498 송인봉 나지영 송기쁨 김석호 이지현 권영배 김대기 김대성 조형권 권중기 뿌리로써청열조습 ( 淸熱燥濕 ), 사화해독 ( 瀉火解毒 ) 등의효능이있다 (2). YG-1 구성약재들의선행연구로는우방자성분중프룩탄의진해작용에대한보고가있으며 (3), tumor necrosis

J Korean Soc Food Sci Nutr 한국식품영양과학회지 44(4), 497~55(215) http://dx.doi.org/1.3746/jkfn.215.44.4.497 급성염증성발열모델에서의항염증성약재혼합추출물 (YG-1) 의효과 송인봉 1* 나지영 1* 송기쁨 1 김석호 1 이지현 3 권영배 2 김대기 3 김대성 4 조형권 4 권중기 1 1 전북대학교수의과대학실험동물의학교실, 2 전북대학교의학전문대학원약리학교실 3 전북대학교의학전문대학원면역학교실, 4 한풍제약 Effects of Extract Mixture (Yg-1) of nti-inflammatory Herbs on LPS-Induced cute Inflammation in Macrophages and Rats In-ong Song 1*, Ji-Young Na 1*, Kibbeum Song 1, Sokho Kim 1, Ji-Hyun Lee 3, Young-ae Kwon 2, Dae-Ki Kim 3, Dae-Sung Kim 4, Hyoung-Kwon Jo 4, and Jungkee Kwon 1 1 Department of Laboratory nimal Medicine, College of Veterinary Medicine, 2 Department of Pharmacology, Institute for Medical Science, and 3 Department of Immunology, Institute for Medical Science, Chonbuk National University 4 Central Research and Development, Hanpoong Pharm & Foods STRCT Traditional herbs, such as Lonicera japonica, rctii Fructus, and Scutellariae Radix have been used as traditional drug due to their anti-inflammatory and anti-oxidant activities. The aim of this study was to investigate the anti-inflammatory effects of extract mixture (YG-1) in a model of lipopolysaccharide (LPS)-induced acute inflammation in both macrophage (RW 264.7) cells and Sprague-Dawley rats. YG-1 did not show specific cellular toxicity in RW 264.7 cells until a concentration of 1 μg/ml. YG-1 reduced various markers related to inflammation such as IL-1β,, and caused by LPS in RW 264.7 cells. Consistent with these results, YG-1 exerted significant anti-inflammatory effects in an acute inflammation rat model. cute fever and high concentration of IL-1β in serum induced by LPS were significantly reduced by YG-1. These results were similar to flubiprofen, a commercial anti-inflammatory and anti-febrile drug. Therefore, these results indicate that YG-1 has beneficial effects on LPS-induced acute inflammation and suggest that YG-1 can serve as an effective anti-inflammatory and anti-febrile drug. Key words: extract mixture (YG-1), lipopolysaccharide (LPS), acute inflammation, fever 서 인후염은흔히목감기라고부르는상기도감염증을말하며목안쪽편도선주위의인두와후두가바이러스나세균등에감염되어염증이생긴상태를말한다. 인후염은급성과만성으로나뉘며급성인후염은감기바이러스나세균감염, 비염, 열성질환등이원인이되어발생한다. 초기에는인두의이물감과건조감, 가벼운기침등의증상이나타나다가심해지면통증과함께음식을삼키기어려워지고고열, 두통, 전신권태등이나타난다. 