J Plant Biotechnol (2010) 37:343 356 DOI:10.5010/JPB.2010.37.4.343 Review 국내 임목류 기내증식 연구현황 및 전망 문흥규 김용욱 박소영 한무석 이재선 A review of forest trees micropropagation and its current status in Korea Heung Kyu Moon Yong Wook Kim So Young Park Mu Seok Han Jae Seon Yi Received: 6 November 2010 / Accepted: 18 November 2010 c Korean Society for Plant Biotechnology Abstract Plant micropropagation techniques include bud cultures using apical or axillary buds, organogenesis through callus culture or adventitious bud induction, and somatic embryogenesis. In Korea Forest Research Institute (KFRI), the first tissue culture trial in woody plant was initiated from the bud culture of hybrid poplars (Populus alba x P. glandulosa) in 1978. Since then several mass propagation techniques have developed from conifer and hardwood species, resulting in allowing practical application to Poplars, Birches and some oak species. In addition, useful micropropagation and genetic resources conservation techniques were established in some rare and endangered tree species including Abeliophyllum distichum. Among various in vitro propagation techniques, somatic embryogenesis is known to be the most efficient plant regeneration system. Since the first somatic embryo induction was reported in Tilia amurensis by KFRI in 1986, various protocols for direct or indirect somatic embryogenesis systems have developed in conifer and hardwood species including Larix leptolepis, Pinus rigida x P. taeda F1, Kalopanax septemlobus and Liliodendron tulipifera, etc. However, most of these technologies have been developed using juvenile tissues, i.e. immature zygotic embryos or mature embryos. Therefore it has been difficult to directly application to tree breeding program due to their unproven genetic background. Recently H. K. Moon ( ) Y. W. Kim S. Y. Park M. S. Han 국립산림과학원 산림생명공학과 (Division of Forest Biotechnology, Korea Forest Research Institute, Suwon, Gyeonggido 441-847, Republic of Korea) e-mail: hkmoon@forest.go.kr J. S. Yi 강원대학교 산림환경과학대학 (College of Forest and Environment Sciences, Kangwon National University, Chuncheon, Kangwondo 200-701, Republic of Korea) remarkable progresses and new approaches have been achieved in mature tree somatic embryogenesis. In this article we reviewed several micropropagation techniques, which have been mainly developed by KFRI and recent international progresses. 서 론 산림수종은 생물다양성의 중요한 구성 요소이자 고대부 터 인간 삶의 필수요소가 되어왔다. 또한 나무는 음식, 연료, 목재 및 기타 가치 있는 비목재산물의 재생 가능한 원천이기도 하다. 최근 이러한 산림자원이 기후변화로 인 해 급속히 파괴되고 있다. 이에 반해 우리의 삶에 필요한 목재의 수요는 계속 증가되고 있다. 산림면적의 감소는 생물 다양성 보존의 위협이 되며 이러한 감소는 결국 인 간 삶의 질을 떨어뜨리게 된다. 산림자원은 목재급원이라 는 기능뿐만 아니라 환경 보존 측면에서도 보존해야 할 가치가 크다. 건강한 산림을 유지하고 필요한 산물을 얻 기 위하여 전통적인 방법의 육종, 개량 및 여러 가지 번식 기술이 개발되어 왔다. 그러나 산림수종이 가지고 있는 고유한 특성, 즉 느린 생장, 장수성, 자가불화합성, 고도로 이형접합화 된 식물이라는 점 때문에 개량이 어렵다. 이로 인해 전통적인 육종 방법으로는 나무의 효과적인 유전적 개량에 한계가 있다 (Girl et al. 2004; Merkle and Dean 2000). 이러한 단점을 극복하기 위해 클론 혹은 영양번식 기 술이 사용되고 있다. 이러한 무성번식 기술은 우성의 상 가적 그리고 epistatic 유전적 효과를 지닌 우수한 유전자 형을 선발할 수 있다는 장점이 있다 (Park 2002). 식물조 직배양 및 형질전환 기술은 제한된 시간 내에 산림수종 의 효과적인 증식과 개량을 가능하게 한다. 지난 10여 년
344 J Plant Biotechnol (2010) 37:343 356 간 미세증식 기술과 더불어 산림생명공학 기술의 비약적 인 발전이 지속되어 왔고 이러한 기술적 발전은 전통적 인 육종의 한계를 벗어나 임목육종의 새로운 패러다임으 로 자리 잡고 있다 (Park et al. 1998; Merkle and Dean 2000; Sutton 2002; Girl et al. 2004; Merkle and Nairn 2005; Nehra et al. 2005; Pijut et al. 2007; Harfouche et al. 2010). 국내 임목류 미세증식 (micropropagation) 연구는 1978년 경북대학교의 박용구교수 (2010 정년퇴임)가 일본에서 유학을 마치고 귀국하여 국립산림과학원 (당시 임목육종 연구소)에서 실험을 시작한 것이 효시이며, 1980년부터 경상과제의 시험제목으로 정상적인 연구가 시작되었다. 임목의 미세증식 기술개발은 대부분 국립산림과학원에 서 이루어졌고, 경북대학교, 강원대학교, 충북대학교 및 동국대학교에서 부분적으로 이루어졌다. 국립산림과학 원에서는 김재헌 연구관이 실험실의 체계를 만드는데 산 파 역할을 하였고, 초기 시험연구의 대상수종으로는 분 열능력이 높은 포플러류의 아배양 (Bud culture)에 의한 대량증식에 연구의 중점을 두었다 (Kim et al. 1981; Kim et al. 1982b; Noh et al. 1988). 침엽수는 리기테다소나무의 배배양을 중심으로 시작되었고 (Kim et al. 1982a) 이후 호 도나무 등 경제적으로 유망한 유실수와 희귀수종의 대량 증식 기술개발이 주로 이루어 졌으며 특히 체세포배발생 (somatic embryogenesis) 기술개발 이후 산림생명공학 분야 의 연구영역이 급진적으로 확대되었다 (Lee et al. 1986b; Lee et al. 1987a, b; Lee et al. 1988; Lee et al. 1989; Kwon et al. 1990; Youn et al. 1992a; Moon et al. 1994; Lee et al. 1995; Park et al. 1998; Kim and Moon 2005; Kim et al. 2006; Kim and Moon 2007a, b). 