(52) CPC 특허분류 A61K 8/736 ( ) A61Q 19/00 ( ) A61Q 19/08 ( ) (72) 발명자 홍선미 경상북도울진군죽변면해양과학길 22 경북해양바이오산업연구원 권은혜 경상북도울진군죽변면해양과학길 22 경북해양바

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민지 천
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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (45) 공고일자 2017년09월12일 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2017년08월29일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 8/19 ( ) A61K 8/02 ( ) A61K 8/73 ( ) A61Q 19/00 ( ) A61Q 19/08 ( ) (52) CPC특허분류 (73) 특허권자재단법인경북해양바이오산업연구원경상북도울진군죽변면해양바이오길 22 울진군경상북도울진군울진읍울진중앙로 121 A61K 8/19 ( ) (72) 발명자 A61K 8/02 ( ) 김소정 (21) 출원번호 경상북도울진군죽변면해양과학길 22 경북해양 (22) 출원일자 2015년11월30일바이오산업연구원심사청구일자 2015년11월30일김창곤 (65) 공개번호 경상북도울진군죽변면해양과학길 22 경북해양 (43) 공개일자 2017년06월08일바이오산업연구원 (56) 선행기술조사문헌 KR A* ( 뒷면에계속 ) ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인유미특허법인 전체청구항수 : 총 4 항 심사관 : 천현주 (54) 발명의명칭세포성장촉진및피부보습개선기능을가진덕구온천수와올리고키토산을함유한화장품조성물 (57) 요약 본발명은덕구온천수및올리고키토산을포함하는화장료조성물및이를포함하는화장품에관한것이다. 대표도 - 도 8-1 -

2 (52) CPC 특허분류 A61K 8/736 ( ) A61Q 19/00 ( ) A61Q 19/08 ( ) (72) 발명자 홍선미 경상북도울진군죽변면해양과학길 22 경북해양바이오산업연구원 권은혜 경상북도울진군죽변면해양과학길 22 경북해양바이오산업연구원 김진수 경상북도울진군죽변면해양과학길 22 경북해양바이오산업연구원 (56) 선행기술조사문헌 KR A* KR A KR A JP A * 는심사관에의하여인용된문헌 공지예외적용 : 있음 - 2 -

3 명세서청구범위청구항 1 경상북도울진군북면덕구온천로응봉산지역의덕구온천수및홍게껍질유래의올리고키토산을포함하는항산화또는주름개선용화장료조성물로서, 상기덕구온천수는칼륨 0.40 내지 0.60 mg/l, 나트륨 40.0 내지 43 mg/l, 칼슘 3.00 내지 3.50 mg/l, 마그네슘 0.01 내지 0.05 mg/l, 산화규소 내지 mg/l, 리튬 0.05 내지 0.10 mg/l, 스트론튬 0.01 내지 0.05 mg/l, 철 0.01 내지 0.05 mg/l, 망간 0.01 내지 0.05 mg/l, 구리 0.01 내지 0.05 mg/l, 납 0.01 내지 0.05 mg/l, 아연 0.01 내지 0.05 mg/l, 불소 8.0 내지 12.0 mg/l, 염소이온 4.00 내지 5.00 mg/l 및황산이온 5.00 내지 6.00 mg/l 를포함하고, 상기홍게껍질유래의올리고키토산은 1kDa 내지 3.5kDa의분자량을갖는것인, 항산화또는주름개선용화장료조성물. 청구항 2 삭제청구항 3 삭제청구항 4 삭제청구항 5 삭제청구항 6 삭제청구항 7 제1항에있어서, 상기온천수는증발및농축한농축물이고, 상기농축물을조성물총부피를기준으로 0.5 내지 50%(v/v) 로함유하는것인화장료조성물. 청구항 8 제1항또는제7항중어느한항의화장료조성물을포함하는화장품. 청구항 9 제8항에있어서, 상기화장품은화장수, 유액, 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선스크린, 메이크업베이스, 파운데이션, 파우더, 메이크업제거제및세정제로구성되는군으로부터선택된 1종이상의제형을가지는것인, 화장품. 발명의설명 [0001] 기술분야 본발명은덕구온천수및올리고키토산을포함하는화장료조성물및이를포함하는화장품에관한것이다

