J Korean Soc Food Sci Nutr 한국식품영양과학회지 45(3), 342~351(2016) http://dx.doi.org/10.3746/jkfn.2016.45.3.342 식품색소 Canthaxanthin 의 HPLC 최적분석법확인및타당성과측정불확도평가 서희재 1 김경수 2 홍미나 2 이찬 2 1 선문대학교식품과학과 2 중앙대학교식품공학부 Validation and Uncertainty Evaluation of an Optimized Analytical Method Using HPLC Applied to Canthaxanthin, a Food Colorant HeeJae Suh 1, KyungSu Kim 2, MiNa Hong 2, and Chan Lee 2 1 Department of Food Science, Sun Moon University 2 School of Food Science & Technology, ChungAng University ABSTRACT This study was carried out to develop an optimized analytical method using highperformance liquid chromatography (HPLC) applied to canthaxanthin, which is not yet designated as a food colorant in Korea, as well as to perform validation and uncertainty evaluation of this method. Official methods of AOAC, UK, and Japan with HPLCUV detection were evaluated for the analysis of canthaxanthin by comparison of linearity, resolution, selectivity, limit of detection (LOD), limit of quantitation (LOQ), accuracy, precision, recovery, interlaboratory tests, and uncertainty measurement. The calibration curves showed high linearity with an R 2 value of over 0.999 for canthaxanthin standard solutions in all three official methods. The official method of Japan exhibited the best results in terms of resolution and selectivity, including the lowest LOD and LOQ. The average coefficients of variation were calculated as less than five of three institutes with a precision value less than 1, accuracy near 100%, and recovery ratio between 100±10%. The expanded uncertainty for canthaxanthin was estimated to be 39.5±5.29 mg/kg (95% confidence level, k=2), and the uncertainty of measurement was 13.4%. In this study, official methods of canthaxanthin were compared and the validities verified. The results will be further applied to establish an authorized analytical method for canthaxanthin in Korea. Key words: canthaxanthin, food color, HPLCUVD, uncertainty 서 Canthaxanthin은지용성의카로티노이드계색소로일부다른카로티노이계물질들과함께주로 βcarotene4,4' dione으로구성되어있다 (1). 자연계에존재하는 canthaxanthin은주로 trans 형태이며, 화학식은 C 40H 52O 2, 분자량은 564.84 g/mol이다. Canthaxanthin을식품이나화장품등에사용하기위해서는독성에대한안전성이입증되어야하므로 1974년부터국제식품첨가물전문가위원회 (FAO/WHO Joint Expert Committee on Food Additives, JECFA) 를중심으로독성평가가이루어졌으며 (2), 1983년이후에는유럽연합식품과학위원회 (EU Scientific Committee on Food, SCF) 에서도 canthaxanthin에대한독성평가가이루어졌다 (3). WHO Received 11 October 2015; Accepted 6 January 2016 Corresponding author: Chan Lee, School of Food Science & Technology, ChungAng University, Anseong, Gyeonggi 17546, Korea Email: chanlee@cau.ac.kr, Phone: +82316703035 론 에의하면 80일동안 1,000 mg/kg bw/d 농도로 canthaxanthin을섭취한생쥐에게경구발암독성에대한특이점은발견되지않았고, 52주동안 250 mg/kg bw/d로 canthaxanthin을섭취한개에서도부작용이발생하지않았으며, 토끼를이용한안구독성평가및쥐의 3세대생식독성평가에서도특이점은발견되지않았다고한다 (4). 여러연구자의 canthaxanthin 독성평가결과를토대로 JECFA는 1995년 canthaxanthin 독성에대한결론을내리고, 원숭이와사람에서관찰된망막결정침전형성에기초하여일일허용섭취량 (Acceptable Daily Intake, ADI) 을 0~0.03 mg/kg bw/d 로설정하였다 (2). 이에따라현재 canthaxanthin은유럽과미국에서음료, 소시지, 수산물, 동물사료등에착색의용도로사용되고있고 (E 161 g), 일본에서는식품에는사용할수없으나개의사료에사용할수있도록허용되어있다. 또한자외선 (ultraviolet) 을조사한피부에 6,680 mg/kg bw/d의 canthaxanthin이발암예방효과를지닌다는연구등에따라 (4) 미국에서는 canthaxanthin을화장품에도사용하도록허용하고있다 (5).