이러한급성인후염이반복해서재발하거나흡연, 과도한음주, 과로, 자극성음식섭취, 매연, 화학물질, 장시간의에어컨노출등이원인이되어만성화된다. Received 27 November 214; ccepted 24 December 214 Corresponding author: Jungkee Kwon, Department of Laboratory nimal Medicine, College of Veterinary Medicine, Chonbuk National University, Jeonbuk 561-756, Korea E-mail: jkwon@jbnu.ac.kr, Phone: +82-63-27-3884 * These authors contributed equally to this work. 론 염증은복잡한병리생리학적인과정으로여러가지형태의감염이나생체내대사산물중자극성물질에대한생체방어기전의발현이라고할수있다. 염증반응의주요증상은발열, 발적, 동통, 부종등이며증상의치료에는주로비스테로이드성항염증제를많이사용하는데위장장애, 신장독성과같은여러가지부작용을수반한다 (1). 혼합추출물 (YG-1) 처방은전통적으로청열 ( 淸熱 ), 열독 ( 熱毒 ), 한열 ( 寒熱 ), 열갈 ( 熱渴 ), 풍한 ( 風寒 ) 등에사용되었던약재중항염증, 항산화효과가있다는인동등, 우방자, 황금을선택하여효과적인비율로배합하여만든기능성복합처방이다. YG-1의구성약재들중인동 ( 忍冬 ) 은인동과 (Caprifoliaceae) 에속하는인동덩굴 (Lonicera japonica) 또는기타동속근연식물의줄기와가지를말하며, 인동등 ( 忍冬藤 ) 이라고도하고청열해독 ( 淸熱解毒 ) 의효능이있다. 우방자 ( 牛蒡子 ) 는우엉 (rctium lappa Linne) 의잘익은열매로써소산풍열 ( 疏散風熱 ), 청열두목이인후 ( 淸熱頭目利咽喉 ), 이인해독 ( 利咽解毒 ), 거담지해 ( 祛痰止咳 ), 이뇨, 소염및피부질환등에이용되고있다. 황금 ( 黃芩 ) 은꿀풀과에속한다년생초본인황금 (Scutellaria baicalensis Georgi) 의

498 송인봉 나지영 송기쁨 김석호 이지현 권영배 김대기 김대성 조형권 권중기 뿌리로써청열조습 ( 淸熱燥濕 ), 사화해독 ( 瀉火解毒 ) 등의효능이있다 (2). YG-1 구성약재들의선행연구로는우방자성분중프룩탄의진해작용에대한보고가있으며 (3), tumor necrosis factor-α(tnf-α) 의분비를감소시킴으로써항알레르기염증에효과가있는것으로보고되어있다 (4). 인동등수용성추출물이 TNF-α 생성을억제함으로써 proteinase-activated receptor 2(PR2) 로인한부종을억제하고면역 cytokine 발현을통하여면역력을증가시켜준다는보고가있다 (5,6). 황금의약리작용으로는항균효과 (7), 항염증작용 (8,9), 항산화효과 (1), 알레르기천식작용 (11) 등이보고되었다. 따라서본논문은위와같은항염증, 항산화효과가있는성분들이상승작용을할수있게 YG-1이란복합물을제조하였고이 YG-1의급성염증성발열모델에서의치료효능을세포실험뿐만아니라생체실험을통해서평가하여탁월한효능의인후염개선및치료제개발의가능성을제시하였다. 재료및방법 혼합추출물 (YG-1) 의제조본실험에사용된인동 (Lonicera japonica), 우방자 (rctii Fructus), 황금 (Scutellariae Radix) 은옴니허브 (Daegu, Korea) 에서구입하여사용하였다. 인동과우방자를각각 3:1의비율로넣고 2배의 3% 알코올 ( 주정 ) 을넣어 85~ 95 C로 3시간씩 2회추출하여여과한후 6 C 이하에서감압농축및건조하여 YG-( 수율 13.8%) 를제조했다. 황금에 2배의 3% 알코올 ( 주정 ) 을넣어 85~95 C로 3시간씩 2회추출하고농축및건조하여 YG-( 수율 39.22%) 를제조했다. 건조된 YG-와 YG-를 2:3의비율로혼합하여 YG-1을제조하였다 (Table 1). 세포실험에사용된세포는마우스대식세포 RW 264.7이다. 세포는 5% CO 2, 37 C 배양기에서배양하였으며배양액은 1% fetal bovine serum(fs), 1% penicillin-streptomycin을함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지 (HyClone, Logan, UT, US) 를사용하였다. 배지는 2~3일마다교환하였으며세포가 8% 이상자랐을때 phosphate buffered saline solution(ps) 으로세척한후 cell scraper를사용하여계대배양하였다. Table 1. Mixing rate of YG-1 Mixing Code Scientific name of source Ratio ratio Lonicera japonica 3 2 rctii Fructus 1 Scutellariae Radix 2.25 3 세포독성및생존율측정세포독성및세포생존율을측정하기위해 MTT assay 를실시하였다. 2 1 4 cell/well의세포부유액을 96 well plate에각각분주한후 37 C, CO 2 배양기안에서 24시간동안안정화시켜준다. 안정화된세포는농도별로 YG-1(up to 2 μg/ml) 을 24시간동안단독처리한군과 YG-1(up to 2 μg/ml) 을 1시간전처리한뒤 lipopolysaccharide (LPS)(1 ng/ml) 를넣고 24시간동안배양한다. 