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1 최종보고서 염산바캄피실린정의생체이용률시험및생물학 적동등성시험표준지침작성 Bioavailability Test of Bacampicillin Preparation and Guideline of its Bioequivalence Test 주관연구기관 : 중앙대학교

2 [ 별지제 10 호서식 ] 용역연구개발사업최종보고서 관리번호 03142약동성529 사 업 명 의약품동등성관리 과 제 명 염산바캄피실린정의생체이용률시험및생물학적동등성시험표국문준지침작성 Bioavailability Test of Bacampicillin Preparation and 영문 Guideline of its Bioequivalence Test 기관명 소재지 대 표 주관연구기관 중앙대학교 서울시동작구흑석동 221 박명수 주관연구 책임자 성명소속및부서전공 최영욱약학대학약제학 연구기간 2003 년 3 월일 ~ 2003 년 11 월일 ( 9 개월 ) 연구비일금육천만원정 ( 60,000,000 ) 12명참여연구원 ( 책임연구원 : 3 명, 연구원 : 9 명 ) 년도용역연구개발사업에의하여수행중인연구과제의최종보고서를붙임 과같이제출합니다. 붙임 : 1. 최종보고서 10 부 ( 배포용 25 부별도제출 ). 2. 최종보고서수록디스켓 1 부 (HWP97). 년월일 주관연구책임자최영욱 ( 인 ) 주관연구기관장중앙대학교총장 ( 직인 ) 식품의약품안전청장 ( 국립독성연구원장 ) 귀하

3 제출문 식품의약품안전청장 귀하 이보고서를 염산바캄피실린정의생체이용률시험및생물학적동등성시험표 준지침작성 ( 중앙대학교 / 최영욱 ) 과제의최종보고서로제출합니다 주관연구기관명 : 중앙대학교 주관연구책임자 : 최영욱 제 1 세부과제명 : 염산바캄피실린정의생체이용률시험및생물학적동등성시험 표준지침작성 ( 제1세부연구기관 / 세부과제책임자 ): 중앙대학교생명의약연구원 / 최영욱교수 제 2세부과제명 : 염산바캄피실린정의생체이용률시험및생물학적동등성시험표준지침작성 ( 제2세부연구기관 / 세부과제책임자 ): 영남대학교약품개발연구소 / 용철순교수 제 3세부과제명 : 염산바캄피실린정의생체이용률시험및생물학적동등성시험표준지침작성 ( 제3세부연구기관 / 세부과제책임자 ): 경희대학교동서약학연구소 / 이경태교수 위탁과제명 : 염산바캄피실린정의생체이용률시험및생물학적동등성시험표준지침작성 ( 위탁연구기관 / 위탁연구책임자 ): 식품의약품안전청 / 식품의약품안전청장

4 연구사업최종보고서요약문 연구과제명 중심단어 염산바캄피실린정의생체이용률시험및생물학적동등성시험지침작성 염산바캄피실린, HPLC, 생체이용률시험, 생물학적동등성시험 주관연구기관중앙대학교주관연구책임자최영욱연구기간 연구개발의목적및필요성 생물학적동등성시험기준 ( 식품의약품안전청고시제 호, ) 및 2003년도식품의약품안정청용역연구개발사업공고 ( 식품의약품안정청공고제 호, ) 에따라, 바캄피실린제제를경구투여하여건강성인에서의생체이용률을구하고이를통하여표준생물학적동등성시험지침을작성한다. 연구개발의내용및범위 각세부기관에서 HPLC를이용한바캄피실린의분석방법 Validation을동시에진행하여그결과를취합표준분석법을확립한다. 확립된표준분석방법을이용하여바캄피실린을시험대상약물로하여제1세부기관 ( 중앙대, 최영욱 ; 주관연구기관 ), 제2세부기관 ( 영남대, 용철순 ) 및제3세부기관 ( 경희대, 이경태 ) 에서생체이용률시험을수행하고, 각기관의결과를종합분석하여표준생체이용률시험법을확립한다. 최종적으로주관연구기관에서표준생물학적동등성시험지침을작성한다. 시험결과의평가항목은약동력파라미터인 AUC, C max, T max, Ke, t 1/2 등을평가하며, 이때, AUC는사다리꼴공식으로산출하며, C max 와 T max 는실측치로부터구하고, 소실속도정수 (Ke) 및소실반감기 (t 1/2) 는 BA Calc 2002 (ver ) 을이용하여혈중농도-시간세미로그플롯에서직선성을나타내는 terminal phase로부터구한다. 연구개발결과 1) 계획서대로 3개기관모두체내변화체인암피실린의혈중분석법을 HPLC-UV 검출법으로검토하여양호한결과를얻었으며, 각기관별로분석법 validation을완료하여정량한계 0.5μg /ml에서생체이용률시험에적용할수있음을확인하였다. 2) 각세부기관에서지원자모집과시험설명및의료기관에서시험담당의사의건강검진을거쳐선정한건강한피험자에대해시험계획서에따라피험자를관리하고바캄피실린제제 ( 대조약 : 펜그로브정 0.4g, 유한양행 ) 1정을물 240mL로경구투여하였다. 투약전 (0시간) 과투약후 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 2, 2.5, 3, 4 및 6시간의총 12시점에서채혈하여혈중약물농도를 Validation된 HPLC-UV 검출법으로혈중암피실린의농도를측정하여생체이용률파라미터를구였다. 연구개발결과의활용결과및계획 생물학적동등성시험방법을표준화한가이드라인을제공할수있으며, 생물학적동등성시험기간단축및비용절감유도 약효동등성이확보된후발의약품으로대체조제를활성화함으로써의료비용절감및의료보험재정의안정화도모 국내연구소의생물학적동등성시험에대한기반자료구축및기술축적

5 Project Summary Title of Project Bioavailability Test of Bacampicillin Preparation and Guideline of its Bioequivalence Test Key Words bacampicillin HCl, HPLC, Bioavailability test, Bioequivalence test Institute Chung-ang Univ. Project Leader Young Wook Choi Project Period The analysis of bacampicillin [1-ethoxy-carbonyloxyehyl-6-(D-a-aminophenylacetamido)- penicillinate hydrochloride] in biological fluids required for the determination of its phar macokinetic parameters. In order to investigate the bioavailability of bacampicillin prep aration, twenty four health volunteers in total were subjected to three different test org anizations. Bacampicillin tablet was given orally to eight healthy volunteers (400mg, sin gle dose) in each organization and venous blood samples (10ml) were taken via cathete r in the forearm in 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 6 hr after dosing. Ampicil lin plasma levels were determined by HPLC method under UV detection at 214nm M phosphate buffer was used as a mobile phase at a flow rate of 1.2 ml/min. Plasma protein was spiked with internal standard (Tiapride), and centrifuged at approximately 12,000rpm for 10min. Ampicillin was eluted between min whereas tiapride was eluted between min. Plasma standard curves were linear over the calibration range of μg /ml, showing the correlation coefficient (R 2 ) of The inter- and intra-day coefficients of variation were about % and %, respectively. Assay accuracy was about 98.23% %. Pharmacokinetic parameters in average fro m the results of three test organizations were obtained as follows (mean±s.d.) : AUC 10.52±2.18( μg hr/ml), Cmax 6.43±1.60 ( μg /ml), Tmax 0.59±0.13 (hr), Ke 0.62±0.17 (hr - 1 ), t1/2 1.20± 0.39 (hr)

6 제 1 장서론 염산바캄피실린제제를경구투여하여건강성인에서의생체이용률을구하고이를통하여표준생물학적동등성시험지침을작성 제시한다. 각세부기관에서 HPLC를이용한바캄피실린의분석방법 Validation을동시에진행하여그결과를취합하여표준분석법을확립한다. 확립된표준분석방법을이용하여바캄피실린을시험대상약물로하여제1세부기관 ( 중앙대, 최영욱 ; 주관연구기관 ), 제2세부기관 ( 영남대, 용철순 ) 및제3세부기관 ( 경희대, 이경태 ) 에서생체이용률시험을수행하고, 각기관의결과를종합분석하여표준생체이용률시험법을확립한다. 최종적으로주관연구기관에서표준생물학적동등성시험지침을작성한다. 생체이용률시험의만 19-55세의지원자중혈액병리검사, 혈액화학검사, 뇨검사, 내과적문진및활력증후등의검진을통하여건강성인을대상으로각기관에서총 8인이상을선정하여염산바캄피실린제제의임상사용량을물 240mL와함께 1회경구투약하고투약후 6시간까지경시적으로총 12회에걸쳐매회혈액 10mL씩을채혈한다. 시험피험자에게는동의서에규정한적절한사례를한다. 생물학적동등성시험규정에의하여투약전 12시간전부터채혈종료시까지적절한피험자관리를시행한다. 약물의투약및채혈은의료기관에서임상담당자인전문의의감독하에시행한다. 검체의처리및분석은표준분석법을따른다. 시험결과의평가항목은약동력파라미터인 AUC, Cmax, Tmax, Ke, t 1/2 등을평가하며, 이때, AUC는사다리꼴공식으로산출하며, Cmax와 Tmax는실측치로부터구하고, 소실속도정수 (Ke) 및소실반감기 (t 1/2) 는 BA Calc 2002 (ver ) 을이용하여혈중농도-시간세미로그플롯에서직선성을나타내는 terminal phase로부터구한다. 시험의신뢰성보증은시험에관련된모든주요사항을문서로작성하여시험의기초자료와함께최종보고서제출일자로부터 5년간보존하며, 시험계획서, 시험결과보고서및시험기초자료에대하여생물학적동등성시험기준 ( 식품의약품안전청고시제 호, ) 제7조에의해구성된심사위원회의심사와평가를받는다. 또한분석크로마토그램을포함한모든시험기초자료를첨부자료로시험결과보고서에첨부한다.

