요약문 1. 제목 : 일주기리듬및생체시계연구분야기술조사연구 2. 연구의목적및필요성 1990년대후반포유류에서생체시계유전자들이동정된후, 일주기생체리듬의분자세포생물학적인연구가 10여년간집중적으로이루어졌는데, 분자생체시계에대한이해가심화되고, 그기능적중요성이알려지면서 2000년

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1 연구책임자 : 고려대학교손기훈 공동연구원 : 연세대학교정호성 공동연구원 : 경북대학교정종화

2 요약문 1. 제목 : 일주기리듬및생체시계연구분야기술조사연구 2. 연구의목적및필요성 1990년대후반포유류에서생체시계유전자들이동정된후, 일주기생체리듬의분자세포생물학적인연구가 10여년간집중적으로이루어졌는데, 분자생체시계에대한이해가심화되고, 그기능적중요성이알려지면서 2000년대이후실용화연구가태동함. 특히일주기분자생체시계가현대산업화사회에서우리나라를포함한선진국을중심으로크게문제가되고있는뇌질환, 대사성질환, 심혈관계질환, 종양성질환, 염증성질환등에대한신약분자표적이될수있다는증거가속속나오면서더욱각광을받고있음. 일주기분자생체시계를기반으로하는융합및실용화연구는최근크게각광을받기시작한분야이며, 특히신약개발이주로선진국의대형제약회사나중점연구소를중심으로진행되기때문에아직공개된기반자료가매우부족함. 따라서통상적인공개정보수집외에도전문가자문회의및핵심연구진방문인터뷰등의방법을통하여자료를확보하는방안이필요함. 3. 연구의내용및범위 일주기생체시계분자네트워크에대한이해를기반으로하는일주기성질환발병기전연구현황 일주기생체시계출력경로에대한다중오믹스연구현황 분자생체시계를직접적인분자표적으로하는일주기생체리듬제어물질개발및실용화동향 기술 / 분야명 일주기분자 생체시계 정의및범위 정의 : 분자 세포수준에서자발적인일주기리듬을생성하는 전사 - 해독피드백분자네트워크

3 일주기성 질환 범위 생체시계단백질들의전사후 / 해독후조절기전규명과신규조절인자발굴연구 생체시계하위유전자 (Clock-controlled gene, CCG) 의 cis-element 동정및전사조절기전연구 일주기생체시계모사를위한시스템 / 합성생물학연구 정의 : 일주기리듬이상을동반하거나, 일주기리듬교란이병인이되는주요질환 범위 생체시계유전자돌연변이생쥐의표현형분석을통해직접적인연관성이입증된주요질환 수면장애, 정서장애, 대사성질환, 심혈관계질환, 종양성질환등생체시계제어화합물의주요적응증으로평가되는질환 정의 : 일주기적기능연구를위한다중오믹스분석기술 범위오믹스기반 CCG 발현분석을위한오믹스기반시스템생물학연구일주기출력 일주기출력경로빅데이터획득, 분석및데이터베이스구축경로분석기술 데이터베이스활용기술연구 : 신규표적동정, Drug repositioning 연구등 생체시계 제어화합물 정의 : 일주기분자생체시계구성단백질을표적으로하는저분자화합물 범위 생체시계단백질결합화합물개발연구 CRY 및 REV-ERB 계열의효현제 / 길항제개발연구 생체시계조절화합물의산업화동향 4. 정보조사결과 일주기분자생체시계분야주요연구소및연구집단의소속연구인력분포를분석하며, 선도연구자에대한개별접촉등을통해기술개발경로및최신연구현황을분석하고, 연구자네트워크를구축함. 해외전문학술대회참석을통한기술정보수집 : 2015년중개최된일주기리듬및생체시계연구분야의전문학술회의 ( 세계시간생물학학술대회, 시간생물학아시아포럼, Cold Spring Harbor Asia 학술대회 ) 와약화학분야전 3

4 문학술대회 (Pacifichem 및미국화학회춘계학술대회 ) 에참석하여핵심연구팀과직접접촉하여기술정보를수집함. 선도연구그룹연구실방문 : 각종학술대회방문기간중현지선도연구진의연구실을직접방문하여현장정보를수집하고, 보다긴밀한논의를진행하였으며, 이와별도로 2016년 2월중, 일주기생체시계연구분야의세계적권위자로인정받고있는일본도쿄대 Hiroki Ueda 교수및교토대 Hitoshi Okamura 교수연구실을직접방문하여연구진행현황에대한미발표정보와향후연구추진계획정보를획득함. 일주기분자생체시계융합기술및신약개발정보의수집 분석 : 문헌및데이터베이스검색을통하여기발표된논문, 특허, 데이터베이스등의자료를분석함. 최근일주기생체리듬연구에서 1인간질환을중심으로한일주기생체시계출력경로및제어기술개발연구와 2최신오믹스분석기법을이용한시스템생물학적연구가부각되고있다는점을고려하여관련분야의동향을중점적으로조사함. 국내외관련연구진활용 : 국내외일주기리듬및생체시계연구진뿐만아니라오믹스연구및각종일주기성질환전문가들을활용하여기술동향분석을수행하고, 국내생체시계연구의저변확대를추진함. 5. 정보조사의활용계획 일주기생체시계활용기술분야국가연구개발사업기획활용 해외연구개발수준분석및국내원천기술개발가이드라인자료 수면-일주기생체리듬유망연구개발분야발굴 국내연구진에일주기생체리듬분석기술및오믹스 DB 정보제공 일주기성질환및오믹스연구그룹을중심으로국내유관분야연구진에최신연구정보를제공 일주기생체시계활용분야의전략적국제공동연구추진 해외핵심연구진과의네트워크구축을통한전략적공동연구추진 국제생체리듬연구자집단에적극참여함으로써장기적인관점에서지속적이고, 안정적인협력네트워크를구축