24시간뒤에 2 μl MTT solution을처리하여최대 3시간 37 C 배양기에서배양한후배지와 MTT 시약을제거하고 dimethyl sulfoxide 시약 (Sigma-ldrich Co., St. Louis, MO, US) 2 μl를가하여 microplate reader(iotek, Winooski, VT, US) 를이용하여 56 nm에서흡광도를측정하였다. IL-1β, TNF-α, PGE2 의세포배양액내분비량측정 LPS로유도된 RW 264.7 세포의배양액내 IL-1β (interleukin-1β), TNF-α, PGE 2(prostaglandin E 2) 의분비를측정하기위해 YG-1 추출물을처리후 ELIS를실시하였다. 5 1 4 cell/ml의농도로 1% FS를첨가한 DMEM 배양액에분주하여 12시간동안안정화시킨후 YG-1(1, 1 μg/ml) 과 flurbiprofen(2 μg/ml) 을 1시간전처리한뒤 LPS(1 ng/ml) 를처리하여 1% FS가함유된 DMEM 배지와함께 24시간배양하였다. 세포를배양한후각 well 에서상층액을회수하였다. 상층액내 IL-1β, TNF-α (bcam, Cambridge, M, US), PGE 2(R&D Inc., Minneapolis, MN, US) ELIS kit을사용하여제시된방법에따라처리한다음 54 nm에서흡광도를측정하였다 (12). Nitric oxide(no) 의세포배양액내분비량측정 5 1 4 cell/ml의농도로 1% FS를첨가한 DMEM 배양액에분주하여 12시간동안안정화시킨후, YG-1(1, 1 μg/ml) 과 flurbiprofen(2 μg/ml) 을 1시간전처리한뒤 LPS(1 ng/ml) 를처리하여 1% FS가함유된 DMEM 배지와함께 24시간배양하였다. 24시간후상층액을회수하여 5 μl의 Griess 시약 (1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid와.1% naphtylethylenediamine; Invitrogen, Carlsbad, C, US) 을혼합후상온에서빛을차단한상태로 2분동안배양한다음 54 nm에서흡광도를측정하였다 (12). 세포내, 의 western blotting 에의한평가 5 1 6 cell/ml의농도로 1% FS를첨가한 DMEM 배양액에분주하여 12시간동안안정화시킨후 YG-1(1, 1 μg/ml) 과 flurbiprofen(2 μg/ml) 을 1시간전처리한뒤, LPS(1 ng/ml) 를처리하여 1% FS가함유된 DMEM 배지와함께 24시간배양하였다. 24시간세포내단백질은 RIP buffer 처리후 4 C에서 15, rpm에서 15분동안

급성염증성발열모델에서의항염증성약재혼합추출물 (YG-1) 의효과 499 원심분리하였다. 단백질정량은 C protein assay reagent(io-rad Laboratories, Hercules, C, US) 를사용하였다. 단백질 sample은 acrylamide gel 12% 에서 electrophoresis를하였고, polyvinylidene difluoride(pvdf) membrane에전기영동하였다. Membrane은실온에서 blocking buffer(ps-t에 5% skim milk) 에 blocking을한뒤,, (Santa Cruz iotechnology, Santa Cruz, C,US), β-actin antibody(cell Signaling, Danvers, M, US) 를 1:1,으로하여 4 C에서 24시간 incubation 하였다. Membrane은 PS-T로 washing 후실온에서 peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG secondary antibody(millipore, Temecula, C, US) 와 1시간동안반응시켰다. Supersignal West Dura extended duration substrate(thermo, Rockford, C, US) 를사용하여 Chemi Imager analyzer system(lpha Innotech, San Leandro, C, US) 에서발색, 감광시켰다 (12). 발열동물모델제작과약물투여실험에사용된흰쥐는 SD-rat 7주령 (22~25 g)(damul Science, Daejeon, Korea) 이고모두수컷을사용하였다. 모든실험대상의흰쥐는사료와음수를사육기간에마음대로섭취하도록하였으며사육장내에서제한없이운동하도록하였다. 발염모델은 LPS(2.5 mg/kg) 를복강투여하여유발시켰다 (13). 실험동물은군당 5마리씩 5그룹으로구분하였고 YG-1은 saline에용해시켜존대가부착된 1 ml 주사기를이용하여경구투여하였다. 발열유발 3분전 flurbiprofen(2 mg/kg)(14), YG-1(1, 4 mg/kg) 을존대로경구투여하였다. 본실험은전북대학교동물실험윤리위원회 (ICUC) 의동물실험승인을받아진행하였다 (Certification Number : 213-1-42). 체온측정흰쥐는직장체온계 (MT2, Microlife, Seoul, Korea) 를사용하여직접직장에넣어체온을측정하였다. 실험시작전과 LPS 투여로인후염유도후 1시간이지났을때측정을한다. 