4 [0002] [0003] [0004] 배경기술온천수는지하수가지열에의해평균기온이상으로더워져서지표로용출된것으로, 보통수온이 25 이상이고일정한광물성분, 수증기, 가스등을포함하고있다. 온천학상으로넓은뜻의온천은, 물리적 화학적으로보통의물과는성질이다른천연의특수한물이지중에서지표로나오는물을의미한다. 이에대하여, 지하수의수온보다낮은것은냉천이라고하고, 수온과는관계없이무기물질또는가스성분을다량으로함유하고있는것을광천이라한다. 온천의한계온도는지역에따라다르다. 우리나라는 25 를기준으로 25 이하는냉천, 는미온천, 는온천, 42 이상은고온천으로구분한다. 온천의분류는학자나국가에따라다르나, 일반적으로온도, 온천의용출형태, 액성이온농도, 광물질의용해도, 또는온천의개발상태등에따라서나눈다. 덕구온천은우리나라에대표적보양온천으로경상북도울진군북면덕구리용봉산 (999m) 기슭에잡고있으며국내유일의자연용출온천수로, 1일용출량은약 2,000톤이며, 수온은 41도, 수질은중탄산나트륨이주성분이고, 불소칼륨 칼슘 철 탄산등의성분이많이함유되어약알카리성이다. 덕구온천수로당뇨병, 신경통, 만성소화불량에좋다고알려져있으나, 이러한온천수를이용한바이오제품의개발이활발히이루어지지못하고있는실정이다. 한편, 키토산은항균작용, 창상피복작용, 약물서방작용, 콜레스테롤저하작용등다양한기능을가지고있기때문에의료용재료나기능성식품재료로이용되고있다. 선행기술문헌 [0005] 특허문헌 ( 특허문헌 0001) 국내특허등록제 호 ( ) 발명의내용 [0006] [0007] [0008] [0009] [0010] 해결하려는과제본발명에서는경상북도지역의덕구온천수에대한세포성장촉진및피부보습개선효능을확인하여, 덕구온천수를유효성분으로함유한화장료조성물을제공할수있음을확인하였다. 나아가, 본발명에서는올리고키토산의분자크기별기능성을확인하였으며, 세포성장촉진및피부보습개선효능이우수한덕구온천수와보습성및친화력이우수한올리고키토산을배합한화장료조성물이피부기능개선을위해유용하게사용될수있음을확인하였다. 따라서, 본발명의하나의목적은경상북도지역의덕구온천수를포함하는화장료조성물을제공하는것이다. 본발명의또하나의목적은경상북도지역의덕구온천수및올리고키토산을포함하는화장료조성물을제공하는것이다. 본발명의또하나의목적은상기화장료조성물을포함하는화장품을제공하는것이다. [0011] [0012] [0013] 과제의해결수단본발명은덕구온천수가세포성장촉진, 피부보습개선및피부장벽강화효능이우수하므로화장품의소재로서유용함을확인하였다. 이에, 본발명은덕구온천수를포함하는화장료조성물및이의이용에관한것이다. 또한, 본발명은홍게껍질유래올리고키토산을덕구온천수에배합한화장료조성물및이의이용에관한것이다. 더욱상세하게는, 세포성장촉진및피부보습개선효능이확인된덕구온천수와, 보습성및친화력이우수하며양이온성의고분자이홍게껍질유래올리고키토산을배합함으로써, 이온성을띠지않은고분자보다점성이뛰어나고유화안정, 분산안정및결합성등이우수하고, 자극없이안전하게사용가능하여, 화장품의소재로서유용하게사용될수있도록개발된화장료조성물및이의이용에관한것이다. 일예로, 본발명은경상북도지역의덕구온천수를포함하는화장료조성물을제공한다. 상기화장료조성물은피부보습또는피부장벽강화용도로사용될수있으며, 피부에자극없이안전하게사용이가능하다

