pissn 2508-1357, eissn 2508-139X J Biomed Transl Res 2020;21(2):059-071 https://doi.org/10.12729/jbtr.2020.21.2.059 Received 18 Mar. 2020, Accepted 25 Mar. 2020 Research Article Artemisia annua extract ameliorates high-fat diet-induced fatty liver by activating AMPK Su-Jin Park 1, Chul Yung Choi 2, Jae-Cheon Jeong 3, Rok-Kyoung Lee 3, Yong-Pil Hwang 4* 1 G&P Bioscience Co., Ltd., Seoul 07528, Korea 2 Jeollanamdo Institute of Natural Resources Research, Jangheung 59338, Korea 3 Mokpo Marine Food-Industry Research Center, Mokpo 58621, Korea 4 Department of Pharmaceutical Engineering, International University of Korea, Jinju 52833, Korea Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is emerging as the most common liver disease in industrialized countries. Recently, natural compounds that may be beneficial for improving NAFLD have received increasing attention. Artemisia annua L. is the source of antimalarial phytomolecule, artemisinin, which has been reported to prevent obesity. However, the effect of A. annua extract on hepatic lipid metabolism remains unclear. This study was performed to determine the protective effect of Artemisia annua extract (AAE) on high-fat diet (HFD)-induced hepatic lipid accumulation, and elucidate the molecular mechanisms behind its effects in vivo and in vitro. We found that HFD-fed mice with AAE administration (50 mg/kg/day) for 8 weeks dramatically reduced hepatic lipid accumulation compared to the control mice taken with HFD alone. The body and liver weights of AAE group were significantly lower than those of HFD group, and oral administration of AAE remarkably suppressed the serum levels of triglyceride (TG), total cholesterol (TC), fasting glucose, alanine transaminase (ALT) and aspartate transaminase (AST) in HFD-fed mice. AAE significantly increased the phosphorylation of AMP-activated protein kinase (AMPK) and acetyl-coa carboxylase (ACC) in the liver of HFD-fed mice and HepG2 hepatocytes. Moreover, AAE downregulated the hepatic expression of sterol regulatory element-binding protein-1c (SREBP-1c) and fatty acid synthase (FAS) in HFD-fed mice and high glucose-treated HepG2 cells. In addition, the inhibitory effects of AAE on the overexpression of SREBP-1c and FAS were attenuated by compound C, which is the specific AMPK inhibitor, in high glucose-treated HepG2 cells. These results indicated that AAE may represent a promising approach for the prevention and treatment of obesity-related NAFLD via the activation of AMPK and the regulation of AMPK-dependent lipogenic genes. Key word: Artemisia annua extract (AAE), high-fat diet (HFD), fatty liver, AMP-activated protein kinase (AMPK), non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) Introduction 비알코올성지방간질환 (non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 은과량의알코올섭취없이도정상간무 게의 5% 이상에해당하는지방이간조직내에축적된 상태를말하며, 전세계적으로성인의약 20% 30% 에게서 발생하는가장흔한만성간질환이다 [1 3]. 최근서구화 된식습관과이로인한비만, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증 등의유병율이높아지면서비알코올성지방간질환의유 병율역시계속증가하는추세를보이고있는데, 실제로 비만이나제 2 형당뇨환자의약 70% 80% 에서비알코올 성지방간질환의발병이보고되고있다 [4, 5]. 비알코올성지방간질환은초기단계인지방간 (steatosis) 부터염증을동반하는지방간염 (steatohepatitis), 간섬유 화에의한간경변 (hepatic cirrhosis) 은물론간암이나간 부전까지진행될수있다 [6]. 비록경도의비알코올성지 방간이간경변증까지진행될확률은낮으나, 전체지방간 염환자의 10% 50% 가간경변증으로발전한다는사실을 고려하면, 초기단계인지방간혹은지방간염의발생을 억제하는것이보건의료적인측면에서매우중요함을알 *Corresponding author: Yong Pil Hwang Department of Pharmaceutical Engineering, International University of Korea, Jinju 52833, Korea Tel: +82-55-751-7946, Fax: +82-55-751-8177, E-mail: protoplast@hanmail.net