이후에는한시간단위로하여총 12번의체온측정을하였다. IL-1β, TNF-α, PGE2 의혈청내분비량측정실험종료각각 6시간 (peak time) 과 12시간 (last time) 에조레틸 (zoletil) 로마취한후심장채혈로혈액을채취하고 centrifuge(3, rpm, 5 min, 4 C) 를하여혈청을분리하고 -2 C에보관하였다. 분리한혈청은 6시간 (peak time) 과 12시간 (last time) 으로나누어 inflammatory cytokine을분석하였다. 혈액내 IL-1β, TNF-α(bCam), PGE 2(R&D Inc.) 의양은 ELIS kit을사용하여제시된방법에따라처리한다음 54 nm에서흡광도를측정하였다 (12). 뇌조직내, 의 western blotting 에의한평가 LPS 투여후 6시간과 12시간째에실험종료후모든흰쥐를부검하여뇌조직을군별로채취하였다. 추출한뇌조직은송과체부분을 RIP buffer 처리후 4 C에서 15, rpm에서 15분동안원심분리하였다. 단백질정량은 C protein assay reagent(io-rad Laboratories) 를사용하였다. 단백질 sample은 acrylamide gel 12% 에서 electrophoresis 를하였고, polyvinylidene difluoride membrane electrotransfer 하였다. Membrane은실온에서 blocking buffer(ps-t에 5% skim milk) 에 blocking을한뒤,, (Santa Cruz iotechnology), β-actin antibody(cell Signaling) 를 1:1,으로하여 4 C에서 24시간 incubation 하였다. Membrane은 PS-T로 washing 후실온에서 peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG secondary antibody(millipore) 와 1시간동안반응시켰다. Supersignal West Dura extended duration substrate(thermo) 를사용하여 Chemi Imager analyzer system(lpha Innotech) 에서발색, 감광시켰다. 통계학적검정모든실험결과는평균 ± 표준오차로표시하였다. 대조군 (control) 과 LPS 단독처리군 (vehicle) 그리고각실험군간의차이를검정하기위해 Student's t-test와 NOV를통해실시하였다. 실험의분석시유의수준은 P<.5로설정하여검정하였다. 결과 YG-1 의세포독성효과 YG-1이마우스대식세포 RW 264.7에미치는영향을측정하기위하여세포독성실험을수행하였다. YG-1(up to 2 μg/ml) 을농도별로 24시간함께배양하였을때 1 μg/ml까지는대조군과비교하여세포의증식이억제되지않았다. 그러나 2 μg/ml 농도에서는세포의증식이다소감소되는것이확인되었다. 따라서 YG-1의독성이나타나지않는범위인 1 μg/ml를최고농도로설정한후이후실험을진행하였다 (Fig. 1). 또한 YG-1(1, 1, 1, 2 μg/ml) 을농도별로 1시간전처리후 LPS(1 ng/ml) 를처리하여 24시간배양한뒤세포생존률을측정한결과, LPS 단독처리군 (vehicle) 과비교하여 1, 1 μg/ml 농도에서농도의존적으로유의성있게증가하였다. 이결과에서 LPS 처리에의해감소한세포생존률이 YG-1 전처리에의해증가하였다는것을확인할수있었다 (Fig. 1). YG-1의 IL-1β, TNF-α, PGE2 의생성억제효과 YG-1이마우스대식세포에서분비하는대표적인염증성사이토카인인 IL-1β와 TNF-α에대하여억제효과가있는지알아보기위하여 ELIS kit을이용해세포배양액내의

5 송인봉 나지영 송기쁨 김석호 이지현 권영배 김대기 김대성 조형권 권중기 Cell viability (% of control). 12 1 8 6 4 2 Cell viability (% of control). 12 1 8 6 4 2 + Control 1 1 1 2 Concentration (mg/ml) Control Vehicle 1 1 1 2 LPS (1 ng/ml) Fig. 1. Effect of YG-1 on LPS-induced cell death in RW 264.7 cells. () MTT assay to determine YG-1 (up to 2 μg/ml) toxicity in RW 264.7 cells. () Cell viability of RW 264.7 cells after treatment with LPS (1 ng/ml) and YG-1 (up to 2 μg/ml) for 24 h. Data are expressed as mean±sem of three independent experiments. P<.1 vs. control, + P<.5, P<.1 vs LPS (vehicle). IL-1β와 TNF-α의분비량을측정하였다. IL-1β는 LPS 자극에따라유의성있게증가하였고, YG-1 처리농도에의존적으로유의성있게감소하였다. 또한양성대조약물인 flurbiprofen과비교하여 YG-1에서도비슷한억제효과를보여주었다 (Fig. 2). TNF-α의분비량은 LPS 자극에따라유의하게증가하였으나, YG-1의농도와관계없이감소되지않았다 (Fig. 2). 