5 [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] [0021] [0022] [0023] [0024] [0025] [0026] 다른예로, 본발명은경상북도지역의덕구온천수및올리고키토산을포함하는화장료조성물을제공한다. 상기화장료조성물은피부보습, 항산화, 주름개선또는피부장벽강화용도로사용될수있으며, 피부에자극없이안전하게사용이가능하다. 다른예로, 본발명은상기화장료조성물을포함하는화장품을제공한다. 상기화장품은화장수, 유액, 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선스크린, 메이크업베이스, 파운데이션, 파우더, 메이크업제거제및세정제로구성되는군으로부터선택된 1종이상의제형을가진것일수있다. 이하, 본발명을보다상세하게설명한다. 본발명에서온천수란지하로부터용출되는섭씨 25 이상의온수로그성분이인체에유해하지않은미네랄배합물을의미하며, 바람직하게는경상북도지역의덕구온천수로서, 나트륨, 불소, 칼륨, 칼슘, 철, 탄산등이고함유된약알칼리성의온천수일수있다. 일구체예로, 본발명의온천수는경상북도울진군북면덕구온천로응봉산지역의덕구온천수일수있다. 다른구체예로, 본발명의온천수는칼륨 0.40 내지 0.60 mg/l, 나트륨 40.0 내지 43 mg/l, 칼슘 3.00 내지 3.50 mg/l, 마그네슘 0.01 내지 0.05 mg/l, 산화규소 내지 mg/l, 리튬 0.05 내지 0.10 mg/l, 스트론튬 0.01 내지 0.05 mg/l, 철 0.01 내지 0.05 mg/l, 망간 0.01 내지 0.05 mg/l, 구리 0.01 내지 0.05 mg/l, 납 0.01 내지 0.05 mg/l, 아연 0.01 내지 0.05 mg/l, 불소 8.0 내지 12.0 mg/l, 염소이온 4.00 내지 5.00 mg/l 및황산이온 5.00 내지 6.00 mg/l 를포함하는것일수있다. 본발명에서온천수는그자체로사용되거나가공되어사용될수있는데, 예를들어증발, 농축및건조에의해수득된농축물또는고형분으로사용할수있다. 또는상기온천수를자연건조로증발시키거나, 인공적으로탈염및건조 ( 또는증발 ) 시켜얻은농축액을사용할수있다. 증발, 농축및건조방법에특별한한정은없으나, 예를들면지하온천수를 1차, 2차및 3차증발기로증발시키고여과한후농축건조하여얻을수있다. 구체적인일실시예로, 본발명의따른상기온천수의농축물은, 우선원수를채수한후, 필터링하는여과단계를거칠수있다. 여과과정을거쳐수득한수득물은탈염단계및건조과정을수행할수있으며, 탈염은이에제한되는것은아니나전기투석기를이용할수있다. 이후, 자연건조나인공건조기를이용한건조단계를거쳐탈염파우더를제조할수있다. 마지막단계에서는탈염파우더를분쇄하여포장할수있다. 또한, 본발명에따른온천수의농축물의제조는원수를채수한후건조과정을통해먼저농축과정을수행할수있고, 이후여과단계를수행할수있다. 본발명의일실시예에있어서, 상기온천수를그자체로사용할경우조성물총부피를기준으로 50%(v/v)~100%(v/v) 의양으로사용할수있으며, 농축물로사용할경우에는조성물총부피를기준으로농축물을 0.5~50%(v/v) 의양으로함유하여사용할수있으나, 이에제한되는것은아니다. 키토산은키틴을탈아세틸화시킨물질로서, 여러생리활성및물리화학적특성을지니고있지만키토산을녹일수있는용매는몇가지용매를제외하고는극히제한되어있다. 본발명에서는키토산을가수분해시킨저분자량의올리고키토산을덕구온천수에배합할수있으며, 이러한올리고키토산은보통화장료에많이사용되는키토산에비해저분자이므로, 헤어나피부에흡수율을증가시켜서우수한컨디셔닝효과를제공할수있다. 올리고키토산은수득하는방법에는특별한제한이없으나, 예를들어키토산을화학적방법또는효소적방법에의하여가수분해하여수득할수있다. 또는, 홍게껍질에서추출한올리고키토산을사용할수있다. 또한본발명의올리고키토산의분자량은 1kDa 내지 3.5kDa일수있다. 본원의화장료조성물은투여경로에따라서, 피부외용, 경피또는피하투여, 헤어투여가가능하며, 바람직하게는피부외용또는경피, 모발, 보다바람직하게는피부, 모발에의외용투여가가능한조성물일수있다. 상기화장료조성물은피부, 두피또는모발에경피적으로적용될수있고, 기초화장품, 메이크업화장품, 바디제품 ( 바디클렌져, 바디로션등 ), 면도용제품, 모발제품 ( 샴푸, 린스, 헤어에센스등 ) 등의모든화장품제품의제조에사용가능한조성물을의미하는것으로, 경고제, 스프레이제, 현탁액, 유액, 크림, 젤, 폼등의형태로제제화된것일수있으나, 그형태에특별한제한이없다. 예를들어, 화장수, 유액, 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선스크린, 메이크업베이스, 파운데이션 ( 고체타입, 액체타입또는스프레이타입등 ), 파우더, 메이크업제거제 ( 클렌징크림, 클렌징로션, 클렌징오일등 ) 및세정제 ( 클렌징폼, 비누, 바디워쉬등 ) 등의제형을가질수있다

