Korean Chem. Eng. Res., 52(1), 98-105 (2014) http://dx.doi.org/10.9713/kcer.2014.52.1.98 PISSN 0304-128X, EISSN 2233-9558 이온교환크로마토그래피에서라이소자임분리에미치는 ph 와온도영향 고관영 김인호 충남대학교화학공학과 305-764 대전광역시유성구궁동 220 (2013 년 9 월 6 일접수, 2013 년 10 월 10 일수정본접수, 2013 년 10 월 17 일채택 ) The Effect of ph and Temperature on Lysozyme Separation in Ion-exchange Chromatography Kwan-Young Ko and In-Ho Kim Department of Chemical Engineering, Chungnam National University, 220 Gung-dong, Yuseong-gu, Daejeon 305-764, Korea (Received 6 September 2013; Received in revised form 10 October 2013; accepted 17 October 2013) 요 약 라이소자임은용균작용, 조직회복과정의촉진등의작용을하며난백중에 0.3% 함유되어있다. 난백에서라이소자임을분리하는방법으로친화성크로마토그래피, 이온교환크로마토그래피, 한외여과법등이있는데이중이온교환크로마토그래피가가장많이사용된다. 라이소자임을양이온젤이충전된유리칼럼에서분리 정제할때최적의 ph 와온도조건을찾는것을실험목표로하고, ASPEN Chromatography 전산모사의결과와비교하였다. 실험에사용되는완충용액은인산완충용액이었고 ph 를 5~8 로변화를주어상온에서실험하였고, 가장분리가잘이루어진 ph 에서온도를 5 o C 간격으로 25~40 o C 로변화시켜실험하였다. RP-HPLC (Reversed phase High Performance Liquid Chromatography) 분석을통해라이소자임의체류시간을확인하였고, OriginPro 8 을이용해용출단계에서크로마토그램의면적을비교하여라이소자임의양을정량분석하였다. 결과를분석한결과, ph 5 일때, 온도가 25 o C 에서가장많은양의라이소자임이분리되었다. Abstract Lysozyme amounts to 0.3% in egg white and functions as an agent of cell lysis and activator of tissue reconstruction. Ion exchange chromatography is the most useful method of separation among affinity chromatography, ion exchange chromatography, and ultra-filtration. The aim of present study is to find the optimum ph and temperature for the separation of lysozyme in egg white within cation exchange gel filled glass column. And we compared results of experiments with those of simulations. Phosphate buffer was used, and ph and temperature were varied as 5~7 and 25~40 o C respectively. RP-HPLC was the tool for the retention time identification and quantitative analysis of lysozyme. OriginPro 8 measured the peak area of lysozyme chromatogram and quantified the eluted lysozyme. Largest amount of lysozyme was separated under the conditions of ph 5 and T 25 o C. Key words: Lysozyme, Ion Exchange Chromatography, Aspen Simulation 1. 서론 라이소자임은박테리아세포벽의주요구성성분인 mucopolysaccaride 의 n-acetylglucosamine과 muramic acid 사이에연결되어있는 β- 결합을가수분해시키는효소로서 Fleming에의해최초로발견되었다 [1]. 