또한세포배양액에서의 PGE 2 함량을측정한결과 LPS 단독처리군 (vehicle) 에서는유의성있게증 가하였으며 YG-1 처리농도 1 μg/ml와 1 μg/ml에서농도의존적으로유의성있게억제되었다. 특히 1 μg/ml 에서는양성대조약물 flurbiprofen과유사한수준까지감소시키는효과가있는것으로확인하였다 (Fig. 2C). YG-1 의 NO 및 의생성억제효과 YG-1 추출물이염증반응및조직손상에관여하는요인으로작용하는 NO와 에대한억제효과를조사하였다. 7 6 * IL-1β 8 7 * TNF-α bsorbance (pg/ml). 5 4 3 2 bsorbance (pg/ml). 6 5 4 3 2 1 1 Control Vehicle Flu 2 YG 1 YG 1 Control Vehicle Flu 2 YG 1 YG 1 LPS (1 ng/ml) LPS (1 ng/ml) C bsorbance (pg/ml). 16 14 12 1 8 6 4 2 * PGE 2 Control Vehicle Flu 2 YG 1 YG 1 LPS (1 ng/ml) D NO assay (% of control). 1 8 6 4 2 * NO Control Vehicle Flu 2 YG 1 YG 1 LPS (1 ng/ml) Fig. 2. Effect of YG-1 (1, 1 μg/ml) on inflammatory makers (IL-1β, TNF-α, PGE 2, and NO) in LPS-induced RW 264.7 cells. RW 264.7 cells were treated with LPS (1 ng/ml) for 24 h in the absence or presence of YG-1 (1, 1 μg/ml) and flurbiprofen (2 μg/ml). Data were expressed as mean±sem of three independent experiments. * P<.1 vs. control, P<.1, P<.1 vs. LPS (vehicle).

급성염증성발열모델에서의항염증성약재혼합추출물 (YG-1) 의효과 51 세포배양액에서의 NO 농도는 LPS 단독처리군 (vehicle) 에서유의성있게증가하였으며, YG-1 처리농도의존적으로유의성있게감소하였다. 특히 YG-1의처리농도 1 μg/ ml에서 79% 의억제효과를보여대조군 (control) 과비슷한수준까지감소시키는것으로확인하였다 (Fig. 2D). 또한 의발현은 LPS 단독처리군 (vehicle) 에서현저히증가하였으나, YG-1을처리후농도의존적으로유의성있게감소하는것이확인되었다. 특히 1 μg/ml에서는양성대조약물 flurbiprofen과비교하여유사한효과가있는것으로확인하였다 (Fig. 3). YG-1 이 LPS에의해유도된 의발현억제효과마우스대식세포 RW 264.7에서 의발현에대한 YG-1 추출물의억제효과를알아보고자 의발현을측정하였다. 의발현은 LPS 단독처리군 (vehicle) 에서현저히증가하였으나, YG-1을처리후유의성있게감소하는것이보였다. 특히 COX 저해제인양성대조약물 flurbiprofen과비교하여뛰어난발현억제효과를보여주었다 (Fig. 3). LPS에의한염증성발열모델에서 YG-1 의효과 LPS(2.5 mg/kg) 를투여후 1시간간격으로 12시간동안체온을측정한결과는가장체온이많이올라간 6시간 (peak time) 과 12시간 (last time) 으로나누어기록하였다 (Fig. 4). 대조군 (control) 과비교해서초기에 LPS 단독처리군 (vehicle) 과 YG-1(1 mg/kg) 군은점차적으로온도가증가하는것이보였으나, YG-1(1 mg/kg) 군은 6시간후에 체온상승이억제되는것이보였다. Flurbiprofen(2 mg/ kg), YG-1(4 mg/kg) 은체온상승에크게변동이없는것으로보아 YG-1(4 mg/kg) 군에서 LPS 투여에따른발열을유의성있게억제하는것을확인할수있었다. 또한양성대조약물인 flurbiprofen군과비교하여 YG-1(1, 4 mg/kg) 은 LPS 투여 6시간 (peak time) 부터해열작용이비슷하게일어나는것을확인하였다 (Table 2, Fig. 4). LPS 에의해유도된 IL-1β, TNF-α, PGE2 의혈청내 YG-1 의발현억제효과실험시작후체온이가장많이올라간 6시간과실험종료시간인 12시간의혈청내염증성사이토카인 (IL-1β, TNFα, PGE 2) 의측정결과 6시간과 12시간모두 LPS 단독처리군 (vehicle) 에서증가하는것을확인하였다. Flurbiprofen (2 mg/kg) 과 YG-1(1, 4 mg/kg) 투여군에서 IL-1β 와 PGE 2 는유의성있게발현이억제되는것을보인반면, TNF-α는 LPS 처리군에서는유의성있게증가하였으나 YG-1과 flurbiprofen 투여군에서발현을억제하지못했다 (Fig. 5). 