식품색소 Canthaxanthin 의 HPLC 최적분석법확인및타당성과측정불확도평가 343 현재우리나라에는식품, 사료, 화장품모두에서 canthaxanthin의사용이금지되어있으므로국내에서는 canthaxanthin의생산및유통이허용되지않을뿐만아니라, 식품에이색소가사용되었을때판별해낼수있는분석법이확립되어있지않다. 우리나라에서사용이허용된착색료는화학적합성품 26개품목, 천연첨가물 24개품목이므로 (Table 1), 이 50품목의착색료에대한분석방법만확립되 어있을뿐지정되지않은착색료에대한분석방법은확립되어있지않다 (6). 그러나우리나라에는미지정착색료라할지라도외국에서허용된착색료의경우에는그지정현황및사용기준을확인하여수입식품중미지정착색료의혼입가능성을예측할필요가있으므로외국에서많이사용되는국내미지정착색료 canthaxanthin에대한분석법확립은절실히요구되고있다. Table 1. The present status of food colors designated by major countries in line with those by Korea Food color CAS NO. Korea Japan USA EU CODEX 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 Copper chlorophyllin Sodium copper chlorophyllin Potassium copper chlorophyllin Riboflavin Riboflavin 5'phosphate sodium Food red No.102 Food red No.2 Food red No.2 aluminium lake Food red No.3 Food red No.40 Food red No.40 aluminium lake Food blue No.1 Food blue No.1 aluminium lake Food blue No.2 Food blue No.2 aluminium lake Food yellow No.4 Food yellow No.4 aluminium lake Food yellow No.5 Food yellow No.5 aluminium lake Titanium dioxide βcarotene Carmine Calcium carbonate Iron sesquioxide Food green No.3 Food green No.3 aluminium lake βapo8'carotenal Gold leaf Beet red Curcumin, turmeric oleoresin Annatto extract Alfalfa extract Sandalwood red Purple sweet potato color Maize morado color Purple yam color Red radish color Red cabbage color Perilla color Gardenia blue Gardenia yellow Caramel color Carotene Cochineal extract Chlorophyll Tannic acid Tomato color Oleoresin paprika Grape juice color Grape skin extract 83885 Anhydrous:103405 2611827 915673 12227622 16423680 25956176 68583959 3844459 68921426 16521383 16521383 1934210 12225217 2783940 15790075 13463677 7235407 1390654 471341 1309371 2353459 1107262 7440575 7659952 (betanin) 458377 (curcumin) 1393631 (annatto) 127402 (lutein) 1397702 (santalin) 42553651 (crocin) 27876944 (crocetin) 8028895 (caramel) 1343788 (carminic acid) 1406651 1401554 502658 (lycopene) 68917782
344 서희재 김경수 홍미나 이찬 식품중 canthaxanthin 을분석하는방법은영국 (7), AOAC (8), 일본 (9), 유럽연합 (3) 등에서보고되었지만, 타당성검증및측정불확도에관한보고는매우미흡한형편이다. 따라서본연구에서는국내에서미지정인착색료 canthaxanthin의제외국공인분석법을검토하여직선성 (linearity), 분리능 (resolution), 민감도 (selectivity), 검출한계 (limit of detection, LOD), 정량한계 (limit of quantification, LOQ) 등을비교하여최적분석법을확보하고자하였다. 그리고확보된최적분석법의정밀성 (precision), 정확성 (accuracy), 회수율 (recovery), 실험실간반복실험 (interlaboratory test), 측정불확도 (uncertainty measurement) 산출을통해타당성 (validation) 을검증하여수입식품의안전하고신속한관리를위한분석법으로제시하고자하였다. 재료및방법시약및시액 Transcanthaxanthin은 SigmaAldrich Co.(St. Louis, MO, USA) 에서구입하였으며, ciscanthaxanthin은 Santa Cruz Biotechnology(Heidelberg, Germany) 제품을사용하였다. 트립신 (trypsin), 펩신 (pepsin), 하이드록시톨루엔부틸 (butylated hydroxytoluene, BHT), 트리플루오르아세트산 (trifluoroacetic acid, TFA) 은 SigmaAldrich Co. 제품이며, HPLC용메탄올 (methanol), n헥산 (nhexane), 아세토니트릴 (acetonitrile), 물 (water) 은 Burdick & Jackson(Seoul, Korea) 에서공급되었다. 프로필알코올 (npropyl alcohol), 에탄올 (ethanol), 무수황산나트륨 (sodium sulfate anhydrous) 은 Duksan Pure Chemical Co. Ltd. (Gyeonggi, Korea) 에서구매하였으며, Samchun Chemical (Seoul, Korea) 에서디에틸에테르 (diethyl ether) 와디클로로메탄 (dichloromethane) 을구입하였다. Canthaxanthin을 N,Ndimethyl formamide(sigma Aldrich Co.) 