대한진단검사의학회지제 27 권제 3 호 2007 Korean J Lab Med 2007;27:192-6 원저 임상화학 SD BIOLINE Tetanus Kit 평가 이지은 이수연 성균관대학교의과대학삼성서울병원진단검사의학교실 Evaluation of SD BIOLINE Tetanus Kit Jee-Eun Lee, M.D. and Soo-Youn Lee, M.D. Department of Laboratory Medicine, Samsung Medical Center, Sungkyunkwan University School of Medicine, Seoul, Korea Background : Point-of-care-testing (POCT) kits for tetanus toxoid antibody are used in emergency departments to evaluate the immunization status of patients with tetanus. The objective of this study was to evaluate the analytical performance and the utility of SD BIOLINE tetanus kit (Standard Diagnostic Inc., Yongin, Korea), as a POCT. Methods : A total of 326 peripheral blood specimens (whole blood, 319; serum, 326) from healthy subjects and patients were used. SD BIOLINE tetanus kit was evaluated for precision, accuracy, effect of specimens, operator variance, and the total processing time. The results from SD BIOLINE tetanus kit were compared with those from 2 quantitative ELISA kits. Results : Compared with ELISA kits, SD BIOLINE tetanus kit revealed a sensitivity of 88-97, specificity of 87-92, positive predictive value of 81-89, negative predictive value of 90-98, and kappa agreement of 0.78-0.82. SD BIOLINE tetanus kit also showed an excellent precision and a high accuracy. It showed a high concordance rate between whole blood and serum specimens. The total processing time of SD BIOLINE tetanus kit was 30-40 min. Conclusions : SD BIOLINE tetanus kit showed an excellent analytical performance. With its rapid turnaround time and the ease of handling and interpretation, SD BIOLINE tetanus kit seems appropriate for the evaluation of tetanus immunization status as a POCT device. However, education for operators and standardized guidelines for result interpretation should be emphasized. (Korean J Lab Med 2007;27:192-6) Key Words : Tetanus, Antibody, Point-of-care-testing (POCT), Evaluation 서 파상풍 (Tetanus) 은법정제2종전염병으로치사율과유병률이높은질환이지만면역저하자, 신생아등의고위험군을제외하면예방접종을통해효과적으로예방이가능하다 [1]. 국내에서는 접 수 : 2006년 9월 19일 접수번호 : KJLM1990 수정본접수 : 2007년 5월 17일 게재승인일 : 2007년 5월 21일 교신저자 : 이수연 우 135-230 서울시강남구일원동 50 성균관의대삼성서울병원진단검사의학과 전화 : 02-3410-1834, Fax: 02-3410-2719 E-mail: sy117.lee@samsung.com 론 어릴때부터예방접종을시행하고있으나추가접종이제대로이루어지고있지않아나이가들수록항체역가가감소하고있다 [2]. 따라서응급실등에서는외상을입고오염된상처가있을경우파상풍발생예방을위해면역글로불린이나항독소를일률적으로주사하는경우가많다. 이러한일률적인주사투여를막기위해응급실등에서는파상풍항체유무를확인하기위한현장검사용진단키트를많이사용하고있었으나전적으로수입된진단시약및키트에의존해야했다. 그러나최근국내에서파상풍항체진단키트인 SD BIOLINE tetanus 키트 (Standard Diagnostic INC, Yongin, Korea) 가개발되었다. 이에저자들은파상풍항독소표준물질을이용하여 SD BIO- 192