본문에서는 그 동안 국내에서 발표된 산림수종의 미세 증식 기술을 국립산림과학원에서 수행된 내용을 중심으 로 고찰하고, 이와 관련된 문제점 및 이를 해결하기 위한 방법, 특히 상변화 (phase change) 등과 같은 몇 가지 방법 을 소개하였다. 또한 산림수종의 기내 미세증식 기술과 산림생명공학 분야 연구발전에 관한 최근 자료의 고찰 을 통해 이 분야 연구에 관한 필요한 정보를 제공하고자 한다. 기관형성 (Organogenesis) 임목류 조직배양 연구의 가장 보편적인 방법은 아배양이 나 액아배양을 통한 우수 클론의 대량증식이며 이 분야 연구성과가 가장 실용화에 접근되어 있다. 외국에서는 사 시나무류, 유칼리나무류 및 자작나무류 등 몇 수종에 대 하여 이미 실용화가 이루어 졌으며, 1990년 이후에는 우 수한 클론의 증식, 즉 영양계 임업 (clonal forestry) 실현을 위한 조직배양 기술의 중요성이 인식되어 이 분야 연구 가 크게 활성화되었다 (Park et al. 1998; Park 2002). 국립 산림과학원에서는 소나무 등의 침엽수종을 대상으로는 배배양과 엽속배양의 기술개발에 역점을 두어 실험이 진 행되었으나 증식효율이 매우 낮고 더욱이 기내생장이 느 려서 실용화에는 어려움이 있는 것으로 지적되었다 (Kim et al. 1982b; Kim and Park 1987). 그러나 이러한 침엽수 조 직배양 연구는 1990년 대 이후 미국, 캐나다 및 뉴질랜드 등 산림선진국에서 체세포배 발생을 이용한 묘목생산 기 술이 임목개량의 육종 프로그램에 응용되면서부터 실용 화에 접근할 수 있었다 (Sutton 2002). 활엽수의 조직배양은 1980년 연구의 초기부터 시작된 포플러류의 기초적인 연구를 토대로 여러 수종에서 배양 조건의 적정화를 통한 대량증식 기술이 개발되었다 (Kim et al. 1981, 1982b; Kang and Moon 2001). 상수리나무 등 참 나무류의 액아배양, 특히 재유령화 기술을 도입한 수형 목의 기내증식 기술이 개발되어 무성번식에 어려움이 있 는 참나무류의 조직배양에 의한 대량번식의 가능성이 제 시되었으며 (Lee et al. 1985; Moon et al. 1987; Hyun et al. 1991; Moon et al. 1991b; Moon et al. 1993a, b; Moon et al. 1997a), 박달나무, 거제수나무 등 자작나무류의 유묘는 물론 성숙목의 배양기술이 개발되어 수형목의 대량증식 의 기반을 조성하였다 (Hong et al. 1986; Lee et al. 1986a; Lee et al. 1990; Moon et al. 1991a; Kwon et al. 1992; Kwon et al. 1994; Moon and Moon 1999). 이러한 활엽수의 조직 배양에는 1980년 Lloyd와 McCown (1980)이 개발한 WPM (Woody Plant Medium) 배지를 주로 쓰고 있다. 이밖에도 피나무 (Youn et al. 1988; Youn et al. 1989; Youn and Ohba 1990), 들메나무 (Youn et al. 1992b) 등에서 기내배양 기술 이 개발되어 기내 대량증식의 기반을 조성하였고, 희귀 및 멸종위기 수종의 보존 및 증식기술로도 유용하게 쓰 일 수 있었다 (Lee et al. 1995). 산림생명공학과에서는 흰 배롱나무 (Lee et al. 1987a), 산개나리 (Moon et al. 1997b), 히어리나무 (Moon et al. 2002a; Kang et al. 2003), 미선나무 (Moon et al. 1999), 망개나무 (Youn et al. 1992a) 등의 수종 에서 아배양을 통한 효율적인 묘목생산 기술을 개발하였 으며, 특히 망개나무는 29~50년생의 맹아지를 이용한 배 양으로 재유령화 기내 증식이 가능함을 보여주었다. 한편 호도나무와 같은 유실수종은 묘목의 가격이 비싸 고 기존의 접 삽목의 방법으로는 효율적인 묘목생산이 어려워 그에 대한 대안으로 조직배양이 시작되었다. 유 사한 이유로 밤나무, 호두나무 (Lee et al. 1988; Kwon et al. 1990), 대추나무 (Lee et al. 1986c; Moon et al. 1994), 왕 머루 (Lee et al. 1989) 등의 유실수와 민초피나무 (Son et al. 1995), 산사나무 (Moon et al. 1990), 마가목 (Moon 1993) 등의 특용수 조직배양 기술이 개발될 수 있었다. 호도나 무의 조직배양은 Driver와 Kuniyuki (1984)에 의해 개발된 DKW라는 배지가 주로 쓰이고 기타 수종은 일반적으로 WPM 혹은 MS (Murashige and Skoog 1962) 배지를 사용하
J Plant Biotechnol (2010) 37:343 356 345 였다. 그러나 이러한 많은 연구에도 불구하고 중요한 유 실수에 대한 조직배양은 초피나무 등 한 두 종 이외에는 실용화하는데 여전히 어려움이 있는 것으로 나타났다. 1990년대 이후의 조직배양은 선발목을 대상으로 한 재 유령화 (rejuvenation), 희귀 및 멸종위기 수종의 번식 및 체 세포배 유도에 의한 대량증식에 중점을 두고 진행되었다 (Kwon et al. 1992, 1994; Moon et al. 1997b; Moon et al. 1999; Moon et al. 2006). 재유령화는 유묘로의 반복 접목 및 강 도 높은 전정과 벌목을 통한 맹아지 유도를 통해 실시되 었고, 희귀수종에는 주로 아배양 기술이 사용되었다. 아배양 (Bud culture) 목본류의 조직배양에서 가장 보편적으로 사용하는 조직 은 눈 (bud), 특히 액아나 신초지의 정아를 사용한다. 최 근의 기내배양 연구는 주로 체세포배형성을 통한 방법이 보편화되고 있으나, 기존의 증식법이 효율적이지 못한 수 종이나, 선발목의 증식에 있어 반복접목 등의 방법으로 재유령화 된 조직의 배양에 아배양을 주로 이용한다. 브 라질이나 인도네시아와 같은 열대림 조성에 있어서는 선 발개체의 영양번식에 의한 클론임업이 상업적인 목적으 로 실행되고 있다. 특히 유칼리속 수종에는 아배양 증식 기술이 보편적으로 적용되고 있다. 국립산림과학원에서 Table 1 Micropropagation via various organ or tissue culture at KFRI Year Species Explant * Result Reference 1981 Hybrid poplar ABS Plantlet production Kim et al. 1982a Hybrid pine ZE Plantlet production Kim et al. 1982b Poplar ABS Plantlet production Kim et al. 1985 Paulownia tomentosa ABS Plantlet formation Lee Quercus acutissima ABS Shoot formation/rooting Lee et al. 1986 Betula costata ABA Plantlet formation Hong et al 1986b Juglans sinensis ABS Shoot formation/rooting Lee et al. 1986c Zizyphus jujuba var. inermis ABS Shoot formation/rooting Lee et al. 1987b Actinidia arguta ABA Shoot formation Lee et al. 1987 Quercus acutissima ABS Shoot proliferation/rooting Moon et al. 1988 Populus davidiana ABA Shoot formation/rooting Noh et al. Tilia cordata ABA Shoot formation/rooting Youn et al. 1989 Tilia cordata ABS Shoot formation/rooting Youn et al. Vitis amurensis ABA Shoot proliferation/rooting Lee et al. 1990 Tilia cordata ABA Plant production/clonal effect Youn and Ohba 1990 Juglans sinensis ABS Rooting Kwon et al. Betula davurica ABA Artificial seed Lee et al. Crataegus pinnatifida ABA Shoot proliferation/rooting Moon et al. 1991 Quercus acutissima ABA Plantlet formation Hyun et al. 1991b ABS Shoot proliferation Moon et al. 1991a Betula platyphylla ABA Shoot