< 국문요약문 > 연구목표 - b2sp 단백질의돌연변이로유발된간암의발생기전에서 b2sp의역할과 b2sp의결실을통해암이형성되는과정을분석하여이에의한암의발생기전을동물모델을이용하여세포수준과더불어조직과개체수준에서알아보고자함. - 암억제유전자인 b2sp의돌연변이혹은발현저하에의해생

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1 최종보고서 [ 기관고유연구사업 ] 과제고유번호 연구분야 ( 코드 ) B-1 지원목적과제공개가능여부프로그램도약연구 ( 공개, 비공개 ) 공개 연구사업명 국립암센터기관고유연구사업 연구과제명 b2-spectrin의결실에의한암발생기전에관한연구 과제책임자 성명 김상수 소속 방사선의학연구과 직위 책임연구원 구분 과제명 과제책임자성명소속 ( 직위 ) 전공 세부과제 (1세부) (2세부) (3세부) 해당단계 총 : 8 명 해당단계 연구비 : 725,000 천원 참여 2013년 3월 ~ 연구원수총연구기간 2015년 12월총연구기간 ( 총 2년 10개월 ) 참여연구원수 내부 : 8 명연구개발민간 : 천원외부 : 명비계 : 725,000 천원 총 : 8 명총연구내부 : 8 명개발비외부 : 명 구분연구기간계국립암센터연구기간및연계 2013년3월-2015년12월 725, ,000 구비제1차 2013년3월-2013년12월 250, ,000 ( 단위 : 천원 ) 제2차 2014년1월-2014년12월 250, ,000 제3차 2015년1월-2015년12월 225, ,000 참여기업참여기업명 : 연구비 : 725,000천원 민간 : 천원 계 : 725,000천원 기업부담금 소계현금현물 국제공동연구상대국명 : 상대국연구기관명 : 위탁연구연구기관명 : 연구책임자 : 요약 : b2-spectrin의결손은배아상태에서심장근의발달의저해를보이며이는세포의생장과분화, 골격단백질의발현과분포에영향을주어과다한세포사를일으키기때문임. b2-spectrin의발현억제는간에서통계적으로유의한 bile duct세포의생장을촉진. 이의원인을규명하기위해간손상을준경우에서 APAP에의한간손상은 b2-spectrin의절단을유도하고이를통해 TGF-b-의존적인세포사와전사조절에영향을줌. 또한 APAP에의한간손상에서 b2-spectrin의결실은간손상을억제하며이의절단을억제하는 caspase-억제제는급성간손상에의한혈액지표와치사를효과적으로억제하여가능한치료제로서의가능성을제시 2015 년 11 월 01 일 과제책임자 : 김상수 ( 인 ) 국립암센터원장 귀하

2 < 국문요약문 > 연구목표 - b2sp 단백질의돌연변이로유발된간암의발생기전에서 b2sp의역할과 b2sp의결실을통해암이형성되는과정을분석하여이에의한암의발생기전을동물모델을이용하여세포수준과더불어조직과개체수준에서알아보고자함. - 암억제유전자인 b2sp의돌연변이혹은발현저하에의해생성되는암의발생기전을분석하여이를통해얻어진연구성과로항암치료에서지표로사용하여치료효율을높임으로써암억제유전자의돌연변이암의새로운치료제및저해제의개발에기여하고자하는것. - 또한본연구는이의작용기전을밝혀내는과정에서 knockout mice와이에서유래된세포나조직을사용함으로써보다믿을만한결론을이끌어낼수있어서상대적으로우수한논문을생산할수있는가능성을가지고있으며이를통해만들어진마우스모델은각각의 genetic alteration에적합한암을 target으로하는치료제개발의최적의모델로이용가능. 연구내용및방법 (1) b2sp의돌연변이마우스모델의유지, 자료축적과분석 연구의 목적및내용 - 현재보유하고있는 b2sp 돌연변이마우스의유전형과운용은 a) b2sp knockout 마우스 : heterozygote 돌연변이형태로유지하며 whole body에돌연변이가분포하여전체조직내의이상을동정하는데사용되며 b2sp의발현을측정할수있는 X-gal assay를통해특정적인발현의조사에이용. b) b2sp conditional knockout 마우스 : 조직특이적인결실을유도하는데사용되며현재간특이적인결실을유도할수있는 albumin-cre transgenic mice와의교배를통해간특이적인이상의관찰에주로사용. 추후 neuron, intestine, pancreas 에특이적인결실의유도를준비중에있음. - 각돌연변이마우스는최소 20마리이상의수컷을동수의대조군과같이 group하여최소주 1회이상의관찰을통해이상을관찰하고이에이상이관찰될시에는해부를통해표적장기를적출하여장기를생화학, 분자생물학적분석과조직학적분석을통해이상을동정함. - 각이상을촉진시키기위해정상사육이외에고지방식을이용한사육이진행되고있으며이외에줄기세포의생장촉진을유도하는 DDC가포함된사료를이용한사육이연내에시작될예정임. (2) b2sp의결실을이용한간특이적마우스모델의연구 - b2sp의결실이간손상의유도를통한간암의발생에영향을주는지알아보기위해위의마우스모델을사용하여간손상을유도하는 acetaminophen (APAP) 을주사하여간손상을유도. 4-8주령의 wild type과 heterozygote 돌연변이쥐에 200 mg/kg의 APAP를주사하고 3일과 7일후간조직을적출하여간의손상과회복정도를 H&E staining과기타항체염색을통해시행하고이와더불어세포수준에서도 HepG2 간세포주를사용하여 b2sp를 shrna를사용하여발현억제한후 APAP에대한민감도와생장도를측정하여간손상에서 b2sp의역할을분석.

3 연구의 목적및내용 (3) b2sp의결실에의한 embryonic lethality에서의이상분석 (II) - b2sp가완전결실된 homozygote 돌연변이마우스의경우배아의발달중에다양한이상현상을보이며이중 neural tube disclosure defect와같은신경계발달의이상과심혈관계통의이상이관찰되고배아발생단계에서 b2sp의발현이심장과 spinal cord에서높게나타남. - 적절한발달시기의배아를얻기위해 b2sp +/- 간의교배를통해배아를얻어내고이를 genotype을통해유전형을동정하고이의형태적인특징과더불어조직학적인분석을수행. 또한각조직은항체를이용한면역염색을통해발달과정에관여하는성장요인과신호전달물질을분석. < 정량적성과 1) > 구분 달성치 / 목표치 1) 달성도 (%) SCI 논문편수 1/2 50 IF 합 5.94/ 기타성과 1) 총연구기간내목표연구성과로기제출한값 연구개발성과 연구개발성과의활용계획 ( 기대효과 ) < 정성적성과 > - b2sp의돌연변이에의한암의발생과정에서다른조절단백질과의상호작용을분석 - b2sp를항암치료에서지표로사용하여치료효율을높이며이를통해각각의돌연변이암의새로운치료제및억제제의개발에기여 - b2sp 마우스모델은 genetic alteration에적합한암을 target으로하는치료제개발의최적의모델로이용가능. (1) 진료적인측면 : 암의발생과정에서발생한 genetic determination은항암치료효과에영향이있음. 특히 b2sp와같이세포생장과더불어암전이를조절하는단백질은이에더욱밀접하게연관되어있음. 본연구를통해얻어진연구결과는항암제개발에있어근간이되는훌륭한분자표적을개발하는데기여할것으로기대되며이를통해암환자의예후예측과적절한치료법고안에기여할것으로기대하며항암치료의효과가극대화되기위해서는항암제에대한종양의반응예측인자에대한조직적이고체계적인생물학적연구가절실하므로본연구를통해얻어진연구성과는이의지표로사용하여치료효율을높이는데기여하고자함. (2) 지식및기술적측면 : b2sp를포함한 TGF-b의신호조절기전은아직도기초연구가필요한분야로이연구를 mice와 human에대해 in vitro와 in vivo수준에서동시에접근하는것은현재매우발달된연구접근법임. 본연구는이의작용기전을밝혀내는과정에서 knockout mice와이에서유래된세포나조직을사용함으로써보다믿을만한결론을이끌어낼수있어서상대적으로우수한논문을생산할수있는가능성을가지고있으며이를통해만들어진모델은유전자특이적암을 target으로하는치료제개발의최적의모델로이용가능. 중심어 b2-spectrin 암 TGF-b 동물모델