7 제 2 장국내 외기술개발현황 현재 UV 와 fluorescence 검출기를사용하는 HPLC system 을사용하여인간의혈장, 타액및 뇨에서 ampicillin 을분석하고있다. 일반적으로시료의전처리를위해사용되는추출과정에많은시간이소요되지만, 바캄피실린의경우추출이아닌제단백을이용하여전처리시간이짧다. 따라서, 시간및시약의소비가적고환경오염을유발하는문제가작다. 바캄피실린은 Penicillin 제제로서위와십이지장에흡수되어곧활성형인 ampicillin 으로유리되 며, 그람양성균및그람음성군을비롯한광범위한균주에감수성을나타낸다. 이약물은경구투여후 1/2~1 시간이내에최고혈중농도에도달한다.

8 제 3 장연구개발수행내용및결과 3개기관에서건강한성인 8인을대상으로염산바캄피실린의생체이용률시험을실시하였으며, 이를위해혈중에서의 HPLC 분석법을확립하였고, 각시험기관에서의약동력파라미터인 AUC, Cmax, Tmax, Ke, t 1/2 등을평가하였으며, 그결과를총괄검증하여최종품목별표준생물학적동등성시험지침을작성하였다. 세부시험기관 구분시험기관시험책임자시험담당자의료기관윤미경삼성서울병원임상제1세부중앙대학교최영욱의학연구소임상시기관생명의약연구원허우성험센터 (358호*) 제2세부영남대학교박상만영남대의료원용철순기관약품개발연구소이경희 (127호) 제 3 세부 기관 경희대학교동서약학연구소 이경태 하용화 류재환 경희의료원 (9 호 ) * 대한임상검사정도관리협회회원번호위의 3개기관이각기독립적으로생체이용률시험을진행하는것을원칙으로하였다. 즉, 시험계획서에준하여피험자의모집에서약물의투약, 피험자관리, 혈중농도분석및검증에이르기까지독립적으로연구를수행하되, 분석조건에관해서는시험계획서의분석원리를벗어나지않는범위내에서각연구기관의실정에따라일부조정할수있도록하였다. 따라서, 시료의전처리조건은산 (Perchloric acid) 을이용한단백침전제거법을따랐으며 ( 회수율 95% 이상 ), HPLC 분석은 UV 검출을사용하고, 컬럼은C18-RP를사용하는등제반조건을 3개기관모두동일하게실시하였다. 각세부기관의생체이용률시험결과를차례로편철하였다.

9 1. 분석법확립결과 기관1 기관2 기관3 추출과정 제단백 제단백 제단백 내부표준물질 Tiapride Tiapride Tiapride HITACHI L-7110 series 주요기기및장치 with HITACHI L-4200H UV-VIS Detector HPLC system (JASCO Millipore Waters HPLC Set, Japan) system 파장 214nm 214nm 214nm 컬럼 Reverse Phase Luna C18 Column ( mm, 5μm ), 36 ( 칼럼온도 ) Luna Su C18, mm, 5μm,26 ( 칼럼온도 ) Shiseido CAPCELL PAK C18 ( mm, 5μm ), 36 ( 칼럼온도 ) 이동상 Methanol : 0.03M Methanol : 0.03M Methanol : 0.03M Na 2 HPO 4 (ph7.5) =(3.4 : Na 2 HPO 4 (ph7.45) =(3.4 Na 2 HPO 4( ph7.5) =(1:3, v/v) 6.6, v/v) : 6.6, v/v) 유속 1.2 ml/min 1.2 ml/min 1.2 ml/min 측정치 약물 (10min), I.S(11.67min) 약물 (9min), I.S(6min) 약물 (16.5min), I.S(14.75min) - 각기관별 validation 결과기관1 기관2 기관3 특이성 peak 분리잘됨 peak 분리잘됨 peak 분리잘됨 직선성 R = R = R = 정밀성 (C.V) 3.03~8.02% 3.41~6.61% 6.585~14.649% 정확성 98.23~106.77% 95.6~105.6% 95.3~102.5% 감도 0.5 μg / ml (S/N=5) 0.5 μg / ml (S/N=5) 0.5 μg / ml (S/N=5) 회수율 94.45%~111.52% - - 동결해동안정성 73.21%~85.24% 실시하지않음 실시하지않음 단기실온안정성 89.61%~92.88% 조제후안정성 80.89%~85.83% 장기안정성 73.86%~82.27% 표준원액안정성 92.58%~108.23%

10 2. 생체이용률시험결과 - 기관별생체이용률시험을비교하여기술기관1 기관2 기관3 시험기관 중앙대학교 영남대학교 경희대학교 시험책임자 최영욱 용철순 이경태 시험담당자 ( 의사 / 약사 ) 허우성 / 윤미경 이경희 / 박상만 류재환 / 하용화 건강진단기관 ( 채혈기관 ) 삼성서울병원영남대의료원임상의학연구소 (127호) 임상시험센터 (358호*) 경희의료원 (9호) 투약량 0.4g 0.4g 0.4g 대상약물 ( 로트번호, 사용기한 ) 펜그로브정 0.4g, 2004, 펜그로브정 0.4g, 2004, 펜그로브정 0.4g, 2004, 시험예수 8명 8명 8명 채혈시간 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 2, 2.5, 3, 4,6 시간 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 2, 2.5, 3, 4,6 시간 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 2, 2.5, 3, 4,6 시간 - 각기관의생체이용률시험결과및약동학적변수 변수기관 1 (n=8 ) 기관 2 (n=8 ) 기관 3 (n=8 ) 총계 (n=24 ) AUC t (μg hr/ml) 10.52± ±0.59 ( μg hr/ml) ( μg hr/ml) C max (μg/ml) 6.43±1.60 ( μg /ml) 1.84±1.23 ( μg /ml) 8.86±2.837 ( μg hr/ml) 6.17±1.021 ( μg /ml) 7.72±3.51 ( μg hr/ml) 4.81±2.58 ( μg /ml) T max (hr) 0.59±0.13 (hr) 0.78±0.18 (hr) 0.56±0.116 (hr) 0.64±0.12 (hr) K e (1/hr) 0.62±0.17 (hr-1) 0.54±0.13 (hr-1) 0.57±0.115 (hr-1) 0.58±0.04 (hr-1) t ½ (hr) 1.20± 0.39 (hr) 1.36± 0.38 (hr) 1.26± (hr) 1.27± 0.08 (hr)

11 제 4 장연구개발목표달성도및대외기여도 당초계획대로큰문제없이원활하게진행되었다. 각세부기관의생체이용률시험및약물분석등전부분에걸쳐신뢰성있는실험결과를얻었다. 본실험결과를바탕으로이미완료된분석방법의 validation을이용하여생체이용률시험을수행하여얻은실험결과를향후생물학적동등성시험수행시지침으로활용하고자한다. 이는향후생물학적동등성시험방법을표준화한가이드라인을제공할수있으며, 생물학적동등성시험기간단축및비용절감유도하며, 약효동등성이확보된후발의약품으로대체조제를활성화함으로써의료비용절감및의료보험재정의안정화를도모할수있다. 또한각세부기관및본연구를수행한국내연구소들은생물학적동등성시험에대한기반자료구축및기술축적을할수있다.

12 제 5 장연구개발결과의활용성과및계획 가. 계량적성과 전문학술지 ( 편수 ) 학회발표 ( 초록 ) 특허 ( 건수 ) 국외국내국외국내국외국내게제투고중게제투고중출원중출원등록출원중출원등록 상품화 기타 (CD-ROM, 저서, 워크샾개최등 ) 나. 성과내용기술 다. 활용계획 - 생물학적동등성시험의표준지침으로활용

13 제 6 장기타중요변경사항 1. 국립독성연구원연기 호 ( 용역연구과제변경승인요청회신 ) 에의해아래와같이 분석조건 1) 및시험담당자 2) 가변경되었음. 1) 시료전처리및분석조건의변경 내용변경전 ( 계획서 ) 변경후 ( 변경승인 ) Mobile Phase Methanol : 0.03M Na 2HPO 4 (ph7.5) (3 Methanol:0.03M Na 2 HPO 4 (ph7.5) : 7, v/v) (3.4 : 6.6, v/v) 내부표준물질 epicillin (20μg/mL) Tiapride(10μg /ml) 2. 내부심사에의해변경되었음.( 별첨자료첨부 ) 내용변경전 ( 계획서 ) 변경후 ( 변경승인 ) 제 3 세부기관 ( 약사 ) 경희대이경원경희대하용화