proliferation Moon et al. 1992 Machilus thunbergii St Plantlet formation Kim and Kang Betula schmidtii ABA Plant production Kwon et al. 1993 Sorbus commixta ABA Shoot proliferation Moon 1993a,b Quercus acutissima St Shoot proliferation Moon et al. 1994 Betula costata ABA Plant production Kwon et al. 1995 Zanthoxylum pipertum ABA Shoot proliferation/acclimation Son et al. 1997 1997a Quercus acutissima ZE ABA/ABS Proliferation/rooting Kim et al. Moon et al. 2001 Populus euphratica IP Kang and Moon 1999 Betula davurica ABA Moon and Moon 2002b Kalopanx pictus ABS Moon et al. 2003 Eucalyptus pellita Shoot proliferation/acclimation Moon et al. Corylopsis gotoana var. coreana ABS Moon et al. 2004 Stewartia koreana ZE Adventitious shoots formation Son et al. 2006 Eucalyptus pellita St LED effect on growth Kim and Moon 2008b Salix pseudolasiogyne Nd Plant production Park et al. 2010 Castanea crenata ZE/ABS Growth enhancement Park et al. * ABS-axillary bud of seedling, ABA-axillary bud of adult tree, St-shoot, Nd-node, IP-In vitro plantlets, ZE-zygotic embryo
346 J Plant Biotechnol (2010) 37:343 356 그간 수행한 아배양의 주요결과는 Table 1과 같다. 참나무류 수형목 4수종 37가계의 기내배양을 실시하 였다 (Moon et al. 1993b). 유묘임에도 불구하고 수종간 및 가계간에 뚜렷한 증식차이를 보여주었고, 배양과정에서 정단괴저가 흔히 나타났다. 상수리나무는 유묘에 반복 접목된 줄기의 사용 혹은 통나무의 맹아지를 사용하여 기내증식 가능성을 보였으나 배양이 잘되는 클론 선발이 무엇보다 중요한 것으로 나타났다. 자작나무류는 성숙목의 번식도 가능하여, 물박달나무 성숙목의 대량증식 (Kwon et al. 1992)과 참다래 x 다래 교 잡종의 대량증식 기술을 확립하였고 (Lee et al. 1987b; Kim and Moon 2005), 내염성 수종인 유프라티카 포플러 의 아배양 및 부정아 유도를 통한 증식 (Cheong et al. 1997; Cheong and Moon 1999), 그리고 오동나무의 부정아 유도를 통한 증식기술을 확립하였다 (Bergmann and Moon 1997). 한편 희귀 및 멸종위기 수종의 기내배양을 통해 산개나리 (Moon et al. 1997b), 금선개나리, 떡버들 (Lee et al. 1995), 미선나무 (Moon et al. 1999) 등에서 묘목생산을 통한 자생지 복원이 가능함을 보여주었다 (Table 2). 상수리나무 (Quercus acutissima) 유묘 및 수형목을 대상으로 액아배양을 통한 기내증식을 시험하였다. 5가지 배지 가운데 WPM 배지에서 줄기 분 화 및 생장이 가장 양호하였다. 싸이토키닌 중에서는 3.0 mg/l zeatin에서 줄기 분화 및 생장 효과가 있었으나 대체 로 BA 처리가 다경유도 및 생장에 주효하였다. BA와 zeatin 혼용처리가 증식 및 생장에 더욱 시너지 효과를 보였 으며, 적정농도는 0.5 mg/l BA, 0.05-1.0 mg/l zeatin이었다. 기내발근은 1/2 GD 배지 (Greshoff and Doy 1972))에 0.5 mg/l IBA 처리로 90% 이상 발근되고, 인공상토에서 70% 이상 생존하였다. 어린대목에 2회 접목된 27개 수형목 클론을 배양한 결과 4개 클론에서 증식 가능성을 보여 클론에 따른 차이를 크게 나타냈다. 가장 좋은 반응을 보인 전북 17호 클론은 증식 후 90% 이상 기내 발근되어 재유령화 되었음을 보여 주었다. 이상의 결과는 상수리나무 수형 목의 기내증식을 위해서 보다 많은 클론을 대상으로 재 유령화 처리가 필요하고 증식이 가능한 클론을 선발해야 될 필요성을 보여주었다 (Moon et al. 1997a). 물박달나무 (Betula davurica Pall.) 50년생 물박달나무 성숙목을 재료로 수관하부에서 당년 생 가지를 채취하여 액아배양을 실시하였다. 증식은 DKW 배지에서 양호하였고, 줄기의 증식에는 액아배양이, 생 장에는 정아배양이 양호하게 나타났다. 발근은 IBA보다 NAA가 효과적이었으며, 1/2 DKW 배지에 1.0 mg/l NAA 처리로 80% 발근되었다. 기내증식 된 줄기는 기외삽목의 방법으로도 효과적으로 발근되어 물박달나무 성숙목의 기내증식이 가능함을 보여주었다 (Moon and Moon 1999). 음나무 (Kalopanax septemlobus) 2년생 음나무의 액아배양을 통해 배지 및 싸이토키닌 처 리별 효과를 시험하였다. 잎의 생장은 MS 배지에서, 엽 병의 생장은 WPM 배지에서 양호하였고 kinetin 처리로 다경유도가 가능하였으나 절편 당 2-3개의 줄기가 유도 되어 증식효율은 저조하였다. 증식된 줄기는 기외삽목의 방법으로 60%까지 발근되었다 (Moon et al. 2002b). 유칼리나무 (Eucalyptus pellita) 유칼리의 실생묘 액아 배양은 DKW, 1/2 MS 및 WPM 배지 의 사용으로 줄기증식이 가능한 것으로 나타났다. 그중 Table 2 Micropropagation for rare and endangered woody species at KFRI Year Species Explant * Result Reference 1987a Lagerstroemia indica AB Shoot proliferation/rooting Lee et al. 1992a Berchemia berchemiaefolia AB Shoot proliferation/rooting Youn et al. 1995 Forsythia koreana AB Shoot proliferation Lee et al. Salix hallaisanesis 1996 Melia azedarach var. japonica ImZE Somatic embryogenesis Moon and Kim 1997b Forsythia saxatilis AB Shoot proliferation/plantlet production Moon et al. 1999 Abeliophyllum distichum AB Shoot proliferation/acclimatization Moon et al. 2002a Corylopsis gotoana var. coreana AB Shoot proliferation/acclimatization Moon et al. 2003 Albizia kalkora IR Adventive shoot induction Park et al. 2004 Stewartia koreana ImZE Adventive shoot induction Son et al. 2006 Oplopanax elatus ImZE Somatic embryogenesis/plantlet production Moon et al. 2008 Echinosphora koreensis AB Plantlet production Moon et al. 2010 Empetrum nigrum IP Shoot proliferation Han et al. * AB-axillary bud, IP-in vitro plantlet, IR-in vitro root, ImZE-immature zygotic embryo