6 [0027] [0028] [0029] 상기화장료조성물은유효성분이외에, 통상의제품화또는제제화에사용가능한모든종류의성분, 예컨대계면활성제, 유화제, 비누산, 용매, 결합제, 희석제, 활택제, 안정제, 항료, 물, 저급알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 착색제, 보존제, 항생제, 항산화제, 소포제, 항균제, 효소, 식물또는미네랄오일, 지방, 형광물질, 살진균제, 굴수성유발물질, 보습제, 방향제, 방향제담체, 보존제, 단백질, 실리콘, 용해화제, 당유도체, 일광차단제, 비타민, 식물추출물및왁스로이루어진군중에서선택된 1종또는 2종이상의약리학적으로허용가능한부형제를함유할수있으며, 그종류와함량은최종산물의용도및사용목적에따라적절하게조절할수있다. 또한, 상기화장료조성물은적용되는형태에통상적으로포함되는용매를포함하는것일수있으며, 예컨대, 에탄올, 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 1,2,4-부탄트리올, 솔비톨에스테르, 1,2,6-헥산트리올, 벤질알코올, 이소프로판올, 부탄디올, 디에틸렌글리콜모노에틸에테르, 디메틸이소소르비드, N-메틸-2-피롤리돈, 프로필렌카보네이트, 글리세레스-26, 메틸글루세스-20, 이소세틸미리스테이트, 이소세틸옥타노에이트, 옥틸도데실미리스테이트, 옥틸도데칸올, 이소스테아릴이소스테아레이트, 세틸옥타노에이트및네오펜틸글리콜디카프레이트등중에서선택된 1 종이상을포함할수있다. 본발명이속하는기술분야의당업자라면제품의특성에따라용매의종류및사용량을알맞게선택하여적용할수있다. 또한, 상기화장료조성물은경피투여시의경피투과를강화하기위한다양한물질을포함할수있다. 예를들어, 라우로켑람유도체및올레인산, 모노올레이트유도체의에스테르유도체, 아다팔렌, 트리티노인, 레틴알데하이드, 타자로틴, 살리실산, 아질라익산, 글라이콜산, 에톡시다이글라이콜, 트윈80, 레시틴올가노겔등을포함할수있다. 또한, 본발명의화장료조성물은부가적인기능을부여하기위해, 본발명의미백또는주름개선효과를해치지않는범위내에서공계면활성제, 계면활성제, 비듬방지제, 각질연화제, 혈행촉진제, 세포활성제, 청량제, 보습제, 항산화제, ph 조절제, 정제수등의보조성분들을첨가할수있으며, 적용되는형태에따라서적절한향료, 색소, 방부제, 부형제등의첨가제를함유할수있다. [0030] 발명의효과본발명의화장료조성물은피부보습, 항산화, 주름개선또는피부장벽강화기능이우수할뿐만아니라, 대게홍게부산물및경상북도울진의천연자원으로하루 2000톤정도유출되는덕구온천수를활용할수있으므로, 부산물처리비용저감, 환경오염저감및새로운산업수요창출측면에서중요한기여를할수있다. [0031] 도면의간단한설명 도 1 은키토산시료중의폴리페놀함량을측정한결과를나타낸다. GAE (Gallic Acid Equivalents) 는폴리페놀 함량을나타내는측정단위이다. 도 2는키토산의 DPPH 소거활성능 (%) 을확인한결과를나타낸다. 도 3은키토산의 Elastase activity(%) 을확인한결과를나타낸다. 도 4는본발명의일실시예에따른덕구온천수, 일반수및정제수를각각분주한페트리디쉬에서상추씨의발아율 (%) 을그래프로나타낸것이다. 도 5는본발명의일실시예에따른덕구온천수, 일반수및정제수를각각분주한페트리디쉬에서발아한상추씨의뿌리길이 (cm) 를그래프로나타낸것이다. 도 6은본발명의일실시예에따른덕구온천수, 일반수및대조군의세포독성을평가하기위하여세포생존율 (%) 을확인한결과를나타낸것이다도 7은본발명의일실시예에따른덕구온천수의시간과온도에따른 ph 변화를나타낸그래프이다도 8은본발명의일실시예에따른덕구온천수및일반정제수의 4주동안피부수분변화 (A.U.) 를그래프로나타내는것이다. 도 9는본발명의일실시예에따른덕구온천수의 4주동안피부보습개선율 (%) 을나타내는것이다. 도 10 본발명의일실시예에따른덕구온천수 ( 시험제품 ) 의 2주동안경피수분손실량의개선율 (%) 을나타내는것이다. 발명을실시하기위한구체적인내용 - 6 -

7 [0032] [0034] [0035] 이하, 본발명을실시예에의해상세히설명한다. 단, 하기실시예는본발명을예시하는것일뿐, 본발명이하기실시예에의해한정되는것은아니다. 실시예 1. 덕구온천수의준비본원의일실시예에서사용한덕구온천수는경상북도울진군북면덕구온천로 924번지응봉산 (999m) 에서흘러나오는 43 약알칼리온천이다. 경상북도울진군에서대한온천학회에의뢰하여덕구온천수의성분을분석결과를표 1에기재하였다. 단위는 mg/l 이다. [0036] 성분 2002년 2008년 2012년 칼륨 (K) 나트륨 (Na) 칼슘 (Ca) 마그네슘 (Mg) 산화규소 (SiO 2 ) 표 1 리튬 (Li) 스트론튬 (Sr) 철 (Fe) 망간 (Mn) 구리 (Cu) 납 (Pb) 아연 (Zn) 알루미늄 (Al) 불소 (F) 염소이온 (Cl - ) 황산이온 (SO 4 ) 총고형물 (TS) [0037] [0038] [0039] 실시예 2. 키토산에따른최적의조건확립 2-1. 폴리페놀분석키토산을분석하기위하여, 분자량크기에따라 3종의올리고키토산 (1kDa, 3.5kDa, 10kDa) 과 CM 키토산 (carboxymethylated chitosan) 을이용하여분석하였다. 각각 10mg/ml로녹여사용하였다. 폴리페놀분석을위하여올리고키토산과 CM 키토산 0.5 ml에섞은용액에 Folin-Ciocalteu 시약 0.5 ml, 7.5 % Na 2 CO 3 1 ml 넣어준 후증류수로최종 10 ml을맞추었다. 배양기 (60) 에서 20분간발색시킨후 765 nm 파장에서흡광도를측정하였고미리 gallic acid (GAE) 을사용하여구한검량곡선으로부터시료중의폴리페놀함량을계산하였다. 그결과, 폴리페놀분석경우올리고키토산분자량에따라서 3.5kD > 1 kd > 5 kd > CM-키토산순으로폴리페놀함량이높게나타났다 ( 도 1). [0041] [0042] 2-2 DPPH 소거활성능 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 측정은 Yinrong와 Yeap Foo의방법에따라다음과같이실시하였다. 올리고키토산과 CM 키토산 0.2 ml에 DPPH (16 mg / 100 ml EtOH) 용액 1 ml 를섞은후 10분간상온에서반응시킨후 517 nm에서흡광도를측정하였다. 시료를첨가하지않은대조군과비교하여유리래디칼소거활성을백분율 (%) 로나타내었다. 계산식은아래와같다. [0043] [0044] A 0 : 대조군흡광도 - 7 -