본실험의결과 YG-1이 LPS에의해증가되는염증성사이토카인의발현을억제함으로써발열이억제되는것으로사료된다. YG-1 의뇌조직내, 발현억제효과 YG-1(1, 4 mg/kg) 과 LPS(2.5 mg/kg) 를투여한후 6시간 (peak time) 과 12시간 (last time) 으로나누어안락사를시킨후송과체에서의 와 의발현을분석하였다. LPS 단독처리군 (vehicle) 에서는 와 의 LPS (1 ng/ml) Control Vehicle Flu 2 YG 1 YG 1 β-actin 35 3 25 2 15 1 5 * 35 3 25 2 15 1 5 * Control Vehicle Flu 2 YG 1 YG 1 LPS (1 ng/ml) Control Vehicle Flu 2 YG 1 YG 1 LPS (1 ng/ml) Fig. 3. Effect of YG-1 on production of and proteins in LPS-induced RW 264.7 cells. RW 264.7 cells were treated with LPS (1 ng/ml) for 24 h in the absence or presence of YG-1 (1, 1 μg/ml) and flurbiprofen (2 μg/ml). Data are expressed as mean±sem of three independent experiments. * P<.1 vs. control, P<.1, P<.1 vs. LPS (vehicle).

52 송인봉 나지영 송기쁨 김석호 이지현 권영배 김대기 김대성 조형권 권중기 Table 2. Change of rectal temperature in rats treated with YG-1 Time (h) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 Control 37.25±.4 1) 37.25±.4 37.5±.6 37.3±.1 37.25±.6 37.2±.4 36.85±.6 37.15±.2 37.25±.4 36.95±.4 37.±.2 36.75±.3 36.75±.2 Vehicle Flurbiprofen (2 mg/kg) YG-1 (1 mg/kg) YG-1 (4 mg/kg) 37.15±.4 37.44±.5 36.64±.4 37.4±.5 37.12±.7 37.78±.4 38.48±.5 38.4±.2 38.35±.4 38.2±.1 38.5±.3 37.95±.7 38.15±.3 37.2±.1 36.72±.2 36.94±.4 36.58±.2 36.68±.3 36.88±.3 37.36±.2 + 37.3±.7 37.5±.1 36.95±.3 36.4±.4 36.6±.2 36.65±.2 1) Data were expressed as mean±sem of three independent experiments. P<.1 vs. control, + P<.5, P<.1, # P<.5, ## P<.1 vs. LPS (vehicle). 37.25±.4 36.92±.4 37.12±.6 37.±.4 37.96±.5 38.8±.4 37.84±.4 # 37.75±.3 36.9±.2 36.55±.7 36.3±.2 36.7±.4 36.75±.3 ## 37.2±.2 36.84±.6 36.76±.4 36.44±.4 36.24±.3 36.34±.3 37.18±.3 # 37.65±.6 37.6±.1 37.4±.4 36.45±.1 36.4±.1 36.5±.1 ## ody temperature ( C). 39.5 39 38.5 38 37.5 37 36.5 36 35.5 35 34.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 Time (hour) Control Vehicle Flu 2 YG1 YG4 Fig. 4. Changes of body temperature. Data were expressed as mean±sem of three independent experiments. bsorbance (pg/ml). 18 16 14 12 1 8 6 4 2 IL-1β 6h (Peak time) + + # # 12h (Last time) ## ## bsorbance (pg/ml). 2 18 16 14 12 1 8 6 4 2 TNF-α 6h (Peak time) 12h (Last time) Control Vehicle Flu 2 YG 1 YG 4 Control Vehicle Flu 2 YG 1 YG 4 C 35 3 PGE2 6h (Peak time) 12h (Last time) bsorbance (pg/ml). 25 2 15 1 5 ## ## ## ## Control Vehicle Flu 2 YG 1 YG 4 Fig. 5. Effect of YG-1 on serum IL-1β, TNF-α, and PGE 2 by YG-1 in LPS-treated rat. Serum IL-1β, TNF-α, and PGE 2 were measured in the each peak time (6 h) and last time (12 h) using ELIS kit. Data were expressed as mean±sem of three independent experiments. * P<.1 vs. control, + P<.5, P<.1, # P<.5, ## P<.1 vs. LPS (vehicle).