SD BIOLINE Tetanus Kit 평가 193 LINE tetanus 키트의재현성및정확도를평가하고기존의효소면역법 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 과방법간및검사분석속도를비교하였다. 그리고본검사키트가현장검사용인점을고려하여검체간및검사자간비교를시행하였다. 1. 연구대상 재료및방법 326명으로부터얻은전혈 319검체및혈청 326검체그리고 NI- BSC Tetanus antitoxin human Ig (A WHO International Laboratory for biologic standards, UK) 를이용하여평가하였다. SD BIOLINE tetanus antibody 키트를이용하여정량적 EL- ISA법인 ELISA anti-tetanus toxin IgG assay (SCIMEDX Co., Denville, NJ, USA) 및 IBL tetanus Ab ELISA (IBL IMMUNO BIOLOGICAL LABORATORIES, Minneapolis, MN, USA) 에의한검사결과와각각비교분석하였다. 2. SD BIOLINE tetanus antibody 키트검사방법및원리 SD BIOLINE tetanus antibody 키트에는플라스틱카세트외부에원형의검체점적부위 (S) 가있고, 직사각형표시창에는대조선 (C) 와검사선 (T) 이표시되어있다. 검체점적부위에혈청또는전혈 (30 L) 을넣은후검체희석액 (100 mm 트리스 - 염산완충액및 0.02 sodium azide) 을 3-4방울넣는다. 검체에파상풍독소항체가존재할경우, 일차적으로검체점적부위에존재하는파상풍독소와반응하며면역크로마토그래피 (immunochromatography) 원리에의해막을따라이동한다. 그리고, 검사선 (T) 위치에흡착되어있는파상풍독소와 direct sandwich 원리로반응하여항원-항체-항원결합물을형성하는데, 설정된파상풍항체농도 (0.1 IU/mL) 이상일경우보라색으로발색한다. 환자의전혈혹은혈청을검체점적부위에넣은후약 20-30분후대조선 (C) 과검사선 (T) 모두에밴드가나타나면양성으로, 대조선 (C) 에만밴드가나타날경우에는각각음성으로판정하였다. 정도관리를위해서는키트자체내에내부정도관리물질이포함되어있어매검사시마다대조선에보라색선이나타나는것을확인하였다. 3. 평가방법 1) 정확도및재현성평가 NIBSC Tetanus antitoxin human Ig를 5개의농도 (2.5 IU/ ml, 1.25 IU/mL, 0.3 IU/mL, 0.1 IU/mL, 0 IU/mL) 로제조한후, SD BIOLINE tetanus 키트를이용하여 5일간반복측정하여재현성을평가하였다. 2) 방법간비교건강검진센타, 외래및병동환자들검체중무작위로선정된혈청 326검체및전혈 317검체를대상으로 SD BIOLINE tetanus 키트와 ELISA 정량검사를동시에실시하여결과를비교하였다. 혈청에존재하는 IgG 파상풍항체의정량에는 ELISA antitetanus toxin IgG assay와 IBL tetanus Ab ELISA 키트를사용하였다. ELISA anti-tetanus toxin IgG assay는환자혈청검체를 1: 100으로희석한다음, 환자검체내의항체와반응용기내의항원과반응시킨후효소접합체를첨가하여 450 및 620 nm 파장에서면역복합체양을정량하였다. IBL tetanus Ab. ELISA는환자혈청검체를이용하여혈청내의항체와반응용기내의항원을반응시킨후효소접합체를첨가하여 450 nm 파장에서면역복합체의양을정량하였다. 동일검체에대하여앞서기술한 3가지검사법을이용한파상풍항체검사를시행하여그결과를비교하였다. SD BIOLINE tetanus 키트는 0.1 IU/mL 이상에서양성으로나오도록고안되어있다. 따라서, 2가지 ELISA 검사법에의한정량값이 0.1 IU/ ml 이상인경우양성, 미만인경우음성으로각각간주하여정성적결과로표현한다음, 이를기준으로 SD BIOLINE tetanus antibody 키트의민감도, 특이도, 양성및음성예측도를산정하였으며, 비교방법간의카파일치율 (kappa agreement) 을구하였다. 3) 검사소요시간파상풍항체진단키트의검사분석속도를비교하기위하여검사분석과정을분석전, 분석중, 분석후의 3단계로각각나누어 ELISA 검사법과비교하였다. 분석전은검체수집후혈청을분리하는데까지걸리는시간으로하였고, 검사중은검체접종후검사완료까지걸리는시간으로, 검사후는검사완료에서부터결과판독하는데걸리는시간까지로각각정의하였다. 4) 검체종류영향및검사자요인 317명의환자로부터동시에발생한전혈과혈청검체에대하여각각 SD BIOLINE tetanus 키트를이용한검사를시행한다음, 그결과를비교하였다. 2인의검사자가각각전혈및혈청검체에대해 SD BIOLINE tetanus 키트로검사를시행하고판정한결과에대해일치율및카파일치율을살펴보았다. 5) 경계값 (cut-off) 주변검증 2가지 ELISA 검사법에의한결과값이경계값 0.1 IU/L 주변에있는검체들에대해 SD BIOLINE tetanus 키트로검사한결과를확인하였다.