8 [0045] [0046] [0048] [0049] A 1 : 실험군흡광도항산화효능은올리고키토산분자량에따라서 1 kd > 3.5 kd > 5 kd > CM-키토산순으로효능이나타났다. ( 도 2) 엘라스타아제 (Elastase) 저해활성분석엘라스타아제 (Elastase) 저해활성측정을위하여, 분자크기별올리고키토산과 CM 키토산 (10mg/ml) 및알부틴 (10mg/ml) 을각각 20ul 시험관에취하고, 50mM tris-hcl buffer (ph 8.6) 에녹인 porcine pancreas elastase (10μg/mL) 용액 50μl을가한후기질로 50mM tris-hcl buffer (ph 8.6) 에녹인 N-succinyl-(L-Ala) 3 -pnitroanilide (0.5mg/mL) 을 100 μl첨가하여 20 분간반응시켜측정하였다. 엘라스타아제저해활성은시료용액의 첨가구와무첨가구의흡광도감소율로나타내었다. [0050] [0051] [0053] [0054] [0055] [0057] [0058] [0059] 올기고키토산분자크기별엘라스타아제저해능을측정한결과, 도 3에나타난바와같이, 올리고키토산분자량에따라서 1 kd > 3.5 kd > CM-키토산 > 5 kd 순으로저해능이확인되었다. 이결과를바탕으로올리고키토산이저분자일수록항산화효능이나주름개선효능이높으로것으로나타났다. 실시예 3. 덕구온천수의성장활성확인덕구온천수, 일반수로서수돗물, 및정제수로서 2차증류수를이용하여발아성장률을비교하는실험을수행하였다. 이를위하여, 페트리디쉬 (90 X 15mn) 에여과지 (adadvant filter paper #2) 를깔고정제수, 일반수또는덕구온천수 5ml를각각분주하고, 페트리디쉬에상추씨 8개정렬후배양실에서배양하였다. 배양실조건은 25, 명 / 암 (L:D) 주기 12H:12H, 및습도 60% 로맞추어배양하였다. 각각발아시킬용매에세척한후사용하였다. 양성발아기준은 3일후뿌리길이가 0.5cm이상자란것으로간주하였다. 5일후뿌리길이를측정하여덕구온천수와일반수, 정제수와비교하였다. 모든실험을 3반복하여 3회이상실시하여 3회이상반복하였다. 상추씨의발아율확인결과, 도 4에나타난바와같이, 덕구온천수가분주된페트리디쉬에서는 86.4%, 일반수가분주된페트리디쉬에서는 80%, 그리고정제수가분주된페트리디쉬에서는 76.7% 의발아율을나타냈다. 또한, 뿌리길이측정결과, 도 5에나타난바와같이, 덕구온천수에서 5.58cm, 일반수에서 4.94cm, 그리고정제수에서 4.1cm로측정되었다. 따라서, 덕구온천수 > 일반수 > 정제수순으로상추씨성장활성을보였다. 특히, 덕구온천수와정제수를비교하여볼때, 덕구온천수가발아율은 9.7% 더높고, 뿌리길이는 1.48cm 더길어, 더높은생장율을보였다. 화장품조성물제조시수용성용매로정제수를일반적으로사용하는보편화되어있는데, 본실험결과에의하여, 덕구온천수가정제수대체용매물로사용할수있음이확인되었다. 실시예 4. 덕구온천수의안정성평가 4-1 세포독성평가 B16-F10 멜라닌세포 ( 제조사 ATCC LOT ) 를이용하여덕구온천수의안정성을평가하였다. 96 well plate에 cell suspension(5000cells/well) 100μl씩분주하여, 24시간동안 37 및 5% CO 2 조건으로 preincubation 시켜 cell 을 well plate 에부착시켰다. blank well 은 cell 을포함하지않은배지 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, 제조사 ATCC) 만 100 μl분주하였다. [0060] 일반수와덕구온천수를각 well 에 10 μl씩처리하고, 음성대조군 (negative control) 으로는배지 10 μl만처리하 고, 양성대조군으로 100% Ethanol 을 10 μl처리한후, 24 시간동안 37 및 5% CO 2 조건으로인큐베이션시켰 다. 각 well 에 CCK-8 solution 10 μl씩첨가한후 1 시간동안인큐베이션하여 450nm 에서흡광도를측정하였다. blank 는세포가없는상태에서시료를넣고측정한것이다. [0061] [0062] survival rate(%) = (A sample -A b )/(A c -A b ) 100 A sample : sample 흡광도 - 8 -