급성염증성발열모델에서의항염증성약재혼합추출물 (YG-1) 의효과 53 LPS (1 ng/ml) Control Vehicle Flu 2 YG 1 YG 4 LPS (1 ng/ml) Control Vehicle Flu 2 YG 1 YG 4 β-actin β-actin 3 3 + 25 2 15 1 5 25 2 15 1 5 Control Vehicle Flu 2 YG 1 YG 4 Control Vehicle Flu 2 YG 1 YG 4 3 3 25 2 15 1 5 25 2 15 1 5 Control Vehicle Flu 2 YG 1 YG 4 Control Vehicle Flu 2 YG 1 YG 4 Fig. 6. Effect of YG-1 on production of and proteins in LPS-treated rat pineal glands. and protein expression were measured in the each () peak time (6 h) and () last time (12 h) using immunoblot analysis. Data were expressed as mean±sem of three independent experiments. P<.1 vs. control, P<.1 vs. LPS (vehicle). 발현이 peak time과 last time에서유의하게증가한반면 YG-1 투여군에서는 와 의발현이 peak time 과 last time 모두에서유의성있게발현이억제되는것을확인하였다 (Fig. 6). 고찰 YG-1에서많은부분을차지하는인동등 (Lonicera japonica) 은해열, 해독, 발한작용이있고 (6), 우방자 (rctium lappa) 는풍열 ( 風熱 ) 을내려주고선폐투진 ( 宣肺透疹 ) 하며, 소종 ( 消腫 ), 해독시키는효과가있어서풍열해수 ( 風熱咳嗽 ), 인후염 ( 咽喉炎 ), 풍진 ( 風疹 ) 등에사용된다 (4). 또한황금 (Scutellaria baicalensis) 은항염증, 해열, 이뇨, 혈압강하작용등이있으며, 현재만성기관지염, 전염성간염, 고혈압등에사용되고있다 (7). 실제임상에서발열및인후염환자에게여러한약성분들이치료에이용되고있으나 YG-1 에포함된복합처방을가지고인후염모델로사용되는면역세포와동물실험에서의평가는미비하다. 그에따라본연구에서는 LPS 처리에의해염증을유도한 RW 264.7 대식세포모델과염증성고열을유발시킨흰쥐에서 YG-1의염증완화효과및해열효과를증명했다. 본실험에사용된 LPS는주로세포및동물실험에서염증및고열유발모델에쓰이는약물이다 (15). 대식세포는전 (pro) 염증성사이토카인 IL-1β, TNF-α와같은염증성인자들의과잉생산을포함한면역반응의중심적인역할을한다 (16). 는대식세포를통해서많은양의 NO를생산하는주효소이며, NO의생산증가는류마티스성관절염과궤양성대장염을포함한다양한염증성질병의원인이되고있다 (17). 는보통정상조직에서는발현정도가매우낮으나염증성인자와같은스트레스에노출된대식세포에서발현되는효소로염증반응에주요한역할을담당하고있는것으

54 송인봉 나지영 송기쁨 김석호 이지현 권영배 김대기 김대성 조형권 권중기 로알려져있다 (18). 또한 에의한 PGE 2 생성은염증반응을매개하는것으로여겨진다고보고된바있다 (19-21). 본연구에서 YG-1은 발현을저해하여 PGE 2 생성을효과적으로억제하여만성염증성질환의예방및치료에적용가능성을제시하였다 (Fig. 2, 4). 이러한결과는 특이적억제제가 LPS 유도성염증반응을억제한다는것을뒷받침한다 (21). 본연구에서는 LPS 처리군염증성사이토카인인 IL-1β 와 TNF-α의발현이대식세포및흰쥐의혈청에서모두유의성있게증가한반면 YG-1을처리한대식세포에서는특이하게 IL-1β의발현만이유의성있게감소하는것을보여주었다 (Fig. 2). YG-1은 TNF-α의발현을억제시키지못했다 (Fig. 2). 따라서 YG-1의염증억제기능은 TNF-α가아닌 IL-1β의경로를따르는것으로해석된다. 염증성사이토카인 IL-1β의발현억제는결국 와 NO 발현의억제를유도했고 와 PGE 2 의발현도억제하는것으로사료된다 (19). 대식세포에서의이러한경향은흰쥐를대상으로한발열실험결과와일치하고있는것을알수있다 (Fig. 2). LPS 투여는발열매개인자인 IL-1β와 TNF-α 및 PGE 2 등의분비를유도함으로써염증반응을개시한다. 본연구에서도염증성사이토카인인 IL-1β와 TNF-α 및 PGE 2 모두유의성있게증가하는것을볼수있었다. 염증반응이일어날때가장먼저보이는증상인발열을측정해본결과 LPS 단독투여한군에서는체온이 6시간이후로계속높은상태를보였다. 하지만 YG-1을투여한군에서는체온이정상군과비교하여크게벗어나지않았다. 또한대조군으로해열제인 flurbiprofen을투여한군과비교하여 YG-1은뛰어난해열효과를가진것으로보였다 (Fig. 3). 흰쥐의혈청에서 LPS 투여에의해증가된염증성사이토카인 IL-1β와 TNF-α 및 PGE 2 의분비억제를측정해본결과대식세포에서의결과와동일하게 IL-1β와 PGE 2 의분비감소는보여주었으나 TNF-α의분비감소는보여주지못했다 (Fig. 5). 