J Plant Biotechnol (2010) 37:343 356 347 DKW 배지에서 다경유도 및 생장이 양호하여 유칼리 기 내증식의 적정배지로 선정할 수 있었다. 증식된 줄기의 발근은 0.2 mg/l 및 0.5 mg/l NAA 농도에서 100% 발근되 었고, 특히 0.2 mg/l 처리시 유근 형성이 좋았다. 발근묘 는 상토로 이식하여 3주간 순화 후 100% 활착되고, 균일 하고 비교적 빠르게 생장하였으며 2개월 후에는 묘고 40 cm 이상으로 생장하였다 (Moon et al. 2003; Park et al. 2005, 2008a). 산개나리 (Forsythia saxatilis) 약 3년생 산개나리 신초액아 절편을 2종의 싸이토키닌 (BA, Kinetin, Zeatin)이 포함 된 MS 배지에 배양하여 그 농도별 증식효과를 조사하였다. 줄기 증식은 싸이토키닌 종류별 혹은 농도별 효과가 뚜렷하지 않았으나 zeatin 처 리시 줄기 및 잎의 발달에 효과가 있었다. Kinetin 처리시 에는 줄기 생장과 함께 모든 절편에서 발근이 이루어졌다. 줄기는 기내에서 3년 이상 계대배양을 통해 정상적으로 증식이 가능하였고, 발근 후 산지에 이식하여 정상적으로 생장하였다 (Moon et al. 1997b). 미선나무 (Abeliophyllum distichum) 신초지 액아를 절편으로 MS 배지에 세 종류의 싸이토키 닌을 처리하여 증식을 시험하였다. 줄기유도는 BA가 효 과적으로 나타났고, 생장은 zeatin 처리가 양호하였다. Kinetin은 고농도 (2.0 및 5.0 mg/l)에서 증식효과가 있었 으나 그 효과는 BA, zeatin에 비해 저조하였다. 증식된 줄 기는 1/2 DBM2 배지에 IBA 처리로 가능하였고, 인공상 토에 이식하여 100% 활착되었고 정상생장을 나타냈다. 이상의 결과로 미선나무의 액아배양을 통한 기내증식 가 능성을 보여주었다 (Moon et al. 1999). 히어리 (Corylopsis gotoana var. coreana) 1년생 및 10년생 액아를 절편으로 MS배지에 0.5~3.0 mg/l zeatin, 0.2 mg/l BA 처리로 줄기증식이 양호하였다. 1년생 이 10년생보다 전반적으로 증식 및 생장이 양호하였으며, 배양 6 개월 후에는 10 년생에서도 매월 3배의 증식이 가 능하였다. 기내발근은 1년생 97%, 10년생 62%를 나타내었 고, 토양이식 시 1년생 배양묘는 67%, 10년생은 48% 생존 하여 모수령에 따른 차이를 나타냈다 (Moon et al. 2002a). 왕자귀나무 (Albizia kalkora) 기내발아 후 10일이 지난 유묘 뿌리를 절편으로 신초를 유 도하여 기내증식 체계를 확립하였다. Thidiazuron (TDZ) 0~4.5 μm과 NAA, 2,4-D 등이 첨가된 B5 배지에서 배양 8주 후 60~93%의 절편에서 신초가 형성되었다. 그러나 자엽, 하 배축, 잎 등의 절편체에서는 뿌리조직에 비해 신초 형성이 매우 저조하였다. TDZ 처리배지에서 유도된 신초는 1.44 μ M GA 3이 첨가된 배지에서 57.5%가 식물체로 발달하고, 생 장조절제 무처리 배지에서 발근되어 정상적인 형태로 생장 하였다 (Park et al. 2003). 시로미 (Empetrum nigrum var. japonicum) 액아 마디를 절편으로 MS 및 WPM 배지에 BA를 처리하 여 줄기 유도 및 발근에 미치는 배지와 호르몬의 효과를 조사하였다. 다경유도는 zeatin이 BA보다 다소 효과적인 반면 줄기생장에는 BA가 zeatin보다 양호한 것으로 나타 났다. 증식줄기의 기내발근은 1/2 MS 배지보다 WPM 배 지가 효과적으로 5.0 mg/l IBA 처리시 53% 까지 발근되 었다. 발근묘는 인공배양토에서 93% 이상 활착되었다 (Han et al. 2010). 이상에서 보여준 몇 가지 산림수종의 아배양 기술은 효율적인 기내 증식수단으로 사용될 수 있음을 보여주고 있다. 그러나 많은 경우 산림수종이 지니는 유전적인 고 유한 특성으로 인해 기내배양을 어렵게 만들고 있으며 (McCown 2000), 배양과정에서 나타나는 문제들 이를테면 오염제거, 페놀성 화합물의 분비, 과수화 현상, 발근의 어 려움과 동일한 수종에서도 반응에 차이를 보이는 개체목 에 따른 유전자형의 효과로 인해 배양조건의 적정화가 어렵다. 최근에는 생물반응기의 활용, 광독립배양의 도 입 등으로 이러한 문제점 들이 극복되고 있다 (Kitaya et al. 2005). 캘러스배양 및 부정아 유도 유용한 유전자를 원하는 식물에 도입하기 위해서는 대상 수종의 재분화 체계 확립이 선행되어야 한다. 유용 유전 자의 탐색과 식물 형질전환을 위한 벡터가 다수 개발되 었으나 임목류에서 형질전환이 주로 포플러류에 한정되 어 이루어지는 이유는 목적하는 다양한 수종의 재분화 체계가 확립되지 못하였기 때문이다. 국립산림과학원에 서는 여러 수종에서 체세포배 형성을 통한 식물체 재생 기법이 확립되고 있어 앞으로는 이 분야의 형질전환 연 구가 기대된다. 그간 수행된 캘러스 및 부정아유도의 주 요결과는 Table 3과 같다. 체세포배발생 (Somatic embryogenesis) 1990년대에 들어와 임목류에서 가장 보편화된 조직배 양 기술은 체세포배 유도를 통한 증식이다 (Gupta et al. 1991). 침엽수는 1985년 독일가문비에서, 활엽수는 1965 년 Sandalwood에서 처음 발표되었다 (Reviewed by Rao et al. 2000). 국립산림과학원의 산림생명공학과에서는 1986 년 피나무의 미숙배 배양으로 체세포배를 처음 유도하였 으며, 다음해에는 완전한 식물체를 얻을 수 있었다 (Kim
348 J Plant Biotechnol (2010) 37:343 356 Table 3 Micropropagation via adventitious bud induction from tissue or callus at KFRI Year Species Explant * Result Reference 1987 Pinus densiflora AB Shoot proliferation Kim and Park 1999 Populus euphratica IP Shoot proliferation Cheong and Moon 2001 Populus euramericana IP Plant regeneration Kang and Moon 2005 Hybrid kiwi SC Plant regeneration Kim and Moon 2005b Eucalyptus pellita IL/IR Adventive shoot induction Kim et al 2006 " IL/Hy Adventive shoot induction Kim et al 2007b Hybrid kiwi IL Plantlet regeneration Kim and Moon 2008b Salix pseudolasiogyne Nd Shoot proliferation, rejuvenation Park et al. 2008a Eucalyptus pellita IP Shoot proliferation Park et al 2010 Eucalyptus pellita Nd Bioreactor culture Kim et al. * AB-axillary bud, Hy-hypocotyl, IL-In vitro leaf, IP-In vitro plantlet, IR-In vitro root, Nd-node, SC-suspension cells Table 4 A review of micropropagation via somatic embryogenesis at KFRI Year Species Explant * Result Reference 1986 Tilia amurensis SE Somatic embryo induction Kim et al. 1988 Juglans regia ImZE Somatic embryo induction/plant regeneration Lee et al. 1991 Hibiscus syriacus FOs Lee et al. 1992a Quercus acutissima mze Kim et al. 1992b Hibiscus syriacus mze Somatic embryo induction Kim et al. 1994 Q. acutissima ImZE Somatic embryo induction/plant regeneration Kim et al. Zizyphus jujuba ImZE Moon et al. 1995b Quercus variabilis ImZE Somatic embryo induction Kim et al. 1996 Melia azedarach var. japonica ImZE Somatic embryo induction/plant regeneration Moon and Kim 1996 Tilia mandshurica ImZE Somatic embryo induction/plant regeneration Moon and Youn 1997 Q. acutissima ImZE Kim et al. 1998 Aralia elata WB Moon et al. 1999 Larix