5 목차 제 1 장서론 1 1. 연구의필요성 1 2. 연구의목적 1 3. 연구내용및범위 1 제 2 장국내외기술개발현황 3 1. 일주기생체리듬과일주기성질환 3 2. 일주기생체리듬 / 생체시계논문 특허현황 11 제 3 장연구내용 일주기생체리듬분야주요연구동향 일주기성질환연구동향 : 대사성질환 일주기성질환연구동향 : 뇌질환 일주기분자생체리듬의시스템생물학적연구 분자생체시계제어기술개발현황 일주기생체리듬분야산업화동향 일주기생체리듬분야선도연구진동향 99 제 4 장연구목표달성도및국내파급효과 114 제 5 장연구결과의활용 116 제 6 장참고문헌 117

6 제 1 장서론 1. 연구의필요성 1990년대후반포유류에서생체시계유전자들이동정된후, 일주기생체리듬의분자세포생물학적인연구가 10여년간집중적으로이루어졌는데, 분자생체시계에대한이해가심화되고, 그기능적중요성이알려지면서 2000년대이후실용화연구가태동함. 특히일주기생체시계가현대산업화사회에서우리나라를포함한선진국에서크게문제가되고있는뇌질환, 대사성질환, 심혈관계질환, 종양성질환, 염증성질환등에대한신약분자표적이될수있다는생각이확산되면서더욱각광을받고있음. 일주기분자생체시계를기반으로하는융합및실용화연구는최근크게각광을받기시작한분야이며, 특히신약개발이주로선진국의대형제약회사나중점연구소를중심으로진행되기때문에아직공개된기반자료가매우부족함. 따라서통상적인공개정보수집외에도전문가자문회의및핵심연구진방문인터뷰등을통하여자료를확보하는방안이필요함. 2. 연구의목적 일주기리듬및분자생체시계분야최신동향수집및국내대응전략제안 선진국의일주기리듬활용기술및일주기성질환연구현황분석 국내관련연구개발현황파악및대응전략수립 선진기술도입을위한국제협력네트워크구축방안강구 국내관련연구 산업의수월성확보를위한선진기술자료확보 3. 연구의내용및범위 일주기생체시계분자기전및일주기성질환발병기전연구현황분석 일주기생체시계출력경로에대한다중오믹스연구현황분석 일주기리듬제어물질개발및실용화동향조사 1

7 기술 / 분야명 일주기분자 생체시계 정의및범위 정의 : 분자 세포수준에서내재적인일주기리듬을생성하는전사-해독피드백분자네트워크 범위 생체시계단백질들의전사후 / 해독후조절기전규명과신규조절인자발굴연구 생체시계하위유전자 (Clock-controlled gene, CCG) 의 cis-element 동정및전사조절기전연구 일주기생체시계모사를위한시스템 / 합성생물학연구 정의 : 일주기리듬이상을동반하거나, 일주기리듬교란이병인이되는주요질환 범위일주기성질환 생체시계유전자돌연변이생쥐의표현형분석을통해직접적인연관성이입증된주요질환 수면장애, 정서장애, 대사성질환, 심혈관계질환, 종양성질환등생체시계제어화합물의주요적응증으로평가되는질환군 오믹스기반 일주기출력 경로분석기술 정의 : 일주기적기능연구를위한다중오믹스분석기술 범위 CCG 발현분석을위한오믹스기반시스템생물학적연구 일주기출력경로빅데이터획득, 분석및데이터베이스구축 데이터베이스활용기술연구 : 신규표적동정, Drug repositioning 연구등 정의 : 일주기분자생체시계구성단백질을표적으로하는저분자화합물생체시계제어 범위화합물 생체시계단백질결합화합물개발현황 CRY 및 REV-ERB 계열에대한효현제 / 길항제개발현황 생체시계조절화합물의산업화동향 2

8 제 2 장국내외기술개발현황 1. 일주기생체리듬과일주기성질환연구 가. 일주기생체리듬과분자생체시계 일주기생체리듬과시상하부중추생체시계 낮과밤이라는규칙적인환경의변화에진화적으로적응한결과로서생명체의수면-각성주기, 호르몬분비, 섭식행동, 생리대사및체온조절에이르기까지다양한생리, 대사, 행동학적과정은자발적으로약 24시간의주기성을나타내는데, 이를 일주기생체리듬 (circadian rhythm) 이라정의함. 포유류에서는시상하부의시신경교차상핵 (suprachiasmatic nucleus. SCN) 에존재하는페이스메이커신경세포들이낮과밤의환경변화를인식하고, 체내다른조직들의일주기위상을동기화하는중추생체시계로서의역할을담당함 (Son et al., 2011) [ 그림 1]. 그림 1. (A) SCN 중추생체시계에의해촉발되는수면-각성주기및생리, 대사, 행동의일주기생체리듬. (B) 일주기분자생체시계의작동원리. CLOCK:BMAL1 이합체와그에대한억제인자인 PERs/CRYs 가중추고리를형성하며, RORs/ REV-ERBs 가안정화 ( 보조 ) 고리를형성함. 이들이각세포에존재하는하위기능유전자군의발현을조절함으로써개체수준의일주기리듬을생성함. 3