60 Su-Jin Park et al. 수있다 [3, 4]. 특히비알코올성지방간질환의가장유력한위험인자가비만인데다, 비알코올성지방간염 (nonalcoholic steatohepatitis, NASH) 의발병가능성역시비만의중증도에비례해서증가하기때문에비알코올성지방간질환의유병율을감소시키기위해서는식이조절, 규칙적인운동과같은근본적인노력과함께비만및이로인한지방간의발생을예방할수있는건강기능식품등의섭취를통한관리가필요하다. 최근비만에의한지방간유발및간의지질대사관련연구에서가장중요하게다뤄지는인자중의하나가 AMP-activated protein kinase(ampk) 인데, 인산화를통한 AMPK의활성화는지방산의합성과분해를매개하는 acetyl-coa carboxylase(acc), fatty acid synthase(fas), sterol regulatory element-binding protein(srebp-1) 등을불활성화시키거나유전자발현을억제함으로써간내의지방산산화를증가시키고, 중성지방의축적을감소시켜간의지질대사균형조절에중요한역할을하는것으로알려져있다 [7 9]. 실제로간에서 AMPK를과발현시킨경우혈중중성지방수치가감소한반면, 간특이적으로 AMPK를제거하자간내에서의지질합성증가가관찰되었다 [10, 11]. 개똥쑥 (Artemisia annua L.) 은국화과에속하는쑥속의한해살이풀로써한국, 중국, 일본, 대만등에자생하는것으로알려져있으며, 주로지상부전초를식용이나약용으로사용하는데, 이를청호또는황화호라고부른다 [12, 13]. 개똥쑥전초는예로부터결핵, 학질, 열사병, 피부질환등여러질환에사용이되어왔으며, 1990년대부터는아르테미시닌을주성분으로하는항말라리아제의원재료로서주목을받고있다 [14, 15]. 개똥쑥의약리학적효과는국내외에서다양한질환을대상으로한다수의연구논문들을통해서도확인되고있는데, Mashati 등, Isani 등, Lang 등과 Kim 등은 leukemia, osteosarcoma, breast cancer, colon cancer 세포등에서개똥쑥추출물의항암효과를보고하였으며 [16-19], Stebbings와 Hunt 등은엉덩이및무릎골관절염환자에게 12주간개똥쑥추출물을투여했을때유의한수준의통증및염증개선효과를나타냈다고발표하였다 [20, 21]. 또, Huang 등은개똥쑥클로로포름추출물이기도의평활근세포를이완시켜천식을개선시킨다는결과를보여주었으며 [22], Deng 등은전신적인아나필락시스랫드모델에서개똥쑥에탄올추출물이아나필락시스쇼크와히스타민방출등을감소시킴으로써항알레르기효과를나타낸다고하였고 [23], Oh 등은 lipopolysaccharide(lps) 로자극을가한 Raw264.7 세포주에서개똥쑥추출물이 NF-κB와 MAPKs 조절을통 해항염증효과를보인다는연구결과를발표하였다 [24]. 한편, 이러한항암, 항염증효과외에도일부논문들은개똥쑥추출물의비만및간손상억제효과를보여주고있는데, Baek 등은 diet-induced obesity(dio) 마우스모델에서개똥쑥추출물이지방합성과체중증가를감소시킬뿐아니라, 개똥쑥추출물과주요성분인 artemisinic acid 가 3T3-L1 세포에서지방세포의분화를조절한다고하였으며 [25], Kim 등은고지방식이를급이한마우스에서개똥쑥추출물이인슐린저항성과지방간형성및간조직의염증을억제한다고발표하였고 [26], Hesham 등은개똥쑥추출물이사염화탄소 (CCl 4 ) 에의한세포독성으로부터 HepG2 세포를보호하여 alanine transaminase(alt) 와 aspartate transaminase(ast) 를감소시키며, 이러한효과가추출물의 hydroxycinnamoyl quinic acids 및 flavonoids 함량과밀접하게연관되어있다는결과를보고하였다 [27]. 그러나개똥쑥추출물이세포및생체내에서간세포의지방합성및축적을어떠한경로로억제하는지, 그작용기전에관해서는충분한연구가수행된적이없었다. 이에본연구에서는고지방식이 (high-fat diet, HFD) 로지방간을유도한마우스에개똥쑥추출물 (Artemisia annua extract, AAE) 을 8주간경구투여한후, 간조직의지방축적및이를조절하는유전자로써 AMPK와함께 ACC, FAS, SREBP-1c의발현을측정하였고, high glucose로지방증을유도한 HepG2 세포에서이들유전자의활성화또는발현에대한영향을조사함으로써개똥쑥추출물의지방간억제기전을규명하고자하였다. Materials and Methods 시약세포배양에필요한 Dulbecco s modified Eagle s medium(dmem), fetal bovine serum(fbs) 과 penicillinstreptomycin은 Gibco-BRL(Grand Island, NY, USA) 제품을사용하였고, 세포시험에사용한 methyl thiazolyl tetrazolium(mtt), AMPK inhibitor(ampki) 인 compound C는 Sigma Chemical(St. Louis, MO, USA) 제품을구입하였다. 그리고 Western blot analysis를위한 phosphorylated-amp-activated protein kinase(p-ampk), phosphorylated-acetyl-coa carboxylase(p-acc), total AMPK, total ACC와 SREBP-1c, FAS, β-actin에대한일차항체는각각 Cell Signaling Technologies(Beverly, MA, USA) 와 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA) 에서, 2차항체인 anti-rabbit IgG conjugated horseradish peroxidase antibody는 Cell Signaling Technologies(Beverly,