14 제 7 장품목별표준생물학적동등성시험지침작성 가. 서론 1) 약리작용, 효능 효과및용법 용량 약리작용-바캄피실린은 Penicillin 제제로서위와십이지장에흡수되어곧활성형인 ampicillin 으로유리되며, 그람양성균및그람음성군을비롯한광범위한균주에감수성을나타낸다. 효능 효과-기관지염, 폐렴, 편도염, 중이염, 부비강염, 임질, 창상및수술후 2차감염등에사용되고인후두염, 신우신염, 요도염, 방광염, 전립선염, 농가진, 단독, 농피증, 봉소염, 농양, 파라티프스등에도사용가능하다. 용법 용량-초기에염산바캄피실린으로서 1일 mg( 역가 ) 을 2-3회분할경구투여한 다. 임균에의한단일급성비뇨생식기감염증에는 1.6 g( 역가 ) 을프로베네시드 1 g 과함께 1 일 1 회투여합니다. 어린이 : 1 일체중 kg 당 25 mg( 역가 ) 을 2-3 회분할경구투여한다. 2) 약물동력학적특성 1 국내피험자를대상으로시험한결과작성 구분 AUC ( μg /ml hr) C max ( μg /ml) T max (hr) Ke(hr -1 ) t 1/2 (hr) 제1세부기관 제2세부기관 제3세부기관 평균 S.D 외국의약품집또는문헌을참조하여작성 구분 oral dose AUC ( μg /ml hr) C max ( μg /ml) T max (hr) t 1/2 (hr) 문헌 1 0.4g 10.99± ± ±0.19 -

15 3 1, 3 세부기관의 AUC, Cmax 의평균과표준편차 구분 AUC ( μg /ml hr) C max ( μg /ml) 제1세부기관 제3세부기관 평균 S.D 검토 -1,3 세부기관의결과를문헌의수치와비교해본결과큰차이를나타내지않았습니다. 2 세 부기관의경우분석기기상의차이등으로인하여수치상의차이를보이는것으로사료됩니다. 결과적으로 1,3 세부기관의결과치가조사문헌상의수치와많은차이를보이지않으므로이 결과를표준지침으로사용가능하다고사료됩니다.

16 나. 생물학적동등성시험 1) 대조약 : 펜그로브정 0.4g (PENGLOBE TAB. 0.4g), 유한양행펜그로브정 0.4g 1정중염산바캄피실린 400mg 함유, 정제 2) 생물학적동등성시험방법가 ) 시험목적 년도식품의약품안전청용역연구개발사업공고 ( 식품의약품안전청공고 ) 에의거 생물학적동등성시험기준 ( 식품의약품안전청고시제 호, ) 을참조하여, 염산바캄피실린 400 mg 제제의대조약 ( 유한양행펜그로브정 0.4g) 으로 3개기관이순차로건강한성인에있어서생체이용률을측정하고전과정과그결과를평가함으로써표준생체이용률지침을마련함을목적으로한다. 나 ) 시험디자인및휴약기간 - 시험대상을무작위배열한후 1회투약함을원칙으로하였다. 다 ) 투여량및투약방법 - 피험자에대한투약은오전 8시부터유한양행의펜그로브정 0.4g 1정 ( 염산바캄피실린으로서 400 mg) 을물 240 ml와함께투약하였다. 피험자간복약시간의차이는채혈시간을고려하여 2분간격으로하였다. 라 ) 채혈시간및횟수 -채혈시간은약물의혈중소실반감기 시간과 Cmax에오르는시간을감안하여 6시간동안실시하였고, 채혈횟수는약물투약직전과 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 2, 2.5, 3, 4 및 6 시간의총 12시점에서채혈하였다. 채혈방법은 i.v. catheter 중에남아있는헤파린처리생리식염수를완전히제거하기위해매번약 1 ml의혈액을빼내어버리고피험자관리번호와채혈시간이기재되어있는채혈용주사기에약 10 ml의혈액을채취하였다. 채혈후마다 i.v. catheter 안에잔류하는혈액의응고를방지하기위하여주사용헤파린을넣은주사용생리식염수를주입하였다. 채혈된혈액은 3,500 rpm, 4 에서 10분간원심분리한후혈장을취하여혈장분리관에옮겨담고분석시까지 -70 에서보관하였다. 마 ) 분석방법예시자료 (1) 분석방법 ( 가 ) 표준액조제 Ampicillin과내부표준물질을물에녹여농도를 1000 μg /ml로만든후냉장보관하였다. 그리고표준원액의안정성시험을위해 0.5~10ppm의약물 stock solution 과내부표준물질의 stock solution을만들었다. ( 나 ) 검량선작성 Ampicillin을물에녹여농도를 1000 μg /ml로만든후냉장보관시키고, 이용액

17 을냉동보관하였던 blank 혈장으로희석하여 ampicillin의혈장중농도가각각 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10 μg /ml 농도가되도록표준혈장시료를만들었다. 각각의표준혈장 0.5 ml에내부표준물질로 Tiapride(10μg /ml : water로녹임 ) 100 μl를가한후흔들어섞었다. 여기에 75 μl의 30% trichloroacetic acid를넣고 phosphate buffer (ph7.5) 로최종량이 750 μl가되게한후 vortex mixer하에서잘섞은다음 rpm으로원심분리하여상층액 50 μl를 HPLC에주입하였다. 여기에서얻은내부표준물질 Tiapride의 Height에대한 ampicillin의 Height비를가지고 ampicillin 의농도에따른검량선을작성하였다. 하루에실험을 5번시행하여일내재현성을구하고연속하여 5일간실험을행하여일간재현성을구하였다. ( 다 ) 분석조건전처리된 혈장 시료는 다음의 HPLC 조건에서 정량하였다. 장치로는 Hitachi HPLC (L-7100) 를, 검출기로는 UV-Detector L-7400 (214 nm) 를, 컬럼은 Reverse Phase C18 Column ( mm, 5μm ) 을, 데이터처리장치로는 D-7000 Software를 사용한다. 이동상으로는 Methanol : 0.03M Na 2HPO 4(pH7.5) (3.4 : 6.6, v/v) 혼합용 액을사용하고유속 1.2 ml/min에서정량하였다. ( 라 ) 시료의분석피험자로부터각시간별로채취하여 -70 에보관했던혈장시료를실온에방치하여녹인후 1분간진탕한다음이혈장 0.5 ml을취하여시험관에옮기고검량선작성방법과동일한방법으로 HPLC에주입하였다. Fig. 1. 공혈장 (Blank plasma) 의크로마토그램

18 Fig. 2. 혈장 (plasma) 중 ampicillin(10.00 분 ) 과 내부표준물질 (11.67 분 ) 의크로마토그램 (A2 의 1 시간째 sample, 6.71 μg /ml) Fig.3. 공혈장에내부표준물질과 ampicillin 을가한 크로마토그램 다. 참고문헌 1. 최철희, 이선희, 최광식, 최기환, 나한광, 문화회, 바캄피실린제제의생물학적동등성시험, 국립보건안전연구원보, 제 1권, 1, , AHFS Drug Information R 97, American Hospital Fornulary ServiceR, , 1997.

19 염산바캄피실린제제 의 생체이용률시험결과보고서 제 1 세부기관 : 중앙대학교 시험책임자 : 최영욱

20 목 차 1. 시험제목, 시험목적및시험결과의요약 시험제목 시험목적 시험결과의요약 1 2. 대조약의성분명및명칭, 제형, 제조일자, 제조번호 2 3. 시험책임자및담당자성명, 소속및직책 시험책임자 시험담당자 ( 의사, 약사및분석담당자 ) 2 4. 예비시험 3 5. 피험자선정기준및방법 지원자모집 건강검진 선정기준 지원자동의방법 최종선정된피험자지원자동의방법 중도탈락자및그사유 6 6. 시험대상예수 7 7. 시험방법 시험전날피험자관리 시험당일 7 8. 채혈인경우감염방지대책 8 9. 검체처리및분석방법 분석대상 주요기기및장치 분석기기조건 검량선작성 혈장 ( 청 ) 시료의처리 혈중농도계산 시험결과및 validation 자료 분석조건의검증 각피험자의시간에따른혈장중암피실린의의농도추이 생체이용률파라메타의산출 시험결과에대한종합의견 시험의신뢰성보증 18

21 첨부자료목록 < 별첨 1> 생체이용률시험용의약품수불현황 < 별첨 2> 생체이용률시험용지원자모집공고 < 별첨 3> 생체이용률시험용지원신청서 < 별첨 4> 증례기록지 < 별첨 5> 생체이용률시험용설명서 < 별첨 6> 생체이용률시험용참가동의서 < 별첨 7> 피험자관리표 < 별첨 8> 위촉장 < 별첨 9> 동의서 < 별첨 10> 회의소집요청서 < 별첨 11> 심사기록서 < 별첨 12> 심사소견서 < 별첨 13> 검체처리결과 raw data < 별첨 14> 분석방법 validation raw data