194 이지은 이수연 Table 1. Performance of SD BIOLINE tetanus kit in comparison with two quantative ELISA kits SD BIOLINE tetanus kit vs ELISA 1 SD BIOLINE tetanus kit vs ELISA2 SD BIOLINE tetanus kit Sensitivity Specificity PPV NPV Kappa agreement (95CI) Sensitivity Specificity PPV NPV Kappa agreement (95CI) in whole blood 86.7 91.8 88.6 90.4 0.79 94.8 89.2 83.3 96.7 0.82 (n=319) (0.72-0.86) (0.75-0.88) in serum 88.3 89.9 86.4 91.4 0.78 96.5 87 80.7 97.5 0.8 (n=326) (0.71-0.85) (0.74-0.87) ELISA 1, ELISA anti-tetanus IgG assay (SCIMEDX Co); ELISA2, IBL tetanus Ab. ELISA (IBL IMMUNO BIOLOGICAL LABORATORIES). Abbreviations: PPV, positive predictive value; NPV, negative predictive value; CI, confidence interval. 결 과 Table 2. Testing results of 3 analytical methods around cut-off (0.1 IU/mL) 1. 정확도및재현성평가표준물질로시행한 5일간반복검사한결과 0.1 IU/mL 이상에서는모두양성으로 0.1 IU/mL 미만에서는모두음성으로서동일한결과를얻을수있었다. 2. 방법간비교혈청및전혈검체를이용한 SD BIOLINE tetanus antibody 키트검사의민감도, 특이도, 양성및음성예측도, 카파일치율은 Table 1과같았다. 3. 검사소요시간검사분석속도의비교에서는 SD BIOLINE tetanus 키트의경우는검체준비단계부터판독까지 1검체당기준으로하였을때, 전혈의경우는약 30분, 혈청의경우는약 40분의시간이소요되었다. 두정량 ELISA 검사는 1회검사시 50검체를동시에검사하는것으로가정하였을때 50검체기준으로약 2시간 10분정도의시간이소요되었다. 4. 검체종류및검사자요인 SD BIOLINE tetanus 키트의검체종류에따른영향평가에서는총 317명으로부터동시에발생한전혈과혈청검체중 310 검체의결과가일치해검체간일치율은 97.8 였으며카파일치율은 0.955 (95 신뢰구간 : 0.922-0.988) 이었다. 사용자영향을보기위한검사자간비교에서는혈청검체를사용한검사에서 326검체중 309검체를동일하게판독하여일치율은 94.8, 카파일치율은 0.893 (95 신뢰구간 : 0.843-0.942) 이었으며, 전혈검체에서는 319검체중 310검체를동일하게판독하여일치율은 97.2, 카파일치율은 0.942 (95 신뢰구간 : 0.905-0.979) 이었다. Specimen No. ELISA 1 (IU/mL) Abbreviations: See Table 1. 5. 경계값주변검증 ELISA 2 (IU/mL) 버림값주변결과치에서 2가지 ELISA 정량값및 SD BIO- LINE tetanus 키트의판정결과는 Table 2와같았다. ELISA 정량값및2명의검사자에의한판독결과가일부에서불일치소견을보였다. 고 파상풍은 Clostridium tetani에의해생기는신경독소인 tetanospasmin이신경계를침범한후시냅스에서신경전달물질 (neurotransmitter) 을차단하여근육경직등을일으키는신경학적이상증후군으로치사율과유병률이매우높다 [1]. 따라서외상으로인한상처를통하여파상풍균에대한노출이예상될경우, 신속한예방조치가필요하며이를위해파상풍톡소이드나항파상풍면역글로불린을주사하는것을권장하고있다 [3]. 인체내파상풍항체역가가 0.1 IU/mL 이상일때파상풍독 찰 SD BIOLINE tetanus kit by operator 1 by operator 2 1 0.101 0.113 Negative Negative 2 <0.100 0.124 Negative Negative 3 0.144 <0.100 Negative Negative 4 0.118 <0.100 Negative Negative 5 0.104 <0.100 Positive Negative 6 0.135 0.107 Positive Negative 7 <0.100 0.123 Positive Positive 8 0.100 0.143 Positive Positive 9 0.100 <0.100 Positive Positive 10 0.105 0.127 Positive Positive 11 0.115 0.106 Positive Positive 12 0.128 0.102 Positive Positive 13 0.136 0.120 Positive Positive 14 0.138 0.147 Positive Positive 15 0.145 0.150 Positive Positive