Artemisia annua extract ameliorates fatty liver by activating AMPK 61 MA, USA) 에서구입하여사용하였다. 개똥쑥추출물 (Artemisia annua extract, AAE) 의제조개똥쑥은경남생약농업협동조합 (Sancheong, Korea) 에서국내산개똥쑥의지상부전초건조물을구입하였으며, 이를칭량및세척하고충분한양의정수를투입하여 85 ± 2 의조건에서 4시간동안환류추출한후, 10 μm 카트리지필터를이용하여추출물을여과한다음, 고형분함량이 25 ± 5% 가될때까지감압농축하였다. 농축액은살균과정을거친후수분측정기로정확한고형분함량을측정한다음, 냉장보관하면서실험에사용하였다. 고지방식이 (High-fat diet, HFD) 로유도한지방간마우스모델시험개똥쑥추출물 (AAE) 의고지방식이에따른지방간개선효능을확인하기위하여한국국제대학교연구윤리위원회의승인 (IUK-M-1301/01) 을받아동물실험을진행하였다. ICR 수컷마우스 (20 25 g), 6주령을 SAMTAKO (Osan, Korea) 에서 15두를구입하여 1주동안고형사료와물을자유롭게섭취시키면서일정한습도 (60 ± 5%) 와일정한온도 (22 ± 2 ) 및 12시간주기로명암이조절되는실험환경에 1주간적응시켰다. 1주일동안적응기간을거친후, 마우스는난괴법에따라정상군 (normal diet, ND), 고지방식이대조군 (HFD), 개똥쑥추출물 (AAE) 투여군 (HFD + AAE) 의총 3군 ( 군당 5수 ) 으로나눈다음, 8주간일반식이또는고지방식이를급이하면서사육하였다. 고지방식이는 Research Diets(New Brunswick, NJ, USA) 의 45% high-fat diet(d12451) 를구입하여사용하였다. AAE 투여군의경우 8주간 1일 1회씩 50 mg/kg의용량으로마우스당 0.1 ml의 AAE를경구투여하였으며, 정상군과고지방식이대조군은 AAE 대신동일한양의생리식염수를투여하였다. 전실험기간에걸쳐물과식이는제한없이공급하였고, 사육실온도는 22 ± 2 로유지하였으며, 조명은 12시간주기 (08:00 20:00) 로조절하였다. 또, 8주의실험기간동안매주 1회씩체중과사료섭취량을측정하였으며, 57일째에동물을치사시켜혈액을채취하고간조직및지방조직을분리하여무게를측정한다음, 혈청생화학적, 분자생물학적분석및조직학적분석에사용하였다. 혈청생화학적분석사육이끝난실험동물로부터채취한혈액은혈청분리용원심분리관 (BD vaccutainer, USA) 에넣어실온에 30분간방치한다음, 원심분리 (4,000 rpm, 15 min) 과정을거쳐 혈청을분리하였다. 분리한혈청은초저온냉동고 ( 80 ) 에서보관한후혈청생화학적분석에사용하였다. 혈청내의중성지방 (triglycerides), 총콜레스테롤 (total cholesterol, TC) 농도는 Asan Pharma(Seoul, Korea) 의 assay kit로분석하였고, ALT, AST 및 glucose는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) 의 assay kit를사용하여측정하였다. Hematoxylin & Eosin(H&E) 염색을이용한조직학적분석실험동물로부터얻은간조직시료를 4% 의 paraformaldehyde에서 24시간동안고정한다음, 수세-탈수-투명-파라핀침투-포매의조직처리과정을거쳐 5 μm의조직절편슬라이드를제작한뒤 H&E(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 로염색하고이를광학현미경 (Axiovert 200M microscope, magnification 200; Carl Zeiss, Jena, Germany) 으로관찰하였다. 현미경으로관찰된간조직의변화는조직의지방증및염증정도에따라다음과같이점수화하였다 (0 = no steatosis; 1 = minimal steatosis; 2 = slight steatosis; 3 = moderate steatosis; 4 = marked steatosis; 5 = severe steatosis). 세포배양및세포독성시험인간간암세포인 HepG2 세포주는 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA) 로부터분양을받아사용하였다. HepG2 세포는 10% FBS과 1% penicillin-streptomycin가첨가된 DMEM 배지를이용하여 37, 5% CO 2 조건에서배양하였다. 이때일반적인배양조건에서는 5.5 mm D-glucose(Sigma Chemical, USA) 를배지에첨가하였고, 지방증 (steatosis) 을유도하기위한 high glucose 배양조건에서는 30 mm D-glucose를사용하였다. HepG2 세포에서배양조건에따른 AAE의세포독성을평가하기위해 MTT assay를시행하였다. HepG2 세포를 96-well plate에 1 10 4 cells/well의밀도로분주하고, 24시간동안안정화를시킨다음, 5.5 mm 또는 30 mm의 D-glucose를함유한 serum free media에 AAE를여러가지농도 (0, 10, 100, 250, 500 μg/ml) 로희석하여처리한뒤, 다시 24시간동안배양하였다. 배양이끝난후각 well에 MTT 500 μg/ml를 4시간동안처리한다음, 세포들이생성한 formazan crystal을 DMSO를사용하여용해하고, 그발색정도를정량하기위해 570 nm에서흡광도 (absorbance) 를측정하였다. High glucose로지방증을유도한 HepG2 세포시험간세포에지방증 (steatosis) 을유도하기위해 Kuo 등의
62 Su-Jin Park et al. 방법에따라 HpeG2 세포를 24 well plate에 1 10 5 cells/well의밀도로분주하고, 24시간동안안정화한다음, 5.5 mm 또는 30 mm D-glucose를함유한 serum free media에 AAE를 0, 10, 30, 100 μg/ml 농도로희석하여처리한후 24시간동안세포를배양하였다 [28]. 한편, AAE의작용이 AMPK 활성에의존적인지를확인하기위하여 HepG2 세포를위와동일한방법으로분주하여안정화한다음, AMPKI인 compound C(10 μm) 를 1시간동안처리한후 AAE를 30 mm D-glucose가함유된 serum free media에희석하여 100 μg/ml로처리하고, 24 시간동안배양하였다. 이후각각의실험에서획득한 HepG2 세포를이용하여 AAE가간세포의지방증에미치는영향을관찰하였다. Nile red binding assay 일반또는 high glucose 배양조건에서 AAE를 0, 10, 30, 100 μg/ml로 24시간동안처리한 HepG2 세포를상온에서 4% paraformaldehyde로 15분간고정한다음, PBS로세척하고, 1 μg/ml의 Nile red solution(sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA) 을 37 에서 90분간반응시켜세포내중성지방을염색하였다. 