부터 유래된 것인 조성물을 제공한다. 항원 제시 세포 (APC)로는 대식세포, B-세포 및 수지상 세포, 예를 들어 미성숙 수지상 세포, 성숙한 수지상 세포 및 랑게 르한스 세포를 들 수 있다. 전문적인 항원-제시 세포, 특히 수지상 세포 (DC)는 CD4 + 및 CD8 + T-세포 둘다에 대한 효과 를 통해 세포-매개된 면역성의 자극을 위한 강력한 비히클을 제공한다 (문헌 [Banchereau 1998, Banchereau 2000]). 그의 기능에 고유하게, 이들은 MHC 부류 I 및 II 생성물 둘다를 CD4 + 및 CD8 + T 세포에 제시하기 위한 항원을 효과적으 로 프로세싱한다. 표면 항원 풍부화 기술을 통해 말초 혈액 또는 골수로부터 단리되거나 PBMC의 배양물로부터 수거된 수 지상 세포는 특정 후보 항원으로 로딩될 수 있으며, 그 후 관련 항원(들)을 원시 또는 휴지 T-세포에 제시할 수 있다. 바람 직하게는, 항원 제시 세포는 백신화될 개체에 자가성이며, 병원체 핵산은 또한 환자로부터 단리되거나 유래된다. 항원 제시 세포는 포유동물 대상체에 의해 및 그로 만들어지거나, 포유동물 대상체로부터 단리된 세포로부터 유래되며, 바 람직한 실시양태에서, 항원 제시 세포는 수지상 세포이다. "수지상 세포 (DC)"라는 용어는 다양한 림프양 및 비-림프양 조 직에서 발견되거나 (문헌 [Steinman (1991) Ann. Rev. Immunol. 9:271-296]), 시험관내에서 수지상 세포 전구체로부터 유래된 형태학적으로 유사한 세포 유형의 다양한 집단을 지칭한다. 수지상 세포는 가장 강력한 APC이며, T 세포 활성화 및 증식에 필요한 신호를 제공한다. 수지상 세포는 골수 전구 세포로부터 유래되고, 말초 혈액에서 적은 수로 순환하며, 미 성숙 랑게르한스 세포 또는 마지막으로 분화된 성숙한 세포로서 나타난다. 바람직한 실시양태에서, 수지상 세포는 단핵구 로부터 분화된다. 항원 제시 세포 (APC)의 단리 방법 및 수지상 세포 전구체 및 성숙한 수지상 세포의 제조 방법은 당업자 에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Berger et al. J Immunol Methods 2002 268:131-40], 미국 특허 출원 제 20030199673호, 제20020164346호 및 제60/522,512호, 및 WO 93/20185 (이들의 내용은 참고로 도입됨)를 참조한다. 바람직한 실시양태에서, 수지상 세포는 문헌 [Romani et al. (J Exp Med 1994 180:83-93)] 또는 [Sallusto et al. (J Exp Med 1994 179:1109-1118)] (이들의 내용은 참고로 도입됨)에 기재된 방법에 의해 CD 14+ 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)로부터 제조된다. 별법으로, 수지상 세포는 문헌 [Caux et al. (J Exp Med 1996 184:695-706)]의 방법에 의해 CD34+ 세포로부터 제조될 수 있다. 항원 제시 세포의 로딩 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 전기천공, 수동 하적, 리포펙션(lipofection), 양이온성 시약, 바이러스 형질도입, CaPO4 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어 PCT/US05/22705 및 미국 특허 출원 제60/583,579호; 미국 특허 공개 제2003/0143743호; 미국 특허 공개 제20050008622호; 미국 특허 공개 제 20040235175호; 및 미국 특허 공개 제20040214333호 (이들의 내용은 참고로 도입됨)를 참조한다. 바람직한 실시양태에 서, 항원 제시 세포는 병원체 폴리펩티드의 다중 균주를 코딩하는 CD40L mrna 및 RNA 둘다로 로딩된다. 항원 제시 세 포의 형질감염에 유용한 인간 CD40L cdna, CD40L 단백질 및 바람직한 CD40L mrna는 각각 서열 407 및 408로 나타 낸다. 