발열과관계가깊은송과선에서의 와 의단백질발현을체온의변화에따라 peak time(6 h) 과 last time(12 h) 에서확인한결과 YG-1에의한유의성있는억제를확인할수있었다 (Fig. 6). LPS 발열에대한 YG-1의해열효과는대식세포에서확인한것과동일한기전에의해매개될수있다. 하나는 YG-1이 IL-1β와 PGE 2 의발현억제와함께 를억제시킴으로써내인성해열시스템이활성화될수있다는것이며 (22), 또하나는 YG-1이 LPS에의해뇌혈관및뇌전체에서증가된 를억제함으로써발열물질인 PGE 2 의생산이감소되었다고볼수있다. 요약하면 YG-1은 LPS 유도성발열을농도의존적으로억제시키는해열작용을가지고있으며, YG-1의해열효과는뇌에서 LPS에의해증가된 와 를억제시키는것과관련이매우깊다고판단되었다. 요 YG-1의항염증및해열치료약물로서의가능성을검증하기위하여대식세포와동물모델에서염증성사이토카인활성및해열관련인자들을연구하여다음과같은결론을얻었다. YG-1은염증성사이토카인인자인 IL-1β의발현을효과적으로억제하였으며, 및 의발현을억제시킴으로써염증인자인 NO 및 PGE 2 생성을유의적으로감소시키는것으로나타났다. 또한 YG-1은 LPS 유도성발열모델에서염증을완화시키고해열의효과를보여주었다. 이상의실험결과로부터본실험에사용된 YG-1은염증에의해유발되는인후염과같은질환을예방및치료할수있을것으로기대된다. 약 감사의글 본연구는농림축산식품부생명산업기술개발사업 (31257-3) 에의해이루어진것임. REFERENCES 1. Liu E, Lewis K, l-saffar H, Krall CM, Singh, Kulchitsky V, Corrigan JJ, Simons CT, Petersen SR, Musteata FM, akshi CS, Romanovsky, Sellati TJ, Steiner. 212. Naturally occurring hypothermia is more advantageous than fever in severe forms of lipopolysaccharide- and Escherichia coli-induced systemic inflammation. m J Physiol Regul Integr Comp Physiol 32: 1372-1383. 2. Kim DH. 26. Chinese medicine pharmacology. 2th ed. Shinil ooks, Seoul, Korea. p 198, 22, 239. 3. Kardosová, Ebringerová, lföldi J, Nosál'ová G, Franová S, Hríbalová V. 23. biologically active fructan from the roots of rctium lappa L., var. Herkules. Int J iol Macromol 33: 135-14. 4. Nam JY, Kim DG, Lee JY. 26. Effects of Woobangja on anti-allergic inflammation. J Korean Oriental Pediatrics 2: 241-255. 5. Tae J, Han SW, Yoo JY, Kim J, Kang OH, aek OS, Lim JP, Kim DK, Kim YH, ae KH, Lee YM. 23. nti-inflammatory effect of Lonicera japonica in proteinase-activated receptor 2-mediated paw edema. Clin Chim cta 33: 165-171. 6. Lee YC, Kwon TH, Ok IS, Seo CW, Kim YJ, Roh SS, Seo Y. 25. The experimental studies on the immunomodulational effects of Lonicerae Caulis et Folium: the effects of Lonicerae Caulis et Folium on cytokines production in mice splenocytes. Kor J Herbology 2: 141-149. 7. Cho SH, Kim YR. 21. ntimicrobial characteristics of Scutellariae Radix extract. J Korean Soc Food Sci Nutr 3: 964-968. 8. Zhang DY, Wu J, Ye F, Xue L, Jiang S, Yi J, Zhang W, Wei H, Sung M, Wang W, Li X. 23. Inhibition of cancer cell proliferation and prostaglandin E2 synthesis by Scutellaria baicalensis. Cancer Res 63: 437-443. 9. Jung SM, Schumacher HR, Kim H, Kim M, Lee SH, Pessler F. 27. Reduction of urate crystal-induced inflammation by root extracts from traditional oriental medicinal plants:

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