염색된세포는광학현미경으로촬영을하였고, Nile Red fluorescence의강도는 microplate fluorescence reader(varioskan, Thermo Electron, Vantaa, Finland) 를이용하여정량적으로측정하였다 (emission = 530 nm, excitation = 485 nm). 간세포내중성지방및총콜레스테롤측정상기실험에서얻어진 HepG2 세포에 protease inhibitor 와 phosphatase inhibitor를포함하는 RIPA buffer(abcam, Cambridge, UK) 를넣어균질화한다음, 이를원심분리 (12,000 g, 10 min, 4 ) 하여상층액을취하고 bicinchoninic acid(bca) 법으로 cell lysate의총단백질량을측정하였다. 측정된단백질량을기준으로 cell lysate의농도를동일하게맞춘후, Asan Pharm(Seoul, Korea) 의 assay kit 를이용하여간세포내중성지방및총콜레스테롤양을분석하였다. Western blot analysis 고지방식이를급이한실험동물및 HepG2 세포의지질대사관련유전자들의발현을확인하기위해동물의간조직및세포를 RIPA buffer로균질화하여상기와동일한방법으로 cell lysate를획득하였다. 단백질농도를동일하게맞춘 cell lysate에 sample buffer를혼합하여 100 에서 7분간가열하고, 이렇게준비된단백질시료를 10% SDS-PAGE로전기영동한후, polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane에옮기고 5% bovine serum albumin 를함유한 tris-buffered saline(tbs) 를사용하여 1시간동안 blocking하였다. 이후 p-ampk, total AMPK, p-acc, total ACC, FAS, SREBP-1c 및 β-actin 단백질에상응하는각각의 1차및 2차항체를순차적으로반응시킨다음, membrane을세척하고, ECL 용액으로 X-ray 필름에감광을시킨다음, 발색된밴드의강도를 Chemidoc(Bio-rad, USA) 으로분석하였다. 통계분석모든실험은최소 3회이상반복실시하였고, 실험결과는 mean ± S.D. 로표시하였으며, one-way ANOVA test와 Student s T-test를실시하여 p값이 0.05 이하인경우에만통계학적인유의성이있는것으로간주하였다. Results 고지방식이유도지방간마우스모델에서체중, 조직무게및혈청지방수준에대한 AAE의효과고지방식이를마우스에게 8주간급이하여체내지방축적을유도한고지방식이대조군 (HFD) 의경우, 일반식이를섭취한정상군 (ND) 대비약 41% 정도유의하게체중이증가되어 44.04 ± 3.7 g을기록한반면 (p<005), AAE 를 50 mg/kg으로투여한군 (HFD + AAE) 에서는약 20% 의유의한체중감소를보였다 (Fig. 1A, p<0.05). 또, 8주간의투여가종료된후간과지방조직을적출하여무게를측정한결과, 고지방식이대조군에서정상군보다약 60% 와 170% 이상간과지방조직무게가유의하게증가된것을확인할수있었다 (p<0.05). 그러나, 이러한고지방식이대조군에비해 AAE 투여군의경우간무게는약 22%, 지방조직무게는약 28% 정도가유의하게감소되어 (p<0.05, p<0.05) AAE가고지방식이에의한체중증가뿐아니라, 간과지방조직의비대역시의미있는수준으로억제하고있음을보여주었다 (Fig. 1B, 1C). 이러한체중및지방의증가조절과더불어 AAE의섭취가혈청내중성지방, 총콜레스테롤및포도당농도변화에미치는영향을확인하기위해혈청생화학적검사를실시한결과, Fig. 1D에서와같이고지방식이대조군의혈청중성지방은정상군대비약 222% 증가된 119.8 ± 8.37 mg/dl로측정된반면 (p<0.05), AAE 투여군은고지방식이대조군대비약 33% 감소된수치를나타냈다 (p<0.05). 중성지방과함께체내지방축적의중요한지표중하나인총콜레스테롤의경우, 고지방식이대조군에
Artemisia annua extract ameliorates fatty liver by activating AMPK 63 서정상군보다약 245% 이상높은총콜레스테롤이확인되었으나 (p<0.05), 이러한총콜레스테롤의증가는 AAE 섭취에의해약 54% 정도유의하게억제되었으며 (Fig. 1E, p<0.05), 중성지방및총콜레스테롤에대한 AAE의감소효과는공복혈당농도측정에서도동일하게관찰되었다 (Fig. 1F, p<0.05). AAE에의한간조직의지방증 (steatosis) 조절 8주간의투여종료후마우스의간조직을채취하여 H&E로염색하고, 염색된조직을현미경으로관찰한결과, 정상군의간조직은지방축적이나이로인한염증반응이거의나타나지않았으나, 고지방식이대조군은간에지방증이뚜렷하게나타난것을확인할수있었다. 이와달리 AAE 투여군의경우정상군과유사한수준의조직학적소견을보였을뿐아니라, steatosis score에서도고지방식이대조군대비 43% 가까이수치를감소시켜통계학적으로유의한지방증감소효과를나타냈다 (Fig. 2A, p<0.05). Fig. 1. AAE attenuates high-fat diet (HFD)-induced obesity and its related biochemical markers in mice. HFD-fed ICR mice were orally administrated with 50 mg/kg/day of AAE for 8 weeks (HFD + AAE). As a control, mice fed with ND or HFD were administered with an equal volume of saline. Eight weeks later, changes in body (A), liver (B) and fat pad weight (C) and the serum levels of triglyceride (D), total cholesterol (E) and glucose (F) were measured in mice. Data are expressed as mean ± S.D. (n = 5/group). # Significantly different from the ND group (p<0.05). * Significantly different from the HFD group (p<0.05). ND, normal diet; HFD, high-fat diet; AAE, Artemisia annua extract.