22 1. 시험목적및시험결과의요약 시험제목 : 염산바캄피실린제제 의생체이용률시험 시험목적 2003년도식품의약품안전청용역연구개발사업공고 ( 식품의약품안전청공고제 호, ) 에의거 생물학적동등성시험기준 ( 식품의약품안전청고시제 호, ) 을참조하여, 염산바캄피실린제제의대조약 ( 펜그로브정 0.4g, 유한양행 ) 으로 3개기관이순차로건강한성인에있어서생체이용률을측정하고전과정과그결과를평가함으로써표준생체이용률지침을마련함을목적으로한다 시험결과의요약 시험개요바캄피실린의분석방법을 HPLC-UV 검출기를이용하여확립하였으며, 8개의농도범위에대하여하루에 5번씩실험하여일내정밀성및정확성을구하고, 연속하여 5일간실험하여일간정밀성및정확성, 검출한계등을구하였다. 또한건강한피험자 8명에대하여염산바캄피실린으로서 400 mg을 1회경구투여하여혈중 ampicillin 농도의경시적인변화를 6시간에걸쳐측정하고, 이결과를바탕으로 AUC 24h, AUC inf, C max, T max, k e, t 1/2 를계산하였다 시험결과염산바캄피실린을 HPLC-UV 방법으로정량하였을때양호한분석결과를나타내었다. 검출한계는 0.5 μg /ml, 일내정밀성 (C.V. %) 은 3.25~6.97 %, 일간정밀성은 3.03~8.02 %, 정확성은 ~ %, 직성성은 R = 로매우재현성있는분석방법임을검증하였다. 염산바캄피실린정 400mg ( 펜그로브정 0.4g, 유한양행 ) 을단회경구투여했을때약물동력학파라미 터는다음과같았다. AUC 6h ( μg hr/ml) C max ( μg /ml) T max (hr) ke (hr -1 ) t 1/2 (hr) 10.52± ± ± ± ±

23 2. 시험약의성분명, 명칭, 제형, 제조일자, 제조번호 시험약의성분명 : 염산바캄피실린 (Bacampicillin) 시험약의명칭 : 펜그로브정 0.4g ( 유한양행 ) 시험약의제형 : 정제 시험약의제조번호 : 시험약의유통기한 : 시험약의원료의약품분량 : 1 정중바캄피실린으로서 400 mg 3. 시험책임자및담당자성명, 소속및직책 3.1. 시험책임자 - 성명 : 최영욱 ( 약사면허번호 : 24702) 소속 : 서울특별시동작구흑석동 221번지중앙대학교생명의약연구원직책 : 교수 3.2. 시험담당자 - 의사성명 : 허우성 ( 의사면허번호 : 41218) 소속 : 삼성서울병원임상의학연구소임상시험센터직책 : 임상실험실장 ( 신장내과교수 ) - 약사성명 : 윤미경 ( 약사면허번호 : 49964) 소속 : 서울특별시동작구흑석동 221번지중앙대학교생명의약연구원직책 : 연구원 - 분석담당자성명 : 윤미경 ( 약사면허 49964) 소속 : 서울특별시동작구흑석동 221번지중앙대학교생명의약연구원직책 : 연구원 - 2 -

24 4. 예비시험 문헌에경구투여시암피실린의혈중농도를비롯한 pharmacokinetic data가이미보고되어있으므로체내동태를파악하기위한별도의인체예비시험은실시하지않았다. 5. 피험자의선정기준및방법 지원자모집지원자모집공고 < 별첨 2> 을통하여만19~55세의건강한성인으로서과거에소화기계, 간장, 신장, 심혈관계, 중추신경계, 내분비계및혈액질환의병력이없고현재타약물을복용하고있지않은지원자를모집공고 ( ~ ) 하고지원신청서 < 별첨 3> 를받아지원자 9명을모집하였다 건강검진 지원자 9명에대한건강진단 ( 식품의약품안전청고시제 호생물학적동등성시험기준 제10조에의함 ) 은삼성서울병원에서 ( ) 시험담당자인허우성의사의문진과내과적 인진찰을받고다음과같은임상병리검사를실시하였다. 혈액병리검사 : WBC, RBC, Hb, Hct, PLT, Neutrophils, Eosinophils, Basophils, Lymphocytes, Monocytes 혈액화학검사 : T. Protein, Albumin, T. Cholesterol, T. Bilirubin, sgot, sgpt, ALP, Glucose, BUN, Creatinine 뇨검 사 : Color, S.G, ph, Glucose, Albumin, Bilirubin, WBC, Blood, β-hcg 내과적검진 : 내과적문진 ( 흡연, 음주, 카페인, 약물복용력, 기왕력, 알러지유무등 ), 활력증 후 ( 혈압, 맥박등 ) 선정기준 생물학적동등성시험기준 제10조및제11조에따라선정기준에모두합당하고제외기준에해당되지않는자로서생체이용률시험에적합한건강한사람으로판정된 8명을피험자로선정하였다. < 선정기준 > 건강진단시연령이만 19세~55세인자 선천성또는만성질환이없고내과적인진찰결과 ( 필요한경우뇌파, 심전도, 흉부및위내시경또는위장방사선검사 ) 병적증상또는소견이없는사람 담당의사가의약품의특성에따라설정 실시한혈액병리검사, 혈액화학검사, 뇨검사등임상병리검사결과피험자로적합하다고판정된자 여성피험자의경우건강진단시비임신사실이확인된자 < 제외기준 > - 3 -

25 시험개시전 1개월이내바르비탈류약물등의약물대사효소유도및억제약물의복용이나과도한음주를한자 시험개시전 10일이내시험에지장을줄우려가있는약물복용자 담당의사가생물학적동등성시험에적합하지않다고판단한자 건강진단서 / 건강소견서 : < 별첨 4-증례기록지 > 지원자동의방법본시험에참여하는지원자를대상으로시험설명회 ( ) 를실시하여본시험의목적, 방법, 이상약물반응발생가능성및이에대한대책등에대하여설명 < 별첨 5> 한후피험자의자유의사에의한시험참가동의를문서 < 별첨 6> 로받았다 최종선정된피험자본시험의피험자로최종선정된사람은평균체중 ± 7.26 kg, 평균연령 21.5± 2.26세의건강한지원자 8명이었으며, 피험자 8명의연령과신장, 체중을 Table 1에, 임상검사결과를 Table 2, 3, 4에나타내었다. Table 1. 피험자명단및인적사항 기호 영문 이니셜 연령 ( 세 ) 체중 (Kg) 신장 (cm) A-1 K J H A-2 K B J A-3 M J Y A-4 Y S H A-5 K M U A-6 L S J A-7 L W J A-8 K J S 평균 S.D

26 Table 2. 피험자 8 명의혈액병리검사결과 피험자 WBC RBC Hb Hct PLT Neutrophils Eosinophils Basophils Lymphoc Monocy (10³/ul) (10 6 /ul) (g/dl) (%) (10³/ul) (%) (%) (%) ytes (%) tes(%) 기준치 A A A A A A A A

27 피험자 Table 3. 피험자 8 명의혈액화학적검사결과 T.Protein (g/dl) Albumin (g/dl) T.Choles terol (mg/dl) T.Bilirubin (mg/dl) sgot (IU/L) sgpt (IU/L) ALP (mg/dl) Glucose(fa sting) (mg/dl) BUN (mg/dl) Creatinin e (mg/dl) 기준치 <40 < A A A A A A A A Table 4. 피험자 8 명의뇨검사결과 피험자 Color S.G ph Glucose Albumin Bilirubin WBC Blood 기준치 straw Yellow Negative Negative Negative Negative Negative P Negative Negative Negative Negative Negativ e P-2 P-3 P-4 P-5 P-6 P-7 P-8 straw Yellow straw Yellow straw Yellow straw Yellow straw Yellow straw Yellow straw Yellow straw Yellow Negative Negative Negative Negative Negativ e Negative Negative Negative Negative Negativ e Negative Negative Negative Negative Negativ e Negative Negative Negative Negative 25/ul(+) Negative Negative 1mg/dl(+ ) Negative Negativ e Negative Negative Negative Negative Negativ e Negative Negative Negative Negative Negativ e 중도탈락자및그사유 - 6 -

28 본시험에지원한지원자 9 명중피험자로서선정되지않은사람은 1 명이었으며그사유는 피험자관리표 < 별첨 7> 에나타내었다

29 6. 시험예수 바캄피실린제제의생체이용률측정을위하여 8 명의지원자에대하여각각동일투약일에투 여하고, 투약량은펜그로브정 0.4g ( 염산바캄피실린으로서 400 mg) 1 정을 1 회경구투여하였다. 7. 시험방법 시험전날피험자관리 시험전일 ( ) 오후 6시에중앙대학교약학대학 2층교수세미나실로집합하여피험자명단및신원을확인한후본시험의목적, 방법, 이상약물반응발생가능성및이에대한대책등에대하여다시주지시켰다. 이후미리예약해둔식당 ( 먹깨비, 동작구흑석동소재 ) 에서모든피험자에게동일한저녁식사 ( 고기 1.5인분및공기밥 ) 를제공하였다. 식사종료시점인 8시이후부터익일투약후 4시간까지는금식시켰다. 저녁식사를마친후피험자전원은삼성서울병원임상의학연구소임상시험센터에시험담당자및보조원이함께숙박하여피험자를감독, 관리하였으며, 투약 12시간전부터채혈종료시까지피험자의운동, 식사, 흡연, xanthine계음료및음주등을제한관리하였다. 숙소에서의합숙후일체의외출을금지시키고음식물은다음날투약후 4시간까지는제공하지않았다. 다만, 식수는밤 10시까지는자유롭게섭취하도록하였다. 시험책임자의관리하에 10시부터취침을권유하여모든피험자가오후 11시이전에취침한것을확인하였다 시험당일 (2003년 5월 7일 ) 시험당일 ( ) 오전 7시에피험자전원이기상하여시험준비에착수하였다. 피험자들은임상시험센터내에있는대기실에서채혈대기하였으며, 채혈은채혈실에서실시하였다. 피험자들의상완정맥부위에 heparin-locked catheter를설치하고 blank 혈액으로각각 10mL 씩을채혈하였다. 실수로인한채혈시간의변동을사전에방지하기위해시험전에채혈자및피험자들에게증례기록지 < 별첨 4> 를배부하였다. 채혈및관리인원으로는채혈관리 2인, 채혈보조인원 2인, 시험담당자 2인 ( 전문의 1인포함 ) 및시험책임자로총 7인을참가시켰다. 피험자에대한투약은오전 8시부터유한양행의펜그로브정 0.4g 1정 ( 염산바캄피실린으로서 400 mg) 을물 240 ml와함께투약하였다. 피험자간복약시간의차이는채혈시간을고려하여 2분간격으로하였다. 채혈시간은약물의혈중소실반감기 시간과 Cmax에오르는시간을감안하여 6시간동안실시하였고, 채혈횟수는약물투약직전과 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 2, 2.5, 3, 4 및 6 시간의총 12시점에서채혈하였다. 채혈방법은 i.v. catheter 중에남아있는헤파린처리생리식염수를완전히제거하기위해매번약 1 ml의혈액을빼내어버리고피험자관리번호와채혈시간이기재되어있는채혈용주사기에약 10 ml의혈액을채취하였다. 채혈후마다 i.v. catheter 안에잔류하는혈액의응고를방지하기위하여주사용헤파린을넣은주사용생리식염수를주입하였다. 채혈된혈액은 3,500 rpm, 4 에서 10분간원심분리한후혈장을취하여혈장분리관에옮겨담고분석시까지 -70 에서보관하였다