9 일주기리듬의발생및유지에는세포수준에서존재하는분자생체시계가핵심적인역할을담당하는데, 생체시계분자네트워크는전사인자인 CLOCK:BMAL1 이합체와그에대한억제인자인 PERIODs (PERs) 및 CRYPTOCHROME (CRYs) 단백질이구성하는생체시계중추분자고리와핵수용체인 REV-ERBα (NR1D1) 와 ROR이구성하는안정화고리로구성됨. 각각의세포들이가지는분자리듬이세포내에서전사, 해독및해독후조절단계를통해나름대로약 24시간의일정한주기를생성하는데, SCN 중추생체시계가그외의세포들이가지는국부분자생체시계의위상을동기화함으로써개체수준에서조화된일주기리듬을만들어내는위계적인구조가일주기생체리듬조절시스템의핵심임. 일주기생체시계의작동원리와시스템생물학적연구 단일세포수준에서기능유전자네트워크의발현을분자생체시계가일주기적으로동기화 (synchronization) 하며, 동시에 SCN의중추생체시계가하위국부생체시계를자신의위상에동기화하는위계적인조절구조가일주기생체리듬의근간이라는사실이규명되면서그분자기전에대한시스템생물학적연구가크게각광받고있음. 유전자발현뿐만아니라그결과로생성되는단백질및대사산물역시일주기적으로조절된다는사실로부터전사체 (transcriptome), 단백체 (proteome), 후성유전체 (epigenome) 및대사체 (metabolome) 를아우르는다중오믹스분석과그결과로얻어지는방대한정보에대한생물정보학적분석이일주기리듬연구분야의핵심이슈로떠오르고있음. 이에따라분자수준에서생리 / 행동을아우르는일주기리듬을통합적으로이해하고자하는다중오믹스연구의일종인 Circadiomics 라는학문분야가새롭게태동하고있음 (Eckel-Mahan et al., 2012; Partel et al., 2012). 특히후성유전체학 (epigenetics) 의발달에힘입어분자생체시계에의한다수유전자의통합조절기전에대한연구가활발히진행되면서, 반대로역동적인유전자발현의후성유전학적조절기전에대한생물학적이해의폭을크게신장함 (Koike et al., 2012; Vollmers et al., 2012). 생체시계단백질에대한구조생물학적인연구역시꾸준히진행되고있는데 2010년생체시계보조고리의핵심조절인자인 REV-ERBα의구조가규명된이래 (Phelan et al., 2010), 생체시계중추고리를구성하는 CLOCK:BMAL1 이 4

10 합체 (Huang et al., 2012) 및 CRYs (Cryptochromes, Czarna et al., 2013) 등주요일주기생체시계단백질들의구조가밝혀지고있음. 이를바탕으로분자생체시계제어기술의개발및실용화연구가더욱가속화하고있음. 2011년 Nature지에나란히발표된두편의논문으로인해기존에확립된전사-해독피드백고리에기반을둔세포핵의분자생체시계와는별도로일주기리듬의동력에대한새로운분자진자가제시됨. 세포핵및전사기구를가지지않는세포인포유류의적혈구와녹조류의일종인 Ostreococcus tauri를이용한연구에서기확립된분자생체시계와는무관하게세포내대사과정및항산화단백질의산화-환원상태의일주기리듬이나타나며, 이역시세포수준에서일주기리듬을생성하는분자적인동력이된다는사실이규명됨 (O'Neill and Reddy, 2011; O'Neill et al., 2011). 미토콘드리아에의해촉발되는세포내대사과정이자체적으로일주기리듬을생성하는분자적인동인이된다는발견은수면-일주기리듬과섭식및대사조절을연결하는새로운관점을제시함. 나. 일주기생체시계와주요질환 일주기성질환 현대사회에서산업화및노령화로인해일주기생체리듬의교란요인들이급증하고있는데, 2009년 WHO에의해공인된바와같이내재적일주기리듬의교란이비만, 당뇨등의대사질환, 심혈관계질환, 면역기능약화, 만성피로증후군및암의위험요인으로서이들질환이급증하는주요원인이되고있음 [ 그림 2]. 90년대후반포유류에서생체시계유전자들이동정되고, 내재적인일주기리듬을생성하는분자생물학적기전이규명되면서, 일주기생체리듬시스템 (Circadian timing system) 이행동 / 생리 / 대사 / 에너지소비등을통합조절하는핵심조절기구라는사실이널리인정받음 (Dolgin, 2013). 그결과, 생체시계제어기술이다양한일주기성질환에대한예방, 치료제로서활용될수있을것이라는기대를받고있음. 5

11 그림 2. 일주기성질환의다양한예시 일주기생체리듬교란과대사성질환 일주기생체리듬및생체시계의기능이상과당뇨병, 비만등각종대사성질환사이의상관관계는생체시계돌연변이생쥐에서폭넓게나타나는식이 / 대사관련이상표현형을바탕으로일찍부터시사되었음 [ 그림 3]. 일주기생체리듬의이상이각종대사질환을유발하는주요병리기전으로는 SCN이만들어내는중추생체리듬과섭식 / 대사조절기구들이가지는국부생체리듬의불일치 (misalignment) 등이제안되고있음 (McHill et al., 2014). 예를들면내재적인일주기생체리듬이사라지는 Bmal1 KO, Cry1/Cry2 dko, Per1/Per2 dko 등의돌연변이생쥐모델들은공통적으로비만발생경향이강하며, 특히환경자극을통해수면-각성주기를일정하게유지시켜주더라도고지질 / 고탄수화물식이에의한비만발생에매우취약한것으로나타남 (Barclay et al., 2013; Guo et al., 2012; Paschos et al., 2012). 반대로고지질혹은고탄수화물식이를통해비만을유도할경우일주기생체리듬조절시스템의안정성이선행하여약화된다는사실이보고되기도함 (Prasai et al., 2013). 따라서다음과같은대사성질환들은현재활발히연구되고있는생체시계조절화합물의잠재적인활용대상혹은적응증으로서수면장애와더불어가장큰주목을받고있음. 6