4 < 영문요약문 > SUMMARY Purpose& Contents Results Research Goals - In liver cancer from b2sp alteration, we will investigate the role of b2sp, and the cellular events caused of loss of b2sp by this animal model. - By analysis of liver cancer from the loss or downregulation of b2sp, alteration of b2sp will be applied for the indicator of cancer prognosis which will improve the treatment efficiency. - The mouse model will be available to development of therapeutic agents for cancer, for each of the genetic alteration to the target. Research Methods (1) Maintenance, data collection and analysis of b2sp mutant mouse model (2) Investigation of conditional knockout mouse with liver-specific loss of b2sp (3) Analysis of embryonic lethality due to loss of b2sp Qualitative Performance - Analyze the interactions of other regulatory proteins in the pathogenesis of cancer by alteration of b2sp - Using as an index in the chemotherapy b2sp increase the treatment efficiency contribute to the development of new therapeutic agents and inhibitors of cancer through which each of the mutant - B2SP mouse models are used as the best model for the development of therapeutic agents for cancer, genetic alteration in target. Expected Contribution (1) Therapeutic view: cancer occurred in genetic alteration which may be affects the prognosis of the anti-cancer treatment. In particular, b2sp protein which regulates the cell growth and cancer metastasis may be more closely related to this. In order to contributing the cancer drug development, this study are expected to investigation of good molecular targets. Thus, this research is intended to contribute to enhance the therapeutic efficiency in using the obtained results. (2) knowledge and technical aspects: the signal modulation of TGF-b, including regulation of b2sp is still need to be investigated. Especially, this study is focused on the in vivo level, which is highly developed research in current trend and be able to draw reliable conclusions by using several models including cell, tissue, and animal. And, animal model created this study will be available in the best model of drug development for a specific cancer casued from the alteration of b2sp. Keywords b2-spectrin cancer TGF-b Mouse Model

5 목차 1. 연구개발과제의개요 2. 국내외기술개발현황 3. 연구수행내용및결과 4. 목표달성도및관련분야에의기여도 5. 연구결과의활용계획등 6. 연구과정에서수집한해외과학기술정보 7. 연구개발과제의대표적연구실적 8. 참여연구원현황 9. 기타사항 10. 참고문헌 < 별첨 > 자체평가의견서

6 1. 연구개발과제의개요 1-1. 연구개발목적 b2sp 단백질의돌연변이로유발된간암의발생기전에서 b2sp의역할과 b2sp의결실을통해암이형성되는과정을분석하여이에의한암의발생기전을동물모델을이용하여세포수준과더불어조직과개체수준에서알아보고자함. 암억제유전자인 b2sp의돌연변이혹은발현저하에의해생성되는암의발생기전을분석하여이를통해얻어진연구성과로항암치료에서지표로사용하여치료효율을높임으로써암억제유전자의돌연변이암의새로운치료제및저해제의개발에기여하고자하는것. 또한본연구는이의작용기전을밝혀내는과정에서 knockout mice와이에서유래된세포나조직을사용함으로써보다믿을만한결론을이끌어낼수있어서상대적으로우수한논문을생산할수있는가능성을가지고있으며이를통해만들어진마우스모델은각각의 genetic alteration에적합한암을 target으로하는치료제개발의최적의모델로이용가능 연구개발의필요성 간암은세계적으로매우높은빈도를보이는암으로세계적으로는세번째, 국내에서는두번째로높은사망률을보이는암임 (WHO report 2006, 암통계 2006). 간암은상대적으로매우예후가좋지않은암으로외과적처치가가장널리사용됨. 간암의중요한원인은간염바이러스에감염되는경우이며그외에발암물질에의하거나알코올성간염과모든원인의간경변증 ( 간경화증 ) 이간암발생을일으킬수있음. TGF-b는세포내에서세포의생장, 분화, 이동, 및세포사의조절에관여하는인자로암의발생에서암의생성촉진과암의생성억제에모두관여한다고알려져있음. 따라서세포에서의 TGF-b 에대한반응성상실은암의특질로알려져있음. TGF-b는이의수용체인 TGF-b receptor I 과 receptor II를활성화시켜전달자인 Smad들을인산화시키며이들을세포내에서핵으로이동을시켜 TGF-b의 target gene들을활성화시킴. b-spectrin (b2sp, ELF) 는 Spectrin의한종류로서대부분의세포에존재하는것으로알려져왔으며최근에 TGF신호전달과정에서 TGF-b 신호의전달자인 Smad3/Smad4와의생화학적결합으로이들과같이세포내에서이동이알려짐. 또한 b2sp의유전자를제거한마우스의발현형질이 Smad의돌연변이마우스와유사하게발생과정에여러가지공통적인이상을보임. b2sp의발현이억제된 heterozygote인경우간경변과더불어 40-70% 의빈도로간암을자연적으로발생함. 반면 b2sp의돌연변이쥐를 Smad4의돌연변이쥐와교잡을시킨경우그의암발생이기하급수적으로증가하며동시의암의발생부위에서위암의비중이높아짐. 사람의암조직을 b2sp 에대한특이적인항체로분석해본결과통계적으로유의하게 b2sp 의발현이 억제되는것으로나타났으며이는암의발생에서 b2sp 의결실이촉진되는것을시사함 연구개발범위

