Journal of the Korean Chemical Society Printed in the Republic of Korea 모세관전기영동을이용한박테리아의분리문병근 최규성 이상천 김용성 * 경남대학교공과대학화학공학부 (2003. 7. 16 접수 ) Separation of Bacteria Using Capillary Electrophoresis Byoung-geoun Moon, Kyu Seong Choi, Sang Chun Lee, and Yongseong Kim* Division of Chemical Engineering, Kyungnam University, Masan 631-701, Korea (Received July 16, 2003) 요약. 모세관전기영동을이용한박테리아의분석에영향을주는다양한실험적인요인을연구하였다. 여러완충액농도에서 gram-positive 박테리아에비해 gram-negative 박테리아는높은전기장하에서다른분리거동을보임을확인하였다. 한편, 모세관내부로주입되는박테리아의농도에따른분리효율의차이가연구되었다. 완충액에존재하는박테리아시료의농도가비교적높은 1.0 mg/ml일때좋은분리효율이얻어졌으며, 이것은박테리아의높은농도에서발생하는 focusing effect에의한결과로보인다. 선형고분자인 poly(ethylene)oxide(peo), polyvinylpyirrolidone(pvp) 와가지형고분자인 dextran을크기와형태적차이로서박테리아를분리하기위하여테스트하였다. 다른고분자와달리보다유연하며입체장애가적은선형고분자인 PEO를포함하는완충액에서 gram-positve 박테리아인 Micrococcus lysodeikticus와 gram-negative 박테리아인 Aerobacter aerogenes의혼합물을높은효율로분리하였다. 주제어 : 모세관, 전기영동, 박테리아, 고분자 ABSTRACT. Various experimental factors that affect the separation of bacteria were investigated using capillary electrophoresis. At different buffer concentrations, gram-positive bacteria and gram-negative bacteria showed somewhat different migration behavior under high electric filed. The separation efficiency was also investigated as a function of concentration of bacterium injected into the capillary. In order to separate bacteria as the difference of size and shape, water soluble polymers such as poly(ethylene)oxide (PEO), polyvinylpyirrolidone (PVP), and dextran were studied. PEO, which is more flexible and has lower steric hinderance, showed the best separation efficiency. The mixed bacteria sample of Micrococcus lysodeikticus as gram-positive bacteria and Aerobacter aerogenes as gram-negative bacteria were successfully analyzed with PEO. Keywords: Capillary, Electrophoresis, Bacteria, Polymer 서 박테리아의분리와특성화에대한연구는생명공학과생물학의영역에서중요한분야로서발전되어왔다. 박테리아세포의특성화에대한연구는성장단계 (growth stage) 와성장상태 (growth condition) 와같은여러요인에따른표면구성성분의변화에대한연구가수행되었다. 1,2 론 미생물의분리에있어최근몇년동안모세관전기영동을이용하여박테리아를빠르고효율적으로분리하기위한연구가시도되었다. 모세관전기영동은박테리아의분리에있어, 낮은시료요구량, 높은분해능, 빠른분리시간으로인하여효과적인분석기술로서이용되어져왔다. 3,4 몇가지사례를보면모세관전기영동을이용하여요도관염을야기하는 Escherichia coli 와 Staphylococcus saprophyticus 가분리되었고, 5 또한의약 -144-