라이소자임은 129개의아미노산으로이루어져있으며, 단량체의형태에는네개의 disulfate 결합이있다. 이결합이라이소자임 To whom correspondence should be addressed. E-mail: ihkim@cnu.ac.kr This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/bync/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 의나선형을구조를형성한다 (~30% α-helix; ~6% β-sheet)[2]. 또한라이소자임은열에대해안정하고, 미생물용균작용뿐만아니라면역증강, 항생물질의작용증강, 조직회복촉진등의다양한작용을한다 [3]. 이특징으로인해라이소자임은효소제로사용되거나궤양, 감염, 상처의치료에도사용되고, 유화제항생제등과같이의약품으로사용된다 [4]. 또한소시지, 치즈등에첨가되는등식품첨가제로사용되며, 펩신에의한우유단백질의분해를촉진시키는기능을갖고있어분유에첨가되기도한다 [5]. 라이소자임은동물의조직, 체액, 식물및미생물등에널리분포되어있지만, 난백중에함량이 0.3% 로가장높다. 계란난백은라이소자임을함유한동물이나식물에비하여분리가용이하며, 추출조작이비교적용이하기때문에추출원료로가장적합한것으로알려 98
이온교환크로마토그래피에서라이소자임분리에미치는 ph 와온도영향 99 져있다 [6]. 난백으로부터라이소자임을추출은 Alderton 등이 5% 소금첨가와 ph 9.5에서직접결정법을성공했고, 그후 Alderton과 Fevold는 5% NaCl과여러종류의산첨가로직접결정법을개선시켰다 [1]. 이와같은방법은나머지계란난백단백질을활용할수없고라이소자임분리의수율과순도가낮은결함이있기때문에친화성크로마토그래피, 이온교환크로마토그래피, 한외여과법 (ultra filtration) 등을시도하게되었다. 친화성크로마토그래피법은친화성물질이고가이므로산업적으로이용하기엔불리하며한외여과법은수율이현저하게떨어지며수율을높이기위해서는요소나 pronase 같은화학물질을첨가해야하는문제점이있다 [7]. 이방법이외에시도한다른방법은이온교환크로마토그래피이다. 이온교환크로마토그래피의경우다른방법들에비해분리된라이소자임의순도가높다. 그래서산업분야에서는염석효과와이온교환크로마토그래피를결합시켜라이소자임을추출해내는데사용한다. 또한, 분리후나머지난백단백질의재활용이가능하다 [7,8]. 이러한이온교환크로마토그래피중라이소자임을분리하는데있어가장많이사용하는방법은양이온교환수지를이용하는방법이다. 양이온교환수지란표면이음전하물질로코팅되어양이온을흡착하는고분자담체이다. 단백질정제에가장널리이용되는교환체로는 carboxymethly cellulose(cm-cellulose) 가있다. 이교환체는 cellulose의히드록시기에 carboxymethyl기 (-CH3COO-) 가부가된구조를가져음전하를띄게되어양전하를가진단백질분자를흡착한다 [3]. 이온교환크로마토그래피로라이소자임의분리에대한연구는 Lee 등 [1] 이이온교환수지를바꾸어실험하고라이소자임의분리정도를알아본연구와 Kim 등 [3] 이 simulation 을통하여 NaCl 농도와 ph에따른분리정도를확인한연구가있다. 그리고 Huh 등 [6] 이이온교환크로마토그래피를반복적으로사용하여사용횟수를측정하고전기영동으로분석한연구도있다. 칼럼의온도변화에따라시료의고정상과의친화도를알아보기위한열역학적매개변수는다음과같은식을이용해구했다 [9]. ΔH lnk ------- 1 ΔS = -- + ------ R T R k' 는 ΔH, R, ΔS 및 T는각각용량인자, 엔탈피, 기체상수, 엔트로피및절대온도이다. 용량인자는시료와컬럼간의상호작용을나타내는값으로써다음식으로정의된다. t k R t = ------------ 0 t 0 t R 은피크의체류시간이며, t 0 는용질이고정상과상호작용을하지않고칼럼을통과하는시간을의미한다. 전산모사는모든기술적분야에서각광받고있는분야이다. 전산모사는주로수치해석법으로복잡한문제를해결하고, 시스템에대해다양한시각을갖게해준다. 또한, 전산모사는실제로실험을하지않고도여러조건에서의결과를빠르게도출할수있기때문에최적의분리조건을간편하게얻을수있고, 각각의경우에맞게알고리즘이나방정식을선택하여사용할수있다. 자주사용되는전산모사프로그램에는 MATLAB, C++, Python, COMSOL, ASPEN 등여러가지프로그램이있다 [10]. 