7 (1) b2sp 돌연변이마우스의운용과개발 기존의 b2sp와별개의돌연변이마우스가영국의 Welcome Trust Institute에서도입되어사육중임. 이돌연변이쥐는기존의개별로제조되는 targeting방식의장점을채용한 promoterless cassette를가지고 b2sp 유전자의발현을 splicing accept를이용하여전사수준에서 termination 시켜 b2sp의유전자를결실시킴. b2sp의 promoterless cassette를사용한 knockout mouse의경우기존의 knockout mouse와같이 homozygous mutant인경우 embryonic lethality를보이는것으로보아유사한결실효과를보이는것으로추정. 이렇게도입된마우스는 homozygous mutation을조직특이적으로도입하기위해 1차로 FLP-recombinase를도입하기위해 actin promoter의영향을받는 FLP-recombinase의 transgene 을포함하는마우스와교배를통해 promoterless cassette의결실을유도하여 conditional knockout 마우스를만든후 tissue-specific cre를가진 transgenic마우스와교배를통해조직특이적인 conditional knockout 마우스를확립할수있음. 현재 b2sp마우스인경우 conditional knockout 마우스의확립이완료되었고간특이적인 b2sp 의결실을유도하기위해 albumin유전자의 promoter를가진 cre마우스와의교배를통해 founder 마우스의간암모델의확립이완료되어이의추가교배를통해관찰군을만들고있는중임. (2) b2sp 돌연변이마우스의표현형분석 현재보유하고있는 b2sp-knockout 마우스의발현형은기존에쓰인 KO 마우스와동일하게배아발달중에치사를보이며, wild type과 heterozygote 돌연변이마우스를각 20 마리이상씩 grouping하여이상의발생을관찰하며암의발생빈도와생장곡선을조사하고있음. 이외에 b2sp가완전결실된 homozygote 돌연변이마우스의경우배아의발달중에다양한이상현상을보이며이중 neural tube disclosure defect와같은신경계발달의이상과심혈관계통의이상이관찰되어이에대한연구를진행중임. b2sp의결실에의한신경계의이상은배아의발달과정에서다양한형태의 neural tube disclosure defect를보임 dpc의배아에서돌연변이배아는 exencephaly와 cauday defect를보이나 ( 위좌측그림 ) 16.5 dpc의배아에서 cauday defect만이관찰되었음. 이표본을조직학적으로분석해보니척추신경계의발달은돌연변이배아에서도정상적인구조를가지나주위의조직에서이상이관찰됨. 이는신경계의발달이지연됨으로써주위조직의형성에영향을주었으리라추측됨. 또한심혈관계에서는돌연변이배아에서만미성숙거대혈관이관찰되었음. 이는본연구자들이발표한 b2sp의돌연변이가 endothelial세포의생장을촉진하나성숙을억제하여확장된혈관을자주보이는것과유사한결과를보임. 또한심장의발달과정에서돌연변이배아의심장은정상배아와달리혈관벽이매우얇고혈액분포에서이상이관찰됨.

8 b2sp가이조직들의발달에영향을주는지알아보기위해배아의발생에서 b2sp의발현을돌연변이 promoterless cassette에있는 b-galactosidase의활성을 X-gal을사용하여측정 dpc의배아를 frozen section하여 X-gal staining을한결과조직내에서 b-galactosidase의활성이가장높게나타나는조직은심장과 spinal cord로나타나 b2sp가돌연변이가된배아에서이들조직에서가장두드러진표현형이나온것과일치한결과를보임 ( 아래그림 ). 향후다양한발달단계에서위조직들의이상을관찰함으로써배아의발달에서 b2sp 의역할에대해 연구할예정임. (3) b2sp knockout 마우스에대한 Acetaminophen- 유도간손상모델의확립 간암의발생은그의발달이잘알려져있고그의전개과정에서지방의축적이나섬유화와같은간손상이초기에일어나므로 ( 위그림 ), b2sp의결실이간손상의유도를통한간암의발생에영향을주는지알아보기위해위의마우스모델을사용하여간손상을유도하는 acetaminophen (APAP) 을주사하여간손상을유도. 4-8주령의 wild type과 heterozygote 돌연변이쥐에 200 mg/kg의 APAP를주사하고 3일과 7일후간조직을적출하여간의손상과회복정도를 H&E staining과기타항체염색을통해시행하고이와더불어세포수준에서도 HepG2 간세포주를사용하여 b2sp를 shrna를사용하여발현억제한후 APAP에대한민감도와생장도를측정하여간손상에서 b2sp의역할을분석 ( 아래그림 ). b2sp가간손상에미치는역할이확인되면, 간손상을유도하는방법으로 hepatectomy, DEN, CCL4 의주입등과같이다양한방법을통해시행하여 b2sp가간손상의어느과정에영향을주는지분석. (4) Primary cultured cell에서의 b2sp의결실유도를통한효과확인

9 현재본실험에서사용되고있는암조직에서유래된세포주를사용하여 shrna를통한 knockdown 을시킨 in vitro system과는별도로쥐의정상조직에서유래된 primary culture를이용하여 cre recombinase를가진 adenovirus를 infection시켜배양된 primary cell에서 b2sp를결실시켜 b2sp의역할을알아보고자함. 아래그림에서나타나듯이심장의발달에서 b2네의역할을알아보기위해 b2sp conditional knockout mouse에서심장을적출하여심장근을배양하고추후 cre를포함하는 adenovirus를 infection시킨결과 b2sp가효과적으로결실되는것이관찰됨. 이러한세포배양의적용은기존의암세포주, 돌연변이마우스, 사람의병리조직등에서도출된결과의효과적인확인방법으로사용됨. (5) 세포골격조절에서 b2sp의결실유도를통한효과확인 b2sp는 spectrin complex의한 component로 spectrin의역할인 cell-cell interaction, membrane intergrity, shape과 polarity유지에관여하리라추측됨. 또한이전의연구과본연구에서도다른골격단백질과의결합이확인됨. b2sp의활성이세포의골격의유지에연관되어있을가능성이있으며이의결실이세포골격의변화를통한신호전달체계의이상을유발하리라추측되나현재 b2sp의결실이어떠한세포골격의이상을유발하는지에대해서는연구가많이되어있지않는상태임. 이에본연구진은최근에사용가능한위에언급된 b2sp를결실시킨쥐의심장근세포를사용하여여러가지골격단백질의분포를조사하고이를정상군과대조하여보니근육의수축과연관되어있는 dystrophin의발현과분포에 b2sp가필요하며근육의수축에필요한구조인 Z-band 단백질의분포도 b2sp가결실되는경우근조직특이적인 band 형태의분포가사라지며분산된형태로나타나는것으로보아이러한세포골격단백질의분포에 b2sp가필요함을알수있었음 ( 위그림좌측 ). 이러한골격단백질의구조형성에 b2sp의필요성이세포뿐아니라조직에서도나타나는지알아보기위해배아의근조직에서 dystrohpin의분포를확인해보니정상에서나타나는 dystrophin의 band 형태의분포가 b2sp가결실된근조직에서는전혀보이지않음으로이의필요성이다시확인됨 ( 위우측 ). 특이하게도이러한세포의경우에서 b2sp의신호체계에서상위에위치하는 Smad단백질의인산화발현이억제되는현상을보이고이러한결과는 b2sp의결실이 TGF-b 신호의전달을방해할뿐만아니라이의 2차적인비활성화를통해억제. 따라서이와같이 b2sp가외부신호를받아활성을매개할뿐만 b2sp의결실은새로운골격구조를가짐으로써신호전달체계에변화를줄가능성을시사함. 2. 국내외기술개발현황 간암은세계적으로는세번째, 국내에서는두번째로높은사망률을보이는암으로매우예후가좋지않음. 간암의중요한원인은간염바이러스에감염되는경우와발암물질 / 알코올등간손상물질에의한간손상의축적이간암발생의요인으로생각됨. 본과제는 b2-spectrin이라는골격단백질이 TGF신호전달과정에서 TGF-b 신호의전달자인 Smad3/Smad4와의생화학적결합으로 TGF-b-의존성세포생장, 분화, 이동, 및세포사의조절에관여할수있는가능성에착안하여 b2-spectrin의결손에의한암의생성촉진을통한암발생의기전을설명하고자함. 현재연구에사용되는 b2sp의유전자를제거한마우스의확보에서본연구그룹은전세계적으로가장발전된동물모델을보유하고운용중임. 또한본연구자와공동연구하고있는 Dr. Lopa Mishra의