Su-Jin Park et al. 64 한편, 간의 지방증 발생 및 이로 인한 조직 손상의 지 지방 축적이 발생한 마우스에서는 대표적인 지방 합성 표로써 혈청 내 AST 및 ALT 수준을 분석한 결과는 Fig. 관련 유전자인 SREBP-1c 및 이로 인한 FAS 단백질의 2B와 같다. 고지방식이대조군의 혈청에서 AST는 정상군 발현이 유의하게 증가되었으나(p 0.05), AAE 투여군에 보다 2배 이상 상승된 69.9 ± 8.7 IU/L로 나타나 현저한 서는 이들 유전자의 발현이 통계학적으로 의미 있게 감 수준의 증가를 보였다. 반면, AAE 투여군의 경우 54.1 ± 소된 것으로 나타났다(Fig. 3A, p 0.05). 5.7 IU/L로 유의하게 감소하였다(p 0.05). 간 조직 외에 AAE에 의한 SREBP-1c 및 FAS의 발현 억제의 작용 심장이나 근육에서도 생산되는 AST와 달리 간 특이적인 기전을 확인하기 위해 이들 유전자의 상위 단계 조절 인 효소인 ALT의 경우, 고지방식이대조군의 혈청에서 48.6 자로 알려진 AMPK와 함께 AMPK에 의해 조절되는 또 ± 6.6 IU/L로 나타나 정상군에 비해 170% 이상 증가하 다른 지질 합성 관련 효소인 ACC의 인산화 수준을 확인 였으나(p<0.05), AAE를 8주간 투여한 마우스의 혈청에서 하였다. AMPK가 인산화되어 활성화되면 acetyl-coa를 는 약 30% 줄어든 33.8 ± 2.0 IU/L로 측정되어 유의한 malonyl-coa로 만드는 효소인 ACC는 반대로 인산화되 수준의 감소 효과를 보였다(p 0.05). 면서 불활성화되는데[9, 11], Fig. 3B에서와 같이 정상군 에 비해 고지방식이 대조군의 p-ampk와 p-acc는 유의 간의 지질대사 조절 인자에 대한 AAE의 영향 고지방식이로 지방증을 유도한 마우스에서 간의 지질 하게 감소된 반면(p 0.05), AAE 투여군의 p-ampk와 대사 조절에 관여하는 주요 인자에 대한 AAE의 영향을 나타났다(p 0.05). 이는 AAE가 인산화를 통해 AMPK를 평가하기 위해 간 조직으로부터 cell lysate를 얻은 다음, 활성화시킴으로써 ACC를 불활성화 시킴과 동시에 AMPK Western blot analysis를 실시하여 유전자의 활성화 또는 에 의해 조절되는 SREBP-1c, FAS 등의 유전자 발현을 발현 분석하였다. 정상군과 달리 고지방식이에 의해 간내 조절함으로써 간의 지질대사를 조절함을 시사한다. p-acc 발현은 모두 의미 있는 수준으로 증가된 것으로 Fig. 2. AAE alleviates hepatic steatosis in HFD-fed mice. After 8 weeks, histological images of H&E-stained sections obtained from liver and scores for hepatic steatosis and inflammation (A) were analyzed and the serum levels of ALT and AST (B) were detected in ND or HFD-fed mice. Data are expressed as mean ± S.D. (n = 5/group). #Significantly different from the ND group (p<0.05). * Significantly different from the HFD group (p<0.05). ND, normal diet; HFD, high-fat diet; AAE, Artemisia annua extract; ALT, alanine aminotransferase; AST, aspartate aminotransferase.
Artemisia annua extract ameliorates fatty liver by activating AMPK 65 Fig. 3. AAE reduces the expression of FAS and SREBP-1c and promotes the phosphorylation of AMPK and ACC in HFD-fed mice. The expression of FAS and SREBP-1c (A) and the phosphorylation of AMPK and ACC (B) were analyzed in the lysates of liver tissues from ND or HFD-fed mice using Western blotting. β-actin was used as a loading control. Densitometry ratios of FAS, SREBP-1c, p-ampkα, and p-acc were normalized to the corresponding β-actin band. # Significantly different from the ND group (p<0.05). * Significantly different from the HFD group (p<0.05). ND, normal diet; HFD, high-fat diet; AAE, Artemisia annua extract; FAS, fatty acid synthase; SREBP, sterol regulatory element-binding protein; AMPK, AMP-activated protein kinase; ACC, acetyl- CoA carboxylase. AAE의간세포지방축적억제효과고지방식이로지방간을유도한마우스모델시험에서나타난 AAE의생체내지방축적억제및간내지질대사조절효과를세포수준에서한번더확인하기위해인간간암세포인 HepG2 세포에 high glucose로지방증을유도하면서 AAE를농도별로처리하여지방축적정도및지질합성관련유전자의발현을확인하였다. AAE의처리농도는 MTT assay를통해세포독성이없는범위내에서결정하였다 (data not shown). HepG2 세포에 30 mm D-glucose를가하여지방축적을유도하면서 AAE 를 0, 10, 30 및 100 μg/ml로처리하여배양한후, 세포내지방축적정도를 Nile red fluorescence 측정을통해확인한결과, 30 mm D-glucose를처리한세포의지방축적정도는정상세포대비 2.5배가까이증가되었으나, AAE를처리한세포에서는그축적정도가농도의존적으로감소되는경향을보였으며, 특히 30 μg/ml과 100 μg/ ml 처리군에서통계학적으로유의한수준의감소효과를보였다 (Fig. 4A, p<0.05). 이러한결과는 HepG2 세포내중성지방과총콜레스테롤농도를측정했을때에도동일한경향으로나타나 AAE 30 μg/ml와 100 μg/ml 처리군에서중성지방과총콜레스테롤이모두 p<0.05 수준으로유의하게억제되었다 (Fig. 4B). 한편, AAE에의한간세포내중성지방및총콜레스테롤의감소가고지방식이유도지방간마우스에서와마찬가지로 FAS나 SREBP-1c의발현조절에따른것인지를관찰하기위해 HepG2 세포의 cell lysate를이용하여 Western blot analysis를수행한결과, high glucose 처리에의해증가된이들유전자의단백질발현이 AAE에의해농도의존적으로유의하게감소됨을확인하였다 (Fig. 4C, p <0.05). 또, AAE에의한 FAS 및 SREBP-1c의발현감소가앞서지방간마우스의간조직에서확인된것처럼 AMPK나 ACC의활성조절에의한것인지를일반조건