에용해하여 500 μg/ml 표준용액으로조제한후 10, 20, 50, 100, 150, 200 μg/ml 농도로희석하여분석에사용하였다. 분석장비가공식품중 canthaxanthin을분석하기위해 2개펌프가부착된고속액체크로마토그래피 (HPLC, Agilent, Santa Clara, CA, USA) 를사용하였고, 자외선검출기 (UVD, Agilent) 를사용하여 475 nm, 470 nm, 460 nm, 415 nm의파장에서분석하였다. 분석칼럼으로 Eclipse XDB C 18(5 μm, 4.6 150 mm, Agilent), ZORBAX Eclipse DBC18(4.6 150 mm, 5 μm, Agilent), YMCPack C30(4.6 250 mm, 5 μm, YMC, Tokyo, Japan), LiChrospher Si 60(4.6 250 mm, 5 μm, Merck, Kenilworth, NJ, USA) 을구입하여사용하였다 (3,79). 분석신뢰성확보를위해 LCMS(liquid chromatographymass spectrometry, Thermo LTQ velos, Accela HPLC)(Thermo Scientific, San Jose, CA, USA) 를이용하여 canthaxanthin 분석피크를재확인하였다. HPLC 를이용한 canthaxanthin 분석가공식품중 canthaxanthin의최적분석법을확보하기위하여 AOAC법, 유럽연합, 영국, 일본의공인분석방법으로 (Table 2) 기기분석후 (3,79) 결과를비교하였다. Table 2. HPLC conditions for analysis of canthaxanthin by various methods Reference AOAC 1) MLHW 2) FSA 3) EFSA 4) Column 4.6 250 mm, 5 μm 4.6 150 mm, 5 μm 4.6 150 mm, 5 μm 4.6 250 mm, 5 μm Stationary phase Mobile phase YMCPack C30 (YMC, Tokyo, Japan) A; 0.2% vitamin C MTBE 5) : methanol=1:10 (v/v) B; 100% MTBE Gradient 0 57 min: 100% A (0.9 ml/min) 57 60 min: 100% B (2.0 ml/min) 60 65 min: 100% A (0.9 ml/min) Eclipse XDBC18 (Agilent, Santa Clara, CA, USA) 0.05% TFA : methanol =3:97 (v/v) ZORBAX Eclipse DBC18 (Agilent) acetonitrile : methanol =95:5 (v/v) LiChrospher Si 60 (Merck, Kenilworth, NJ, USA) nhexane : acetone =86:14 (v/v) Column temp. 30 C 40 C 25 C 25 C Flow rate 0.9 ml/min 1.2 ml/min 1.0 ml/min 1.3 ml/min Injection vol. 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl Wavelength λ.=415 nm λ.=475 nm λ.=470 nm λ.=446 nm Retention time 17 18 min about 6 min about 8 min low resolution and repeatability Run time 65 min 30 min 30 min 30 min 1) AOAC (8). 2) MLHW (9). 3) FSA (7). 4) EFSA (3). 5) Methyl tertiary butyl ether.
식품색소 Canthaxanthin 의 HPLC 최적분석법확인및타당성과측정불확도평가 345 HPLC 분석법비교및최적분석법확인가공식품중 canthaxanthin의최적분석법을확인하기위하여표준용액을 5, 10, 20, 50, 100, 300 μg/ml의 6 point로희석한후 AOAC법, 유럽연합, 영국, 일본의공인분석방법 (3,79) 에서제시한방법에따라 HPLC 분석을하여검량선을구하고그상관계수 (R 2 ) 값을통해직선성을검토하였다. 또한위의공인분석방법으로부터얻은 HPLC 크로마토그램의분리능과민감도를계산하기위하여다음식을이용하였다 (10). Resolution= 2(t2t1) w2+w1 t1: the retention time of the adjacent peak t2: the retention time of the peak w1: the width of the adjacent peak w2: the width of the peak Selectivity= k2 (t2t0)/t0 = k1 (t1t'0)/t'0 k1: retention factor of the peak k2: retention factor of 2nd peak t1: the retention time of the peak t2: the retention time of 2nd peak t0, t'0: void time (1) (2) Canthaxanthin 기기분석의검출한계와정량한계를산출하기위하여저농도로제조된 canthaxanthin 표준용액 3 point 12.5, 25, 50 μg/ml의검량선을작성하였다. 기울기값과중간농도 25 μg/ml를 7회분석하여구한표준편차값을이용하여 ICH Harmonised Tripartite Guideline(11) 에서제안한다음과같은계산식을이용하여검출한계와정량한계를산출하였다. LOD=3.3 σ/s (3) LOQ=10 σ/s σ = standard deviation of the intermediate concentration S = gradient of standard calibration curve at low concentration 분석법확인분석법의신뢰성을확보하기위해 LCMS와 LCMS/ MS(liquid chromatographmass spectrophotometer, Thermo LTQ velos, Accela HPLC) 를이용하여 Table 3 의분석조건으로 canthaxanthin 피크를재확인하였다. Canthaxanthin 전처리 AOAC법, 일본과유럽연합의공인분석방법 (3,8,9) 에따라균질화된시료 5 