10 경우본실험실도보유하고있는 b2sp의유전자결손마우스모델을최초로확립한연구자로이단백질의결손에의한이상현상분석에있어서가장발전된연구결과를생산하고있음. 또한유일하게조직특이적인결손유도마우스 (conditional knockout mouse) 를보유하고운용중임. 연구의진행에서이상형질의발현원인의규명이다각도로이루어지고있으나이의원인을간손상의축적에두고연구를진행하는것은본연구그룹이유일하며이는 b2sp의유전자를제거한 knockout 마우스의경우완전결실의경우발생과정의이상으로생존가능하지않으며 heterozygous 돌연변이마우스인경우이의결손이간이외의조직에서도나타나간-특이적모델로의이용에제한적임. 따라서본과제의운용은확보된동물모델의운용를통한간-특이적인접근은현재연구분야에있어서충분히경쟁력이확보하고있음. 3. 연구수행내용및결과 b2sp의결실에의한심장발달에서의이상분석 b2sp이완전히결실된 homozygote 돌연변이마우스는배아발달중에치사를보이며이는 b2sp가발달과정에중요한역할을할것임을제시. 이에 heterozygote 마우스간의교배를통해 homozygote 를만들어발생과정에서발달에미치는영향을조사. 위의그림에서나타나듯이교배를통해얻어진배아에서 homozygote 돌연변이의경우 wild type 이나 heterozygote돌연변이배아에비해작고 dorsal neural tube defect를보이며조직학적인검사를통해본결과심장이정상적으로발달되지않음을알게됨. 발달에서 b2sp의발현분석 : 발달에서 b2sp의발현을알아봄으로써 b2sp가어떤기관의형성에관여하는지를분석. b2sp의발현은 targeting construct에존재하는 IRES-LacZ의발현을배아에직접염색하거나동결시키고절단한배아의 section을사용하여 X-gal assay를하여발색된 LacZ의활성을모니터링함. E9.5일의염색의경우심장위치에서두드러진발색이나타나며 E16.5의경우심장에서뚜렷한염색이관찰되어 b2sp의발현이심장의발생과정에서타기관에비해매우높게나타남을알수있었음 ( 아래좌측그림 ).

11 b2sp의결손에의한심장발달의이상 : 발달과정에서 b2sp를결손시키고이에의해심장발달에서이상이생기는지를관찰하니돌연변이배아의심장은정상에비해상대적으로작고심장에서의혈관형성이잘되지않음을관찰. 심장의이상은발달이진행됨에따라심해지고정상배아와달리심장벽이형성이잘되지않으며, 측정을통해얻어진결과로분석해본결과통계적으로유의한 compact layer의감소가관찰됨 ( 위우측그림 ). b2sp의결손에의한심장근세포의단백질변화분석 : b2sp의결손이심장발달의이상을초래하는원인분석을위해 b2sp conditional mouse의배아에서심장을적출하여근세포를배양하고이세포에서 b2sp의결손을위해 cre-adenovirus를감염시켜대조군과비교하니 b2sp를결손시킨결과 TGF-b/Smad 신호전달단백질의발현감소가일어나거나활성화가억제되며근세포의생장을촉진하는단백질의발현이증가하는반면에세포사를조절하는물질의발현이동시에증가하는양상을보임. 또한정상근세포와 b2sp결손근세포에서세포의생장과세포사를측정해보았을때통계적으로유의한세포생장의감소와세포사의증가가관찰되며세포의생장을배양과정에서측정해보았을때세포배양 3일후부터통계적으로유의하게감소됨. b2sp의결손에의한심장근세포의분화와세포골격의유지에서의역할변화분석 : 앞의결과에서보이는 TGF-b/Smad 신호전달과생장조절에서의 b2sp의역할이근세포의분화에직접적으로영향을주는지알아보기위해배양된심장근세포에서 b2sp의결손을유도하고이를통한근세포특이적인단백질발현패턴의변화를분석해보니 b2sp의결손은 Dystrophin, Nkx2.5, a-sma과같은근세포특이적인단백질의축적을저해. 이와더불어 b2sp가결손된심장근세포는이들단백질의정상적인분포가나타나지않거나근섬유특유의분포가없어짐을관찰. 이러한 b2sp 의결손으로부터유도된근세포특이적인단백질의축적이억제되거나분포의이상이기능과연관되어있는지알아보기위해근수축을알아볼수있는자발적인근세포의수축을측정하여보니 b2sp가결손된근세포의경우자발적인근세포의수축의횟수가정상의절반에미치지못하고이러한차이는통계적으로유의함. 이에 b2sp은근세포의분화를조절하며이를통해근세포특이적인단백질의발현을조절하며근세포특이적인골격단백질의정상적인분포에필요하며이러한조절은근세포의기능인수축작용에필요함을시사.

12 b2sp의결손에의한심장근세포의분화와세포골격의유지에서의역할변화분석 : b2sp에의한분화와세포골격의유지에서의역할이심장근세포뿐아니라발생중인배아에서도유사한조절을하는지알아보기위해발생중인 b2sp돌연변이배아에서생장의정도를비교해보니 b2sp의결실은세포의생장을저하하고세포사를증가시키는것으로관찰. 또한세포골격단백질인 dystrophin의위치를분석해보니정상에서나타나는 band형태의위치가돌연변이에서는관찰되지않음으로써배아의생장과세포골격의유지에도 b2sp가관여함을알수있음. 또한심장근의두께형성에미치는영향이외에도 b2sp돌연변이배아의심장에서 ventricular septal defect와같은심장형성에이상이관찰되어 b2sp의존재가심장의발달의다양한단계에관여함을보여줌. Acetaminophen (APAP) 에의한간손상에서 b2sp의역할에관한연구 간의손상에서의 b2sp의변화 : (A/B/C) 간손상과 b2sp와의관계를알아보기위해간손상조건및손상유도물질을처치하여 b2sp의변화를관찰한결과고용량에서간독성을유발하는것으로알려진 acetaminophen (APAP) 을처리한결과전기영동상에서 b2sp의수준감소와면역양성을보이는 fast migrating band가관찰됨. 이 fast migrating band를쥐에 APAP를투여한후조사해보니 APAP 처리후통계적으로유의한증가가관찰됨으로 APAP에의한유도가능성을제시. (D) APAP에의해유도되는간손상에관여하는조절기전을분석하니 b2sp의 fast migrating band의유도와더불어 TGF-b pathway와 apoptosis의증가가관찰됨. (E) fast migrating band의파악을위해 V5/His-tag을이용한결과이는 TGF-b에의해유도되며 b2sp full-length에서유래되는것으로보임. b2sp의절단 : (A) 간손상에의해생기는작은분자가 b2sp에서유도된물질인지를알아보기위해 b2sp의발현과정에서말단에각기 FLAG/V5 두개의다른표지를붙이고 COS7 세포주에서발현시켜본결과이분자는 240 kda인 full length protein이 repeat region내에서절단이이루어져 N-말단쪽은약 150 kda으로 C-말단쪽은 90 kda의두개의조각으로나뉘어져생성됨. (B) 이의절단에관여하는 protease의동정을위해 b2sp를순수정제하여기질로사용하여 in vitro assay를시행하여분석한결과 caspase-3에의해생성됨. (C/D) 반면세포내에서 caspase-3의저해제를통해절단을방해하여도절단이일어나나 pan-caspase의저해제는절단의억제효과를보여다른 caspase가절단에관여할가능성을보임. 이에 caspase family를통해분석하니 caspase-3이외에 caspase-7이절단에관여함을보임.