이번연구에사용한프로그램은 ASPEN Choromatography이며, 이온교환크로마토그래피에설정된등온흡착 (1) (2) 식은 Mass Action Equilibrium, Yamamoto, Extended Langmuir, Extended Langmuir 2 and Counter-Ion Dependent, Extended Langmuir-Freundlich, User Procedure, User Submodel이있다. 이번실험의전산모사에사용한등온흡착식은 Yamamoto이다. 이방정식은이온교환크로마토그래피에적합한방정식으로알려져있으며, (3) 식과같다 [11,12]. IP w k = ( IP 1k + IP 2k c 3k b )ck 식에서 w k 는고정상에흡착된 k성분의농도, c k 는이동상에서 k성분의농도, c b 는 counter-ion의농도, IP 1, IP 2, IP 3 는 k성분에대한등 IP 온매개변수이다. (3) 식에서 (IP 1k +IP 2k c 3k b ) 항은 w k 와 c k 사이의비례상수이며, 흡착에대한분배계수 (m) 이다. 분배계수는이온강도에대한함수이며, 이온의세기가클수록분배계수값은작아진다 [11]. 본연구에서는이온교환크로마토그래피를이용하여난백에포함되어있는라이소자임을분리정제할때가장최적의조건을찾는것을목표로실험을수행하였다. 완충용액의 ph를 5~8로변화를주어최적의 ph를찾고, 온도를 5 o C 간격 25~40 o C로변화시켜라이소자임분리에미치는영향을확인하고, 위의조건에맞춰전산모사를수행하고, 두결과를비교해보았다. 2. 실험및전산모사 2-1. 실험재료및시약실험에사용된재료는계란의난백을건조시킨난백파우더를증류수로희석하여시료로사용하였다. 완충용액은 0.02 M 인산나트륨 (Sigma-Aldrich, USA) 용액을 ph 5, 6, 7, 8로각각제조하여사용하였다. 용리용액은 1.0 M 염화나트륨 (Sigma-Aldrich, USA) 용액이포함된 0.02 M 인산 (Sigma-Aldrich, USA) 용액을사용하였다. 양이온교환수지는 CM Excellose겔 (Bioprogen, Korea) 을사용하였다. RP-HPLC 실험에서는 Acetonitrile(J. T. Baker, USA) 과증류수를 1:1의부피비로혼합하여이동상으로사용하였고, 이동상을여과하기위해막필터 (GVPP, Millipore, USA) 를사용하였다. 2-2. 시료전처리방법실험에사용되는시료를만들기위해먼저난백파우더 5 g을증류수 1,000 ml에희석시켰다. 그리고희석된용액에서 500 ml를추출하여 15,000 rpm 원심분리기로 210초동안원심분리시키고, 원심분리된용액을거름종이를이용하여불순물들을걸러내고시료로사용하였다. 2-3. 실험기기및장치원심분리기는 Centrifuge 5412(Eppendorf, Germany) 를사용하였다. 용리, 완충용액을흘리기위한펌프로 P-500(Phamarcia, USA) 사용하였고, Liquid chromatography controller LCC-500(Phamarcia, USA) 로유량을조절하였다. 그리고시료주입은펌프 P-50(Phamarcia, USA) 로하였다. 칼럼은유리칼럼 (15 mm ID 250 mm L, Phamarcia USA) 을사용하였다. 검출기는 UV 검출기 UV-1(Phamarcia, USA) 을사용하였다. 용출단계에서용액을모으기위하여 fraction collector (Model 2110 Fraction Collector, BIO-RAD, USA) 를사용하였고, UV 검출기에서흡광도를측정하여전기적신호로바꾸어주기위하여데이터수집기와소프트웨어 (Autochro 2000, Younglin, Korea) 를 (3)
100 고관영 김인호 Table 1. Experimental conditions of ion exchange chromatography Resin bed volume 8.8 ml Flow rate and time 1) equilibration 4.5 ml/min for 10 min (45 ml) 2) sample loading 2 ml/min for 15 min (30 ml) 3) washing 4.5 ml/min for 10 min (45 ml) 4) elution 2 ml/min for 15 min (30 ml) Equilibration and washing buffer 0.02 M Sodium phosphate buffer (ph 5.0~8.0) Elution buffer 0.02 M Sodium phosphate buffer (ph 5.0~8.0) with 1.0 M Sodium chloride 사용하였다. 