g을취하여전처리한후각결과를비교하였다. AOAC 분석법에서는시료 5 g을 250 ml 용량플라스크에칭량후 BHT 250 mg, 디클로로메탄 120 ml, 에탄 Table 3. LCMS conditions for the determination of canthaxanthin Instrument Mobile phase Flow rate Injection vol. Ionization mode Run time LCMS (liquid chromatographmass spectrophotometer, Thermo LTQ velos, Accela HPLC) (Thermo Scientific, San Jose, CA, USA) A : B=30:70 (v/v) A: acetonitrile B: water with 0.1% formic acid (v/v) 300 μl/min 10 μl ESILCMS/MS 6.6 min 올 100 ml를첨가하여암실에서 2시간반응시킨다음디클로로메탄을가해 250 ml로맞춘후격렬히진탕하여칸타잔틴을추출하였다. 이과정을 3 반복진행하여칸타잔틴이추출되어있는디클로로메탄층을모두모아진공농축기 (rotary vacuum evaporator, EYELA, Tokyo, Japan) 를이용하여농축시킨후이동상에녹여 0.45 μm membrane filter로여과 (Millipore, Milford, MA, USA) 한것을 HPLC 시험용액으로하였다 (8). 일본후생노동성분석법에서는시료 5 g에아세토니트릴 30 ml와 n헥산 20 ml를넣고소량의무수황산나트륨을더해균질화한후 3,000 rpm에서 5분간원심분리하여 canthaxanthin을추출하였다. 3 반복으로추출된아세토니트릴층을모아진공농축기 (EYELA) 로농축한후메탄올에녹여 0.45 μm membrane filter로여과 (Millipore) 한것을 HPLC 시험용액으로하였다 (9). 유럽연합방법에서는시료 5 g에트립신과펩신을각각 50 mg씩넣고증류수 80 ml와 25% 암모니아수 1 ml를첨가해 50 C에서 30분간초음파처리하였다. 증류수를더해 100 ml를맞춘후에탄올 40 ml와디에틸에테르 60 ml를넣어 canthaxanthin을추출하고진공농축기 (EYELA) 를이용하여농축한후 (50 C 이하 ) 이동상에녹여 0.45 μm membrane filter로여과 (Millipore) 한것을 HPLC 시험용액으로하였다 (3). 이때색소추출과정은 3 반복으로진행되었다. 최적분석법의타당성검증 AOAC법, 유럽연합, 영국, 일본의공인분석방법 (3,79) 에서제시한방법에따라가공식품중 canthaxanthin을분석해보고, 각공인분석방법에따른분석결과로부터직선성, 분리능, 민감도, LOD, LOQ 등을비교하여최적의 canthaxanthin 분석방법을확보하였다. 그리고확보된방법의정밀성, 정확성, 회수율, 실험실간반복측정, 측정불확도등을산출하여타당성을검증하였다. 정밀성과정확성은일간및일내반복실험을통해산출되었다. 일간분석을위해직선성에해당하는검량농도 6 point(10, 20, 50, 100, 150, 200 μg/ml) 를지정하여하루에 1회분석으로 3일간측정후합산하여정밀도와정확도를산출하였다. 일내분석에서는검량농도와는다른 4 point
346 서희재 김경수 홍미나 이찬 (30, 60, 120, 180 μg/ml) 를제조하여하루에 5회반복분석한결과로정밀도와정확도를산출하였다. 정밀도를일간및일내반복분석결과의표준편차로산출하고, 정확도는이론값과실측값을비교하여산출하였다. Canthaxanthin을사용할수있는서로다른 3개의식품매트릭스 ( 수산물, 음료, 유제품 ) 에최종농도가 5, 10, 50 μg/ ml가되도록 canthaxanthin 표준용액을첨가하여회수율을측정하였다. 회수율은 3 반복실험으로진행되었다. Canthaxanthin 최적분석법의타당성을확보하기위하여서로다른 3개의실험실에서같은농도조건으로조제된시료를실험하여실험실간교차검증을하였다. 3개실험실에서직선성과회수율을 3 반복측정하고그결과값의 C.V 를산출하여교차검증의우수성을확인하였다. 6개농도로조제한 canthaxanthin 표준용액 10, 20, 50, 100, 150, 200 μg/ml를 3 반복측정하여검량선을작성하고그 R 2 값과 C.V 를산출해직선성을확인하였다. 또한한가지식품군에최종농도가 10, 20, 50 μg/ml가되도록 canthaxanthin 표준용액을첨가한후회수되는농도를측정하여이론값에대비한회수율을산출하고, 실험실간 C.V 값을산출하였다. 최적분석법의측정불확도추정 Canthaxanthin 최적분석방법의불확실성을추정하기위하여 GUM(Guide to the expression of uncertainty in measurement) 에근거하여모델식을설정하고 (12), 시료전처리에대한불확도, 표준물질순도에대한불확도, 표준용액제조에대한불확도, 표준물질검량선에대한불확도, 반복측정에대한불확도를설정하여 Fig. 1과같이특성요인 도 (Fish bone diagram) 를나타내었다. 식 (4)~(8) 을이용하여각각의불확도요인에대한표준불확도, 상대표준불확도, 합성상대표준불확도, 합성표준불확도, 확장불확도를산출하여 canthaxanthin 분석법의측정불확도를추정하였다 (1214). 위의불확도요인에대한표준불확도를산출할때반복측정값이있는경우는 A type 표준불확도식 (4) 를이용하였고, 교정성적서상의불확도또는반복측정하지않은데이터를이용하는경우는 B type 표준불확도식 (5) 를이용하였다. 검량선이외의실험에서반복측정이이루어진경우는자유도를 n1로계산하였고, 검량선을위한실험에서는반복측정이이루어졌다고하더라도 KRISS 지침에따라검량선기울기에대한표준불확도의자유도를 n2로계산하였다 (14). 합성표준불확도는식 (4) 또는식 (5) 를이용하여산출한각불확도요인의표준불확도값을근거로불확도전파의법칙에따라식 (6) 을이용하여산출하였다 (1214). 확장불확도는식 (8) 과같이합성표준불확도에포함인자 k를곱하여산출하였다. 이때자유도는식 (7) 을이용하여산출하였으며, 자유도가 10보다큰경우는 95% 신뢰수준에서 k=2를적용하였고, 10보다작은경우는 Student t분포표를이용하여 κ값을적용하였다 (1214). u(x i) = (4) (A type) u(x i) = (5) (B type) = (6) Fig. 1. Fish bone diagram of uncertainty sources in canthaxanthin determination.