12 그림 3. 일주기리듬의교란과식이 / 대사질환. 일주기생체시계는 1섭식, 2대사 / 에너지소비및 3지방세포증식 / 분화등의통합조절인자임. Nature 지는 2013년특집호를통해일주기리듬교란에의한비만발생의위험성을경고함. 1 식이 / 섭식장애 야간식이증후군 (Night eating syndrome) 이나폭식장애 (Binge eating disorder) 와같은섭식장애는일주기생체시계의지연에따른음식물섭취또는포만감장애에따른것으로해석할수있음. 수면-각성주기의변화에따른장애는식욕, 포만감, 음식물섭취에영향을준다고알려져있음. 즉, 일주기리듬이섭식행동에직접적인영향을줌. 따라서일주기생체시계조절화합물이일주기교란으로인한섭식장애의예방 / 치료제로사용될수있을것으로기대됨. 2 비만 일주기생체리듬은대사 / 에너지항상성에직접적인영향을주는것으로알려져있으며그매개체는특정대사효소및수송계임. 특히일주기생체시계는지질대사및지방형성과정과밀접한관계가있음. 이러한사실은동물실험뿐만아니라교대근무자및비만환자를대상으로한임상연구에서도증명됨. 7

13 ➂ 당뇨병 인슐린감수성및인슐린분비의일주기성으로인한혈당변화는췌장베타세포의생체시계에의해조절되는것으로알려져있음. 최근연구결과에따르면 Cry1/Cry2 녹아웃쥐에서인슐린분비장애가확인됨 (Ikeda et al, 2007). 뿐만아니라 CRY는 camp signaling 및 hepatic gluconeogenesis를매개함 (Zhang et al, 2010). 따라서일주기생체시계조절화합물은인슐린감수성및인슐린분비조절을통한당뇨예방 / 치료제로사용될수있음. 일주기생체시계와뇌질환 각종뇌질환에서많은경우수면장애가동반된다는점은잘알려져있었으나, 과거에는이를 2차적인증상으로보는시각이우세하였음. 하지만수면및일주기리듬의취약성이이들주요질환의발병및진행과정에서핵심적이라는주장이점차지지를받고있음. 수면제어및평가기술의비약적인발전과더불어일주기생체시계와관련된다양한모델동물과분석기법이확립되면서, 일주기리듬장애와뇌질환과의직접적인연결고리가규명되고있음. 1 일주기리듬이상과퇴행성뇌질환 현재수면장애가노화에수반되는인지기능의저하와더불어각종퇴행성뇌질환의전조가될수있다는사실에대해서는학계의동의가모아지고있는상황임. 2009년알츠하이머병을유발하는핵심단백질로알려진아밀로이드베타 (amyloid-β) 의뇌척수액내의농도가수면-각성주기에따라일주기적으로변화하고있으며, 생쥐를대상으로한실험을통해수면부족과아밀로이드단백질의농도사이의상관관계가입증됨으로써노년층의수면장애가알츠하이머발병의전조이며, 동시에병의진행을가속화하는주요원인이될수있다는사실이밝혀짐 (Kang et al., 2009; Spiral et al., 2013). 더욱이수면의질향상이원발성알츠하이머병의발병빈도를낮추고, 병의진행을늦출가능성이최근제기되었는데 (Lim et al., 2013), 이는수면중뇌내독성대사산물을제거하는과정에서아밀로이드단백질역시제거되기때문인것으로생각됨 (Xie et al., 2013). 8

14 수면장애는알츠하이머병뿐만아니라파킨슨병이나헌팅턴병과같은퇴행성뇌질환에서도전조로나타나며, 이에따라수면장애및일주기리듬과퇴행성뇌질환의상관관계와분자생물학적기전에대한활발한연구가진행되고있음 (Costandi, 2013). 특히유전학적연구를통해일주기생체시계유전자의다형성과 SCN 중추생체시계의특성이이러한수면장애와퇴행성뇌질환의상관관계를매개하는주요인자가될수있다는증거들이꾸준히보고되고있으며, 동시에최근발견된세포내대사활성의일주기리듬역시퇴행성뇌질환의발병에핵심적인역할을담당할것으로기대됨 (Musiek et al., 2013). 2 일주기생체시계와정신질환 정서조절의일주기리듬이상이우울증, 조울증, 불안장애, 계절성기분장애등다양한형태의정서장애와중독질환의발병과깊은연관이있다는사실은주지의사실로서, 실제수면박탈이나광치료 (bright light therapy) 등일주기리듬교정요법이기분장애치료법으로임상적으로사용되고있음 (McClung, 2013). 일주기생체시계유전자의특정다형성이단극성혹은양극성기분장애에대한취약성과더불어치료제반응성과높은상관관계를보여주고있는데, 흥미롭게도수면-각성주기의일주기형 ( 저녁형 / 아침형 ) 이이들을매개하는중요한요인으로나타나고있음 (McCarthy and Welsh, 2012). 2005년정서조절및일주기리듬분야의저명연구자인텍사스대 Nestler 교수및 Takahashi 교수의공동연구팀에의해분자생체시계최상위전사인자인 CLOCK 유전자가결여된생쥐가정서 / 중독질환의유용동물모델이될수있다는주장이제기된이래, 생체시계돌연변이생쥐를이용하여수면및일주기리듬과정서조절을연결하는분자기전을규명하려는연구가활발히진행되고있음 (McClung et al., 2005). 2014년국내연구진에의해중뇌도파민신경세포가발현하는국부생체시계, 특히 REV-ERBα 단백질이일주기리듬과정서조절을연결하는핵심매개인자라는사실과함께중뇌 REV-ERBα의활성제어가정서장애의새로운치료전략이될수있다는사실이실험적으로증명됨 (Chung et al., 2014). 일주기리듬과교란과연관된기타질환 전술한뇌 / 대사질환과일주기리듬및생체시계유전자와의연관성과더불 9