모세관전기영동을이용한박테리아의분리 145 품및건강보조식품에첨가되는 Saccharomyces cerevisiae 와 Enterococcus feacalis, Bifidobacterium infantis와 Lactobacillus acidophilus의분리가보고되었다. 6,7 모세관전기영동을이용하여박테리아를검출하는경우대부분형태, 크기, 표면의구성성분들의차이에기반을두고있다. 그러나 5-9, 박테리아표면의구성성분은다양할뿐만아니라, 미생물은실험적변인 ( 온도, ph, 완충액의농도, 박테리아의분산의여부 ) 에의하여직접적인영향을받는다. 이와같은다양한변인에의 8,10 한박테리아에대한영향은모세관전기영동을이용한미생물의특성화및분리에있어반드시고려되어져야만한다. 박테리아와같은원핵미생물의경우, 표면구성성분의차이에따라크게 gram-positive 박테리아와 gramnegative 박테리아로나누어진다. 이러한분류는 gramstain이라고부르는특별한 staining 반응의차이에기반을두고있으며, 세포벽구조는외형에서상당한차이를보인다. 11 Gram-negative 박테리아는 peptidoglycan 과더불어 lipopolysaccharide(lps) 와단백질로이루어진복잡한다중층을형성하고있는반면, gram-positive 박테리아의경우두꺼운 peptidoglycan의단일층으로이루어져있다. Gram-positive 박테리아와 gram-negative 박테리아는화학적, 물리적으로차이를보이며, 외부환경에의한영향에대해다른반응을보에게된다. 그럼에도불구하고 gram-positive 박테리아와 gram-negative 박테리아는생리학적 ph에서음전하를나타내며, 물리적형태및크기에서유사점이관찰된다. 이러한 8,11 점들은박테리아의특성화및분리를어렵게만드는중요한요인으로고려되어져왔다. 특히, 미생물의분리에있어실험적변인들에따른분리효율에대한자료와연구가부족한편이다. 따라서, 이번연구에서는모세관전기영동을이용하여완충액의농도, 박테리아시료의농도와시료에대하여형태적선택성이있는고분자에대한박테리아의거동의변화가연구되었다. 실 험 시약. Aerobacter aerogenes, Pseudomonas fluorescens, Micrococcus lysodeikticus, Escherichia coli 는 Sigma- Aldrich, Co.(St. Louis, MO, USA) 에서냉동건조상태로구입되었다. Tris(hydroxymethyl)aminomethan(Tris), Boric acid, ethylenediaminetetraacetate(edta), poly(ethylene)- oxide(peo, Mw = 600,000), dextran(mw = 513,000), polyvinylpyyrrolidone(pvp, Mw = 1,300,000), hydrochloric acid, potasium hyroxide은 Sigma-Aldrich, Co. 에서구입하였다. 실험에사용된 75, 100 µm fused silica capillary 는 Polymicro Technologies(Phoenix, AZ, USA) 에서구입하였다. 실험에사용된물은 Milli-Q reagent water system을통하여탈이온화하여준비하였다. 기기의구성. 모세관전기영동에사용된 CE system은 Lambda 1010 UV detector(bischoff, Germany), Spellman high voltage power supply로구성되었고전류측정을위하여 DM-340 digital multimeter(miltek, Korea) 가사용되었다. 모세관세척을위하여 diaphragm-type pump (Gast, OH, U.S.A) 가사용되었다. 완충액의 ph측정은 MP 220 ph meter(medttler Toledo, Switzerland) 를사용하였다. 미생물의분산및완충액내의기체를제거하기위해 1050 초음파세척기 (Chosun Scientific, Korea) 를사용하였다. 원심분리에는위하여 Micro 17TR (Hanil science industrial, Korea) 을사용하였다. 완충액의농도에따른미생물거동변화. 90 mm Tris, 90 mm boric acid, 2 mm EDTA(1.0XTBE) 를증류수에녹인뒤 ph를 8.4로조정된완충액을증류수로 0.8 X, 0.5 X, 0.3 X, 0.1 X, 8:1 diluted 0.05 X TBE의농도가되도록희석하여준비한다. 실험에사용될미생물시료는 1.0 mg/ml의농도가되도록준비된농도의완충액을가한뒤 mixing vortex에서적절히분산시켰다. 준비된미생물시료들은 12,000 rpm에서 10분간원심분리하여상등액을제거하고다시완충액을가하여혼합기에서 2분간, 초음파세척기에서 3분간분산시켰다. 다른농도의미생물시료는분산이완료된후묽혀사용하였다. Fused silica capillary는 polymicro technology의내경 75 µm 모세관을사용하였고모세관의총길이는 50 cm이며, window는 inlet 으로부터 40 cm에만들었다. 모세관은미생물의분리이전에 3분간 0.1 N 염산, 3차증류수로 2분간, 1.0 N 수산화나트륨으로 2분 30초간세척한뒤 3차증류수로 2분간, 완충액으로 2분간세척하였다. 미생물시료를 2.5 cm에서 5초간 siphoning으로주입한뒤 15 kv에서 214 nm의파장에서검출하였다. 박테리아농도에따른분리효율의변화. 8:1로희석된 0.05XTBE 완충액은 ph 8.4로조정된뒤, 1.0 mg/ml 의농도가되도록 Micrococcus lysodeikticus에가한뒤 12,000 rpm에서 10분간원심분리한뒤상등액을제거