식품색소 Canthaxanthin 의 HPLC 최적분석법확인및타당성과측정불확도평가 347 = (7) = (8) u : Standard uncertainty n : Number of measurements : Combined standard uncertainty : Effective degree of freedom U : Expanded uncertainty k : Coverage factor 결과및고찰 Canthaxanthin HPLC 분석법의분리능, 민감도, 직선성, LOD, LOQ 비교 Canthaxanthin의 HPLC 최적조건을확인하기위하여 AOAC법, 일본, 영국, 유럽연합의공인분석법 (3,79) 에서제시한 Table 2의조건으로실험한결과 Fig. 2와 Fig. 3의결과를얻었다. 분리능은 AOAC법이 5.8로가장좋았으나오랜분석시간 (65분) 과머무름시간 (17.8분) 을나타내었고, 유럽연합공인분석법은피크의분리능및민감도에문제가있는것으로나타나비교대상에서제외했다 (Fig. 2). 일본과영국의공인분석법으로 canthaxanthin을분석시총분석시간 30분, 머무름시간 6~8분으로비슷한결과를나타내었지만, 분리능과민감도는일본방법이각각 4.0, 1.3으로나타났고영국방법이각각 2.4, 1.3으로나타나일본방법이더우수하였다 (Fig. 2). 또한 canthaxanthin 표준용액을 5, 10, 20, 50, 100, 300 μg/ml의 6 point로희석한후 Table 2의조건으로 HPLC 분석을통해얻은검량선의상관계수 (R 2 ) 는 AOAC, 일본, 영국의공인분석법모두 0.999 이상으로양호한직선성을나타내었다 (Fig. 2)(15). 1 2 3 4 Fig. 2. Chromatogram and calibration curves of canthaxanthin standard solution by using various HPLC methods. 1, AOAC (8); 2, MLHW (9); 3, FSA (7); 4, EFSA (3).
348 서희재 김경수 홍미나 이찬 Fig. 3. Full mass scan of canthaxanthin using LCMS and LCMS/MS. LOD와 LOQ는 AOAC법이 0.105 mg/kg, 0.918 mg/kg 으로나타났고, 일본의공인분석법은 0.084 mg/kg, 0.254 mg/kg으로나타났으며, 영국의공인분석법은 0.395 mg/ kg, 1.196 mg/kg으로나타나일본공인분석법이가장우수하였다. LCMS와 LCMS/MS를이용한 canthaxanthin 분석결과는 Fig. 3과같다 (15). 정밀도및정확도를이용한 canthaxanthin 최적분석법확인위의결과를종합해볼때일본에서발표한 canthaxanthin 공인분석방법의 HPLC 분석조건이직선성, 분리능, 민감도, LOD, LOQ 면에서가장우수한것으로나타났다. 그러나 이방법이 canthaxanthin 분석을위한최적의방법이되기위해선실험중에발생할수있는계통오차 (systematic error) 또는우연오차 (random error) 가이상적인기준에부합하는지확인해볼필요가있다. 따라서일간분석및일내분석을통해정밀도와정확도를측정한결과 (12) Table 4와같은결과를얻었다. Canthaxanthin 표준용액의농도를 10, 20, 50, 100, 150, 200 μg/ml의 6 point로희석하여하루에 1회분석으로 3일간측정하여얻은일간분석에서정밀도는 0.06~1.09로나타났고, 정확도는 91~102% 로나타났다. 또한 canthaxanthin 농도를 30, 60, 120, 180 μg/ml의 4 point로조제하여하루동안 5회분석하여얻은일내분석에서는정밀도가 0.04~1.19, 정확도는 101~106% 로나타났
식품색소 Canthaxanthin 의 HPLC 최적분석법확인및타당성과측정불확도평가 349 Table 4. Precision and accuracy obtained from interday test and intraday test using optimized analysis methods Interday test (n=3) Intraday test (n=5) Spiked concentration (μg/ml) Mean concentration (μg/ml) Precision Accuracy 10 9.12 0.06 91.2 20 19.23 0.21 96.1 50 49.97 0.46 100 100 101.43 0.44 101.4 150 153.34 1.09 102.2 200 196.91 0.9 98.5 30 31.68 0.04 105.6 60 62.82 0.1 104.7 120 125.9 0.19 104.7 180 181 0.12 100.5 다. 즉, 일간분석및일내분석모두에서국제표준화기구 (International Organization for Standardization, ISO) 가이상적인측정값이라고설정한정밀도 1, 정확도 90~105% 의기준에근접하는결과를나타내 (12), 일본의공인분석방법이 canthaxanthin 최적분석방법이되기에매우타당하였다 (15). Canthaxanthin 전처리법비교및최적화 Canthaxanthin 사용대상식품인음료, 유제품, 수산물가공품의 3개식품군에속하는시료각 5 g을취하여 canthaxanthin 표준용액을 50 mg/kg 농도가되도록첨가한후 AOAC법, 일본및유럽연합의공인분석방법에따라전처리하고 (3,8,9), 위에서 canthaxanthin 최적기기조건으로확인된일본의 HPLC 분석조건 (Table 2) 으로분석한결과는 Table 5와같다. 