9 [0063] [0064] [0065] [0067] [0068] [0069] A b : blank 흡광도 A c : 음성대조군흡광도 (cell있는상태에서증류수넣고측정한값 ) 그결과도 6에나타난바와같이, 덕구온천수처리시세포생존율이 90% 이상나타나, 안정성이확인되었다. 이에반하여, 양성대조군 (100% Ethanol) 은세포생존율이 20% 이하로나타나세포독성이확인되었다. 4-2 시간과온도변화에따른덕구온천수의 ph 변화및안정성테스트덕구온천수에대하여시간및온도에따라 ph 변화를살펴보았다. 기간은 3개월정도 5-6일에한번씩측정을하였고, 온도는 4 및 25 로하였다. 4 는냉장보관, 25 는배양기를통해서일정한온도를유지하면서 ph 변화도, 변취및부유물발생등을관찰하였다. 그결과, 도 7 에서보는바와같이, 덕구온천수의 ph는평균 4 에는 8.58±0.14로나타났고, 25 에는 8.49± 0.13로나타났으며, 시간에따른 ph 변화는나타나지않았다. [0070] [0071] [0072] [0073] 실시예 5. 덕구온천수를이용한임상시험 5-1. 덕구온천수의피부보습개선에대한임상시험덕구온천수원수를 A 제품 ( 시험제품 ), 일반정제수를 B 제품 ( 대조제품 ) 으로하여피부보습효능을평가하였다. 각군의피험자의기본정보는아래표 2 및 3에정리하였다. [0074] 표 2 A 제품 ( 시험제품 : 덕구온천수 ) 의피험자의기본정보 전체피험자수 (A 제품시험제품 ) 21 명성별남 : 0 명여 : 21 명평균연령 43.8 세 [0075] 표 3 B 제품 ( 대조제품 : 정제수 ) 의피험자의기본정보 전체피험자수 (B 제품대조제품 ) 21 명성별남 : 0 명여 : 21 명평균연령 45.2 세 [0076] [0077] [0078] 피험자선정및제외기준에따라연구에적합한피험자를선정하고, 피험자의피부상태를확인한후, 기기평가 (Corneometer) 를시행하였다. 시험부위는피험자의안면 ( 눈가 ) 부위로하였다. 피험자들의측정조건을동일하게하고자시험부위를깨끗하고마른상태를유지하였으며, 최소 30분간항온항습 (22±2, R.H. 40~60%) 이유지되는곳에서피부안정을취한후진행하였다. 보습측정은 Corneometer(CM825, Courage and Khazaka Electronic Co., Germany) 를이용하여안면부위를측정하였으며, 3개의값을이용해평균값을구하였다. 측정은제품사용전 (0주, 0w), 제품사용 2주후 (2w), 제품사용 4주후 (4w) 에실시하였다. Corneometer는피부에접촉하는 probe를통해전달되는전류의정전부하용량 (capacitance) 계측으로이루어진다. 수분의함량과정전부하용량은서로비례하는성질이있어수분 ( 보습량 ) 이높을수록측정수치가높아지며, 측정계수는 arbitrary unit(a.u.) 이다. 통계분석은두군간의비교를위해독립검정 (independent t-test) 법으로분석하였다. 모든통계결과는생물학적통계분석에서가장많이사용하는유의차 5%(p<0.05) 일때통계적유의성이있다고간주하였으며, 통계분석은 SPSS 18.0 software를사용하였다. Corneometer를이용한피부보습측정결과는표 4 및표 5에정리하였다. 표 4-9 -

10 [0079] A 제품 ( 시험제품 : 덕구온천수 ) 의피부보습측정결과 피험자 No. 0w 2w 4w ( 단위 :A.U.) 평 균 표준편차 [0080] 표 5 B 제품 ( 대조제품 : 정제수 ) 의피부보습측정결과 피험자 No. 0w 2w 4w ( 단위 :A.U) 평 균 표준편차