66 Su-Jin Park et al. Fig. 4. AAE decreases high glucose-induced lipid accumulation in HepG2 cells via the activation of AMPK and the regulation of lipogenic genes. HepG2 cells were incubated in serum-free media containing normal (5.5 mm) or high (30 mm) glucose concentrations in the absence or presence of AAE (10, 30, and 100 μg/ml) for 24 hours. Intracellular lipids were stained with Nile red solution and assessed by fluorescence intensity (A). The levels of hepatic triglycerides and total cholesterol (B) were measured using commercial assay kits, and the expression of FAS and SREBP-1c (C) and the phosphorylation of AMPK and ACC (D) were detected in the cell lysates by Western blot analysis. Densitometry ratios of FAS, SREBP-1c, p-ampkα, and p-acc were normalized to the corresponding β-actin band. # Significantly different from normal glucose-treated cells (p<0.05). * Significantly different from high glucose-treated cells (p<0.05). AAE, Artemisia annua extract; FAS, fatty acid synthase; SREBP, sterol regulatory element-binding protein; AMPK, AMP-activated protein kinase; ACC, acetyl-coa carboxylase. 으로배양한 HepG2에서확인한결과, AAE는 Fig. 4D 에서와같이정상세포대비 AMPK 및 ACC의인산화를농도의존적으로증가시켰으며, 이를인산화비율로표시했을때 AAE 30 μg/ml와 100 μg/ml 처리군에서 p<0.05 수준으로유의한증가효과를보여 AAE가 AMPK의활성화와이를통한 ACC의불활성화를통해 간세포의지질대사를조절할수있음을보여주었다. AAE의 AMPK 의존적지방축적억제효과고지방식이로지방간을유도한마우스및간세포에서확인된 AAE의 AMPK 활성화및이로인한지방합성관련유전자의조절과간조직또는간세포내지방축적
Artemisia annua extract ameliorates fatty liver by activating AMPK 67 Fig. 5. AAE downregulates the lipid contents of hepatocytes and the cellular expression of FAS and SREBP-1c induced by high glucose in an AMPK-dependent manner. HepG2 cells were treated with the AMPK inhibitor (AMPKI), compound C (10 μm), in serum-free media for 1 hour, followed by incubation with or without 100 μg/ml AAE for an additional 24 hours. Lipid-bound Nile red fluorescence (A) was measured using a microplate fluorescence reader. The concentrations of hepatic triglyceride and total cholesterols were measured by commercial assay kits. Western blot analysis of FAS and SREBP-1c (C) was performed and β-actin was used as a loading control. Densitometry ratios of FAS and SREBP-1c were normalized to the corresponding β-actin band. # Significantly different from normal glucose-treated cells (p<0.05). * Significantly different from high glucose-treated cells (p<0.05). ** Significantly different from high glucose plus AAE-treated cells (p<0.01). AAE, Artemisia annua extract; FAS, fatty acid synthase; SREBP, sterol regulatory element-binding protein. 억제가 AMPK에의존적인효과인지살펴보기위해 high glucose 조건에서배양한 HepG2 세포에 AMPK 특이적인억제제인 compound C를처리하고, 1시간후 AAE를처리한다음, 세포내지방축적정도와함께 FAS, SREBP-1c의단백질발현을분석하였다. 우선세포내지방을 Nile red solution으로염색하고발광정도를측정한결과, high glucose에의해 2배이상증가된지방축적이 AAE에의해유의하게감소되는효과를보였으나 (p<0.05), AAE의이러한효과는 AMPK 억제제인 compound C 처리에의해상쇄되는것으로나타났다 (Fig. 5A, p<0.01). Compound C에의한 AAE의효과억제는세포내중성지방과총콜레스테롤농도를분석한결과에서도동일한양상으로나타나, AAE에의해감소된중성지방과총콜레스테롤수준이 compound C에의해다시회복되는결과를보여주었다 (Fig. 5B, p<0.05, p<0.01). 뿐만아니라, 지방합성을조절하는 FAS와 SREBP-1c 발현에있어서도 AAE가 high glucose에의해증가된이들단백질의생산을 p<0.05 수준으로유의하게감소시킨데반해, compound C를처리하여 AMPK의활성화를억제시킨경우에는 AAE가 FAS와 SREBP-1c의단백질발현을낮추지못함으로써두단백질의발현이다시의미있는증가를보이는것으로나타났다 (Fig. 5C, p<0.01). 이러한결과는 AAE가 AMPK에의존적으로지방합성관련유전자들을조절함으로써간조직및간세포내지방의합성및축적을억제함을시사한다. Discussion 비알코올성지방간질환 (NAFLD) 은과다한알코올섭취없이발생하는간의지방증 (hepatic steatosis) 을말하