15 어다음질환들역시대표적인일주기성질환으로서일주기생체시계조절화합물의잠재적인표적으로인정되고있음. 실제로 2009년 WHO에의해중요일주기성질환으로처음분류된질환은유방암을포함한종양성질환임. 1 종양성질환 일주기생체리듬교란과암의직접적상관관계는역학조사결과뿐만아니라실험적증거들에의해뒷받침됨. 생체시계를구성하는몇몇분자표적들이세포주기의조절자로알려졌으며생체시계기능장애로인한이상세포증식현상이지속적으로보고됨. 따라서생체시계조절화합물은일주기교란으로인한암의발생을억제하거나세포주기조절을통해암세포의증식을억제하는예방 / 치료제로기대되고있음. 2 면역 / 염증성질환 일주기리듬은면역체계에직접적인영향을줌. 예를들어최근 Science에발표된연구결과에따르면일주기리듬이 TH17을통해염증반응을조절함. 광주기가교란된생쥐모델에서 TH17 축적으로인한염증성장질환유사증상의발병이그증거임 (Yu et al, 2013). ➂ 심혈관계질환 동맥경화를포함한혈전질환 (Thrombotic disease) 의발병시간과일주기리듬의상관관계는오래전부터광범위하게연구되어왔음. Protein C/S, anti-thrombin factor VII, fibrinogen 등많은수의응고인자또는혈전용해인자들이일주기리듬을보인다는사실이알려져있음. 예를들어, PAI1 (plasminogen activator inhibitor type 1) level은아침일찍최고조에달하는데 (Vaughan, 2005), PAI1 유전자발현은간에서 REV-ERBα 에의해직접적으로조절됨 (Wang et al, 2006). 결국시차증후군이나수면장애와같은전형적인일주기리듬교란질환뿐 만아니라이상과같은광범위한일주기성질환들이현재활발히개발되고 있는일주기생체시계조절화합물의잠재적인적응증으로평가받고있음. 10

16 2. 일주기생체리듬 / 생체시계논문 특허현황 가. 일주기생체리듬연구분야논문현황 연구동향에대한전반적파악및동향에대한객관적접근을위하여 Thompson ISI 사에서제공하는 Web of Science 데이터베이스를이용하여분석을수행하였음. 검색을위한초기키워드로 Circadian rhythm OR Circadian clock 을설정하고, 1996~2015년동안발표된논문의총수를검색한결과, 28,458건의논문 ( 원저및종설기준 ) 발표가집계되었음 [ 표 1]. 포유류의분자생체시계가확립되기전후인 1996~2000년사이에는연간 1000 여편의일주기생체리듬관련논문이발표되었으나, 최근 5년 (2011~2015년) 동안은연간 2,000여편으로증가함. 표 1. 일주기생체리듬및생체시계연구분야논문발표수 기간 일주기리듬전체 일주기생체시계 일주기성질환 시스템생물학 생체시계제어물질 1996~2000 5,054 1,059 (20.9%) 498 (9.8%) 71 (4.5%) ~2005 5,843 2,548 (43.6%) 595 (10.2%) 159 (6.2%) ~2010 7,479 3,797 (50.8%) 1,066 (14.3%) 415 (10.9%) ~ ,082 6,172 (61.2%) 1,782 (17.7%) 600 (11.0%) 45 합계 28,458 13,576 3,941 1, 주 ) 시스템생물학분야의 % 는일주기생체시계연구논문에대한비율임 초파리의생체시계유전자가처음발견된것이 1971년이며, 꼬마선충이나애기장대등에서이미생체시계유전자가종정이되었으나, 1998년포유류의생체시계유전자가발견되기직전인 1996~1997년에발표된일주기리듬관련논문중일주기생체시계를명시한논문은 20~25% 수준이었음. 하지만포유류의 Clock 유전자가동정되고생체시계분자네트워크의작동원리가규명되었던 1998~2003년에는이비율이 40% 이상으로증가하였으며, 현재는 60% 수준에이름. 이는전통적으로일주기생체리듬의신경생리학혹은신경내분비학적연구가 11