11 [0081] [0082] [0083] [0084] [0085] [0086] [0088] [0089] [0090] [0091] [0092] [0094] [0095] [0096] 피부보습변화량 (A.U.) Corneometer로측정한피부보습변화량 (A.U.) 을도 8에그래프로나타내었다. 피부보습변화량 = 사용후에측정한피부보습측정결과 -사용전의피부보습피부보습측정결과, A 제품 ( 시험제품 : 덕구온천수 ) 은사용전 (0주) 76.60A.U., 제품사용 2주후 77.58A.U. 및제품사용 4주후 78.49A.U로나타났으며, B 제품 ( 대조제품 : 정제수 ) 은사용전 (0주) 76.48A.U. 에서제품사용 2주후 76.92A.U. 및제품사용 4주후 76.95A.U. 로나타났다. 따라서, 제품사용후 A 제품 ( 시험제품 : 덕구온천수 ) 에서피부보습에변화가있음을확인할수있었으며, A 제품은사용후 4주후 B 제품 ( 대조제품 : 정제수 ) 과비교하여통계적으로유의한수준의피부보습개선효과를나타내는것을알수있었다 (p<0.05) 피부보습개선율 (%) 시험제품에대한피부보습개선율 (%) 은피부보습변화량을각각구하여사용전에대한피부보습개선율 (%) 을산출하였으며, 그결과는도 9에나타내었다. 피부보습개선율 (%)=( 피부보습변화량 / 결과사용전의피부보습측정결과 ) 100 그결과, A 제품 ( 시험제품 : 덕구온천수 ) 제품은제품사용전 (0주) 과비교하여, 제품사용 2주후 1.55%, 및제품사용 4주후 2.71% 의보습개선율을확인하였다. 결론적으로시험제품사용전후에따라피부보습에변화가있음을확인할수있었다. 이상의결과로 " 덕구온천수 " 은 " 정제수 " 에비하여통계적으로유의한수준의피부보습개선효과가있는것으로확인되었다 (p<0.05) 피부자극테스트피험자의기본정보는덕구온천수의피부보습개선에대한인체적용시험병행하여실시하였으므로, 표 2 및표 3 와동일하다. 배포된시험제품을사용방법에따라 2주및 4주동안사용한피험자를대상으로피부자극평가와기기평가 (Corneometer) 를병행하여효과를평가하였다. 그리고제품사용 4주후에각각피험자를대상으로시험제품에대하여일반적인평가 ( 사용감 ), 효능성 ( 피부보습개선효과등 ) 평가및호감도에대한평가를설문조사하였다. 시험제품에대해이상반응인홍반 (Erythema), 부종 (Edema), 인설 (Scaling), 가려움 (Itching), 자통 (Stinging), 작열감 (Burning), 뻣뻣함 (Tightness), 따끔거림 (Prickling) 이나다른이상반응이발생하는지의존재여부를면밀히관찰하고피부이상반응이나타날시심한정도에따라등급을표시하고이에대한검사소견을작성하였다. 방문하는날이아니더라도시험에더이상참가할수없게되는경우는본인의서명이첨부된 " 시험참가포기동의서 " 를쓰도록하였다. 이상반응여부및등급분류표 (Adverse grading) 는다음과같다. [0097] 표 6 0:none( 이상반응없음 ), 1:mild, 2:severe, 3:very severe( 심각한이상반응 ) Erythema Edema Scaling Itching Stinging Burning Tightness Prickling 홍반 부종 인설 가려움 자통 작열감 뻣뻣함 따끔거림 [0098] 또한, 실험결과시험제품사용후연구자에의한육안평가에서피부이상반응은관찰되지않았다. [0099] 표 7 피험자의피부자극평가에대한결과 홍반 부종 인설 가려움 자통 작열감 뻣뻣함 따끔거림 2주후 주후