30 식사에의한영향을배제하기위하여투약전 12시간이상절식한상태에서투약후 4시간까지는금식상태를유지시켰으며, 투약후 4시간째채혈을마친후병원내의식당에서점심을제공하였다. 투약후 6시간째채혈이끝난후에는팔또는손등의정맥부위에거치된 catheter를제거하였다. 시험전과정을통하여피험자개개인의상태를관찰하여증례기록지 < 별첨 4> 에기록하였으며, 마지막채혈이끝난후담당의사에의해혈액, 맥박, 기타이상유무를확인, 기록하였다. 8. 채혈인경우감염방지대책 피험자들의혈액채취는일반인들의출입이통제된격리된방에서실시하며, 사용하는기구는완전멸균된 1회용으로하였다. 9. 검체처리및분석방법 분석대상 바캄피실린이경구투여시흡수되어신속히전부가 ampicillin 으로전환된다는사실에입각하 여경시적으로혈중 ampicillin 양을측정하였다 주요기기및장치 - HPLC system : HITACHI L-7110 series with HITACHI L-4200H UV-VIS Detector - ph 측정기 : ORION 원심분리기 : MICRO 17TR centrifuge - Vortexing-mixter : EYELA cute mixer CM Balance : METTLER TOLEDO AG HPLC 조건전처리된혈장시료는다음의 HPLC 조건에서정량하였다. 장치로는 Hitachi HPLC (L-7100) 를, 검출기로는 UV-Detector L-7400 (214 nm) 를, 컬럼은 Reverse Phase C18 Column ( mm, 5μm ) 을, 데이터처리장치로는 D-7000 Software를사용한다. 이동상으로는 Methanol : 0.03M Na2HPO4(pH7.5) (3.4 : 6.6, v/v) 혼합용액을사용하고유속 1.2 ml/min에서정량하였다 검량선작성 Ampicillin을물에녹여농도를 1000 μg /ml로만든후냉장보관시키고, 이용액을냉동보관하였던 blank 혈장으로희석하여 ampicillin의혈장중농도가각각 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10 μg /ml 농도가되도록표준혈장시료를만들었다. 각각의표준혈장 0.5 ml에내부표준물질로 Tiapride(10μg /ml : water로녹임 ) 100 μl를가한후흔들어섞었다. 여기에 75 μl의 30% - 9 -

31 trichloroacetic acid를넣고 phosphate buffer (ph7.5) 로최종량이 750 μl가되게한후 vortex mixer하에서잘섞은다음 rpm으로원심분리하여상층액 50 μl를 HPLC에주입하였다. 여기에서얻은내부표준물질 Tiapride의 Height에대한바캄피실린의 Height비를가지고 ampicillin의농도에따른검량선을작성하였다. 하루에실험을 5번시행하여일내재현성을구하고연속하여 5일간실험을행하여일간재현성을구하였다 혈장시료의처리피험자로부터각시간별로채취하여 -70 에보관했던혈장시료를실온에방치하여녹인후 1분간진탕한다음이혈장 0.5 ml를취하여 E-tube에옮기고여기에내부표준물질로 Tiapride(10 μg /ml) 100 μl를가한후검량선작성방법과동일한방법으로전처리한후 HPLC에주입하였다 혈중농도계산 얻어진크로마토그램으로부터내부표준물질의피이크높이에대한 ampicillin 의피이크높이비를 구하여미리작성한검량선으로부터혈장중 ampicillin 의농도를구하였다

32 10. 시험결과및 validation 자료 ( 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성, 감 도등 ) 분석조건의검증 특이성 ; n= 항의시험방법과같이검체를처리하여 HPLC로분석하였을때얻어진크로마토그램은 Fig. 1~2와같았으며, ampicillin 피이크의유지시간은약 10.00분, 내부표준물질피이크의유지시간은약 11.67분이었고, 분석조건에서 ampicillin 및내부표준물질 (I.S.) 은기타혈장성분들과잘분리되었다. Fig. 1. 공혈장 (Blank plasma) 의크로마토그램

33 Fig. 2. 혈장 (plasma) 중 ampicillin(10.00 분 ) 과 내부표준물질 (11.67 분 ) 의크로마토그램 (A2 의 1 시간째 sample, 6.71 μg /ml) 직선성 ; n=5 blank 혈장시료, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10 μg /ml 의표준액과 10 μg /ml의내부표준물질 100( μl ) 를 spike한혈장시료를 11.5항과같이검체를처리하여 HPLC로분석하였을때, 혈장시료로부터구한 ampicillin의검량선의계산식은 y = 0.299x (R =0.9999) 로 0.5~10 μg /ml 범위에서양호한직선성을나타내었다 (Fig. 3) y = 0.299x R 2 = Fig. 3. 혈장중 ampicillin 의검량선 정밀성, 정확성및감도 ( 정량한계 ) ; n=5 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10 μg / ml 7 가지농도의 ampicillin 혈장표준액을상기의검체처리방법으로처 리하여분석하였다.. - 정밀성 ; n=5 ampicillin 과내부표준물질의피크높이비의표준편차를 ampicillin 과내부표준물질의피크높이

34 비의평균값으로나눈비의백분율 (%) 로서구하였다. 하루에 5 번시행하여일내정밀성 (%C.V. 로표시 ) 을구하였고 5 일간실험을반복시행하여일간정밀성 (%C.V. 로표시 ) 을구하였다. - 정확성 ; n=5 검량선에의하여정량한농도의평균값을기지의농도로나눈비의백분율 (%) 로서구하였다. - 감도 ( 정량한계 ) ; n=5 크로마토그램상에서신호대잡음비 (S/N ratio) 를 5 이하로하고정밀성이 20% 이하이고, 정확성 이 % 인조건을만족하는농도로구하였다. 이때본분석방법의정밀성 C.V.% 는일내정밀성이 6.97% 이하, 정량한계농도에서의일내정밀성은 6.97% 이하였고, 일간정밀성은 8.02% 이하, 정량한계농도에서의일간정밀성은 8.02% 였으며, 정량한계농도에서의정확성은 % 였으며, 나머지농도에서의정확성은98.23~106.77% 를나타내었다. 감도는 0.5 μg / ml (S/N=5) 이었다. Table 5. 혈장중 ampicillin 농도분석에있어서정밀도와정확도 농도 ( μg / ml ) 일내 (n=5, d ay 1) 정밀성 (C.V.%) 일간 (n=5) 정확성 (%, n =5)

35 이로부터혈장중 ampicillin 에대한본 HPLC 분석법은인체에대한생체이용률시험에이용될 수있는충분한감도, 특이성, 직선성, 정확성및정밀성을갖고있음을알수있었다 각피험자의시간에따른혈장중 ampicillin의농도추이피험자에게펜그로브정 0.4g을투여한후구한시간별혈장중약물농도는 Table 6에각각나타내었으며, 각피험자에있어서의혈장중약물농도-시간곡선을 Fig. 5~12 에각각나타내었고이를평균혈장중약물농도-시간곡선으로그려보면 Fig. 13와같다. Table 6. 펜그로브정 0.4g 투여후각피험자의시간에따른혈장중바캄피실린농도 ( μg / ml ) Subect 시간 (hr) B.Q.L B.Q.L B.Q.L B.Q.L B.Q.L B.Q.L B.Q.L B.Q.L B.Q.L B.Q.L 평균 표준편차 B.Q.L: Below Quantitation Limit (0.5 μg / ml )

36 암피실린혈중농도그래프 A Conc(µg/ml) Time(hr) Fig. 5. 피험자 A1 의혈장중 ampicillin 의농도 A Conc(mg/ml) Time(hr) Fig. 6. 피험자 A2 의혈장중 ampicillin 의농도