온도를변화시키기위해항온조 (Cole-Parmer Polystat, USA) 를사용하였다. Fraction collector로모은샘플의흡광도측정은분광광도계 (Series1000, Cecil, UK) 를사용하였다. 전산모사는 Aspen Chromatography(ver.2006, Aspen Tech., USA) 프로그램을사용하였다. 2-4. 실험방법라이소자임정제실험을위해양이온교환크로마토그래피의평형, 시료주입, 세척, 용리의순서로수행하였다. 크로마토그래피실험조건은 Table 1과같고, 이실험조건에따라유량과시간을조절하여각각단계별로용액을주입하였다. 용출단계에서나온용액은 UV 검출기를지나 fraction collector에 20초단위로분획된다. 이때 UV 검출기에서는흡광도를측정하였으며, 측정된흡광도를 Autochro 2000을통해전기적인신호로바꾸어컴퓨터에저장하였다. 완충용액은실험의목적에맞게 ph를 5부터 8까지변화를주어사용하였다. Fraction collector를통해분획된용액중에서라이소자임의농도가가장높은분획을찾기위해서흡광도를측정하였다. 그중가장흡광도가높은분획시료 20 μl을 RP-HPLC를이용하여분석하였다. 이때사용한펌프는 SP930D(Younglin, Korea) 2대로주펌프에는 100% 증류수, 보조펌프에는 100% Acetonitrile(ACN) 을연결하여사용하였다. ACN와 DW를 50:50을비율로 1ml/min의유속으로흘려보내칼럼을안정화시킨후시료를주입하였다. 두용액이완전히섞이게하기위해 gradient mixer(gradient mixer, BIO- RAD, USA) 사용하였다. 칼럼은 C18 칼럼 (250 46 mm, Phenomenex, USA) 을사용하였고, 측정을위해자외선검출기 (783A, Applied Biosystems, USA), 데이터수집장치 (Autochro Data Module, Younglin, Korea), 데이터수집소프트웨어 (Autochro 2000, Younglin, Korea) 를사용하였다. 표준라이소자임의체류시간은 2분 10초였다. 시료주입후동일한체류시간에단일피크가형성이되면라이소자임으로보았다. 수집된라이소자임을정량분석하기위하여크로마토그램의면적을 OriginPro 8(OriginLab Corporation, USA) 프로그램으로구하였다. 이온교환크로마토그래피실험에서는용출단계인 35~50분사이의면적을구하였고, RP-HPLC로분석한크로마토그램에서는라이소자임의피크가나타나는 2~3분사이의면적을구하였다. 2-5. 전산모사방법이온교환크로마토그래피로난백에서라이소자임을분리하는실험을 Aspen의 cyclic organizer를 [13] 이용하여전형적인평형, 샘플주입, 세척, 용리의 4단계를고려하여 Aspen Chromatography 전산모사를 Table 2. Simulation variables used Name Value Unit Description H b 7.46 cm Height of adsorbent layer D b 1.5 cm Internal diameter of adsorbent layer E i 0.35 Interparticle voidage N p 20 Number of plates MTC 30 min 1 Mass transfer coefficient IP 1 (L) variable Isotherms parameter IP 2 (L) variable Isotherms parameter IP 3 (L) variable Isotherms parameter IP 1 (O.P) variable Isotherms parameter IP 2 (O.P) variable Isotherms parameter IP 3 (O.P) variable Isotherms parameter L: Lysozyme, O.P: Ohter proteins 하였다. 전산모사와비교한실험은 ph가 5, 8일때, 온도가 25, 40 o C 일때이다. 전산모사에사용한흡착등온식은 Yamamoto 방정식이다. 식 (3) 의 IP 1, IP 2, IP 3 매개변수를변화시켜전산모사결과를얻었다. 전산모사에대한입력변수는 Table 2에정리하였다. 3. 