68 Su-Jin Park et al. 며, 단순지방증 (simple steatosis), 지방간염 (steatohepatitis), 섬유화 (fibrosis) 및간경변 (cirrhosis) 을포함하는만성간질환으로서전세계적으로비만과제2형당뇨병의유병률이증가하면서 NAFLD 환자또한계속늘어나고있다 [29, 30]. 우리나라의경우, NAFLD 유병률이성인인구의 18% 를차지하는것으로보고되고있는데, 서구화된식습관과운동부족, 비만인구의증가등으로인해앞으로도우리나라의만성간질환유병율중 NAFLD가차지하는비중은계속증가할것으로예상된다 [31]. 현재전세계적으로 NAFLD에대해공인된치료제는없으며, 대부분의경우운동, 식이, 체중감량등생활습관의개선과함께증상에따라비만치료제, 인슐린저항성치료제 ( 글리타존류 ), 고지혈증치료제 ( 스타틴계열 ), 항산화제등을사용하는대증요법에의존하고있다 [32]. 이러한대증요법약물들중비알코올성지방간염환자를대상으로가장많이연구된약물은피오글리타존 (pioglitazone) 과비타민 E(vitamin E) 인데각각체내의인슐린민감도를개선시키고중성지방을감소시킨다거나, 간세포의풍선변성 (ballooning degeneration) 및염증에효과적이라는보고들이있으나, 그효과가부분적이고장기복용시안전성우려가있어사용이매우제한적인상황이다 [33 35]. 따라서이처럼명백한치료적한계가존재하는현재의상황을개선하기위해서는 NAFLD의출발점인지방증단계에서체내의지방합성및축적을억제하여지방간염으로진행하는것을막을수있는새로운개념의간질환개선제의개발이필요하다. 항말라리아제인아르테미시닌의주요공급원으로알려진개똥쑥은결핵, 학질등다양한질환에사용되어져온전통식물로서, 최근개똥쑥추출물을대상으로한다양한연구에서고지방식이에의해증가된마우스의체중, 체지방과함께인슐린저항성을감소시키고, 지방간형성및간조직의염증을억제할뿐아니라, CCl 4 를처리한 HepG2 세포의 ALT, AST의상승을방지함으로써지방간억제및간손상보호효과가있음이확인되었다 [25 27]. 이를토대로본연구에서는고지방식이로지방간을유도한마우스에개똥쑥추출물 (AAE) 을 8주간경구투여한후, 체중, 체지방의증가와함께간조직의지방축적및이를조절하는유전자로써 AMPK, ACC, FAS, SREBP- 1c의활성화또는발현을측정하였다. 그결과, AAE는고지방식이에의해증가된체중및간과지방조직의무게를감소시켰고, 혈청중성지방및총콜레스테롤의농도를낮췄을뿐아니라, 간조직의지방축적및이로인한 AST, ALT의증가를유의적으로억제하였다. AAE에의한간조직의지방축적억제기전을확인하기위해생 체내지방합성의핵심조절인자인 AMPK의인산화및 AMPK에의해조절되는 ACC, FAS, SREBP-1c를분석한결과, AAE가 AMPK의인산화를촉진함으로써지방합성에관련된유전자인 ACC를불활성화시키고, FAS 및 SREBP-1c의발현을억제함을확인할수있었다. 뿐만아니라, 고지방식이로유도한지방간마우스모델시험에서확인된 AAE의이러한효과가세포수준에서도재현되는지확인하기위해 high glucose로지방증을유도한 HepG2 세포에 AAE를처리하여이들유전자의활성화또는발현에대한영향을평가한결과에서도 AAE는 AMPK를활성화시켜 SREBP-1c의발현을감소시켰으며, ACC를불활성화시키고, FAS의발현을낮춤으로써간세포내중성지방과총콜레스테롤을포함한지방축적을억제하였다. AMPK는세포내의에너지항상성유지에센서역할을하는효소로서세포내에너지가감소하는경우, 즉 ATP가고갈되는경우활성화되어 ATP를소비하는지방산합성과콜레스테롤합성등을억제하고, ATP를생산하는지방산산화와해당과정등을촉진함으로써지방및탄수화물대사조절에중요한역할을한다 [36 38]. AMPK의활성화로인한효과는에너지대사조절을담당하는간, 근육, 지방, 췌장등표적장기와밀접하게관련되어있는데, 특히간에서 AMPK가활성화되면지방산과콜레스테롤의합성이억제되고지방산의산화가촉진되기때문에이러한 AMPK의조절이지방간질환을치료하는데있어중요한표적으로여겨지고있다 [39]. Malonyl-CoA를합성하는 ACC 효소는미토콘드리아의지방산산화에대한잠재적인억제자로작용하는데, AMPK 활성화에의한 ACC의인산화, 즉 ACC의불활성화는 malonyl-coa의농도저하를초래하고 carnitine palmitoyltransferase-1(cpt-1) 의활성도를증가시켜지방산의산화를증가시킨다 [40]. SREBP-1은간에서지질을합성하는유전자들을조절하는주요전사인자로서 AMPK 에의해발현이조절되는데, SREBP-1이증가되면 ACC, FAS 및 stearoyl-coa desaturase-1(scd-1) 과같은유전자들의발현이유도되어간내지방합성및축적이촉진된다 [41]. AMPK와지방합성관련유전자들의이러한상호작용을고려할때, AAE에의한 AMPK의활성화는 SREBP- 1c의발현을억제시킴으로써 ACC를불활성화시켜 malonyl- CoA의농도를낮추고, FAS를감소시켜지방산의합성을방지함으로써간조직의지방축적을억제하는것으로판단된다. 한편, 지방증이유도된마우스와간세포에서확인된 AAE의 AMPK 활성화및이로인한지방합성