유럽연합의 canthaxanthin 전처리법은음료, 유제품, 수산물가공품모두에서 53% 이하의회수율을보여가장정확도가떨어지는것으로나타났다. 또한전처리절차중효소처리과정이포함되어있어오랜분석시간이요구될뿐만아니라분석비용이많이드는단점이발생하였다. AOAC 방법은전처리법이간단하였지만세종류식품매트릭스에첨가한 canthaxanthin 회수율이 73% 이하로나타나역시최적전처리법으로확보되기에는부족하였다. 일본공인분석법의경우 50 mg/kg 농도로첨가한 canthaxanthin이 세가지서로다른매트릭스에서 91~99% 로회수되는것으로나타나가장좋은결과를보였다. 최적분석법이되려면낮은첨가농도에서도높은회수율을나타내어야하므로, canthaxanthin 표준용액을최종농도가 5, 10, 50 mg/kg이되도록세종류식품매트릭스에첨가하여일본의전처리법으로다시한번회수율실험을한결과세농도모두에서 87~106% 의우수한회수율을나타내고, 분석법의정밀도를나타내는분석값간의상대표준편차는 1.7~23.9 % 의좋은결과를나타내었다 (Table 6). 이상에서가공식품중 canthaxanthin 최적전처리법과 HPLC 기기조건은모두일본의공인분석법으로확인되었다. Canthaxanthin 최적분석법의실험실간교차검증 Canthaxanthin 최적분석방법으로확인된일본의공인분석법을이용하여서로다른 3개의실험실에서 HPLC 기기의직선성과회수율을측정한결과는 Table 7과같다. 검량선농도를 10, 20, 50, 100, 150, 200 μg/ml의 6 point로조제하여측정한결과각실험실간에약간의차이는있었으나 R 2 값이 0.999 이상으로우수하였다. 한가지식품군에 10, 20, 50 μg/ml의 3개농도가되도록 canthaxanthin을첨가한후회수율을측정한결과세기관모두에서 90~ 110% 로나타났고, CV% 값이평균 5% 정도로평이한결과를얻어분석방법의타당성이입증되었다 (14,15). Table 5. Comparison for recoveries of canthaxanthin in the 50 μg/ml spiked concentration using various official methods AOAC 1) MHLW 2) EFSA 3) Beverage Dairy product Fishery product Mean concentration 36.4±2.9 34.9±3.1 36.0±4.1 RSD 8.0 8.7 12.1 1) AOAC (8). 2) MLHW (9). 3) EFSA (3). Recovery 72.8 69.9 66.7 Mean concentration 49.0±8.0 45.6±4.2 49.3±2.5 RSD 16.2 9.2 5.1 Recovery 97.9 91.2 98.6 Mean concentration 26.7±6.0 26.0±2.3 26.0±3.1 RSD 22.3 8.9 12.1 Recovery 53.4 52.0 51.5 Table 6. Recoveries of canthaxanthin using optimized analysis methods Class Spiked concentration Mean±SD (μg/ml) RSD Recovery Beverages Dairy products Processed marine products 5 μg/ml 10 μg/ml 50 μg/ml 5 μg/ml 10 μg/ml 50 μg/ml 5 μg/ml 10 μg/ml 50 μg/ml 4.7±0.4 8.7±0.4 49.0±8.0 5.0±0.1 9.0±2.2 45.6±4.2 4.7±0.1 10.6±1.2 49.3±2.5 7.4 4.1 16.2 2.4 23.9 9.2 1.7 11.5 5.1 94.6 87.4 97.9 100.0 90.4 91.2 93.5 106.0 98.6
350 서희재 김경수 홍미나 이찬 Table 7. Inter laboratory test using optimized canthaxanthin analysis methods Spiked concentration Laboratory 1 Laboratory 2 Laboratory 3 C.V Recovery 10 μg/ml 20 μg/ml 50 μg/ml 101.1% 102.3% 95.4% 95.6% 94.6% 90.2% 109.9% 97.7% 90.7% R² (correlation coefficient) 0.9996 0.9995 0.9999 7.05 3.95 3.96 Canthaxanthin HPLC 최적분석법의측정불확도본실험에서확인한 canthaxanthin 최적분석법의타당성을확보하기위하여측정불확도를평가하였다. 측정결과값에영향을줄수있는불확도인자로시료전처리, 표준물질, 표준용액제조, 검량곡선, 시료반복측정을설정하였고, 요인별측정값에서표준불확도, 상대표준불확도, 합성상대표준불확도, 합성표준불확도, 확장불확도를계산하여 canthaxanthin 측정불확도를산출하였다. 