SD BIOLINE Tetanus Kit 평가 195 소에대해면역력이있는것으로, 역가가 1.0 IU/mL 이상일때는장기면역력이있는것으로볼수있다 [4, 5]. 우리나라의경우는유소아기때 DTP에대한예방접종을시행하고있지만파상풍추가접종이시행되고있지않아, 나이가들수록파상풍에대한면역력이감소되며파상풍항체역가가 0.1 IU/mL 이상을유지하지못하는경우가많다 [2]. 그러나응급의료센터에내원하는외상환자들의경우체내항체역가를측정한후파상풍면역주사를투여하기보다는미국질병예방본부의권고사항에따라상처의종류와과거예방접종력및추가접종력을가지고파상풍면역주사를일률적으로투여하여왔다 [2, 3]. 이에의해의료비증가와함께불필요한주사투여가이루어졌다. 그러므로파상풍균에안전한지를알아내기위한항체역가검사가필요하며이검사를통해환자의면역상태를즉시평가하고불필요한백신이나면역글로불린투여로인한부작용예방및의료비절감이가능하다. 파상풍항체를검사하기위하여과거에는파상풍항체에대한검사방법으로독소중화검사 (toxin neutralization tests, TNT)[6], 독소결합억제검사 (toxin-binding inhibition test) [7], 방사선면역측정법 (radioimmunoassay)[8], 라텍스응집법 (latex agglutination)[9] 및 ELISA[10] 등이이용되었다. TNT 는실험동물이필요함은물론검사법이복잡하고검사소요시간이 5-6일정도로매우길어검사실에서사용하기는부적절하다. [7]. 이외의검사방법들도 TNT에비해방법은간단하지만검사소요시간이 2시간이상으로응급검사실에서사용하기에는부적절하다 [4, 8]. 이러한제한점으로인해현장검사의형태로적용하는것이불가능한파상풍항체검사법들은실제적으로임상진료에이용하기에어려움이있었고그이용도가낮았다 [11]. 이에보다신속한검사의필요성에따라현장검사용진단키트가개발되어사용되고있다 [12]. 국내에서도이미파상풍항체검사가수행되고있는데전적으로수입진단시약및진단키트에의존하여왔던상황이며, 최근국내에서본파상풍항체현장검사용진단키트개발에성공하였다. 본연구에서 SD BIOLINE Tetanus kit는재현성및정확도검사에서우수한결과를보였다. ELISA 정량검사와의비교에서도유의한차이를보이지않았다. 오히려 ELISA 검사에비해별도의검사장비가필요하지않고혈청은물론전혈을바로사용할수있으므로진료현장에서간편하게검사할수있을뿐만아니라, ELISA 정량검사에서처럼검사후다시검사수치를가공할필요가없이바로판독할수있었다. 이와같이검사전처리나검사과정, 결과판독이단순해검사전문인력이아니더라도쉽게검사가가능하며사용자간영향도유의하지않았다. 단, 경계값주변의검체에서반응강도가명확하지않게나타날경우양성또는음성의판정에어려움이있었는데, 이는정성검사가가지는불가피한한계점으로볼수있으며검사자에대한충분한교육과결과판정에있어서의명확한기준이필요하겠다. 특히현장검사용도로서전혈로검사할수있다는것이큰장점으로서검사전과정이 30분밖에소요되지않았다. 기존의외국산현장검사키트 (Tetanus Quick Stick, GAMMA, Belgium) 를보면, 그성능평가연구결과, 민감도 79.6, 특이도 99.2, 양성예측도 97.7, 음성예측도 91.9 로나타났으며 [13], SD BIOLINE Tetanus kit 와유의한차이가없었다. 본연구결과, SD BIOLINE Tetanus kit는분석능이우수하며, 검사및판독의용이하고신속한검사수행이가능하여, 현장검사로서의기능을충분히만족시킬수있는검사법으로서, 응급실에서파상풍항체유무확인에이용될수있을것으로판단되었다. 요약배경 : 파상풍이의심되는외상환자에서파상풍항체역가가충분한지파악하여신속히처치하는것이중요하므로, 현재응급실등에서외국산현장검사용진단키트를이용한파상풍항체검사가이루어지고있다. 본연구에서는최근국내에서개발된 SD BIOLINE tetanus kit (Standard Diagnostic Inc.) 의분석능및유용성을평가하고자하였다. 방법 : 건강인및환자 326명으로부터수집한검체 ( 전혈 319검체및혈청 326검체 ) 를대상으로, SD BIOLINE tetanus antibody kit를, 2가지 ELISA 정량검사법인 ELISA anti-tetanus toxoid IgG assay (SCIMEDX Co.) 와, IBL tetanus Ab. ELI- SA (IBL IMMUNO BIOLOGICAL LABORATORIES) 등과비교하였다. 검체종류및검사자에따른영향을평가하였으며검사소요시간을비교하였다. 결과 : ELISA 검사에의한정량값과비교시, SD BIOLINE tetanus kit의민감도는 88-97, 특이도 87-92, 양성예측도 80-88, 음성예측도 90-97, 카파일치율 0.78-0.80이었다. 전혈및혈청검체간일치율은 97.8 였으며, 2인의검사자간일치율은혈청의경우 94.8, 전혈의경우는 97.2 였다. 표준물질에의한정확도및재현성평가결과, 0.1 IU/ ml 이상에서는모두양성으로그미만에서는모두음성으로모두일치된결과를보였다. SD BIOLINE tetanus antibody 키트의검사소요시간은전혈이용시약 30분, 혈청이용시약 40분이었다. 결론 : SD BIOLINE Tetanus Ab 진단키트는분석능이우수하고, 검사및판독이용이하였으며, 신속한검사수행이가능하여현장검사로서의기능이충분하다고판단되었다. 단, 경계값주변의검체에서반응강도가명확하지않게나타날경우판정에어려움이있으므로검사자에대한충분한교육과결과판정에있어서의명확한기준이필요하겠다. 감사본연구에서현장검사키트및 ELISA 검사수행을맡아도움