바람직한 실시양태에서, mrna는 서열 410의 뉴클레오티드 38 내지 877에 상응한다. 바람직하게는, mrna는 5' 캡 핑되며 폴리아데닐화된다. 바람직한 실시양태에서, 캡은 ARCA이다. 바람직한 폴리A 꼬리 길이는 50 내지 1000 뉴클레오 티드, 보다 바람직하게는 64 내지 900 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 101 내지 600 뉴클레오티드 범위이다. 추가의 실 시양태에서, 항원 제시 세포는 병원체의 다중 균주로부터의 병원체 폴리펩티드를 코딩하는 RNA의 시험관내 번역에 의해 제조된 폴리펩티드로 로딩된다. 병원체 폴리펩티드는 CD40L mrna를 갖는 항원 제시 세포 내로 로딩될 수 있다. 수지상 세포는 성숙 또는 미성숙할 경우 시험관내에서 로딩될 수 있다. 로딩된 미성숙 수지상 세포는 백신화 전에 시험관내에서 성숙되거나 백신화 후 생체내에서 (외인성 성숙 자극이 있거나 없이) 성숙될 수 있다. 별법으로, 핵산은 동일계내에서 항원 제시 세포에 전달될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Liu et al. (Vaccine 2002 20:42-48)], [Lisziewics et al. (Vaccine 2003 21:620-623)] 및 [O'Hagen (Curr Drug Targets Infect Disord 2001 1:273-286)] (이들의 내용은 참고로 도입됨)을 참 조한다. 바람직하게는, 상기 조성물에서 항원 제시 세포는 수지상 세포이다. 그 후, 로딩된 수지상 세포는 환자에서 병원체 감염을 치료하는 백신으로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 병원체 및 항원 제시 세포 (예를 들어, 수지상 세포)는 치료될 환자에 대해 자가성이다. - 26 -
또다른 실시양태에서, 본 발명은 병원체-감염된 포유동물로부터 수득되거나 그로부터 유래된 항원 제시 세포를 상기 포유 동물에 존재하는 병원체의 다중 변이체로부터의 1종 이상의 항원을 코딩하는 핵산으로 형질감염시키는 것을 포함하며, 상 기 핵산은 병원체의 상기 변이체 사이의 변이성을 상쇄하도록 설계된 다수의 프라이머를 사용한 병원체 폴리뉴클레오티드 의 핵산 증폭에 의해 유래된 것인, 자가 백신의 제조 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 기재된 로딩된 항원 제시 세포를 포함하는 백신을 제공한다. 이러한 백신에서, 로딩된 항원 제시 세포 는 환자에 치료적 투여에 적합한 완충제 내에 있을 것이다. 백신은 또한 항원 제시 세포 또는 T 세포의 자극을 위한 인자용 의 보조제를 포함한다. 제약 조성물의 제제화 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science]의 최신판을 참조한다. 수지상 세포 백신에 대한 최적 면역화 간격은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 환자는 투여당 1x10 6 내지 1x10 7 의 살아있는 RNA-로딩된 DC로 5시간 백신화될 것이다. 백신화를 위해 선택된 투여량 수준은 안전하 고 잘 내성일 것으로 예상된다. 단리, 제조, 형질감염, 제제화 및 항원 제시 세포의 환자에의 투여 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Fay et al. Blood 2000 96:3487]; [Fong et al. J Immunol 2001b 166:4254-4259]; [Ribas et al. Proc Am Soc Clin One 2001 20:1069]; [Schuler-Thurner et al. J Exp Med. 2002 195:1279-88]; [Erratum in: J Exp Med. 2003197:395]; 및 [Stift et al. J Clin Oncol 2003 21: 135-142] (이들의 내용은 참고로 도입됨)을 참조한다. 