결과및토의 3-1. ph에따른이온교환크로마토그램의변화및 RP-HPLC 분석 25 o C에서이온교환크로마토그래피실험을완충용액의 ph를변수로설정하여 ph 5, 6, 7, 8로각각수행한결과를 Fig. 1a~1d에보였다. 샘플주입단계의크로마토그램을보면사다리꼴모형의피크가나타났다. ph 5일때높이가가장낮았고, ph가 7까지증가함에따라피크의높이도높아졌다. 이는난백에포함된여러가지단백질들이양이온수지에흡착되지않고통과하여높은흡광도를나타낸것이다. 약 40분부터라이소자임의용출이시작되는데, Fig. 1a, 1b의피크가 Fig. 1c, 1d의피크보다더높은것을볼수있었다. Fig. 1a와 1b를비교했을때, 피크의높이는 Fig. 1b에서더높게나왔지만총면적은 Fig. 1a가더넓은것으로보아용출된양은 Fig. 1a가더많다는것을알수있었다. 단백질의용출량은샘플주입단계에서원하는단백질이양이온교환수지에흡착되는양에비례한다. 교환수지에단백질의흡착양은이온화도에비례하는데, 등전점과멀어질수록이온화가더많이되므로흡착되는양도많아진다. 라이소자임의등전점이 10.5이므로 ph가낮아질수록양이온화가더많이되어양이온교환수지에많이흡착된다. 따라서 ph 5에서라이소자임이가장많이용출되었고, ph 7과 8에서는큰차이가없었다. 이전의연구에서는 ph가높을수록용출시간이앞당겨졌고, 피크의높이가높게나왔지만, 피크의폭은좁게나왔다 [3]. 이는 ph가높을수록등전점에
이온교환크로마토그래피에서라이소자임분리에미치는 ph 와온도영향 101 Fig. 1. Chromatograms of lysozyme from ion exchange column (a~d) and simulation (e, f) under various ph conditions. (a, e) ph 5, (b) ph 6, (c) ph 7, (d, f) ph 8. [IP 1, IP 2 and IP 3 of lysozyme; (e) 0.8/7.0*10 2 /-1.5, (f) 0.8/1.12*10 5 /-5]. 가까워져이온화도가적게되어흡착제와의결합력이약해져짧은시간에라이소자임이용출된것이다. 정량적인측정은하지않았지만, ph에따른이온화도에대해서는같은경향성을보였다. 실험에서 ph가가장낮을때 (ph 5) 와높을때 (ph 8) 의전산모사결과를 Fig. 1e, 1f에나타냈다. Fig. 1a와같이 ph 5일때의실험에서는사다리꼴형태피크의윗면이기울어져서나타났지만, Fig. 1e 에나타낸전산모사의크로마토그램은안정된사다리꼴형태를보였 다. Fig. 1d는 ph 8일때의그래프인데, 전산모사의결과인 Fig. 1f와비슷한결과를보였다. 이온교환크로마토그래피실험에서분리한라이소자임을 RP- HPLC를이용하여분석한결과를 Fig. 2에나타내었다. 모든그래프에서 2분 10초에단일피크가형성된것으로보아순수한라이소자임임을알수있었다. 그리고여러 ph에서피크높이도이온교환크로마토그래피실험에서의결과와비슷한것으로보아분석이정량적
102 고관영 김인호 Fig. 2. RP-HPLC chromatograms of lysozyme eluent fractions in Fig. 1. Mobile phase composition is 50:50 (ACN:DW) in C18 column. (a) ph 5, (b) ph 6, (c) ph 7, (d) ph 8 으로이루어진것을알수있다. 그리고이온교환크로마토그래피실험결과와 RP-HPLC 분석결과를비교해본결과라이소자임의분리에서최적의 ph는 5임을알수있었다. 3-2. 온도에따른이온교환크로마토그램의변화및 RP-HPLC 분석이온교환크로마토그래피실험을 25, 30, 35 및 40 o C로실험한결과를 Fig. 3a~3d에나타내었다. 완충용액의 ph는 Fig. 1에서알수있듯이분리가잘이루어진 ph 5에서실험을하였다. Fig. 3a와 3b는온도가 25, 30 o C 일때의결과인데, 앞서수행한 ph 5일때의결과 (Fig. 1a) 와비슷하게나왔다. 온도가 35 o C일때의결과그래프 Fig. 3c를보면용출단계의피크가 Fig. 3a, 3b에비해반정도로떨어진것을볼수있다. Fig. 3d의용출피크가가장낮았으며, 잔피크를많이볼수있는데, 이는높은온도의용액에서배출된관내부의기포의영향이다. 25, 40 o C일때의전산모사결과는 Fig. 3e, 3f에나타내었다. 실험결과와전산모사의결과를비교해보면라이소자임에대한피크의형태는같은경향이다. 흡착되지않고관에서배출된다른단백질들에대한사다리꼴모형의피크는실험에서와같이납작한모양이었다. 