196 이지은 이수연 을주신김정해, 박연희선생님께감사드립니다. 참고문헌 1. Humeau Y, Doussau F, Grant NJ, Poulain B. How botulinum and tetanus neurotoxins block neurotransmitter release. Biochimie 2000; 82:427-46. 2. Kim HJ, Kang GH, Kim GW, Kim SC, Kim YS, Kim CH, et al. Korean multicenter study of tetanus antibody titer (KoMUST). J Korean Soc Emerg Med 2005;16:667-76. ( 김호중, 강구현, 김기운, 김상철, 김영식, 김춘호등. 한국인의연령별파상풍항체역가에대한다기관조사. 대한응급의학회지 2005;16:667-76.) 3. Hsu SS and Groleau G. Tetanus in the emergency department: a current review. J Emerg Med 2001;20:357-65. 4. Coplu N, Esen B, Gozalan A, Miyamura K, Yoshida I, Kurtoglu D, et al. Tetanus antibody assay combining in-house ELISA and particle agglutination test and its serosurvey application in a province in Turkey. Jpn J Infect Dis 2004;57:97-102. 5. Caglar K, Karakus R, Aybay C. Determination of tetanus antibodies by a double-antigen enzyme-linked immunosorbent assay in individuals of various age groups. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2005; 24:523-8. 6. Hong HA, Ke NT, Nhon TN, Thinh ND, van der Gun JW, Hendriks JT, et al. Validation of the combined toxin-binding inhibition test for determination of neutralizing antibodies against tetanus and diphtheria toxins in a vaccine field study in Viet Nam. Bull World Health Organ 1996;74:275-82. 7. Hendriksen CF, vd Gun JW, Nagel J, Kreeftenberg JG. The toxin binding inhibition test as a reliable in vitro alternative to the toxin neutralization test in mice for the estimation of tetanus antitoxin in human sera. J Biol Stand 1988;16:287-97. 8. Wahren E, Bengtsson C, Bjorksten B, Mark A, Granstrom M. Capture EIA for determination of IgE to diphtheria and tetanus toxins in comparison to RIA. Vaccine 1998;16:873-6. 9. Booth JR and Nuttall PA. A rapid automated latex screen for tetanus toxoid antibodies. Vox Sang 1978;34:239-40. 10. Sedgwick AK, Ballow M, Sparks K, Tilton RC. Rapid quantitative microenzyme-linked immunosorbent assay for tetanus antibodies. J Clin Microbiol 1983;18:104-9. 11. Nichols JH. Quality in point-of-care testing. Expert Rev Mol Diagn 2003;3:563-72. 12. Colombet I, Saguez C, Sanson-Le Pors MJ, Coudert B, Chatellier G, Espinoza P. Diagnosis of tetanus immunization status: multicenter assessment of a rapid biological test. Clin Diagn Lab Immunol 2005; 12:1057-62. 13. Yoon YS, Kim EC, Lee WH, Chung SW, Yi JH, Park IC, et al. Utility of Tetanus Quick Stick test for selective tetanus prophylaxis. J Korean Soc Emerg Med 2004;15:95-101. ( 윤유상, 김의중, 이운형, 정상원, 이진희, 박인철등. 선별적파상풍예방처치를위한 Tetanus Quick Stick 의유용성. 대한응급의학회지 2004;15:95-101.)