37 A Conc(µg/ml) Time(hr) Fig. 7. 피험자 A3 의혈장중 ampicillin 의농도 A Conc(µg/ml) Time(hr) Fig. 8. 피험자 A4 의혈장중 ampicillin 의농도

38 A Conc(µg/ml) Time(hr) Fig. 9. 피험자 A5 의혈장중 ampicillin 의농도 10 A Conc(µg/ml) Time(hr) Fig. 10. 피험자 A6 의혈장중 ampicillin 의농도

39 10 A7 8 Conc(µg/ml) Time(hr) Fig. 11. 피험자 A7 의혈장중 ampicillin 의농도 10 8 A8 Conc(µg/ml) Time(hr) Fig. 12. 피험자 A8 의혈장중 ampicillin 의농도

40 10 Bacampicillin 8 Conc.(µg/ml) Time(hr) Fig. 13. 펜그로브정 0.4g 의평균혈장중 ampicillin 농도추이 (n=8, Mean±S.E.) 생체이용률파라메타의산출 각피험자의 AUC, Cmax, Tmax, ke, t1/2 등의생체이용률파라메타는 BA Calc 2002 ( ver ) 을이용하여구하였으며, 각피험자의생체이용률파라메타를정리하면 Table 7와같다. Table 7. 각피험자의 AUC, Cmax, Tmax 피험자번호 파라메타 AUC ( μg hr/ml) Cmax ( μg /ml) Tmax (hr) ke (hr -1 ) t 1/2 (hr) A A A A A A A A 평균 표준편차 실험결과에대한종합의견

41 1. 3개시험기관모두같은 HPLC-UV 분석법으로 ampicillin의혈중분석법을검토하여 Validation 을통하여양호한분석법을확립하였다. 이방법을실제약물투여후얻은혈장검체에적용한결과양호하게분석을할수있었으므로생체이용률시험이나생물학적동등성시험에적용할수있는분석법임을확인하였다. 2. 제1세부기관에서생물학적동등성시험기준 ( 식품의약품안전청고시제 호 ) 에따라건강한성인지원자에게유한양행의펜그로브정 0.4g ( 염산바캄피실린 400 mg) 1정을 1회경구투여한후 6시간에걸쳐피험자들의혈장중 ampicillin 농도를구하였다. 이로부터혈장중농도-시간곡선하면적 (AUC6h) 최고혈장중농도 (C max), 최고혈장중농도도달시간 (T max), 소실속도정수 (K e), 소실반감기 (t 1/2) 등의생체이용률파라미터를구하였으며, 그값은각각10.52±2.18( μg hr/ml), 6.43±1.60 ( μg /ml), 0.59±0.13 (hr), 0.62±0.17 (hr -1 ), 1.20± 0.39 (hr) 이었다

42 11. 시험의신뢰성보증시험의신뢰성을보증하기위하여시험에관련된모든주요사항을문서로작성하여시험의기초자료와함께허가취득일자로부터 5년간보존하며, 시험결과보고서및시험기초자료에대하여 생물학적동등성시험기준 ( 식품의약품안전청고시제 호, ) 제7조에의해구성된심사위원회의심사와평가를받았다. < 별첨 8~12> 또한 HPLC 크로마토그램을포함한모든시험기초자료를시험결과보고서에첨부하였다. < 별첨 13~14>

43 펜그로브정 ( 염산바캄피실린 ) 의 생체이용율시험결과보고서 제 2 세부기관 : 영남대학교약품개발연구소 연구책임자 : 용철순

44 목 차 1. 시험목적및시험결과의요약 시험목적 시험결과의요약 2. 대조약의성분명, 명칭, 제형, 함량, 용법및용량 3. 시험기관 4. 연구기간 5. 대조약의관리 6. 예비시험 7. 피험자선정기준및방법 지원자모집 건강검진 선정기준 지원자동의방법 최종선정된피험자 중도탈락자및그사유 8. 시험예수 9. 시험방법 시험전날 (2003년 8월 27일 ) 피험자관리 시험당일 (2003년 8월 28일 ) 10. 채혈인경우감염방지대책 11. 검체처리및분석방법 분석대상 주요기기및장치 HPLC 조건 검량선작성 혈장시료의처리 12. validation 자료 ( 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성, 감도등 ) 분석조건의검증

45 각피험자의시간에따른혈장중암피실린의농도추이 생체이용률파라메타의산출 13. 결론

46 < 첨부자료목록 > < 별첨 1> 생체이용률시험용의약품수불현황 < 별첨 2> 생체이용률시험지원자모집공고 < 별첨 3> 생체이용률시험지원신청서 < 별첨 4> 건강진단서및건강소견서 < 별첨 5> 생체이용률시험설명서 < 별첨 6> 생체이용률시험참가동의서 < 별첨 7> 피험자관리표 < 별첨 8> 피험자선정기록서 < 별첨 9> 증례기록서 < 별첨 10> 검체처리결과 raw data < 별첨 11> 분석방법 validation raw data

47 1. 시험목적및시험결과의요약 시험목적 염산바캄피실린에대한표준생물학적동등성시험지침제시를통한생물학적 동등성시험의활성화및관리의효율화 시험결과의요약 시험개요 : 건강한성인 8인을대상으로바캄피실린제제의생체이용률시험을실시하며, 이를위해바캄피실린의활성대사체인암피실린의 HPLC 분석방법을확립하였고, 약동력파라미터인 AUC, C max, K e, T 1/2 등을평가하고생체이용률시험결과를총괄검증하여최종품목별표준생물학적동등성시험지침을작성한다. 시험결과 : 바캄피실린의활성대사체인암피실린을 HPLC 방법으로정량하였을때양호한분석결과를나타내었다. 검출한계는 0.5 μg /ml, 일내정밀성 (CV %) 은 ~ %, 일간정밀성은 ~ %, 정확성 ( 은 95.6 ~ %, 직선성은 R 2 = 로매우재현성있는분석방법임을검증하였다. 투여량 (mg) AUC C max ( μg /ml) T max (hr) half-life (h) K e ± ± ± ± ± 대조약의성분명, 명칭, 제형, 함량, 용법및용량 성분및함량 : 이약 1 정중바캄피실린 400 mg 명 제 칭 : 유한양행펜그로브정 형 : 정제 용법및용량 : 성인 ( 체중 25kg 이상 ) : 염산바캄피실린으로서 1 일 g( 역 가 ) 을 2- 회분할경구투여한다

48 임균에의한단일급성비뇨생식기감염증 : 1.6g( 역가 ) 을프로베네시드 1g과함께 1일 1회투여한다. 어린이 : 1일체중 kg당 25mg( 역가 ) 을 2-3회분할경구투여한다. 3. 시험기관영남대학교약품개발연구소주소 : 경북경산시대동 영남대학교책임연구자 : 용철순 4. 연구기간 2003 년 3 월 년 11 월 5. 대조약의관리 대조약은의약품임상시험관리기준제 15 조의규정에따라대조약의표시및 관리를행한다. ( 별첨 1) 6. 예비시험 예비시험을실시하지않았다. 7. 피험자선정기준및방법 지원자모집지원자모집공고 < 별첨 2> 을통하여만19~55세의건강한성인으로서과거에소화기계, 간장, 신장, 심혈관계, 중추신경계, 내분비계및혈액질환의병력이없고현재타약물을복용하고있지않은지원자를모집공고 ( ~ 8. 13) 하고지원신청서 < 별첨 3> 를받아지원자 8명을모집하였다 건강검진 - 2 -

49 지원자 8명에대한건강진단 ( 식품의약품안전청고시제 호생물학적동등성시험기준제10조에의함 ) 은영남대학교부속영남대학병원에서 ( ) 시험담당자인이경희 ( 의사 ) 의문진과내과적인진찰을받고다음과같은임상병리검사를실시하였다. 혈액병리검사 : Hemoglobin, Hematocrit, WBC, Platelet, Differential counting of WBC 혈액화학검사 : BUN, Creatinine, Total protein, Albumin, SGOT, SGPT, Alkaline phosphatase, Total bilirubin, Cholesterol, Glucose fasting 뇨검사 : ph, Sugar, color, Albumin, Specific gravity, Bilirubin, RBC, WBC, cast 선정기준생물학적동등성시험기준제10조및제11조에따라선정기준에모두합당하고제외기준에해당되지않는자로서생체이용률시험에적합한건강한사람으로판정된 8명을피험자로선정하였다. 피험자선정기준항목 : - 건강진단시연령이만 19세~30세인자로비흡연자 - 선천성또는만성질환이없고내과적인진찰결과 ( 필요한경우뇌파, 심전도, 흉부및위내시경또는위장방사선검사 ) 병적증상또는소견이없는사람 - 담당의사가의약품의특성에따라설정 실시한혈액병리검사, 혈액화학검사, 뇨검사등임상병리검사결과피험자로적합하다고판정된자 - 여성피험자의경우건강진단시비임신사실이확인된자 피험자제외기준항목 : - 시험개시전 1개월이내바르비탈류약물등의약물대사효소유도및억제약물의복용이나과도한음주를한자 - 시험개시전 10일이내시험에지장을줄우려가있는약물복용자 - 담당의사가생물학적동등성시험에적합하지않다고판단한자 - 3 -