17 중심이던시대에서분자세포생물학적연구로패러다임이변화하였음을단적 으로보여주는통계임. 기초기전연구에서활용기술개발연구로의이행 주지할만한사실은일주기생체시계분자네트워크에대한이해와함께일주기성질환의발병기전연구가크게증가한것임. 수면-각성주기이상등을통해일주기성질환에대한인식은생체시계유전자발견이전부터있었으나, 90년대후반일주기생체리듬연구중 10% 이하가관련질환에집중한논문이었으나 2010년대에들어서는이비율이 17.7% 로증가함. 분자생체시계가전사조절네트워크에기반을두고있기때문에이에대한시스템생물학적연구는예상가능함. 실제로생체시계에대한오믹스기반의시스템생물학적연구는생체시계유전자발견전후로 4~5% 수준이었으나최근 5년동안에는 11% 로그비율이급증하였으며, 각종오믹스연구기법의비약적발전과빅데이터분석및데이터베이스구축 활용기술의발전에힘입어향후더욱증가할것으로예상됨. 일주기분자생체시계가동정된후그활성을조절하는제어기술개발연구가태동하였음. 초창기에는생체시계단백질의해독후조절과정에관여하는각종신호전달경로를표적으로하는제어기술개발연구가이루어졌으나, 2006~2008년사이에생체시계단백질들의구조가밝혀지고, 그중일부단백질들에대한소형결합화합물들이동정되면서생체시계단백질의직접적인효현제 / 길항제를개발하는연구가활성화됨. 2007년최초로일주기성핵수용체인 REV-ERBs의효현제가개발되면서관련분야연구가크게활성화되고있으나최근 5년동안연간논문발표건수가 10여편에머무르는등여전히태동기라할수있음. 나. 국내연구진에의한일주기생체리듬논문발표현황 미국, 유럽, 일본등일주기생체리듬연구의선진국들과비교할때국내연구진의규모는작으나 (PubMed 기준최근 5년이내 160 여편 ), 최근질적으로국제경쟁력이있는우수연구성과들을도출하여 Cell, Nature, Mol Cell, Gene Dev, PNAS USA 등의선도학술지에논문을발표하고있음. 다른뇌연구분야와유사한양상으로일주기생체시계의조절과정에대한 12

18 분자세포생물학적기전연구는비교적경쟁력이있는분야임. 특히신규생체시계조절인자발굴연구및생체시계단백질의해독후조절기전 ( 인산화, 메틸화, 당화등 ) 분야에서우수성과들을도출하고있으나, 기능연구및활용기술개발로이어지는경우가적음. 분자생물학적기전연구분야와달리일주기성생리, 대사및수면-각성주기조절등일주기생체리듬의생리적기능연구분야는취약한편임. 이는국내연구진에의한수면-일주기생체리듬통합연구및실용화연구가취약한주요원인중하나라사료됨. 수면및일주기리듬분야에서국내연구진에의해수행된최근 5년이내연구중주목할만한성과들은다음과같음 [ 표 2]. 표 2. 국내연구진에의해발표된주요연구결과 대표그림 주요내용 세포내대사활성의일주기리듬조절기전규명 연구내용 : 미토콘드리아내산화-환원활성의일주기적조절기전을규명 연구책임 : 이서구 ( 연세대 )/ 길인섭 ( 연세대 ) 게재연월 : 2015년 8월 게재지 : Molecular Cell 정서, 기분의일주기리듬조절핵심단백질규명 : REV-ERBα 연구내용 : 일주기생체시계와정서조절의분자적연결고리규명을통해정서장애치료제신규표적을제시 연구책임 : 김경진 ( 서울대 )/ 손기훈 ( 고려대 ) 게재연월 : 2014년 5월 게재지 : Cell 신규생체시계단백질저해제개발 연구내용 : 생체시계중추고리의억제성인자인 CRYPTOCHROME의저해제를세계최초로개발함 연구책임 : 김경진 ( 서울대 )/ 서영거 ( 서울대 ) 게재연월 : 2014년 3월 게재지 : ACS Chemical Biology 13

19 일주기리듬을조절하는신규인자발견 : LSD1 연구내용 : 생쥐의뇌와간에존재하는 LSD1 단백질의인산화가일주기적으로조절되는데, 이것이일주기리듬의유지및재조정에필수적임 연구책임 : 백성희 ( 서울대 ) 게재연월 : 2014년 3월 게재지 : Molecular Cell 스테로이드호르몬합성시발생하는활성산소의작동원리규명 연구내용 : 대표적인일주기성호르몬인부신글루코코르티코이드의합성과정에서활성산소와이를제거하는항산화단백질의상호작용원리와일주기적조절규명 연구책임 : 이서구 ( 이화여대 ) 게재연월 : 2012년 6월 게재지 : Molecular Cell 일주기생체시계의속도를조절하는신규기전규명 : O-GlcNAc 수식화 연구내용 : 생체시계의속도조절기전으로서생체시계단백질의 O-GlcNAc 수식화의중요성을규명함으로써신진대사와일주기리듬사이의신규연결고리규명 연구책임 : 김은영 ( 아주대 )/ 조진원 ( 연세대 ) 게재연월 : 2012년 3월 게재지 : Genes & Development 다. 일주기생체리듬분야특허동향 핵심어로 Circadian rhythm OR Circadian clock 을이용하여 1차특허검색을수행함. 이후결과내검색을위한하위핵심어로서다음과같은분류를사용함. 1 수면및수면장애 : Sleep OR Sleep Disorder 2 대사성질환 : Metabolic disorder OR Appetite OR Obesity OR Diabetes 14