13 b2sp 단백질분해위치의돌연변이와 Fragment 의 cloning: (A) TGF-b에의해유도되는 b2sp의 cleavage는 recombinant caspase와의반응을통해 caspase-3 와 caspase-7에의해절단되고, caspase-3/7에의해절단되는단백질의 1차구조를분석해본결과, caspase-3 와 caspase-7에의해공통적으로인식되는기질의 1차구조는 DEVD sequence가 b2sp내의 17개의 alpha-helix repeat중의 13번째에부위 ( ) 에이 sequence가존재. 이 13번째 alpha-helix repeat에존재하는 DEVD sequence가 caspase-3/7에의해인식되고절단되는부위인지를확인하기위해 1457번아미노산인 aspartic acid를 alanine으로 site-directed mutagenesis를통하여돌연변이를제조하고이를정상 b2sp단백질과절단여부를비교. 절단위치를 DEVA로변환시킨 b2sp의경우정상단백질에서관찰되는 90 kda크기의 fragment가전혀관찰되지않는것으로보아이위치가 caspase-3/7에의해인식되어절단되는부위임을동정. (B/C) 또한절단이일어나지않는돌연변이와비교를통해절단되는 b2sp가통계적으로유의한세포사와 TGF-b의존적전사조절의활성이높은것으로비추어이절단이이들활성조절에영향을줄것으로생각됨 b2sp와각 Fragment 들의세포주기조절능력의비교 : (A) b2sp의절단으로생성된 fragment가세포주기의조절에서어떠한효과를매개하는지알아보기위해 Full-length b2sp와절단된두개의 fragment를세포에서과발현시키고세포주기조절에관여하는단백질의양적변화를 western blot으로확인한결과두 fragment 단백질은모두 G1/S checkpoint arrest에관여하는 Rb의인산화, CDK4, cyclin D1을감소시키고 apoptosis에관여하는 caspase-7을활성화시킴. (B/D) 각말단에특이적인결합단백질을조사해보니 N-말단의경우 TGF-b의신호전달에관여하는 Smad3의특이적인결합이확인되었고, C- 말단의경우 p53과결합하여세포사를조절하는 53BP2의특이적인결합이확인됨. (C/E) 이특이적인결합을활성과연관지어보니 N-말단의경우 TGF-b-의존적전사조절에통계적으로유의한효과를보이는반면, C-말단 fragment가 apoptosis의조절에연관되어있음을보여줌. b2sp의위치변화 : (A) b2sp의절단이 b2sp의위치조절과연관이있는지알아보기위해 Full-length

14 b2sp와절단된두개의 fragment를 U2OS세포와 Hela세포에서발현시킨후세포를고정하고 vector 에존재하는 V5-tag을대상으로 V5에대한항체를사용하여세포내에서 b2sp의위치를조사. 두가지의세포모두에서 Full-length b2sp의경우세포질에서발현이주로나타나는데비해 N-말단의 Fragment는핵막주위에서집중되어분포하고 C-말단의 fragment는세포질에분포하여 b2sp의절단이 b2sp의위치조절에관여할수있는가능성을제시. 이를확인하기위해세포를분획을통해세포질과핵으로나눈후각이의분포를항체를통해확인한결과 N-말단의경우다른 b2sp와달리핵에높은분포로존재함을확인. b2sp의 APAP- 유도간손상에서의역할 : (A/B) b2sp의 APAP-유도간손상에서의역할을알아보기위해간세포주인 HepG2세포에 APAP를처리하고그의손상정도를 MTT assay를통해검사. 또한이세포주에 b2sp의발현을조절하기위해 b2sp에특이적인 shrna와이의대조군으로 CTL shrna를처리한 HepG2세포를이용하여발현조절. b2sp의발현이억제된 HepG2세포주의경우대조군에대비해 APAP처리후 24시간과 48시간에서공히 APAP에대해통계적으로유의한저항성을보이는것으로보아 APAP에의해유도된간손상반응에 b2sp가관여함을보임. (C/D) b2sp가 APAP에의해유도되는간손상과정에서의역할을검증하기위해 b2sp의발현이절반으로줄어든 b2sp heterozygote mouse에 APAP를주사하고간손상이최대로나타나는 3일후쥐의간을적출하고조직을조사. H&E 염색을통해조사하였을때정상쥐의경우간의손상이나타나는반면에돌연변이쥐의경우간의조직이정상과유사한형태로나타나며간세포의생장정도를 KI-67로염색하여보았을때돌연변이쥐의경우정상쥐보다높은 Ki-67 수치를보이는것으로보아손상에의한생장의억제가일어나지않은것으로판단됨. 이러한결과는 b2sp가 APAP에의해유도되는간손상에서중요한역할을하고 b2sp의결실이이러한과정이잘못되어손상받은간의생장을통해암의발생빈도를높일것으로추정됨. 이결과는급성간부전의가장대표적인원인인과다복용된 APAP에의한간독성의진행되는과정에서 b2sp의절단이일어나고이에의해생성된 b2sp의절단이 TGF-b의신호전달과정에서나타나는 transcriptional activation과 apoptosis가조절함을시사하며이과정의조절을통해 APAP-의존성급성간부전의새로운치료제의도출이가능함을시사함.

15 APAP 에의한간손상에서 b2sp의역할에관한연구 b2sp의결손에의한 APAP- 유도간손상 : b2sp의 APAP-유도간손상에서의역할을알아보기위해간특이적인 b2sp의결손을유도한돌연변이마우스 (b2sp co/co alb1-cre) 와정상마우스에 APAP를고농도 (500 mg/kg) 로주사하고 24시간이경과한후혈청을취득하여간손상과관련된효소인 ALT와 AST의수치를비교해보니 b2sp의결손은 APAP에의한간손상에서통계적으로유의한저항성을보임. 또한해당농도에서 APAP에의한급성간부전에의한사망률을비교해보니 b2sp co/co alb1-cre마우스의경우정상마우스에비해치사율이통계적으로유의하게저하됨을보임. 이러한 b2sp의결손이 APAP에의한간손상에서차이를보이는이유를알아보기위해정상쥐와 b2sp돌연변이쥐의간을적출하고조직을 H&E 염색을통해분석해보았을때 b2sp co/co alb1-cre마우스의경우정상쥐에비해동일시간에손상부위가상대적으로작고빨리회복됨이관찰됨. APAP-유도급성간부전에서 b2sp의결손에의한간섬유화억제 : 고농도의 APAP에의한급성간부전은간세포의 apoptosis를유도하고손상받은간은섬유화현상을보이며이러한섬유화의유무를 collagen의축적을표지하는 Masson 의 Trichrome염색으로시도해보니정상쥐의간의경우에는괴사가빈번하게일어나는부위에서파란색으로 collagen의축적이관찰되나간특이적으로 b2sp의결손을유도한 b2sp co/co alb1-cre 돌연변이마우스에서는동일한부위에서 collagen의축적이관찰되지않음 ( 우측그림 ). APAP-유도급성간부전에서 b2sp의결손에의한영향분석 : APAP에의한급성간부전에서 b2sp의결손은간손상에저항성을보이는데이원인의분석을위해간조직에서세포사와생장을 TUNEL과 PCNA염색을통해조사. 간조직의괴사의경우정상조직의경우 b2sp가결손된경우에비해괴사가일어난면적이넓게분포하고괴사가오랫동안지속되는양상을보임. 반면에간세포의생장의경우반대로 b2sp가결손된경우에서생장이일어나는부위가넓고생장회복이정상의경우보다빨리일어남이관찰됨 ( 아래그림 ). b2sp 의결손시 APAP- 유도간손상의심각성 : 급성간부전의관점에서보면 b2sp 의결손은오히려간