leptolepis ImZE Kim et al. 1999 Aralia elata WB Moon and Youn 2003 Liriodendron tulipifera ImZE Lee et al. 2005a Aralia elata Pt/L Kim et al. 2005 Eleutherococcus koreanum IR Park et al. Kalopanax pictus ImZE Moon et al. Liriodendron tulipifera ImZE Somatic embryo induction Son et al. 2006 Zyzyphus jujuba ImZE Somatic embryo induction/plant regeneration Kim et al. 2006 Oplopanax elatus ImZE Moon et al. 2007a Pinus rigida P. taeda ImZE Kim and Moon 2007c Larix leptolepis ImZE Kim and Moon 2007 Magnolia abovata ImZE Kim et al. 2008 Picea koraiensis ImZE Li et al. 2010 Pinus contorta ImZE/WB Park et al. Liriodendron tulipifera SE Bioreactor culture An et al. * AB-axillary bud, FOs-floral organs, IR-in vitro root, ImZE-immature zygotic embryo, mze-mature zygotic embryo, L-leaf, Pt-petiole, SE-somatic embryo, WB-winter bud et al. 1986; Kim et al. 1988). 호두나무는 미숙배를 재료로 체세포배의 유도와 발아를 시험하였으나 완전한 식물체 는 얻지 못했다 (Lee et al. 1988). 그러나 무궁화의 성숙배 혹은 화사 (filament)로부터 체세포배를 유도하여 완전한 식물체까지 얻었다 (Lee et al. 1991; Kim et al. 1992, 1995). 또한 상수리나무의 성숙배를 절편으로 BA와 IBA를 처리 한 MS, WPM 배지에서 체세포배를 유도하였으며, BA가 처리된 WPM 배지에서 발아 후 몇 본을 폿트묘까지 육성 하였다 (Kim et al. 1992a, 1994, 1997). 이 같은 연구결과는 1995년 이후 조직배양의 가장 진보된 핵심 기술로 자리 잡은 체세포배 연구의 귀중한 토대를 이루게 되었으며, 멧대추 (Moon et al. 1994; Kim et al. 2006), 무궁화 (Kim et al. 1992b, 1995a), 상수리나무 (Kim et al. 1994, 1997), 굴참 나무 (Kim et al. 1995b), 찰피나무 (Moon and Youn 1996),
J Plant Biotechnol (2010) 37:343 356 349 Fig. 1 Plant production via somatic embryogenesis (SE) from various tree species at KFRI [A. Direct SEs formation from zygotic embryo of Eleutherococcus divaricatus var. chiisanensis; B-D. Globular (B), torpedo (C) and conversion stage (D) of SEs in Tilia amurensis; E-F. Synchronized SEs by sieving in Aralia elata; G-J. Artificial seeds using SEs (G), plantlet conversion (H) and acclimatization (I and J) in Kalopanax septemlobus; K. Emblings of Aralia elata] 멀구슬나무 (Moon and Kim 1996) 등에서 기술개발이 이 루어졌다 (Fig. 1). 1990년대 이후 조직배양에 의한 기내증식의 현저한 특 징은 체세포배 유도에 의한 증식기술의 보편화이다. 이 기술은 초저온 저장기술과 연계하여 임목에서도 비교적 단기간에 유전적 개량을 가져올 수 있는 새로운 기술로 보고되고 있으며 (Park 2002), 150여 종의 임목류에서 체 세포배 형성이 보고되었다 (Dunstan et al. 1995). 전술한 바와 같이 체세포배형성 기술은 대량증식의 측면에서 매 우 효율적일 뿐만 아니라, 초저온저장에 의한 생식질보 존이 가능하고, 형질전환의 좋은 재료가 된다. 우리 과학 원에서도 1995년 이후 체세포배 유도기술을 이용한 증식 기술이 여러 유용한 수종에서 보편적으로 적용되어 왔으 며, 최근에는 기내배양이 매우 어려운 소나무 등에서도 체세포배 유도를 통한 묘목생산이 가능하게 되었다. 절편체는 대부분 유시성 (juvenility)이 높은 미숙배로부 터 배발생 조직을 유도하고 있다. 절편으로 미숙배를 사 용하는 것은 침엽수 혹은 활엽수종에서 동일한 현상으로 나타나지만 기내배양이 까다로운 침엽수종에 있어서는 미숙배의 발달시기 중 특정한 기간에만 배발생이 가능한 time window가 있다. 따라서 수분과 수정이 된 다음 일정 한 시기별로 배양을 실시하여 배발생이 가능한 적정시기 를 찾아야 한다. 한편 활엽수종에 있어서도 절편은 배발 생능이 높은 미숙배를 사용하고, 수종에 따라서는 화기 조직이나 유묘의 신초를 사용하고 있다. 두릅나무는 배 발생능이 좋아서 유묘의 신초나 동아 (winter bud)로부터 배발생이 가능하였으며, 최근에는 약 50년생 모수의 근 맹아지로부터 캘러스 및 배발생 캘러스를 유도하여 묘목 을 생산한 바 있다. 배지는 주로 MS 배지를 사용하고 있 으며, 백합나무에서는 1/2 LM 배지 (Lindemann et al. 1970) 를, 그리고 소나무 및 리기테다소나무에서는 1/2 Lepoivr (LP, Aitken-Christie 1984) 혹은 P6 (Teasdale et al. 1986) 배 지를 사용하였다 (Kim and Moon 2007a). 적정배지는 수 종, 유전자형, 배양절편에 따라 다를 수 있다. 배발생 조 직의 유도에 있어 생장조절제의 처리는 필수적이다. 대 부분의 활엽수종은 2,4-D의 단독처리가 주효하며, 수종 에 따라서는 저농도의 싸이토키닌을 혼용 처리한다. 멀 구슬나무는 특이하게 BA 단독처리로 배발생 조직이 유 도되었으며 (Moon and Kim 1996), 상수리나무의 미숙배 로부터 배발생조직의 유도는 BA와 IBA의 혼용처리로 가 능하였다 (Kim et al. 1997). 일단 배발생 조직이 얻어지면 계대배양을 통해 배발생 능이 있는 조직만을 유지, 증식하는 것이 매우 중요하다. 이러한 배발생 조직은 세포계통에 따라 체세포배의 유 도, 발아 및 식물체 형성이 다르게 나타나므로 다른 세포 주와 섞이지 않도록 주의 깊게 다루어야 한다. 배발생 조 직이 증식된 다음의 단계는 이러한 조직으로부터 체세포 배를 유도하는 것이다. 일반적으로는 배발생 조직의 유 지에 첨가시킨 오옥신을 제거한 기본배지로 옮겨 체세포 배를 유도하지만 침엽수종의 경우 고농도의 ABA를 첨가 하는 것이 보통이다. ABA는 체세포배의 조기발아를 억제하고, 균일한 체세 포배를 유도시켜 준다. 많은 경우 체세포배는 자엽이 붙 어있는 것, 단자엽 혹은 다자엽으로 형성된 것, epicotyl이 형성되지 못한 것 등이 나타나는바 ABA의 처리는 이러 한 기형의 체세포배 유도를 억제한다. 또한 ABA의 처리 와 함께 보통 고농도의 삼투압제를 사용하고, 기본배지 에 glutamine 등의 아미노산을 첨가하기도 한다. 수종에 따라서는 polyethylene glycol (PEG)를 첨가하며 PEG 4000 으로 농도범위 7~10%을 주로 사용한다. 체세포배가 유도 되면 다음의 단계는 체세포배를 정상적으로 발아시켜 식 물체로 유도하는 것이다. 활엽수종의 체세포배, 특히 오 갈피류의 체세포배 발아시에는 GA 3의 처리가 효과적으 로 보고되고 있으며, 음나무 및 땃두릅나무의 체세포배 발아에 있어서도 GA 3 처리가 필수적이었다 (Moon et al. 2005; Moon et al. 2006) (Fig. 1H). 민두릅나무 (thornless Aralia elata) 동아 및 신초 유조직을 재료로 MS 기본배지에 2,4-D를 처리하여 배발생 캘러스를 유도하고, 일련의 배양과정을 적정화하여 체세포배 유도, 발아 및 식물체 형성을 통한 묘목 생산을 체계화하였다. 1999년부터 2002년까지 폿트 묘로 10만 본 이상을 산림청 산하 기관으로 보급하였다. 이상의 결과는 조직배양묘의 실용화라는 측면에서 의의 가 있다 (Moon et al. 1999) (Fig. 2C).