20 3 퇴행성뇌질환 : Neurological Disease OR Neurodegenerative Disease OR Alzheimer OR Parkinson OR Huntington 4 정신질환및인지 / 정서기능 : Psychiatric Disorder OR Psychological Disorder OR Mood OR Cognition 5 종양성질환 : Oncology OR Cancer 6 심혈관계질환 : Cardiovascular OR Hypertension OR Angina OR Cardiac arrest OR Myocardial Infarction 7 생체시계제어저분자화합물 : Small Molecule 미국, 유럽, 일본을중심으로국내기관에의해등록된특허를조사하여국 가별로분류함 [ 표 3]. 표 3. 일주기생체리듬및생체시계연구분야특허등록수 검색어 / 분야 미국 유럽 일본 한국 일주기생체리듬전반 (22.8%) 811 (12.6%) 224 (3.48%) 수면및수면장애 (24.4%) 20 (1.47%) 10 (0.73%) 대사성질환 (22.1%) 57 (1.57%) 28 (0.77%) 퇴행성뇌질환 (24.3%) 185 (5.56%) 29 (0.87%) 정신질환및인지 / 정서 (22.9%) 45 (1.55%) 38 (1.30%) 종양성질환 (20.4%) 103 (3.46%) 35 (1.17%) 심혈관계질환 (20.6%) 62 (2.07%) 27 (0.90%) 저분자화합물 (14.6%) 3 (0.44%) 1 (0.15%) 주 ) % 는미국소재기관에의해등록된특허에대한비율임. 대부분의경우처럼미국소재기관에서출원된특허가모든검색어에서가장많으며, 유럽의경우정량적으로는미국의 20~25% 수준이지만, 전반적으로미국대비상대적으로일정한비율을보이고있음. 다만유럽의경우도타분야에비해서신생분야인저분자화합물개발은미국대비비율이다소낮게나타남. 이는생체시계조절저분자화합물개발연구를미국의캘리포니아, 텍사스, 플로리다소재의일부대학교및연구소에서주도하기때문에나타난결과로사료됨. 15

21 일본의경우일주기생체리듬전반에서는미국의 12.6% 수준의특허등록률을보이고있으나, 일주기성질환및저분자화합물분야에서는극히낮은비율을보이고있음. 이러한현상은일본의일주기리듬실용화연구를주도하고있는일본고등기술연구원 (AIST), 홋카이도대학교, 도쿄대학교등이생체신호분석기술등모니터링기술이나신규리포터개발등의기반기술개발에치중하기때문에나타난현상임. 또한일본의경우는인간질환과더불어수산업분야활용을위한해양생물연구가큰비중을차지하는것도한가지이유임. 전술한바와같이우리나라의경우는아직일주기생체리듬연구가소수의생체시계전문연구자들에의해서만이루어지는경향이있으며, 수면장애를연구하는일부임상연구자를제외하고는주요질환연구자들의관심이극히부족한실정임. 그결과일주기생체리듬실용화연구가선진국에비해극히저조한상태에머무르고있음. 분자생체시계를표적으로하는저분자화합물개발연구의태동 2000년대중반에보고된 Longdaysin, LH846 등, 생체시계를표적으로하는초기화합물조절제들은분자생체시계의일주기활성을측정하는 High Throughput Screening (HTS) 을통해도출되었고실질적인분자표적은주로 GSK-3β, CKI, AMPK 등의인산화효소들이었음. 중추분자생체시계의작동원리에대한이해가심화되면서이를직접적인표적으로하는일주기생체시계조절화합물의개발가능성이대두되었음. 주지한바와같이일주기생체리듬의교란및그로인한수면장애는다양한주요질환의병인인데, 일주기생체시계단백질중특히 CRY 및 REV-ERBα (NR1D1) 가현재주된분자표적이되고있음. 일주기생체시계조절연구가심화되면서선구적인일주기생체시계조절화합물들이 2000년대후반부터개발되고있음. 생리활성조절을위한화합물개발단계상기초연구의성과가생리학적작용연구및유효물질발굴-선도물질개발로이어지고있는태동단계임. 중추일주기생체시계단백질을직접적으로표적으로하는국내외특허는다음과같음 [ 표 4]. - 생체시계중추고리의핵심조절인자인 CRY를표적으로하는 KL001 유도체 (CRY 활성제, 미국 USC/ 스크립스연구진개발 ) 와 KS15(CRY 저해제, 본연구 16