임상적으로 사용되는 APC 투여 경로는 정맥내 (IV), 피하 (SC), 진피내 (ID), 및 림프내를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 객관적인 임상적 반응은 다른 APC 백신의 IV, SC 및 ID 투여 후에 보고되었다. 현재, ID 투여에 대한 증대되는 선 호도가 있는데, 이는 진피가 유출 림프절로 이동하는 것으로 공지된 수지상 세포를 위한 정상적인 거주지이기 때문이다. 뮤린 모델에서, SC-주사된 수지상 세포는 유출 림프절의 T-세포 영역에서 후기에 발견되며, FV 면역화 후의 것보다 우수 한 보호 항종양 면역성을 촉발한다. 림프절 내로의 직접적인 수지상 세포 주사가 보호 항종양 면역성 또는 세포독성 T-림 프구 (CTL)을 생성하는데 있어서 다른 전달 경로보다 우수하다는 뮤린 증거가 있다 (문헌 [Lambert et al. Cancer Res 2001 61:641-646] (그 내용은 참고로 도입됨) 참조). 이는 전체 수지상 세포가 단일 유출 림프절 또는 바신에 충격을 주 도록 전달되어야 함을 암시한다 (가능한 많은 절이 관여하는 다중 부위 사이의 투여량을 나누기보다는). 백신의 면역원성을 평가하기 위해, 백신화된 개체에서 면역 반응은 하기 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 성숙 프로파일에 의해 모니터링될 수 있다. 예를 들어, HIV-특이적 효과기 세포 기능의 회복은 효과기 T-세포의 표현형을 발현하는 세포, CD45 RA + CCR7 " 의 존재, 및 IFN-γ 및 그란짐 B의 상승하는 수준의 분비에 의해 결정될 수 있다. HIV-특이적 증식 반응의 회 복은 IL-2를 생성하고 CFSE를 낮추고, 이후 HFV-RNA 회복 HIV-특이적 기억 T 세포 구획으로 형질감염된 수지상 세포 로 자극함으로써 결정될 수 있다. 백신에 의해 유도된 특이적 T 세포의 성숙은 유동 세포 분석법을 이용하여 표면 및 세포내 마커를 사용하여 측정될 수 있 다. CD8+ T 세포는 αβtcr, CD45RA, CCR7 및 CD 107을 비롯한 표면 마커, 또는 그란짐 B 또는 γ-ifn과 같은 세포내 분자에 대한 염색에 의해 모니터링될 것이다. CD3, CD4.CCR7 및 IL-2를 사용하여 CD4+ T 세포를 모니터링할 수 있다. 이러한 분석법을 이용하여 환자로부터의 자가 HIV 서열을 포함하는 펩티드로 인큐베이션한 후 면역 반응을 모니터링할 수 있다. 각각의 새로운 백신화 전의 기준선에서 및 매달의 세포 면역 반응의 비교는 세포 면역 반응의 넓이에 대한 백신의 효과의 측정을 가능하게 한다. 면역 반응의 넓이는 또한 CFSE 증식 분석법을 이용하여 측정될 수 있다. HIV 항원에 의해 코딩되는 수백의 CTL 에피토프가 기재된 반면, 자가 HIV 백신에 대한 상기 인자의 고려사항은 본 출원 인이 백신에 대한 일차 표적으로서 gag (p55), rev, nef 및 vpr을 선택하게 하였다. 그러나, 다른 HIV 항원은 또한 본 발명 의 방법을 이용하여 표적화될 수 있다. 상기 기재된 방법은 HFV 감염된 개체로부터의 HFV의 다중 균주를 증폭할 수 있는 프라이머를 선택하는데 사용되었다. 특히, 본 출원인은 다중 HFV 균주로부터의 gag, nef, rev 및 vpr 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 발견하였다. 프라이머 서열, 프라이머 수 및 명칭, Tm 및 길이는 도 1에 나타낸다. 참조 HIV 게놈 (수탁 번호 NCOO1 802)에 대한 상기 프라이머의 위치는 도 2에 나타낸다. 따라서, 일 측면에서, 본 발명은 서열 1 내지 20, 206 및 207, 및 서열 1 내지 20, 206 및 207과 75% 이상의 서열 동일성 을 갖는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드로 본질적으로 이루어진 HIV gag 전방향 프라이머를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 서열 동일성은 80%, 85%, 90% 이상, 또는 95% 이상이다. - 27 -