50 건강진단서 : < 별첨 4> 지원자동의방법본시험에참여하는지원자는설명회를실시하여본시험의목적, 방법, 이상약물반응발생가능성및이에대한대책등에대하여설명 < 별첨 5> 한후피험자의자유의사에의한시험참가동의를문서 < 별첨 6> 로받았다 최종선정된피험자본시험의피험자로최종선정된사람은평균체중 kg, 평균연령 22.62세의건강한지원자 8명이었으며, 피험자 8명의연령과신장, 체중을 Table 1에, 임상검사결과를 Table 2, 3, 4에나타내었다. Table 1. 피험자명단및인적사항 No. 성명연령 ( 세 ) 체중 (kg) 신장 (cm) B-1 JSY B-2 JYH B-3 KJH B-4 HHH B-5 CJY B-6 KYK B-7 KTW B-8 LSM 평균 ± S.D ± ± ±

51 Table 2. 피험자 8 명의자동화학검사 No. 이름 Ca Glu UA TP T-Bil LDH AST D-Bil Na Cl (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (g/dl) (mg/dl) (U/L) (U/L) (mg/dl) (meq/l) (meq/l) 정상범위 B-1 JSY B-2 JYH B-3 KJH B-4 HHH B-5 CJY B-6 KYK B-7 KTW B-8 LSM No. 이름 IP BUN T-Cho Alb ALP ALT GGT CRE K (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (g/dl) (U/L) (U/L) (U/L) (mg/dl) (meq/l) 정상범위 B-1 JSY B-2 JYH B-3 KJH B-4 HHH B-5 CJY B-6 KYK B-7 KTW B-8 LSM Table 3. 피험자 8 명의혈액화학검사결과 No. 이름 WBC Hb Hct PLT Manu-DIF (K/uL) (g/dl) (%) (K/uL) Seg(%) Lymp(%) Mono(%) Eos(%) Baso(%) 정상범위 B-1 JSY B-2 JYH B-3 KJH B-4 HHH B-5 CJY B-6 KYK B-7 KTW B-8 LSM

52 Table 4. 피험자 8 명의뇨검사결과 No. Name R-UA UA-mic Color SG ph Alb Glu Keto Bil Bld UBG Leuk Nit RBC WBC 정상범위 Straw/ Yellow (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) (+/-) B-1 JSY straw / B-2 JYH yellow / B-3 KJH straw B-4 HHH yellow / B-5 CJY straw B-6 KYK colorl ess / B-7 KTW yellow / B-8 LSM yellow / 중도탈락자및그사유본시험에지원한지원자중중도탈락자는없었다. 8. 시험예수바캄피실린의생체이용률측정을위하여 8명의지원자에대하여유한양행펜그로브정 ( 바캄피실린으로서 400 mg) 을 1회경구투여하였다. 9. 시험방법 시험전날 (2003년 8월 27일 ) 피험자관리시험전일오후 5시에영남대학교의료원으로집합하여피험자명단및신원을확인한후본시험의목적, 방법, 이상약물반응발생가능성및이에대한대책등에대하여재차설명하였다. 이후미리예약해둔식당 ( 영대의료원내영의관식당 ) 에서모든피험자에게동일한저녁식사 ( 비빔밥 ) 를제공하였다. 식사종료시점인 8시이후부터익일투약후 4시간까지는금식시켰다. 저녁식사를마친후피험자전원은영남대학교의료원인근의여관에시험담당자및보조원이함께숙박하여피험자를감독, 관리하였다, 합숙후일체의외출은금지시켰으며, 투약 12시간전부터채혈종료시까지피험자의운동, 식사, 흡연, xanthine계음료및음주등을제한, 관리하였다. 여관에서의식수는생수를제공하고, 밤 10시까지는자유롭게섭취하도록하였다. 취침시간은밤 10시로하여모두취침하였다 시험당일 (2003년 8월 28일 ) 시험당일오전 7시에피험자전원이기상하여영남대학교의료원에도착하 - 6 -

53 였다. 피험자들은병원내 9층에마련된장소에서채혈대기하였으며, 채혈은같은층에위치한한연구실에서실시하였다. 피험자들의상완정맥부위에 heparin-locked catheter를설치하고 blank 혈액으로각각 10mL 씩을채혈하였다. 실수로인한채혈시간의변동을사전에방지하기위해시험전에채혈자및피험자들에게증례기록서 < 별첨 9> 를배부하였다. 채혈및관리인원으로는채혈관리 1인, 채혈보조인원 2인, 시험담당자 2인 ( 전문의 1인포함 ) 및시험책임자로총 6인을참가시켰다. 피험자에대한투약은오전 8:00 부터영진약품의바캄피실린정 1정 ( 바캄피실린으로서 400mg) 을물 240mL와함께투약하였다. 피험자간복약시간의차이는채혈시간을고려하여 1분간격으로하였다. 채혈시간은약물혈중소실반감기 0.39 시간의 3배이상인 6시간동안실시하였고, 채혈횟수는약물투약직전과 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 2, 2.5, 3, 4 및 6 시간의총 12시점에서채혈하였다. 채혈방법은 i.v. catheter 중에남아있는헤파린처리생리식염수를완전히제거하기위해매번약 1~2mL의혈액을버리고피험자관리번호와채혈시간이기재되어있는채혈용주사기에약 10mL의혈액을채취하였다. 채혈후마다 i.v. catheter 안에잔류하는혈액의응고를방지하기위하여주사용헤파린을넣은주사용생리식염수를주입하였다. 채혈된혈액은 3,500 rpm, 4 에서 15분간원심분리한후혈장을취하여혈장분리관에옮겨담고분석시까지 -70 에서보관하였다. 식사에의한영향을배제하기위하여투약전 12시간이상절식한상태에서투약후금식상태를유지시켰으며, blank 채혈후 4시간째채혈이끝난후동일한점심식사 ( 갈비탕 ) 를제공하였다. 시험전과정을통하여피험자개개인의상태를관찰하여증례기록서 < 별첨 9> 에기록하였으며, 마지막채혈이끝난후담당의사에의해혈액, 맥박, 기타이상유무를확인, 기록하였다. 10. 채혈인경우감염방지대책 피험자들의혈액채취는일반인들의출입이통제된격리된방에서실시하 - 7 -

54 며, 사용하는기구는완전멸균된 1 회용으로하였다. 11. 검체처리및분석방법 분석대상 혈장중바캄피실린의활성대사체인암피실린의농도를측정하였다 주요기기및장치 - HPLC( 분석기기 ) system(jasco Set, Japan) - Dual pump - Autosampler - Detector: UV-VIS 214 nm - Column: Luna Su C18, 250x4.6mm, 5 nm, 36 - Phenomenex Thermasphere TS-130, 36 - Borwin Data Analysis System - 원심분리기 : 혈장원심분리기 ( 한일기기 ) - Vortex Mixer (G-560, Scientific Industries) - ph meter HPLC 조건전처리된혈장시료는다음의 HPLC 조건에서정량하였다. 장치로는 Jasco HPLC system을, 검출기로는 UV-VIS detector UV 214 nm, 컬럼은 Luna Su C18 을사용하고, 컬럼오븐은 Phenomenex Thermasphere TS-130으로온도를 36 로유지하며데이터처리장치로는 Borwin Data Analysis System을사용하였다. 이동상으로는 Methanol : 0.03M Na 2 HPO 4 Buffer(pH 7.45) = 3.4 : 6.6 (v/v) 혼합용액을사용하고유속 1.2 ml /min에서정량하였다 검량선작성 Ampicillin 을물에녹여농도를 1000 μg /ml 로만든후냉장보관시키고, - 8 -

55 이용액을냉동보관하였던 blank 혈장으로희석하여 ampicillin의혈장중농도가각각 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10 μg /ml 농도가되도록표준혈장시료를만든다. 각각의표준혈장 0.5 ml에내부표준물질로 Tiapride(10ppm : water로녹임 ) 100 μl를가한후흔들어섞는다. 여기에 75μl의 30% trichloroacetic acid를넣고 vortex mixer하에서잘섞은다음 12000rpm으로 10분간원심분리하여상층액 50μl를 HPLC에주입한다. 여기에서얻은내부표준물질의피이크면적에대한바캄피실린의피이크면적비를가지고검량선을작성하였으며하루에실험을 5번시행하여일내재현성을구하였고연속하여 3일간실험을행하여일간재현성을구하였다 혈장시료의처리피험자로부터각시간별로채취하여 -70 에보관했던혈장시료를실온에방치하여녹인후 1분간진탕한다음이혈장 500 μl를취하여시험관에옮기고여기에내부표준물질로 Tiapride(10ppm : water로녹임 ) 100 μl를가한후검량선작성방법과동일한방법으로전처리한후 HPLC에주입하였다 혈중농도계산얻어진크로마토그램으로부터내부표준물질의피이크면적에대한암피실린의면적비를구하여미리작성한검량선으로부터혈장중암피실린의농도를구하였다. 12. validation 자료 ( 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성, 감도등 ) 분석조건의검증 특이성본시험에서적용한분석방법에따라검체를처리하여 HPLC로분석시 bacampicillin의활성대사체인 ampicillin과내부표준물질인 tiapride는 Fig. 1에서보는바와같이각각 RT가 9분및 6분부근에서검출되어완벽히분리되었다. 또한공혈장을같은방법으로전처리하여 HPLC로분석한결 - 9 -