350 J Plant Biotechnol (2010) 37:343 356 상수리나무 (Quercus acutissima) 수정 후 약 5주부터 일주 간격으로 미숙배를 채취하여 glutamine, proline과 생장조절제 BA와 IBA가 처리된 MS 배지에서 체세포배를 유도하였다. 체세포배는 BA가 처 리된 WPM 배지에서 발아 및 식물체로 재생하였다. 총 210본의 재분화체 중 120본을 토양에 이식하여 34%가 활 착되었다. 이 결과는 기내배양이 까다로운 상수리나무의 체세포배 유도를 통한 식물체 재생의 흥미 있는 결과로, 체세포배의 발아 및 재분화율 제고는 계속 연구할 필요 가 있다 (Kim et al. 1994; Kim et al. 1997). 음나무 (Kalopanax septemlobus) 8월 중순 미숙배를 재료로 2,4-D가 처리된 MS 배지에서 암배양으로 배발생 캘러스를 유도하였다. 체세포배는 ABA 처리된 배지에서 가능하였고, 정상적인 배 발아 및 재분 화를 위하여 저농도의 활성탄 처리가 필요하였다. 체세 포배의 발아과정에서 2차 체세포배를 형성하였고, 정상 적인 배발생 경로를 통해 식물체가 형성되었다. 재분화 된 식물체는 인공배양토에서 95% 이상 활착되어 포지에 이식 후 정상생장 하였다 (Moon et al. 2005). 낙엽송 (Larix leptolepis) 자엽단계의 접합자 배를 절편으로 LM 배지 등 3종의 배 지에서 배발생 조직을 유도하였다. 미숙배의 발달단계에 따라 배발생율이 크게 달랐으며, 7월말에 채취한 미숙배 에서 배발생율이 가장 양호하였다. ABA는 배의 조숙화 발아 억제에 효과가 있었다. 이 방법으로 총 400본 이상의 체세포배 유래 식물체를 생산하였다 (Kim et al. 1999). 소나무 (Pinus densiflora) 약 5,700 개 이상의 미숙종자를 배양하여 10개의 배발생 계통을 얻었다. 7월 5일에 채취한 종자에서 가장 양호한 결과를 얻었고 0.36%의 배발생 조직을 유도하였다. 배발 생 세포로부터 체세포배의 유도는 세포계통에 따라 차이 를 보였으며, 80 um ABA, 0.2M maltose, 1.0% gellan gum 배지에서 체세포배를 유도하여 자엽단계의 배로 성숙하 였다. 이러한 성숙배는 0.2% gellan gum의 1/2 LM 배지에 서 발아 되었는데, 배성숙배지의 ABA 농도, 활성탄이 첨 가된 발아배지의 종류에 따라 0~34%까지 발아되었다 (Kim et al. unpublished data). 리기테다소나무 (Pinus rigida x P. taeda) 6월 11일부터 7월 30일까지 약 1주 간격으로 미숙종자를 채취하여 절편으로 사용하였다. 총 3,400개 이상의 종자 로부터 5개의 배발생 조직을 얻어 평균 0.14%의 빈도를 보였다. 13.5 μm 2,4-D와 4.4 μm BA를 첨가한 P6 배지에 서만 배발생 조직이 유도되었으며, 7월 3일에 채취한 종 Fig. 2 Growth performance of several tree species produced via micropropagation at KFRI (A. 5-yr-old yellow poplar emblings; B. 9-yr-old hybrid pine emblings; C. 8-month-old thornless Aralia elata emblings; D. 20-yr-old hybrid poplar produced via axillary buds; E. 15-yr-old Pinus densiflora produced via mature zygotic embryos; F. 15-yr-old Quercus acutissima produced via axillary buds; G. 5-yr-old Magnolia abovata emblings) 자에서 0.55%의 가장 높은 배발생 조직이 유도되었다. 조 직검경 결과 이 시기의 접합자배는 전배 (proembryos)에 서 초기 자엽단계로 전이되는 상태로 나타났다. 배발생 조직은 세포질이 충만하고 잘 발달된 배병 (suspensor)을 나타내어 비배발생 조직과 구별되었다. 얻어진 5개의 배 발생 조직은 증식율의 차이가 있었으나 모두 체세포배를 형성하였으며, 80-150 μm ABA 처리가 필요하고, 고농도 gellan gum (1%)에서 성숙되었다. 체세포배는 생장조절제 무처리 조건에서 정상적인 배발달 경로를 통해 발아되었 다 (Kim and Moon 2007a). 재분화 된 어린 식물체는 인공 상토에서 순화하여 묘목으로 육성하였다 (Fig. 2B). 상변화 (Phase change) 임목류 미세번식의 가장 큰 어려움은 성숙목의 분화능이 현저히 낮다는 것이다. 그러나 대부분의 수종에서 중요 한 특성들은 성숙기 (adult stage)에 도달해야만 발현된다. 나무가 나이가 들고 성숙해지면 영양 번식체의 발근력 이 점차 감소하기 때문에 산림수종의 무성번식 (조직배양 을 포함)은 상변화를 잘 이해할 필요가 있다 (Greenwood 1987, 1995). Greenwood (1987)는 성숙상에 이르는 4가지 발달 단계 를 제안하였다. 이것은 형태형성 등의 독특성에 의해 특 징 지울 수 있다. 배발생단계, 유묘단계 (유시상과 밀접하게 관련), 천이단계 (유시기에서 성숙기로 넘어가는 단계로 생 식능을 얻는 단계를 포함) 및 성숙상 단계 (생식능이 최고 에 달하고, 묘고나 직경생장 능력은 최저가 됨) 등이다.
J Plant Biotechnol (2010) 37:343 356 351 상변화와 관련하여 몇 가지 정의를 숙지할 필요가 있다. 상변화란 배 (embryo)로부터 시작하여 유시기와 성숙기 를 거쳐 식물이 발달해가는 과정에 관련한 생리적 변화 이다. 노화 (aging)는 나이듦 혹은 가령 ( 加 齡 )을 뜻하며 식물의 개체발생적 혹은 연대기적 나이가 들어가면서 나타 나는 표현형적 변화를 뜻한다. 개체발생적 노화 (ontogenetic aging)란 배로부터 출발하여 성숙기로 발전해가는 과정 에서 나타나는 노화를 뜻한다. 이와 비슷한 용어로 연대 기적 노화 (chronological aging)가 있는데 이것은 실생묘이 든 영양번식체이든 어떤 개체 식물의 일생을 통하여 지 속적으로 나타나는 노화를 의미한다. 이것의 특징은 종 자기원이나 영양번식 기원에 관계없이 그 식물체가 생장 한 기간에 의해 결정되는 노화를 뜻한다. 보다 자세한 설 명은 다음에 기술하였다. 상변화에는 담쟁이나 유칼리나무의 경우처럼 때때로 잎 모양이 특징적으로 변하기도 한다. 유시 특성을 지닌 조직을 이용하면 성숙목의 번식이나 배양이 촉진되는데 이것은 검증된 성숙한 우량한 나무 (유전자형)의 성공적 인 번식을 위해 매우 중요한 내용이다. 위치효과 (position effect)를 고려한다면 유시특성은 대부분의 나무의 뿌리 에 가까운 기저부에 있다. 이곳은 개체 발생적으로 어린 조직이 있는 곳이다. 반면 성숙된 조직은 개체 발생적으 로 늙은 그러나 연대기적으로는 젊은 (발달이나 생리적 요소의 기능으로 볼 때) 상태인 식물의 외면에 존재한다. 나무의 맨 꼭대기 상단부의 정아나 줄기 조직이 이에 해 당한다고 볼 수 있다. 유시조직을 얻기가 어려우면 노화의 역전 (reversion)이나 부분적 재유령화 (partial rejuvenation) 처리가 도움을 줄 수 있다. 야외에서는 가지치기, 전정, 근맹아지의 이용, 어린대목으로의 접목, 생장조절제 살포, 황화처리 및 수경재배를 통한 부정아유도, 잠아 (epicormic bud)유도 등이 있다. 기내 방법으로는 잠아가 있는 절편 의 배양, 반복된 계대배양, 유시대목으로 미세접목, 부정 아유도, 체세포배형성, 수평배양 (horizontal culture) 등을 시도할 수 있다 (Hartmann et al. 2002). 비록 상변화의 기작은 아직 잘 알려지지 않은 상태이다. DNA methylation에서의 변화가 노화와 관련이 있다는 연 구와 여러 가지 형태적, 생화학적, 분자수준의 마커를 이 용하여 서로 다른 발달단계 상 (phase)에 대한 특성이 구 명되고 있다. 유시성에 대한 임의적 마커 유전자가 담쟁 이의 성숙화 과정에서 동정되었는데 dihydroflavonol reductase 가 그것이다. 사과에서는 MADS-box 유전자가 개화의 시 작을 통한 생식발달에 관여하고 (van der Linden et al. 1999), 배 (pear)에서는 DNA-methyltransferase 유전자가 동정 되 었다 (Giannino et al. 1999). 개체발생적 노화 (Ontogenetic aging) 노화는 식물 발달에 있어 두 가지 별개의 의미를 지닌다. 개체발생적 노화란 유식물이 배발생기, 유시기, 천이기 를 거쳐 성숙상태로 발달해 가면서 나타나는 상변화이다. 