16 손상이억제되는장점이있으나다른문제점이발생될수있는가능성을조사해보니, 손상된 b2sp co/co alb1-cre 돌연변이마우스의간조직에서는 bile duct주위와간세포에서현저히높은생장이관찰됨 ( 우측그림 ). 이는손상된간조직에서분비되는인터류킨에의해촉진된생장이 b2sp의결손된세포에영향을주어생장을과다하게촉진하는것으로생각됨. 따라서 b2sp의발현저하에의해생기는간암의원인이손상에따른다른반응성으로생각됨. 이를확인하기위해저농도의 APAP (250 mg/kg) 에의한손상을반복적 ( 월2회 X 6개월 ) 으로주고간이상이관찰되는지확인중임. 위결과는 b2sp가 APAP-의존성간손상을매개하고이에의해세포사를촉진하며세포생장의억제를통해간손상을유발함을시사함. 그러나 b2sp의발현저하혹은결실은이과정을저해하여 APAP-의존성간손상은억제하나이는간세포의생장을촉진하여이의반복적인자극은간암과같은이차적인간질환을유발할가능성을제시함. Caspase의활성억제에의한 APAP에의한급성간부전의회복에관한연구 b2sp의절단억제에의한 APAP- 유도간손상의억제 : 본연구에서 APAP는간손상시 b2sp의절단을유도하고이에의해간세포에손상이축적되고세포사를일으키므로급성간부전의치료의관점에서 b2sp의주요한조절작용인절단을억제할경우간손상과급성간부전을억제할수있는지를조사함. 이를위해개체수준에서 caspase를억제하는것으로알려진 IDN-6556 (Emricasan) 을 10 mg/kg의용량으로복강에투입하였을때 APAP에의한간손상을혈액과조직에서확인. 흥미롭게도 APAP에의해생기는간손상시 IDN-6556을동시에주었을때조직에서 APAP에의해생기는간조직의괴사가효과적으로사라지고혈액에서는간손상수치인 ALT/AST의수치도통계적으로유의하게정상수준으로회복됨을관찰함. 이는 APAP에의한간손상이 b2sp의절단에관여하는 caspase의억제를통해효과적으로억제됨을보여줌. APAP- 유도간손상에서 IDN-6556 과 NAC의효과비교 : 급성간부전의치료에서본연구에서제시된 IDN-6556과기존의사용되어온 NAC와효과를비교하기위해 APAP를주사하여급성간부전을일으킨마우스에시간에따라 IDN-6556 (10 mg/kg) 과 NAC (500 mg/kg) 를주사하여간손상정도를비교. APAP주사후 24시간경과후측정을기준으로하였을때 NAC의경우에는통계적으로유의한간보호효과를보이기위해서는최소 18시간전의투입 (APAP손상후 6시간이내에 ) 이필요하나 IDN-6556은혈액채취 6시간전의투입 (APAP손상후 18시간경과 ) 후에도효능을보임이관찰됨. APAP-유도간손상에서 IDN-6556 과 NAC의복합효과 : 급성간부전의치료에서 IDN-6556은손상에의

17 한세포사를억제하는반면에기존에사용되어온 NAC 는손상을일으키는원인물질을 PQIP 를제거하 여손상의생성을방지하는작용을함. 따라서서로다른효과를보이는두약물의복합처방이급성 간부전의회복에보다효과적인지알아보기위해 APAP (400 mg/kg) 를주사하여급성간부전을일으 킨마우스에 12 시간후 IDN-6556 (10 mg/kg) 과 NAC (500 mg/kg) 를주사하고 12 시간후간손상정 도를비교. 두약물의단독처리에서는이전의실험과같이주어진환경에서 NAC 에비해 IDN-6556 이 효과적인결과를보였으나이두결과보다는복합처방이가장좋은예후를보이는것으로관찰됨. 따라서위의결과는가장빈번하게일어나는급성간부전의원인인 APAP 에의한간손상에서 b2sp 의 조절에관여하는 caspase 의억제는이에적합한적절한치료법이될가능성을제시함. 지속적간손상에서 b2sp- 결손에의한간질환연관성에관한연구 APAP- 유도간손상에서 IDN-6556 과 NAC 의복합효과 : 마우스에서 b2sp 의발현저하나결손은자연적 으로지방간을유발하고간암과같은간질환을유발 하는것으로알려짐. 그러나간손상이이러한질환과 의연관성은잘알려지지않음. 따라서본연구는저 자극의지속적인간손상을유도하였을때위질환으 로손쉽게유도되는지관찰하고자함. 현재계획되고 있는간손상방법은마우스의사료에지방함량을높 인고지방사료 (45% Fat diet) 로사육하여지방간을 촉진하거나, 줄기세포의생장을촉진하는것으로알 려진 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocolidine(DDC) 함유사료로사육하거나위에사용된 APAP 를저농도 로지속적으로주어 b2sp 의결손이대상간질환의 발생을촉진하는지확인하고더나아가더심각한질 환으로유도되는지관찰. 이러한노력은간손상의기전연구뿐만아니라간손상에의해생기는간질 환에대한새로운치료제의발굴과확인을위한적합한동물모델로개발하여해당환자를대상으로 하는특이적치료제발굴을촉진하고치료효율을높이는데기여하고자함. 4. 목표달성도및관련분야기여도 4-1. 목표달성도 목표세부연구목표달성내용달성도 b2sp의 KO에서통계적으로유의한 bile duct 세포 b2sp의 KO 마우스모델의조직분석과결과도출 의과다생장확인 b2sp 모델 b2sp의간특이적-conditional KO 마우스모델 1.5년의기간동안에 b2sp의간특이적-conditional 시스템을의관찰과자료축적 KO 마우스모델의관찰과자료축적완료이용한 APAP를사용한간손상에서의 b2sp의역할규 APAP에의한 b2sp의절단과세포사와 TGF-b-의존 간손상명적전사조절 Data의 b2sp KO 마우스에대한간암유도를통한간암고지방식의투여에의한지방간과이에관련병리축적 모델의확립형질의확인 (2013년) b2sp의결실에의한 embryonic lethality에서의 b2sp의결실에의한심장발달이상의확인 이상분석 (I) b2sp의간특이적-conditional KO 마우스모델간특이적 b2sp의결실시 KO 마우스와동일한 bile 의조직분석과결과도출 duct 세포의과다생장확인 b2sp 모델 b2sp의결실이간손상과암발생에미치는영 b2sp의결실시간손상의억제가일어남과동시에 시스템을향의상관관계분석회복시간조직세포에서과다생장이촉진됨을확인이용한간암유도를통한암발생에서의 b2sp의역할 APAP에의한 b2sp의절단과세포사와 TGF-b-의존 간손상규명적전사조절결과의 APAP에의한 b2sp의절단시 N-말단과 C-말단의분석간손상유도에서의 b2sp의위치변화의분석 핵막과세포질로위치변화확인 (2014년) b2sp의결실에의한 embryonic lethality에서의 b2sp의결실이심장근세포의신호전달, 세포생장, 이상분석 (II) 및세포분화의이상확인 b2sp- 의 b2sp 의조직특이적 -conditional KO 마우스모간특이적 b2sp 의결실시 KO 마우스와동일한 bile