이때측정결과에대한불확도는약 95% 의신뢰수준에서의포함인자 (k, coverage factor) 를적용하여산출하였다 (14,1618). 시료전처리에대한표준불확도에는저울과용량플라스크가포함되었다. 화학저울교정성적서상의불확도, 표준분동에대한반복측정안정성, 화학저울의분해능이저울의불확도요인으로측정되었으며, 교정성적서상의불확도, 물무게의반복측정안정성, 온도에대한부피안정성이용량플라스크의불확도요인으로측정되었다. 화학저울에대한교정성적서상의불확도는 0.0003 g(95% 신뢰수준 ) 으로나타나표준불확도는 0.00013이었다. 저울의안정성실험에서는 25 g 분동을이용하여 4회반복측정한합동표준편차가 0.000052 g으로나타나표준불확도는 0.000026이었다. 화학저울의분해능은 0.0001 g이었으며, 분해능에대한표준불확도는 0.0000289였다. 용량플라스크의교정성적서상의불확도는 0.69 ml이고표준불확도는 0.35였다. 물을채워 10회반복측정시의표준편차는 0.00348 g이고표준불확도는 0.00110이었다. 실험실온도변화 (±5 C) 에따른물의팽창계수 (0.00021/ C) 를고려한표준불확도는 0.061로나타났다. 따라서시료전처리에대한저울과용량플라스크의상대표준불확도는각각 0.0000027, 0.0007이었고, 합성상대표준불확도는 0.0007로나타났다. 표준물질의불확도는제조사규격을적용하여산출하였다. Canthaxanthin 표준물질의순도는 98.8%, 오차는 ± 1.2% 였고, 신뢰구간이정해져있지않았으므로직사각형분포로추정하였다. Canthaxanthin 표준물질의불확도는오차를 3으로나누어 0.0069로산출되었으며, 합성상대표준불확도는 0.0070으로산출되었다. 표준용액제조의불확도측정에서 canthaxanthin 표준용액을 1,008 μg/ml로제조하기위해사용된용량플라스크, 화학저울의불확도를계산하여불확도요인으로산출하였다. 교정성적서상에표시된불확도, 10회반복측정에대한불확도, 실험실온도변화 (±5 C) 에따른물의팽창계수 (0.00021/ C) 를고려한불확도를계산하여용량플라스크의 상대표준불확도를구하였으며, 화학저울교정성적서상의불확도, 표준분동에대한반복측정안정성, 화학저울의분해능을불확도요인으로화학저울의상대표준불확도를측정하였다. 그후화학저울과용량플라스크의상대표준불확도를합성하여표준용액제조에대한합성상대표준불확도를추정한결과 0.0015로나타났다. 검량곡선의불확도측정을위해서는 canthaxanthin 표준용액을 0.1, 5, 10, 20 μg/ml 농도로희석한후 HPLC UVD로 3회씩반복측정하고최소자승법을이용하여검량선을작성한결과상관계수 (R 2 ) 는 0.999였다. 식 (4) 에의해산출된검량선의표준불확도는 0.051 μg/ml였으며, 상대표준불확도는 0.0260으로산출되었다. 시료반복측정에대한불확도측정을위해시료 5.000 g을채취하여 3회반복분석한결과시료중 canthaxanthin 평균함량은 39.5 mg/kg으로측정되었다. 이때의표준편차는 2.7332이며자유도는 2, A형표준불확도는 1.5780, 상대표준불확도는 0.03999로측정되었다. Canthaxanthin 확장불확도 (expanded uncertainty) 를산출하기위해위에서측정된불확도요인각각의표준불확도와상대표준불확도로부터합성상대표준불확도 (combined relative uncertainty) 와합성표준불확도 (combined standard uncertainty) 를산출하였다. 그결과 Table 8과같이측정농도 39.5 mg/kg에대한합성표준불확도는 1.9 mg/ kg으로나타났다. Canthaxanthin 확장불확도는식 (8) 을이용하여합성표준불확도 1.9 mg/kg에포함인자 k=2.78을곱하여산출하였으며, 5.29 mg/kg으로나타났다. 즉측정농도 39.5 mg/kg은확장불확도를포함하여 39.5±5.29 mg/ Table 8. Uncertainties for canthaxanthin analysis using HPLC UVD Parameter Result Concentration 1) Combined relative uncertainty (ur/r) Combined standard uncertainty (uc) 1)2) Expanded uncertainty (U) 1)3) (95% confidence level, k=2) A coverage factor (k) Effective degree of freedom (veff) 39.5 0.048 1.9 5.29 2.78 4 Uncertainty/result 13.39 1) Unit is mg/kg. 2) Combined standard uncertainty was calculated for multiplying concentration and combined relative uncertainty. 3) Expanded uncertainty was calculated for multiplying combined standard uncertainty and a coverage factor.