56 과공혈장에서는 ampicillin 및내부표준물질의검출시간대에는다른오염 된피크가전혀관찰되지않았다. (a) (b) Fig. 1. HPLC 크로마토그램. (a) 공혈장의크로마토그램, (b) 내부표준물질과 ampicillin (6 μg /ml) 의크로마토그램 직선성앞에서설명한혈장시료전처리에따라혈장시료에서최종 ampicillin 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10 μg /ml 농도의 HPLC 분석결과 ampicillin에대한 I.S의피크면적비에따른검량선계산식은일내에서는 Y = X (R 2 = ) 및일간에서는 Y = X (R 2 = ) 로서 0.5~10 μg / ml범위에서양호한직선성을나타내었다. (Fig. 2)

57 Intraday Calibration Curve y = x R 2 = Interday Calibration Curve y = x R 2 = Fig. 2. 혈장중 ampicillin 의검량선 정밀성, 정확성 Ampicillin과내부표준물질의피크면적의표준편차를 ampicillin과내부표준물질의피크면적비의평균값으로나눈비의백분율 (%) 로써정밀성을, 실측치와이론농도의차에대한이론농도의비의백분율로써정확성을구하였다. 하루에 5회시행하여일내정밀성을구하였으며, 5일간반복시험하여일간정밀성을구하였다

58 Table 5. Intra-day and inter-day coefficient of variation and accuracy for determination of ampicillin in human plasma (n=5) Theoretical concentration ( μg /ml) Concentration ( μg /ml) found CV (%) Accuracy (%) Intra-day Inter-day 본분석방법의정밀성 (CV %) 는검량선의최저농도 (0.5 μg / ml ) 에서일내정밀성이 CV는 1.924% 및정확도에서 109.2% 를보였으며기타농도에서는 15% 이내에서확인되었다. 일간정밀성및정확도에서최저농도인 0.5 μg /ml에서 6.616% 를보였으며정확도에서 96.2% 를보였으며기타농도에서는전부 15% 이하의결과를나타내었다 각피험자의시간에따른혈장중암피실린의농도추이각피험자에게펜그로브정 400mg을투여한후구한시간별혈장중약물농도는 Table 6에각각나타내었으며, 각피험자에있어서의혈장중약물농도-시간곡선을 Fig. 3~10 에각각나타내었고이를평균혈장중약물농도-시간곡선으로그려보면 Fig. 11 과같다

59 Table 6. 펜그로브정 400 mg투여후각피험자의시간에따른혈장중암피실린의농도 (ug/ ml ) B-1 B-2 B-3 B-4 B-5 B-6 B-7 B-8 평균 표준편차 0 N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D (B. Q.L) (B. Q.L) (B. Q.L) (B. Q.L) (B. Q.L) (B. Q.L) (B. Q.L) (B. Q.L) (B. Q.L) (B. Q.L) (B. Q.L) (B. Q.L) (B. Q.L) (B. Q.L) (B. Q.L) (B. Q.L) N.D (B. Q.L) (B. Q.L) (B. Q.L) (B. Q.L) (B. Q.L) (B. Q.L) (B. Q.L) (B. Q.L) N.D N.D N.D N.D (B. Q. L) (B. Q.L) (B. Q.L) (B. Q.L) (B. Q.L) (B. Q.L) 6 N.D N.D N.D N.D N.D N.D (B. Q.L) (B. Q.L) (B. Q.L) (B. Q.L) N.D : Not Detected. B.Q.L : Below Quantitive Limit

60 Conc(ug/ml) B Time(h) Fig. 3. 피험자 B-1 의혈장중암피실린의농도 7 B-2 Conc(ug/ml) Time(h) Fig. 4. 피험자 B-2 의혈장중암피실린의농도

61 2.5 B-3 2 Conc(ug/ml) Time(h) Fig. 5. 피험자 B-3 의혈장중암피실린의농도 3 B Conc(ug/ml) Time(h) Fig. 6. 피험자 B-4 의혈장중암피실린의농도

62 2.5 B-5 2 Conc(ug/ml) Time(h) Fig. 7. 피험자 B-5 의혈장중암피실린의농도 Conc(ug/ml) B Time(h) Fig. 8. 피험자 B-6 의혈장중암피실린의농도

63 Conc(ug/ml) B Time(h) Fig. 9. 피험자 B-7 의혈장중암피실린의농도 Conc(ug/ml) B Time(h) Fig. 10. 피험자 B-8 의혈장중암피실린의농도

64 Av erage Conc. (ug/ml) Time(h) Fig. 11. 펜그로브정 400mg 를투여한건강한피험자의평균혈장중 암피실린의농도추이 (n=8, Mean±S.E) 생체이용률파라메타의산출 각피험자의 AUC, C max, T max 등의생체이용률파라메타를구하였으며, 각피 험자의생체이용률파라메타를정리하면 Table 7 과같다. Table 7. 각피험자의 AUC, C max, T max B-1 B-2 B-3 B-4 B-5 B-6 B-7 B-8 평균표준편차 Ke AUC Tmax Cmax T 1/ 결론

65 본분석방법은펜그로브정 400mg 을경구투여하였을때, 바캄피실린의활성대 사체인암피실린의혈중농도를정량하는방법으로적합한정밀성과정확성, 감 도를가지고있는것으로사료된다

66 총괄연구과제요약 세부과제 고유번호 연구과제명 약동성 529 공개가능여부 염산바캄피실린의생체이용률시험및생물학적동등성시험지침작성 ( 영문 ) Bioavailability Test of Bacampicillin Preparation and Guideline of its Bioequivalence Test 세부과제명 성명최영욱주민등록번호 연구책임자 소속기관명 전자우편 중앙대학교약학대학 전화번호 연구목표 각세부기관에서 HPLC를이용한바캄피실린의분석방법 Validation을동시에진행하여그결과를취합표준분석법을확립한다. 확립된표준분석방법을이용하여바캄피실린을시험대상약물로하여각세부기관에서생체이용률시험을수행하고, 각기관의결과를종합분석하여표준생체이용률시험법을확립한다. 연구내용 각세부기관에서 HPLC 를이용한바캄피실린의분석방법 Validation 을동시에진행하여 그결과를취합표준분석법을확립한다. 확립된표준분석방법을이용하여바캄피실린을시험대상약물로하여제1세부기관 ( 중앙대, 최영욱 ; 주관연구기관 ), 제2세부기관 ( 영남대, 용철순 ) 및제3세부기관 ( 경희대, 이경태 ) 에서생체이용률시험을수행하고, 각기관의결과를종합분석하여표준생체이용률시험법을확립한다. 최종적으로주관연구기관에서표준생물학적동등성시험지침을작성한다. 시험결과의평가항목은약동력파라미터인 AUC, C max, T max, Ke, t 1/2β 등을평가하며, AUC 는사다리꼴공식으로산출하며, C max 와 T max 는실측치로부터구하고, 소실속도정수 (Ke) 및소실반감기 (t 1/2) 는혈중농도-시간세미로그플롯에서직선성을나타내는 terminal phase ( 최종채혈시점을포함하여최소 3점이상의구간 ) 로부터구한다. 연구성과 ( 응용분야및활용범위포함 )

67 1) 계획서대로 3 개기관모두바캄피실린의혈중분석법을 HPLC-UV 검출법으로검토하여 양호한결과를얻었으며, 각기관별로분석법 validation 을완료하여정량한계 0.5 μg /ml 에서생체이용률시험에적용할수있음을확인하였다. 2) 각세부기관에서지원자모집과시험설명및의료기관에서시험담당의사의건강검진을거쳐선정한건강한피험자에대해시험계획서에따라피험자를관리하고바캄피실린제제 ( 대조약 : 펜그로브정 0.4g, 유한양행 ) 1정을물 240mL로경구투여하였다. 투약전과투약후 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 2, 2.5, 3, 4 및 6시간대에총 12시점에서채혈하여혈중약물농도를 Validation된 HPLC-UV 검출법으로혈중바캄피실린의농도를측정하여생체이용률파라미터를구였다. 혈장중농도-시간곡선하면적 (AUC 6h) 최고혈장중농도 (Cmax), 최고혈장중농도도달시간 (Tmax), 소실속도정수 (Ke), 소실반감기 (t 1/2 ) 등의생체이용률파라미터를구하였으며, 그값은각각10.52±2.18( μg hr/ml), 6.43±1.60 ( μg /ml), 0.59±0.13 (hr), 0.62±0.17 (hr -1 ), 1.20± 0.39 (hr) 이었다. 참여연구원 성명 주민등록번호 Keywords (5 개내외 ) 한글염산바캄피실린, HPLC, 생체이용률시험, 생물학적동등성시험 영문 bacampicillin, HPLC, Bioavailability test, Bioequivalence test

68 주 의 1. 이보고서는국립독성연구원에서시행한용역연구개발사업 의보고서입니다. 2. 이보고서내용을발표할때에는반드시국립독성연구원에서 시행한용역연구개발사업의연구결과임을밝혀야합니다. 3. 국가과학기술기밀유지에필요한내용은대외적으로발표또는 공개하여서는아니됩니다

69 목 차 제출문요약문영문요약문 1. 서론 2. 국내외기술개발현황 3. 연구개발수행내용및결과 제 1세부기관결과 제 2세부기관결과 제 3세부기관결과 4. 연구개발목표달성도및대외기여도 5. 연구개발결과의활용성과및계획 6. 기타중요변경사항 7. 품목별표준생물학적동등성시험지침작성 서론 생물학적동등성시험 8. 연구 ( 세부 ) 과제요약