146 문병근 최규성 이상천 김용성 하였다. 이미생물시료는다시 8:1로희석된 0.05XTBE 완충액을이용하여 0.25, 0.17, 0.125 mg/ml의농도가되도록희석하여준비하였다. 그이외의실험조건은완충액의농도에따른미생물거동변화에대한실험과동일하다. 미생물의크기와형태적특성에선택성이있는물에녹는고분자의준비. 8:1로희석된 0.05XTBE 완충액 (ph 8.4) 에 0.5% 의농도가되도록 poly(ethylene)- oxide(peo, Mw = 600,000), dextran(mw = 513,000), polyvinylpyrrolidone(pvp, Mw = 1,300,000) 를각각가하여 12시간동안녹인다. 여기에 8:1 희석된 0.05XTBE 완충액을가하여 0.025%(PEO, PVP) 의농도가되도록희석시킨뒤적절히분산하였다. 각각의고분자와미생물간의선택성을확인하기위하여, 8:1로희석된완충액을박테리아시료에가하여 1.0mg/ ml의농도가되도록분산된 Micrococcus lysodeikticus를사용하였다. 결과및고찰 완충액의농도에따른박테리아의거동변화. 박테리아의형태학적분류에있어서 gram-staining의차이에따라 gram-positive 박테리아와 gram-negative 박테리아로나뉘어진다. 이러한차이는박테리아를구성하는유사한화학적성분의조합의차이에의한결과로서박테리아의크기및형태와같은물리적특성을부여한다. 11 모세관전기영동을이용한분리에서 gram-positive 박테리아와 gram-negative 박테리아는완충액의농도에따라다른거동이관찰되었다. 0.1XTBE 완충액에서 gram-positive 박테리아인 Micrococcus lysodeikticus와 gram-negative 박테리아인 Escherichia coli, Aerobacter aerogenes, Pseudomonas fluorescens의경우서로다른거동이관찰된다. Fig. 1에서 gram-positive 박테리아인 Micrococcus lysodeikticus(fig. 1a) 의경우에는비교적안정한단일 peak이관찰되는반면, gram-negative 박테리아에서는안정한단일 peak(aerobacter aerogenes; Fig. 1b) 이외에도불안정한 peak(escherichia coli; Fig. 1c, Pseudomonas fluorescens; Fig. 1d) 들이관찰되었다. Gram-negative 박테리아인 Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens의결과에서관찰되는불안정한 peak들은박테리아표면에존재하는구성물질인 peptidoglycan의해리의결과로여겨진다. 12 Gram-positive 박테리아의경 Fig. 1. Electropherograms of Micrococcus lysodeikticus (Fig. 1a), Aerobacter aerogenes (Fig. 1b), Escherichia coli (Fig. 1c) and Pseudomonas fluorescens (Fig. 1d). Bacteria samples were dissolved in 0.1XTBE buffer at the concentration of 1.0 mg/ml. The running buffer consisted of 9.0 mm Tris, 9.0 mm boric acid, and 0.2 mm EDTA (ph 8.4). Conditions: fused silica capillary, 75 µm i.d. 50 cm total length, 40 cm effective length, +15 kv running voltage, room temperature, siphoning injection at 2.5 cm for 5 sec. Journal of the Korean Chemical Society
모세관전기영동을이용한박테리아의분리 147 우표면의구성성분중 peptidoglycan 의비율이약 90% 를차지하는반면, gram-negative 박테리아는약 10% 정도의 peptidoglycan 이존재한다. 완충액의농도가비교적높을경우높은전류의발생으로인한주울열 (Joule heating) 에기인하며, 그결과모세관내부에서발생하는열의영향에의한박테리아의표면에손상이발생하게되고 gram-negative 박테리아의경우더욱영향을받게되는것으로생각된다. 한편, Gram-negative 박테리아인 Aerobacter aerogenes 의경우 0.1XTBE 완충액에서 Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens 와달리비교적안정된단일 peak 이관찰되었는데이러한현상은세포벽에존재하는 peptidoglycan 의비율이 Aerobacter aerogenes 의경우비교적높다는것을의미한다. 0.1XTBE 완충액에서안정된 gram-positive 박테리아인 Micrococcus lysodeikticus 와 gram-negative 박테리아인 Aerobacter aerogenes 의경우보다높은농도인 1.0XTBE 완충액에서거동의차이가관찰되었다. 일반적으로모세관내부의완충액의농도가증가하면같은전기장에서발생하는주울열도높아지는것이잘알려 져있다. 1.0XTBE 완충액에서 gram-positive 박테리아인 Micrococcus lysodeikticus(fig. 2a) 는비교적안정한단일 peak이관찰되지만, 모세관내부에서발생하는주울열에의한박테리아의손상과연관된 peak의불안정성의견지에서 gram-negative 박테리아인 Aerobacter aerogenes(fig. 2b) 와같이심각해보이지않는다. Aerobacter aerogenes에서관찰되는불안정한 peak들은박테리아표면으로부터해리된구성물질의검출에의한결과이다. 