18 존성암발생기전의분석과타겟도출 (2015 년 ) 델의관찰과자료축적유도를통한조직손상에서의 b2sp의역할규 명 b2sp KO 마우스에대한간암유도를통한간암 모델의확립 b2sp 와결합골격단백질의상관관계분석 b2sp 의위치변화에따른결합골격단백질의변 화분석 duct 세포의과다생장확인 APAP에의한간손상시 b2sp의결실시간손상에 억제및치사의감소관찰 간손상의유도를위해지방간, 줄기세포촉진, 간손상을통한간암유도 b2sp 의결실이심장근세포의다수의골격단백질의 분포및발현의이상확인 APAP에의한간손상시주요골격단백질의 b2sp의 절단에의한위치변화와더불어주요골격단백질의 발현변화의확인 4-2. 관련분야기여도 b2sp의유전자를제거한마우스의확보에서본연구그룹은 Dr. Lopa Mishra을통해 b2sp의유전자결손마우스모델을공여받았으며또한유일하게 Sanger Institute를통해조직특이적인결손유도마우스 (conditional knockout mouse) 를공여받아운용중임. 연구의진행에서이상형질의획득과이의원인분석을통해동물모델의확보가매우중요한데본연구그룹은전세계적으로가장다양한 b2sp의결손마우스모델을확보하고이동물모델의운용를통한간-특이적인접근은현재연구분야에있어서충분히경쟁력이확보하고있음. b2sp를포함한 TGF-b의신호조절기전에대한기초연구뿐아니라암발생기전에대한원인규명은연구를 in vitro와 in vivo수준에서동시에접근하는것은현재매우발달된연구접근법으로연구과정에서동물모델과세포나조직을사용함으로써보다믿을만한결론을이끌어낼수있어서상대적으로우수한논문을생산할수있는가능성을가지고있으며이를통해만들어진모델은유전자특이적암을 target으로하는치료제개발의최적의모델로이용가능. 5. 연구결과의활용계획 진료적인측면 : 암의발생과정에서발생한 genetic determination은항암치료효과에영향이있음. 특히 b2sp와같이세포생장과더불어암전이를조절하는단백질은이에더욱밀접하게연관되어있음. 본연구를통해얻어진연구결과는항암제개발에있어근간이되는훌륭한분자표적을개발하는데기여할것으로기대되며이를통해암환자의예후예측과적절한치료법고안에기여할것으로기대하며항암치료의효과가극대화되기위해서는항암제에대한종양의반응예측인자에대한조직적이고체계적인생물학적연구가절실하므로본연구를통해얻어진연구성과는이의지표로사용하여치료효율을높이는데기여하고자함. 지식및기술적측면 : b2sp를포함한 TGF-b의신호조절기전은아직도기초연구가필요한분야로이연구를 mice와 human에대해 in vitro와 in vivo수준에서동시에접근하는것은현재매우발달된연구접근법임. 본연구는이의작용기전을밝혀내는과정에서 knockout mice와이에서유래된세포나조직을사용함으로써보다믿을만한결론을이끌어낼수있어서상대적으로우수한논문을생산할수있는가능성을가지고있으며이를통해만들어진모델은유전자특이적암을 target으로하는치료제개발의최적의모델로이용가능. 6. 연구과정에서수집한해외과학기술정보 간암은세계적으로는세번째, 국내에서는두번째로높은사망률을보이는암으로매우예후가좋지않음. 간암의중요한원인은간염바이러스에감염되는경우와발암물질 / 알코올등간손상물질에의한간손상의축적이간암발생의요인으로생각됨. 본과제는 b2-spectrin이라는골격단백질이 TGF신호전달과정에서 TGF-b 신호의전달자인 Smad3/Smad4와의생화학적결합으로 TGF-b-의존성세포생장, 분화, 이동, 및세포사의조절에관여

19 할수있는가능성에착안하여 b2-spectrin의결손에의한암의생성촉진을통한암발생의기전을설명하고자함. 현재연구에사용되는 b2sp의유전자를제거한마우스의확보에서본연구그룹은전세계적으로가장발전된동물모델을보유하고운용중임. 또한본연구자와공동연구하고있는 Dr. Lopa Mishra의경우본실험실도보유하고있는 b2sp의유전자결손마우스모델을최초로확립한연구자로이단백질의결손에의한이상현상분석에있어서가장발전된연구결과를생산하고있음. 또한유일하게조직특이적인결손유도마우스 (conditional knockout mouse) 를보유하고운용중임. 연구의진행에서이상형질의발현원인의규명이다각도로이루어지고있으나이의원인을간손상의축적에두고연구를진행하는것은본연구그룹이유일하며이는 b2sp의유전자를제거한 knockout 마우스의경우완전결실의경우발생과정의이상으로생존가능하지않으며 heterozygous 돌연변이마우스인경우이의결손이간이외의조직에서도나타나간-특이적모델로의이용에제한적임. 따라서본과제의운용은확보된동물모델의운용를통한간-특이적인접근은현재연구분야에있어서충분히경쟁력이확보하고있음. 7. 연구개발과제의대표적연구실적 번호 구분 ( 논문 / 특허 / 기타 1 논문 논문명 / 특허명 / 기타 Loss of β2-spectrin 소속 기관명 prevents cardiomyocyte 국립암센터 differentiation and heart 역할논문게재지 / 특허등록국가 교신 Cardiovascular Research (101, 39-47) Impact Factor 논문게재일 / 특허등록일 사사여부 ( 단독사사 또는 중복사사 ) 특기사항 (SCI 여부 / 인 용횟수등 ) 중복사사 SCI development 2 yyyy.mm.dd 3 yyyy.mm.dd 4 yyyy.mm.dd 5 yyyy.mm.dd 8. 참여연구원현황 번호 소속기관명직위생년월일전공및학위 성명 과학기술인등록번호 성별 취득년도 학위 ( 전공 ) 연구담당분야 과제참여기간

20 < 별첨작성양식 > [ 별첨 ] 1. 과제현황 자체평가의견서 과제번호 사업구분 기관고유연구사업 연구분야 B-1 단위과제구분사업명기관고유연구사업주관 총괄과제 b2-spectrin의결실에의한암발생기전에관한연구 총괄책임자 김상수 과제명 b2-spectrin의결실에의한암발생기전에관한연구 과제유형 기초 연구기관 국립암센터 연구책임자 김상수 연구기간 연구비 ( 천원 ) 연차 기간 연구비 민간 계 1차년도 , ,000 2차년도 , ,000 3차년도 , ,000 계 , ,000 참여기업 상대국 상대국연구기관 총연구기간이 5 차년도이상인경우셀을추가하여작성요망 2. 평가일 : 평가자 ( 과제책임자 ) : 소속 직위 성명 국립암센터방사선의학연구과 책임연구원 김상수 4. 평가자 ( 과제책임자 ) 확인 : 본인은평가대상과제에대한연구결과에대하여객관적으로기술하였으며, 공정하게평가하였음을확약하며, 본자료가전문가및전문기관평가시에기초자료로활용되기를바랍니다. 확약