식품색소 Canthaxanthin 의 HPLC 최적분석법확인및타당성과측정불확도평가 351 kg(95% 신뢰구간, k=2.78) 으로표기될수있다. 이때확장불확도는측정농도의 13.4% 에해당하는값으로유럽연합의기준 16% 를만족하는값이었다 (19). 따라서본연구에서확인한 canthaxanthin 최적분석법은향후우리나라공인분석방법으로제시되기에타당하다고생각한다. 요 본연구는한국에서식용색소로지정되지않은 ketocarotenoid계의 canthaxanthin에대한최적분석방법을확보하기위해수행되었다. HPLCUVD를이용한외국의 canthaxanthin 공인분석법을검토하여직선성, 분리능, 민감도, 검출한계 (LOD), 정랑한계 (LOQ) 를도출하고, 각실험데이터를비교하여최적의 canthaxanthin 분석방법을확보하였다. 또한확보된최적분석방법에대한정밀도, 정확도, 회수율, 실험실간교차검증, 측정불확도를산출하여 canthaxanthin 최적분석법에대한타당성을검증하였다. AOAC법, 일본및영국의공인분석법을이용하여 canthaxanthin 표준용액을 5, 10, 20, 50, 100, 300 μg/ml의 6 point로희석한후얻은검량선의상관계수는모두 R 2 =0.999 이상으로나타나우수한직선성을보였으나분리능, 민감도, LOD, LOQ는일본의공인분석법이가장우수하였다. 일본공인분석법의 LOD와 LOQ는각각 0.084 mg/kg, 0.254 mg/kg으로나타났으며, 1보다낮은정밀도, 100% 에가까운정확도, 100± 10% 사이의회수율, 교차검증시세기관의변동계수가 5 이하로나타나 canthaxanthin 분석을위해가장최적화된방법으로확인되었다. 또한측정하는중에나타나는불확실성을알아보기위하여 canthaxanthin이함유된가공식품을분석하여측정불확도를산출한결과 39.5±5.29 mg/kg (95% 신뢰구간, k=2.78) 으로나타났다. 확장불확도는측정농도의 13.4% 로나타나유럽연합의기준 (16% 이하 ) 에적합한결과를보였다. 약 감사의글 본연구는 2014년도식품의약품안전처연구개발비 (14162 불량식971) 로수행되었으며이에감사드립니다. REFERENCES 1. Isler O. 1979. History and industrial application of carotenoids and vitamin A. Pure & Appl Chem 51: 447462. 2. WHO. 1996. WHO Food Additives Series 35. World Health Organization, Geneva, Switzerland. Available from: http:// www.inchem.org/documents/jecfa/jecmono/v35je08.htm (assessed Jul 2015). 3. EFSA. 2010. Scientific opinion on the reevaluation of canthaxanthin (E 161 g) as a food additive. EFSA Journal 8: 1852. 4. WHO. 1986. WHO Food Additives Series 22. World Health Organization, Geneva, Switzerland. Available from: http:// www.inchem.org/documents/jecfa/jecmono/v22je09.htm (accessed Jul 2015). 5. FDA. 2015. Code of Federal Regulation Title 21. Food and Drug Administration, Washington, DC, USA. Available from: http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/cfrs earch.cfm?fr=73.75 (accessed Jul 2015). 6. KFDA. 2010. Korea Food Additives Code. Korea Food and Drug Administration, Ohsong, Korea. Available from: http:// www.mfds.go.kr/fa/%20%20index.do?nmenucode=12& page_gubun=1&gongjeoncategory=1 (accessed Jul 2015). 7. FSA. 2010. Review and evaluation of available methods extraction and analysis for approved natural colours in food and drink. Food Standard Agency, London, UK. p 1329. 8. AOAC. 2012. Official methods of analysis. 19th ed. Association of Official Analytical Chemists, Washington, DC, USA. Chapter 51, p 13. 9. JMHLW. 2009. Canthaxanthin analysis method. The Japan Ministry of Health, Labour and Welfare, Tokyo, Japan. Available from: http://www.mhlw.go.jp/topics/bukyoku/iyaku/syokuanzen/zanryu3/2042.html (accessed Jul 2015). 10. Ahuja S, Dong MW. 2005. Handbook of pharmaceutical analysis by HPLC. Elsevier Academic Press, London, UK. p 1658. 11. EMEA. 2006. Validation of analytical procedures: Text and methodology. European Medicines Agency, London, UK. p 815. 12. ISO. 2004. Guide to the expression of uncertainty in measurement (GUM)Supplement 1: Numerical methods for the propagation of distributions. International Organization for Standardization, Geneva, Switzerland. p 536. 13. Ellison SLR, Roesslein MI, Williams A. 2000. Quantifying uncertainty in analytical measurement. 2nd ed. EURACHEM, London, UK. p 3294. 14. KRISS. 2010. Guide to the expression of uncertainty in measurement. Korea Research Institute of Standards and Science, Daejeon, Korea. p 1142. 15. Kim KS. 2015. Comparison and optimization of the analytical method for canthaxanthin, a food additive. MS Thesis. ChungAng University, Gyeonggi, Korea. p 2733. 16. CITAC. 2012. Quantifying uncertainty in analytical measurement. 3rd ed. Cooperation on International Traceability Analytical Chemistry, Sugiez, Switzerland. p 431. 17. BIPM. 2008. Evaluation of measurement dataguide to the expression of uncertainty in measurement. Bureau International des Poids et Measures, Sèvres, France. p 527. 18. EC. 2004. Report on the relationship between analytical results, measurement uncertainty, recovery factors and the provisions of EU food and feed legislation, with particular reference to community legislation concerning. European Commission, Brussel, Belgium. p 622. 19. Codex. 2004. Guidelines on measurement uncertainty CAC/ GL 542004. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, Italy. p 5.