온도변화에따른이온교환크로마토그래피실험에서분리한라이 소자임을 RP-HPLC를이용하여분석하였다. Fig. 2와비슷하게모든그래프에서 2분 10초에단일피크가형성된것으로보아순수라이소자임을얻었다. RP-HPLC 피크의높이가이온교환크로마토그래피실험에서의결과와비슷하였고, 온도가증가할수록 RP-HPLC 피크가작아졌다. 따라서 ph 5에서의라이소자임분리의최적온도는 25 o C임을알수있었다. 3-3. 분석에의한크로마토그램면적비교온도와 ph의변화에대해용출된라이소자임을정량화하여 Fig. 4에나타냈다. 이온교환수지와 RP-HPLC에서 ph의변화에따른결과를 Fig. 4a, 4b에나타내었다. 두그래프의면적을비교했을때, ph 5에서면적이가장넓었고, ph가올라갈수록면적이줄어들었다. ph 7과 ph 8의면적이큰차이가나지않아비슷한양의라이소자임이용출되었음을알수있었다. 따라서 ph가올라갈수록용출되는라이소자임양이줄어듬을알수있었다. Fig. 4c와 4d는온도변화에대한결과인데, 25 o C에서면적이가장크고, 온도가높아질수록면적이작아지는경향을보였다. 이는온도가높아질수록라이소자임의흡탈착이잘이루어지지않아용출되는라이소자임의양이적게나타난것으로보인다.
이온교환크로마토그래피에서라이소자임분리에미치는 ph 와온도영향 103 Fig. 3. Chromatograms of lysozyme from ion exchange column and simulation under various temperatures at ph 5; (a, e) 25 o C, (b) 30 o C, (c) 35 o C, (d, f) 40 o C [IP 1, IP 2 and IP 3 of lysozyme; (e) 0.8/7.0*10 2 /-1.5, (f) 0.8/1.12*10 2 /-4]. 3-4. 이온교환젤과단백질의반응이온교환젤과단백질의흡착반응에대해알아보기위해 (1) 식을통해용량인자와칼럼의온도에대한그래프를그린결과 Fig. 5를얻었다. 용량인자는 (2) 식에의해칼럼의공극율과용출개시시간을고려하여계산하였다. 용량인자는단백질시료의고정상과의친화도로, 온도가 25 o C에서 40 o C로증가함에따라체류시간이 증가하므로친화도가증가함을알수있다. 결과적으로 Fig. 5에서온도의역수와용량인자의로그값이정비례하는것을볼수있었다. (1) 식의기울기가음수이므로엔탈피변화는양수이며이온교환젤에단백질이흡착할때반응은흡열반응임을알수있었다. 라이소자임의분리는 25 o C에서잘이루어지는것을알수있었다.
104 고관영 김인호 Fig. 4. Chromatogram areas of lysozyme peaks in ion exchange chromatography and RP-HPLC under various conditions. (a) Ion exchange chromatogram area with change of ph, (b) HPLC chromatogram area with change of ph, (c) Ion exchange chromatogram area with change of temperature, (d) HPLC chromatogram area with change of temperature. 하였다. ph를변화시켜실험을한결과 ph 5에서분리수율이좋았고온도는가장낮은온도인 25 o C에서좋은결과를보였다. Fig. 5 에서온도의영향과 ph의영향을비교해봤을때그래프의기울기로보아라이소자임의용출량은온도변화보다 ph 변화가더영향력이크다는것을알수있었다. 이는 ph가라이소자임의이온화도에영향을미치기때문이라고생각된다. 따라서온도조절보다 ph를조절하는것이이온교환크로마토그래피를통한라이소자임분리에더효과적이다. 감 사 Fig. 5. Graph of ln k' with inverse of temperature. 4. 결론이온교환크로마토그래피를통해라이소자임을분리하는데에최적의 ph와온도를알아보기위해분리실험을비교하기위해 ph 변화와온도변화에따른라이소자임의용출단계의피크면적을비교 본연구는한국연구재단기초연구사업의지원으로수행되었으며이에감사드립니다. References 1. Lee, S. K., Yoo, I. J. and Min, B. Y., Studies on the Lysozyme Isolation by Ion-exchange Chromatography, Korean J. Anim. Sci., 31(12), 780-787(1989). 2. Wang, Steven S.-S., Hung, Y. T., Wang, P. and Wu, J. W., The
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