유묘에서 개화기까지의 천이 (transition)는 연년식물에서 매우 빠르게 일어나지만 나무에서는 20년 이상이 걸리기 도 한다. 이러한 천이 기간을 며칠 혹은 몇 년의 시간 개 념으로 표시하는 것이 편리하기도 하지만 상변화는 정단 분열조직에서 발달한 마디수로 결정하는 것도 좋은 방법 이다. 특정한 마디에서 생산된 눈 (bud)은 그것의 개체 발 생적 나이와 관련하여 마디의 epigenetic potential을 지니 고 있다. 예로써 식물의 기부에서 만들어진 눈 (bud)은 보 다 유시적이라고 말할 수 있는데 그것은 유시상 (juvenile phase)의 발달기 동안에 처음 형성되었기 때문이다. 상변화는 잎 모양이나 개화능력과 같은 특정단계의 형 태적 특징으로써 가장 잘 구분된다. 식물에 따라서는 유 묘에서 성숙상으로 발달하면서 형태적 변화가 분명치 않 은 경우가 있다. 이러한 것을 homoblastic이라 부른다. 다른 식물에서는 나이를 먹으면서 특성변화에 있어서 분명한 표현형적 변화가 있는데 이것을 heterobastic이라 부른다 (Hartmann et al. 2002 and there in cited papers). 유시 혹은 성숙상에서 차별적으로 발현되는 여러 유전자와 유전자 산물이 동정되고 있는데 이러한 것은 상발달의 분자적, 생화학적 마커로 사용될 수 있다 (Park et al. 2010). 연대기적 노화 (Chronological aging) 이러한 노화는 실생묘이든 영양번식체이든 관계없이 어 떤 개체 식물의 일생을 통하여 지속적으로 나타난다. 이 노화의 특징은 식물체가 생장한 실제 연수 (year)에 의해 결정된다. 좋은 생장조건의 어린 식물체는 생장이 왕성 하고, 건강하여 꽃이 많이 피게 되지만 나이가 들면서 생 장은 점차로 감퇴한다. 개화 및 결실이 많을 지라도 새로 운 생장은 감소하는 경향이 있으며 식물은 결국 노쇠하 여 죽게 될 것 이다. 노쇠기로 들어간 식물은 재 번식시 켜 왕성하고 생산적인 상태로 되돌아 갈 수 있다. 여러 가지 외부적 처리 즉, 전정, 질소시비, 관수, 해충이나 질 병 조절, 기타 일반적으로는 관리경영을 잘해서 재유령 화를 촉진 시킬 수 있다. 상변화와 영양번식 (Vegetative propagation) 개체 발생적 노화 (ontogenetic aging)는 영양번식에서 매 우 중요하다. 왜냐하면 성숙목의 정아나 측아를 영양번식 시키면 그 차대 식물에서도 계속해서 개체 발생적 노화가 나타나기 때문이다. 예로써 모본의 식물이 유시상이라면 그 영양번식 차대는 유시상을 나타낼 것이고 차후 생장을 통해 성숙상으로 바뀌게 되어 안정화된 성숙 생식상으로 들어간다. 실생묘의 성숙된 가지를 이용한 영양 번식체는 결국 S 1세대에서 실생묘의 표현형이 재생되지 않을지 모 른다. 나무의 아래쪽 기부에서 만들어진 번식체는 생물
352 J Plant Biotechnol (2010) 37:343 356 학적으로 유시성의 경향을 띤다. 나무의 꼭대기나 외면 에서 취한 절편체는 생물학적으로 차대에서 성숙상을 띤 다. 유시와 성숙상 중간 단계에서 취한 영양 번식체는 유 시 혹은 성숙상을 띨 수 있다. 임업인들은 이러한 변이를 관찰하고 새로운 단어를 만들어 냈는데 식물을 ortet로 S 1 식물을 ramet이라 부르게 되었다. 이러한 변이는 유전적 변화에 기인하는 것이 아니라 영양번식 과정에서 지속되 는 성숙상에서의 후생적변이 (epigenetic variation)에 기인 한다. 유시 및 성숙상의 특성 영양 번식체가 계속 생장하고 세대가 지속되면 클론 개 체식물의 성숙상은 안정화 되고 유시상의 특성이 사라진 다. 과실, 종자, 꽃을 목적으로 한 대부분 클론 품종은 성 숙 cycle의 성숙상에 달하면 동일한 특성을 나타낸다. 대 부분 개체 식물체는 꽃이 피고 영양 발달기 이후에는 상 당히 빠르게 과실이 맺힌다. 그리고 유시상과 관련된 바 람직하지 못한 특성도 사라지게 된다. 안정화된 성숙 클 론의 영양상 (vegetative phase)을 유시적 (juvenile)이라고 부르는 것은 적절치 않다. 유시상에서 성숙상으로의 상변화 촉진 많은 목본수종에서 유묘가 성숙하여 개화기에 달하려면 오랜 시간이 필요하다. 임목류 육종 프로그램은 주로 유 묘를 이용하는데, 이러한 경우 유시기가 길어서 방해를 받는다. 유시기 (juvenile stage)는 여러 유전자에 의해 조 절될 수 있기 때문에 육종과 생산주기를 단축시킬 수 있 다. 그리고 나무의 생장이나 발달 역시 환경적인 제어로 조절될 수 있다. 생장과 발달 역시 환경적 조절로 조절될 수 있다. 가장 중요한 개념은 가능하면 빨리 유시기를 지 나서 성숙상의 나무로 자라도록 하는 것이다. 예를 들어 자작나무 유묘는 겨울에 온실에서 계속 장일장하에서 키 웠을 때 단일장으로 키운 것 보다 유시기를 지나 성숙기 로 가는 기간이 훨씬 빠른 것으로 나타났다. Crab apple은 일반적으로 4년에 개화가 시작되지만 온실에서 계속 키 웠을 때 발아 후 13개월에 2.5~3.0 m에 달하고 개화가 시 작되었다 (Zimmermann 1971). 생장억제, 환상박피, 왜성 대목으로 접목, 기타처리 등으로 조기 개화가 가능하다. 그러나 이러한 방법은 나무가 천이기 혹은 성숙기에 도 달했을 때에만 유용하다. 때문에 유묘는 생장을 촉진시 켜 유시상을 벗어나도록 해야만 한다. 유시상의 선택과 유지 영양번식을 위해 모본 재료를 유시상으로 유지시키는 것 은 발근력을 증가 시키는 중요한 요인이다. 여러 가지 방 법이 사용될 수 있는데, 나무의 근부에 있는 유시 특성을 나타내는 줄기의 선택, 근맹아 혹은 epicormic shoot의 이 용, 돌기조직 (sphaeroblasts)의 선택, 산울타리 (hedge rows) 처리, 연속적인 삽목재료의 유지, 지표면 가까이의 삽수 줄기를 이용한 stool-shoot 상 (bed)의 조성 등이다 (Moon et al. 1991a). 재유령화 (Rejuvenation) 자연상태에서 식물이 성숙상에서 유시상으로 역전되는 것은 생식 (sexual)에 의해서 혹은 apomictic 시기에 종자 의 발달로 이루어진다. 한편 성숙상의 유시상으로의 역 전은 영양 재료로써도 가능하다. 세코이야 혹은 유칼리 나무에서는 성숙된 가지를 어린 대목에 연속적으로 접목 시키면 성숙상에서 유시상으로 역전되었다. 조직배양에 서 정단 분열조직을 계속해서 계대배양 시키면 유시상으 로 바뀐다. 생장호르몬의 처리도 효과적인데 GA의 처리 는 담쟁이의 유시생장을 유도하였고, ABA 처리는 또 다 시 성숙상으로 역전되었다 (Hartmann et al. 2002). 이상에서 언급한 식물의 상변화와 관련한 몇 가지 내 용은 성공적인 미세번식 특히 성숙목의 번식에 있어 중 요한 내용이 된다. 대부분 목본류는 성숙목이 되어야 바 람직한 특성이 나타나므로 성숙목의 번식을 위해서는 상 변화에 관련한 이러한 특성을 잘 이해할 필요가 있다. 적 극적인 방법으로는 야외에서 반복 접목이나 고강도의 전 정과 같은 여러 가지 재유령화 처리를 실시하고, 기내배 양 조건의 최적화와 더불어 여러 가지 스트레스처리 (고 농도 생장조절제, 삼투압제, 고 저온처리, 기아처리, 박 편배양 등)를 통해 선발목의 미세번식이 가능할 것이다 (von Aderkas and Bonga 2000). 최근 여러 침엽수 및 활엽 수에서 성숙목을 재료로 한 체세포배 유도와 다양한 형 질전환체의 활용이 보고되고 있는데 이러한 결과는 전통 적인 산림수종의 육종과 개량을 촉진시켜 목재의 생산성 을 크게 제고시키는 방법이 될 것이다 (von Aderkas and Bonga 2000; Harfouche et al. 2010). 결 론 산림수종의 기내배양 기술은 기존의 육종프로그램의 보 조수단 혹은 촉매수단으로 유용하게 사용될 수 있다. 일 반적으로 대부분의 나무는 장수성이고, 수체가 크며, 개 화기까지 수년 혹은 수십 년이 소요되고, 성숙목이 되어 야 유용한 형질특성이 나타나고, 환경적인 제어가 곤란 하여 육종에 어려움이 많다. 그러나 앞서 언급했듯이 미 세번식 기술은 산림수종의 육종에 있어 효율적인 번식 수단이 될 수 있으며 성숙목을 대상으로 한 번식기술의 개발은 선발에 의한 개량효과를 크게 높일 수 있다. 열대 림 속성수종으로 육성임업과 클론임업의 주요수종으로