이러한현상은 gram-positive 박테리아와 gram-negative 박테리아의열적손상과연관된 peptidoglycan의비율의차이에의한것으로보여진다. 박테리아농도와분리효율간의관계. Fig. 3는 Micrococcus lysodeikticus 농도에따른분리효율의차이를보여준다. 실험에서사용한여러농도중에서 1.0 mg/ml 일때가장높은분리효율 ( 이론단수, 4.3 10 4 ) 을보이는반면농도가낮아짐에따라분리효율의감소가관찰되었다. 박테리아들은중성이나약알칼리성완충액하에서콜로이드성입자인 hairy particle로서인식된다. 박 13,14 테리아의순전하 (net charge) 는이러한완충액에서음전하를띄며모세관전기영동에서박테리아의시료구역은낮은전도도를가지게된다. 이러한시료구역은일시적으로구역의전, 후에걸쳐음극면 (cathode side) 에는양전하 (cation) 가양극면 (anode side) 에서는음전하 (anion) 가집중되는현상이발생한다. 이러한결과, 시료구역의집중이발생하게된다. 따라서 14, 박테리아의농도가높을수록시료구역의집중 (focusing) 이발생할확률은증가된다. 그와더불어, 모세관내부로주입된박테리아들의방향성에따라이동도의차이를보이게되는데, 이결과서로다른방향성을갖는박테리아들의충돌의결과로서시료구역의집중이발생하게된 Fig. 2. The electropherogram of Micrococcus lysodeikticus (Fig. 2a) and Aerobacter aerogenes (Fig. 2b). Bacteria samples were dissolved in 1.0XTBE buffer. The running buffer consisted of 90 mm Tris, 90 mm boric acid, and 2.0 mm EDTA. Other conditions were the same as in Fig. 1. Fig. 3. The separation efficiency (the number of theoretical plate) as a function of concentration of Micrococcus lysodeikticus.
148 문병근 최규성 이상천 김용성 다. 이러한시료구역의집중은박테리아의농도가 13,15 높을수록더욱영향을받게되며순차적으로높은분리효율로이어진다. 박테리아의형태적특성에선택성이있는고분자의선택. 박테리아의형태적특성에따른분리를위하여 sieving matrix로서수용성고분자를포함하는완충액을이용하게되는데, 고분자의화학적특성에따른분리효율의차이를연구하였다. Fig. 4는수용성고분자로서선형고분자 (linear type polymer) 인 poly(ethylene)oxide (PEO), polyvinylpyrrolidone (PVP) 와가지형고분자 (branch type polymer) 인 dextran 을포함하는완충액에서 Micrococcus lysodeikticus 의 electropherogram 을보여주고있다. 선형고분자인 poly(ethylene)oxide(peo) 의경우 (Fig. 4a) 가장높은분리효율이관찰되었다. 이러한현상은고분자의유연성과관계하는것으로생각된다. Dextran 과같은가지형고분자인경우 (Fig. 4c) 선형고분자에비하여유연성이떨어진다. 16,17 낮은유연성을갖는가지형고분자인 dextran 의경우박테리아표면과화학적상호작용 ( 친수성, 소수성 ) 의가능성은적다. 반면, 선형고분자인 poly(ethylene)oxide(peo) 는박테리아와의높은화학적상호작용 ( 친수성, 소수성반응 ) 의결과로인하여박테리아에대하여형태적선택성을가지게된다. 그러나, 같은선형고분자인 polyvinylpyrrolidone(pvp) 의경우낮은분리효율을보이는데 (Fig. 4b), 이러한현상은고분자의유연성과더불어 pyrrolidone 그룹의입체장애가박테리아에대한형태적선택성에중요한영향을주는것으로생각된다. 뿐만아니라, polyvinylpyrrolidone (PVP) 는박테리아를검출하기위해사용되는파장인 214 nm 근처에서 UV 를흡수하므로박테리아의검출에있어서검출한계에영향을줄수있다. 18 본실험에서는, 박테리아의형태적특성에대하여선택성이있는고분자로서 poly(ethylene)oxide (PEO) 가박테리아의분리에최적임을알수있었다. 혼합박테리아의분리. Fig. 5 은두가지혼합박테리아 (Micrococcus lysodeikticus, Aerobacter aerogenes) 의분리를보여준다. 