21 Ⅰ. 연구개발실적 1. 연구개발결과의우수성 / 창의성 등급 : ( 아주우수 ) 본연구는이의 b2-spectrin의결실에의해일어난이상현상을밝혀내는과정에서 knockout mice와이에서유래된세포나조직을사용함으로써보다믿을만한결론을이끌어낼수있어서상대적으로우수한논문을생산할수있는가능성을가지고있으며이를통해만들어진 knockout 마우스모델은각각의 genetic alteration에적합한암을 target으로하는치료제개발의최적의모델로이용가능하다. 또한세포골격단백질의발현조절이신호전달에영향을줄가능성을제시함으로써기존의사고에반하여골격단백질의중요성을규명함, 2. 연구개발결과의파급효과 등급 : ( 아주우수 ) 암의발생과정에서발생한 genetic determination은항암치료효과에영향이있다. 특히 b2-spectrin 와같이세포생장과더불어암의전이를조절하는단백질은이에더욱밀접하게연관되어있어서본연구를통해얻어진연구결과는항암제개발에있어근간이되는훌륭한분자표적을개발하는데기여할것으로기대됨. 또한간손상과정에서 b2-spectrin의역할을규명하고이에연관된 caspase의억제를통한급성간손상의회복은해당질환의중요한치료방법의근거가되리라예상. 3. 연구개발결과에대한활용가능성 등급 : ( 아주우수 ) b2-spectrin의비활성화및변이에의한암발생기전에대한규명은이를통해암환자의예후예측과적절한치료법고안에기여할것으로기대하며항암치료의효과가극대화되기위해서는항암제에대한종양의반응예측인자에대한조직적이고체계적인생물학적연구가절실하므로본연구를통해얻어진연구성과는이의지표로사용하여치료효율을높이는데기여하고자한다. 암의발생과더불어 caspase의억제제인 IDN-6556에의한급성간손상에서간손상억제및치사율감소와같은효과는현재사용되고있는 N-acetylcysteine과는다른작용기전을이용하여간손상을억제하는치료제로이의활용가능성이매우높을수있음. 4. 연구개발수행노력의성실도 등급 : ( 아주우수 ) 본연구진은 3년간의연구사업을진행하면서계획된연구목표를 달성하였으며본연구과제의지원을통해 1편의연구논문을게재되었고 1편이심사중에있으며향후 2년이내에 2편의연구논문을추가로투고할예정입니다. 5. 공개발표된연구개발성과 ( 논문, 지적소유권, 발표회개최등 ) 등급 : ( 미흡 )

22 연구지원기간동안에본연구책임자는 1편의논문이 Cardiovascular Research (IF: 5.940) 이계제되었고이저널은 Journal citation reports 의기준으로총 8659 개의저널중상위 433번째 (5.00%) 에위치하는저널이며, 또 1 편의논문이 International Journal of Biological Sciences (IF: 4.509) 에투고하여 Revision 중이며이저널은 Journal citation reports 의기준으로총 8659 개의저널중상위 737번째 (8.51%) 에위치하는저널이다. 또한향후 2년이내에 2편의연구논문을추가로투고할예정입니다. Ⅱ. 연구목표달성도 세부연구목표 비중 (%) 달성도 b2sp 의 KO 마우스모델의조직분석과결과도출 6 6 b2sp 의간특이적 -conditional KO 마우스모델의 관찰과자료축적 APAP를사용한간손상에서의 b2sp의역할규 명 b2sp KO 마우스에대한간암유도를통한간암 모델의확립 b2sp의결실에의한 embryonic lethality에서의 이상분석 (I) b2sp의간특이적-conditional KO 마우스모델의 조직분석과결과도출 b2sp의결실이간손상과암발생에미치는영 향의상관관계분석간암유도를통한암발생에서의 b2sp의역할 규명 (%) 자체평가 b2sp 의 KO 에서통계적으로유의한 bile duct 세포의 과다생장확인 1.5년의기간동안에 b2sp의간특이적-conditional KO 마우스모델의관찰과자료축적완료 APAP에의한 b2sp의절단과세포사와 TGF-b-의존적 전사조절고지방식의투여에의한지방간과이에관련병리형질 의확인 7 7 b2sp 의결실에의한심장발달이상의확인 간손상유도에서의 b2sp 의위치변화의분석 7 7 b2sp 의결실에의한 embryonic lethality 에서의 이상분석 (II) b2sp 의조직특이적 -conditional KO 마우스모델 의관찰과자료축적 유도를통한조직손상에서의 b2sp 의역할규 명 b2sp KO 마우스에대한간암유도를통한간암 모델의확립 b2sp 와결합골격단백질의상관관계분석 7 7 b2sp 의위치변화에따른결합골격단백질의변 화분석 7 7 합계 100 점 100 점 간특이적 b2sp 의결실시 KO 마우스와동일한 bile duct 세포의과다생장확인 b2sp의결실시간손상의억제가일어남과동시에회 복시간조직세포에서과다생장이촉진됨을확인 APAP에의한 b2sp의절단과세포사와 TGF-b-의존적 전사조절 APAP에의한 b2sp의절단시 N-말단과 C-말단의핵막 과세포질로위치변화확인 b2sp 의결실이심장근세포의신호전달, 세포생장, 및 세포분화의이상확인 간특이적 b2sp 의결실시 KO 마우스와동일한 bile duct 세포의과다생장확인 APAP 에의한간손상시 b2sp 의결실시간손상에억제 및치사의감소관찰 간손상의유도를위해지방간, 줄기세포촉진, 간손상을통한간암유도 b2sp 의결실이심장근세포의다수의골격단백질의분 포및발현의이상확인 APAP에의한간손상시주요골격단백질의 b2sp의절 단에의한위치변화와더불어주요골격단백질의발현 변화의확인 Ⅲ. 종합의견

23 1. 연구개발결과에대한종합의견 b2-spectrin 단백질의돌연변이로유발된간암을비롯한다양한암에서빈번히관찰되고있으나이의결실에의한발생기전은잘알려져있지않음. 본연구는이의규명을위해 b2-spectrin의생화학적인상호작용을하는타겟을발굴하고이의역할을규명하여 b2-spectrin의돌연변이로부터발생된간암이발생기전을밝힘으로써항암제개발에있어근간이되는훌륭한분자표적을개발하는데기여할것으로기대됨. 또한간손상과정에서 b2-spectrin의역할을규명하고이에연관된 caspase의억제를통한급성간손상의회복은해당질환의중요한치료방법의근거가되리라예상. 2. 평가시고려할사항또는요구사항 본연구의핵심분야인 Knockout mice 의사용으로인하여결과도출에걸리는시간이다른세포중심 과제에비해오래걸리는특성이있어이의고려가요구된다. 3. 연구결과의활용방안및향후조치에대한의견본과제는암억제유전자인 b2-spectrin의돌연변이혹은발현저하에의해생성되는암의발생을분석하여본연구를통해얻어진연구성과를항암치료에서지표로사용함으로써치료효율을높이며이를통해각각의돌연변이암의새로운치료제및저해제의개발에기여하고자하는것임. 또한본연구는이의작용기전을밝혀내는과정에서 knockout mice와이에서유래된세포나조직을사용함으로써보다믿을만한결론을이끌어낼수있어서상대적으로우수한논문을생산할수있는가능성을가지고있으며이를통해만들어진마우스모델은각각의 genetic alteration에적합한암을 target으로하는치료제개발의최적의모델로이용하고자함. 암의발생과더불어 caspase의억제제인 IDN-6556에의한급성간손상에서간손상억제및치사율감소와같은효과는현재사용되고있는 N-acetylcysteine과는다른작용기전을이용하여간손상을억제하는치료제로이의활용가능성이매우높을수있어이에대한추가연구를통해급성간손상에대한치료제로서의가능성을제시하고자함. Ⅳ. 보안성검토 1. 연구책임자의의견 해당없음 2. 연구기관자체의검토결과