J Plant Biotechnol (2010) 37:343 356 353 각광 받는 유칼리나무는 이미 성숙목의 번식기술 개발로 개량효과를 크게 높이고 있다. 하지만 그동안의 목본류 를 대상으로 이루어진 대부분의 기내증식 프로토콜이 유 시재료를 사용한 것이기 때문에 선발목 등 성숙목에 직 접 적용하기 어려운 문제점이 있다. 최근에는 성숙목의 번식기술에 대한 그동안의 노하우와 새로운 기술의 적용 으로 이러한 문제점들이 점차 극복되고 있다 (Bonga et al. 2010; Park et al. 2010). 성숙목의 배양은 보다 유시적인 재료의 선택 이를테면 근부의 재료를 사용, 근맹아지 사 용, epicormic shoot를 이용할 수 있으며, 재유령화의 방법 으로는 어린 대목으로의 반복접목, 생장조절제 전처리, 황화처리, 강도 높은 전정, 산울타리 조성 (hedging), 삽목 발근, 여러 가지 스트레스 처리를 통한 기내배양, 기내 미세접목 기술이 적용될 수 있다. 특히 암술 및 수술을 포함하는 화기조직과 같은 기관은 성숙목 클로닝의 좋은 재료가 된다. 이러한 재료의 선택은 절편 채취의 최적 시 기를 결정해야하고 한편으로는 분화능이 좋은 개체 (유 전자형)를 선발해야 한다. 최근 우수한 형질을 가진 성숙 목의 기내배양 체계확립을 위해 다양한 기초연구가 이루 어지고 있다 (Park et al. 2010). 이러한 체포배 유도 기술 의 적용이 침 활엽수의 여러 수종에서 시도되어 좋은 결 과를 얻고 있다. 체세포배 유도기술은 형질전환의 좋은 재료가 되며, 초저온저장 등 생식질 보존의 좋은 재료도 된다. 산림수종, 그 중에서도 용재 수종의 기내번식을 위 한 체세포배 기술의 개발은 산림과학 연구에서 계속 중 요한 위치를 차지할 것으로 보인다. 인용문헌 Aitken-Christie J (1984) Micropropagation of Pinus radiata. The Plant Propagator 30:9-11 An CH, Yi JS, Kim YW, Moon HK (2010) Somatic embryo germination and the related biochemical changes of Liriodendron tulipifera by biorector immersion time. J Korean For Soc 99:423-431 Bergmann BA, Moon HK (1997) In vitro adventitious shoot production in Paulownia. Plant Cell Rep 16:315-319 Bonga JM, Klimaszewska K, von Aderkas P (2010) Recalcitrance in clonal propagation, in particular of conifers. Plant Cell Tiss Org Cult 100:241-254 Cheong EJ, Moon HK (1999) Light, cytokinins and explant s position on adventitious bud induction from the leaf segments of Populus euphratica Olive. J For Sci 62:92-98 Cheong EJ, Moon HK, Kwon YJ, Youn Y, Noh ER (1997) In vitro shoot proliferation and ex vitro rooting of Populus euphratica Olive. Res Rep For Gen Res Inst Korea 33:81-86 Driver D, Kuniyuki A (1984) In vitro propagation of Paradox Walnut rootstok. HortScience 19:507-509 Dunstan DI, Tautorus TE, Thorpe TA (1995) Somatic embryogenesis in woody plants. In: In Vitro Embryogenesis in Plants. pp471-538. (ed. TA Thrope). Dordrecht: Kluwer Academic Pub Giannino D, Ticconi C, Frugis G, Mele G, Florio S, Santini L, Cozza R, Bitonti MB, Innocenti AM, Mariotti D (1999) Characterisation of juvenile and adult stages in woody species by means of ddrt-pcr markers and genes from heterologous species. Congress on Application of Biotechnology to Forest Genetics in Vitoria-Gasteiz, Spain, 22-25 September 1999. Book of Abstracts Girl CC, Shyamkumar B, Anjaneyulu C (2004) Progress in tissue culture, genetic transformation and applications of biotechnology to trees: an overview. Trees 18:115-135 Greenwood MS (1987) Rejuvenation of forest trees. Plant Growth Regul 6:1-12 Greenwood MS (1995) Juvenility and maturation in conifers: current concepts. Tree Physiol 15:433-438 Greshoff PM, Doy CH (1972) Haploid Arabidopsis thaliana callus and plants from anther culture. Aust J Biol Sci 25: 259-264 Gupta PK, Timmis R, Mascarenhas AF (1991) Field performance of micropropagated forestry species. In Vitro Cell Dev Biol-Plant 27:159-164 Han MS, Park SY, Moon HK, Kang YJ (2010) Micropropagation of a rare tree species, Empetrum nigrum var. japonicum K. Koch via axillary bud culture. J Korean For Soc 99:568-572 Harfouche A, Meilan R, Altman A (2010) Tree genetic engineering and applications to sustainable forestry and biomass production. Trends in Biotechnol-842 (In press) Hartmann HT, Kester SE, Davis Jr FT, Geneve RL (2002) Plant propagation - Principles and Practices (seventh edition). Prentice Hall Press pp 880 Hong SH, Shim SY, Park HS, Kwon SW, Lee SJ (1986) In vitro plantlet regeneration from adventitious buds induced on cutting of peeled twigs of Betula costata Traut. Res Rep Inst For Gen Korea 22:35-39 Hyun YI, Moon HK, Lee SK (1991) In vitro of 4 plus tree clones of Quercus acutissima. Res Rep Inst For Gen Korea 27:69-74 Kang HD, Moon HK (2001) Shoot proliferation of Populus euramericana (Populus deltoides x P. nigra) through in vitro tissue culture. Plant Res 4:111-120 Kang HJ, Moon HK, Yi JS (2003) Micropropagation of Coryopsis coreana by thidiazuron treatment. Kor J Plant Biotechnol 30:263-267 Kim CS, Kang YJ (1992) Vegetative propagation of Machilus thunbergii through in vitro and cuttings. Res Rep Inst For Gen Korea 28:58-62 Kim JA, Moon HK, Kim YW (2005a) Effect of growth regulators and osmoticums on somatic embryogenesis and plants regeneration in Aralia elata cultivar Zaoh. Kor J Plant Biotechnol 32:129-134 Kim JA, Moon HK, Kang HD (2005b) Effect of BA and NAA
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