박테리아의효율적분리를위해박테리아의형태적특성에선택성이있는고분자인 poly (ethylene)oxide(peo) 는 8:1 로희석된 0.05 XTBE 완충액에녹여준비하였다. Fig. 5 은구형의 gram-positive 박테리아인 Micrococcus lysodikticus( 약 7.8 분 ) 와막대모양의 gram-negative 박 Fig. 4. The electropherograms of Micrococcus lysodeikticus in 8:1 diluted 0.05XTBE with 0.02 5% PEO (Fig. 4a), 0.025% PVP (Fig. 4b), 0.5% dextran (Fig. 4c). Running buffer was diluted 8:1 from 0.05XTBE buffer (4.5 mm TRIS, 4.5 mm boric acid, 0. 1mM EDTA). 1 0 0µm i.d. fused silica capillary was used for the separation. Other conditions were the same as in Fig. 1. 테리아인 Aerobacter aerogenes( 약 9.7 분 ) 가 poly(ethylene)- oxide(peo) 가포함된완충액에서성공적으로분리가되고있음을보여준다. 이러한결과는모세관전기영동이미생물의분석에효과적인방법이될수있음을보여주는것이다. Journal of the Korean Chemical Society
모세관전기영동을이용한박테리아의분리 149 안정성과연관된박테리아의표면구성성분중하나인 peptidoglycan의비율의차이에의한것으로추정된다. 모세관전기영동을이용한박테리아의분리에서모세관내부로주입되는박테리아의농도가높을수록좋은효율을보였다. 이러한현상은중성에가까운완충액하에서박테리아들은 hairy particle로서의집중뿐만아니라, 주입된박테리아의방향성의차이에의한시료구역의집중에기인한다. 박테리아의크기와형태에대한선택성이있는고분자로서선형고분자인 poly(ethylene)oxide(peo) 가가장좋은분리효율을나타내었다. 이러한현상은 PEO 의높은유연성과적은입체장애로인한박테리아와 PEO간의화학적상호작용 ( 친수성, 소수성반응 ) 의결과이다. 이번연구는모세관전기영동이박테리아의분석에효율적인방법임을보여주고있으며이러한기술을응용한박테리아의환경모니터링, 병원성미생물의조기진단등의연구가진행중에있다. 본연구는 한국과학재단목적기초연구 (R05-2001- 000-00238-0(2002)) 지원으로수행되었으며이에감사드립니다. 인용문헌 Fig. 5. Electropherograms of Micrococcus lysodeikticus (Fig. 5a), Aerobacter aerogenes (Fig. 5b), and the mixed sample (Fig 5c) of Micrococcus lysodeikticus and Aerobacter aerogenes. The concentration of each bacterium was 0.5 mg/ml. Other conditions were the same as in Fig. 4. 결 높은전기장하에서완충액의농도가증가함에따라증가되는주울열 (Joule heating) 로인하여 gram-positive 박테리아와 gram-negative 박테리아는서로다른거동을보이는것을확인하였다. 또한, 같은 gram-negative 박테리아라할지라도완충액의농도의변화에따라서로다른거동이관찰되었다. 이러한결과는박테리아의 론 1. Meyer, L. S.; J. Bacteriol. 1936, 32, 433. 2. Sonohara, R.; Muramastu, N.; Oshima, H.; Kondo, T. Biophys. Chem. 1995, 55, 273. 3. Armstrong, D. W.; Schulte, G.; Schneiderheinze, J. M.; Westenberg, D. J. Anal. Chem. 1999, 71, 5465. 4. Henny, C.; Mei, V. D.; Busscher, H. J. Appl. Environ. Microbiol. 2001, 67, 491. 5. Armstrong, D. W.; Schneiderheinze, J. M. Anal. Chem. 2000, 72, 4474. 6. Armstrong, E. W.; Schneiderheinze, J. M.; Kullman, J. P.; He, L. FEMS. Microbiol. letters. 2001, 194, 33. 7. Moon, B. G.; Kim, Y. Submitted to Bull. Korean Chem. Soc. 2003. 8. Armstrong, D. W.; Schulte, G.; Schneiderheinze, J. M.; Westenberg, D. J. Anal. Chem. 1999, 71, 5465. 9. Armstrong, D. W.; He, L. Anal. Chem. 2001, 73, 4551. 10. Moon, B. G.; Lee, Y.; Kang, S. H.; Kim, Y. Bull. Korean Chem. Soc. 2003, 24, 81. 11. Brock, T. D.; Madigan, M. T.; Martinko, J. M.; Parker, J. Prentice-Hall International, Inc., 1994, 58. 12. Pfetsch, A.; Welsch, T.; Fresenius, J. Anal. Chem. 1997,
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