Artemisia annua extract ameliorates fatty liver by activating AMPK 69 관련유전자의조절및지방축적억제효과가 AMPK에의존적인현상인지확인하기위해 high glucose를처리하여지방증을유도한 HepG2 세포에 AMPK 특이적인억제제인 compound C를처리하고나서 AAE를처리하여배양한다음, FAS, SREBP-1c의단백질발현과함께세포내지질축적정도를분석한결과, compound C가 high glucose 처리에의해증가된 FAS와 SREBP-1c의발현을낮추는 AAE의효과를상쇄시킬뿐아니라, 이로인한중성지방및총콜레스테롤생산에도영향을미쳐 AAE의간세포내지질축적억제효과도약화시키는것으로나타났다. AMPK 활성화억제에따른이러한결과는 AMPK가간세포내지질축적에관여하는유전자들의조절에핵심인자로작용하며, AAE가이러한 AMPK에의존적인방식으로지질대사관련유전자들의활성화또는발현을조절함으로써간세포, 나아가간조직의지방증억제에효과적으로작용할수있음을시사한다. 다만, 세포및생체수준에서확인된개똥쑥추출물의뚜렷한지방간개선효과에도불구하고, 이러한효과를나타내는유효성분에대한연구는아직까지미미한수준에머무르고있는데, 비록최근에발표된 Rho 등의연구를통해개똥쑥열탕추출물에 1,3-di-O-caffeoylqunic acid, 3,4-di-O-caffeoylquinic acid, 3,5-di-O-caffeoylqiunic acid, 1,5-di-O-caffeoylquinic acid, 4,5-di-O-caffeoylquinic acid 및 scopoletin이함유되어있음이밝혀졌으나 [42], 이들각성분이개똥쑥추출물의지방간개선에있어어떠한역할을하는지추가적인연구가필요한실정이다. 이상의내용을종합할때, 개똥쑥추출물은간의지방증을포함한비알코올성지방간질환의예방을위한신규건강기능식품의기능성원료는물론, 비알코올성지방간염치료를위한의약품의후보물질로서충분한가치를가지며, 향후유효성분규명및이들성분의작용기전확인을통하여최종제품개발및상용화가능성제고에기여할수있을것으로사료된다. Acknowledgements 이논문은 2013년도정부 ( 농림수산식품부 ) 의재원으로농림수산식품기술기획평가원-생명산업기술개발사업의지원을받아수행된연구임 (No. 112032-1). ORCID Su-Jin Park, https://orcid.org/0000-0002-2693-3664 Chul Yung Choi, https://orcid.org/0000-0003-2006-635x Jae-Cheon Jeong, https://orcid.org/0000-0003-3526-3575 Rok-Kyoung Lee, https://orcid.org/0000-0001-5516-7682 Yong Pil Hwang, https://orcid.org/0000-0002-0671-4181 References 1. Younossi ZM, Golabi P, de Avila L, Paik JM, Srishord M, Fukui N, Qiu Y, Burns L, Afendy A, Nader F. The global epidemiology of NAFLD and NASH in patients with type 2 diabetes: a systematic review and meta-analysis. J Hepatol 2019;71:793-801. 2. Moore JB. From sugar to liver fat and public health: systems biology driven studies in understanding non-alcoholic fatty liver disease pathogenesis. Proc Nutr Soc 2019;78:290-304. 3. Ratziu V, Goodman Z, Sanyal A. Current efforts and trends in the treatment of NASH. J Hepatol 2015;62:S65-S75. 4. Golabi P, Bush H, Younossi ZM. Treatment strategies for nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis. Clin Liver Dis 2017;21:739-753. 5. Kotronen A, Peltonen M, Hakkarainen A, Sevastianova K, Bergholm R, Johansson LM, Lundbom N, Rissanen A, Ridderstråle M, Groop L. Prediction of non-alcoholic fatty liver disease and liver fat using metabolic and genetic factors. Gastroenterology 2009;137:865-872. 6. Chalasani N, Younossi Z, Lavine JE, Diehl AM, Brunt EM, Cusi K. The diagnosis and management of non-alcoholic fatty liver disease: practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases, American College of Gastroenterology, and the American Gastroenterological Association. Hepatology 2012;55:2005-2023. 7. Brown MS, Goldstein JL. The SREBP pathway: regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription factor. Cell 1997;89:331-340. 8. Foretz M, Carling D, Guichard C, Ferre P, Foufelle F. AMPactivated protein kinase inhibits the glucose-activated expression of fatty acid synthase gene in rat hepatocytes. J Biol Chem 1998;273:14767-14771. 9. Woods A, Azzout-Marniche D, Foretz M, Stein SC, Lemarchand P, Ferre P, Foufelle F, Carling D. Characterization of the role of AMP-activated protein kinase in the regulation of glucose-activated gene expression using constitutively active and dominant negative forms of the kinase. Mol Cell Biol 2000;20:6704-6711. 10. Zhou G, Myers R, Li Y, Chen Y, Shen X, Fenyk-Melody J, Wu M, Ventre J, Doebber T, Fujii N, Musi N, Hirshman MF, Goodyear LJ, Moller DE. Role of AMP-activated protein kinase in mechanism of metformin action. J Clin Investig 2001;108:1167-1174.
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