12 [0100] [0101] [0102] [0103] [0104] [0105] [0106] [0108] [0109] 5-3. 피부장력강화실험피험자는만 30세에서 45세의성인여성 20명을대상으로 2주간시험을수행하였으며중도탈락자는없었으므로총참여피험자는 20명이다. 피험자들의측정조건을동일하게하고자시험부위는깨끗하고마른상태를유지하며최소 30분간항온항습 (22±2, R.H. 40~60%) 이유지되는곳에서피부안정을취한후진행하였다. 제품사용전, 시험부위세정후 30분간피부안정을취한다음시험부위의사진촬영및경피수분손실량 (TEWL) 측정후 SLS(Sodium Lauryl Sulfate) 1% 를함침한 Chamber를시험부위에 24시간동안부착하였다. 매방문시마다 Digital Camera(CANON EOS 7D, JAPAN) 로시험부위인상완부를촬영하였다. 시험부위에부착된 Chamber를제거한후시험부위의상태를확인하였다. 각질층의제거가제대로되었으면, 사진촬영및 Tewameter를이용하여시험부위경피수분손실량 (TEWL) 을측정하고, 각질층의제거가부족하다고판정이되면추가적으로새로운 Chamber를부착하며추후에시험부위를재확인후경피수분손실량 (TEWL) 을측정하였다. 측정을끝낸피험자들에게시험제품의사용법에대해설명하고시험제품을분배하면서하루에 2회씩사용하도록당부하였다. 제품사용 1주, 7일 ±1 후에는, 시험제품을사용방법에따라사용한피험자를대상으로피부자극평가후, 사진촬영및경피수분손실량 (TEWL) 측정을하여피부장벽강화효과를평가하였다. 제품사용 2주, 14일 ±1 후에는, 시험제품을사용방법에따라사용한피험자를대상으로피부자극평가후, 사진촬영및경피수분손실량 (TEWL) 측정을하여피부장벽강화효과를평가하였다. 그결과, 경피수분손실량 (TEWL) 개선율은제품사용 1주후에제품사용부위에서 91.72%, 미사용부위 96.79% 로, 제품사용 2주후에제품사용부위에서 90.37%, 미사용부위 94.92% 로나타났다 ( 도 10). 제품사용부위와미사용부위의개선율을비교한결과, 제품사용부위에서제품사용 2주후에통계적으로유의한수준의장벽강화효과를나타내었다 (p<0.05). 이상의결과로덕구온천수는피부장벽강화에도움을주는것으로확인되었다 (p<0.05). 실시예 6. 화장품제조조성물 6-1. 덕구온천수함유샴푸조성물 [0110] 한글성분명 함량 % 기능 INIC 온천수 보습 Onsen-Sui 프로방스장미꽃수 5 보습 Rosa Centifolia Flower Water 키토올리고산 0.05 피막형성제모발강화 Chitosan 폴리쿼터 0.5 점증제 Polyquaternium-10 알란토인 0.1 보습, 재생 Allantoin EDTA-2NA 0.03 산도조절 Disodium EDTA 데실글루코사이드 20 계면활성제 Decyl Glucoside 라우릴글루코사이드 19 계면활성제 Lauryl Glucoside 소듐코코실글루타메이트 3 계면활성제 Sodium Cocoyl Glutamate 디소듐라우레스설포석시네이트 15 계면활성제 Disodium Laureth Sulosuccinate 코카미도프로필베타인 6 계면활성제 Mitaine CA 글리코디스테라이트 1 점증제 Glycol Distearate Micopol CME 5 점도증가 Cocamide MEA 디메치콘 2 실리콘오일 Dimethicone 구연산 0.1 산도조절 Citric Acid 소듐시트레이트 0.1 산도조절 Sodium Citrate 1,2-헥산디올 0.06 용제방부제 Hexanediol 사향장미잎오일 0.05 향, 보습 Rosa Moschata Oil 케라스젠 0.06 피부컨디셔닝 Canavalita gladiata 알로에베라잎추출물 0.06 보습 Aloe Barbadensis Leaf Extract 마치현추출물 0.06 피부보습제 Portulaca Oleracea Extract 하이드롤라이즈드콜라겐 0.06 피부컨디셔닝제 Hydrolyzed Collagen 표

13 [0111] 6-2. 덕구온천수함유미스트조성물 [0112] 한글성분명 함량 % FOUNCTION INIC 온천수 to 100 보습 Onsen-Sui 프로방스장미꽃수 30 보습 Rosa Centifolia Flower Water 소듐하이알루로네이트 3 피부컨니셔닝제 Sodium hyaluronate 1,2-헥산디올 2 용제방부제 Hexanediol 하이드롤라이즈드콜라겐 0.5 피부컨디셔닝제 Hydrolyzed Collagen 마치현추출물 0.5 피부보습제 Portulaca Oleracea Extract 로즈에센스향료 0.5 Rose perfume 키토올리고당 0.5 피막형성제모발강화 Chitosan 표 9 [0113] 6-3. 덕구온천수함유비누조성물 표 10 [0114] 성분명 함량 % FOUNCTION INIC NO TEA 비누베이스 87.9 비누베이스 온천수 10 보습 Onsen-Sui 소듐하이알루로네이트 1 보습 Sodium hyaluronate 로즈힙오일 1 보습 로즈에센스향료 0.1 Rose perfume 키토올리고당 0.02 항균피부강화 Chitosan 도면 도면

14 도면 2 도면 3 도면

15 도면 5 도면 6 도면

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17 도면 10 심사관직권보정사항 직권보정 1 보정항목 발명( 고안 ) 의설명 보정세부항목 [0023] 변경전 총중량을기준으로 50%(v/v)~100%(v/v) 의양으로 변경후 총부피를기준으로 50%(v/v)~100%(v/v) 의양으로 직권보정 2 보정항목 발명( 고안 ) 의설명 보정세부항목 [0023] 변경전 총중량을기준으로농축물을 0.5~50%(v/v) 의양으로 변경후 총부피를기준으로농축물을 0.5~50%(v/v) 의양으로 직권보정 3 보정항목 청구범위 보정세부항목 제7 항 변경전 총중량을기준으로 0.5 내지 50%(v/v) 로 변경후 총부피를기준으로 0.5 내지 50%(v/v) 로

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