22 자를포함한국내연구진개발 ) 에대한특허가비만, 당뇨, 대사장애, 녹내장, 수면장애, 기분장애, 암조절등에대한내용으로각 1건씩발표되어있음. - 생체시계보조고리핵심인자 NR1D1의리간드로알려진 GKS4112 유도체 (NR1D1 효현제, 다국적제약사인 GlaxoSmithKlein (GSK) 사개발 ) 에대한특허는염증성질환조절에대한내용으로 1건 PCT 출원되어있음. - 이와는별도로 NR1D1 분자표적활용관련특허로는심혈관계질환, 피부질환, 내분비질환, 대사성질환, 혈액질환, 염증성질환, 호흡기질환, 근골격계질환, 신경성질환, 비뇨기질환을대상에대한내용으로 1건 PCT 출원되어있음 (WO ). 표 4. 주요생체시계조절저분자화합물특허현황물질형태표적국가 ( 출원 / 등록번호 ) 주요적응증 KL001 및유도체 KS15 저분자화합물 CRY1/2 미국 (US ) 캐나다 (CA ) 저분자화합물 CRY1/2 대한민국 ( 제 호 ) 비만, 당뇨등대사장애와녹내장등수면장애, 기분장애, 대사성질환, 암등 GSK4112 및유도체 저분자 화합물 NR1D1 PCT(WO ) 염증성질환등 - 특히 KL001 계열의화합물들은미국 Salk 연구소의 Ronald Evans 박사, Texas Southwestern Medical Center의 Joseph Takahashi 박사와 Masashi Yanagisawa 박사, 벤처캐피탈회사인 Bay City Capital 등이 2008년공동으로창업한일주기생체시계전문벤처회사인 Reset Therapeutics사로기술이전되었는데, KL001 개발자인 Steve Kay 교수와 Peter Schultz 교수역시이사진으로참여하고있으며, 최근 KL001 유도체인 SHP-1의전임상개발에성공한것으로알려졌음. SHP-1의적응증은당뇨, 비만, 대사성질환, 쿠싱병, 녹내장등임. - 또한당초대형제약사에의해개발된 NR1D1 효현제의경우도 2015년전임상시험을성공적으로마무리한것으로알려져있는데, GSK의일주기생체시계조절제는비만등대사성질환을핵심적응증으로하며, 동시에만성폐쇄성폐질환 (COPD), 폐기종, 낭성섬유종, 급성순환기장애등염증성질환에도효과가있는것으로알려짐. 17

23 제 3 장연구내용 1. 일주기생체리듬분야핵심기술동향 가. 일주기생체리듬전문학술대회현황 2015년은 4년만에유럽생체리듬학회 (European Biological Rhythm Society, EBRS) 및국제시간생물학회 (World Congress of Chronobiology, WCC) 의합동학술대회와시간생물학아시아포럼 (Asian Forum on Chronobiology 2015) 이개최되었고, 미국 Cold Spring Harbor Asia Conference 시리즈에서 생체리듬 (Biological Rhythms) 을주제로한학술대회를개최하는등일주기생체리듬분야의최신연구동향에대한체계적이고효율적인정보수집의적기였음. 본연구책임자는상기 3 건의일주기생체리듬전문학술대회에모두심포 지움연자로초청되었기에이를통해최신기술동향정보수집과더불어본 분야의해외선도연구자들과활발한인적교류를수행함. 유럽생체리듬학회와국제시간생물학회합동학술대회 (EBRS and WCC Meeting 2015, 2015년 8월 2~6일, 영국맨체스터개최 ) 여명의연자들이본학술대회를통해미출판성과를포함한최신연구결과를발표하였음. 본사업책임자역시초청연자로서일주기생체시계와기분장애의연결고리를규명한최신연구결과를소개함. 18

24 2 특히개최장소의특성상초청연자중 70% 이상이유럽지역의연구자들이었는데, 유럽연구자들이상대적으로강점을보이는생리학, 내분비학및신경과학의전통을바탕으로일주기생체리듬의기능적중요성및조절기전에대한연구결과들이다수발표됨. 3 Ueli Schibler 교수 ( 스위스제네바대 ), Hugh D. Piggins 교수 ( 영국맨체스터대 ), Henrik Oster 교수 ( 독일뤼벡대 ), Takashi Yoshimura 교수 ( 일본나고야대 ) 등의해외선도연구자들과의별도면담을통해향후인적교류및공동연구방안에대해논의함. 특히 Yoshimura 교수와는 2016년한국에서개최되는아시아-오세아니아국제비교내분비학회에서 일주기생체리듬 세션을공동으로개설하기로합의하였으며, 이후학회사무국과의추가적인논의를통해일주기리듬전문세션 ( 세션명 : Comparative Chronobiology) 의개설을확정함. 시간생물학아시아포럼 (Asian Forum on Chronobiology 2015, 2015년 9월 7~6일, 일본삿포로개최 ) 1 한국, 일본, 중국, 인도, 터키등 5개국으로부터 30 여명의연자들이본학술대회를통해최신연구결과를발표하였음. 본연구책임자역시초청연자로서기분장애의핵심분자표적을발굴한최신연구결과를소개함. 한국에서는총 4명의심포지움연자가참여함. 한국연자 : 김경태 ( 포스텍 ), 김은영 ( 아주대 ), 손기훈 ( 고려대 ), 최준호 (KAIST) 2 학회기간중일본의일주기생체리듬연구가태동한곳이라고할수있는홋카이도대학의일주기리듬연구소를참관하였으며, 9월 9일점심회의를통해각국대표자들이자국의생체리듬연구자및관련학회현황을소개함. 3 일본의경우일주기생체리듬의기초및응용연구뿐만아니라기반기술개발에대한투자가매우활발한것이특징임. 특히일본에서처음태동한생체인광의실시간측정기술을바탕으로다양한분자탐침 (molecular probe) 을지속적으로개발하여상용화하고있는데, 최근살아있는동물을대상으로한실시간 3차원이미징기술을개발하여관련분자탐침, 시약및측정기기시장을개척한것은주목할만함. 4 아울러일본을대표하는생체리듬연구자이자본사업책임자와원래친분이있던교토대 Hitoshi Okamura 교수와미국의저명생체리듬연구자인 Paolo Sassone-Corsi 교수 ( 캘리포니아어바인대 ) 의제자이자현재교토대 19

25 약학대학부교수인 Doi Masao 교수등과는개별면담을통해비공개연구 진행정보를교환함. 특히 Doi Masao 교수는최근신계열의생체시계조절 화합물을개발하여논문 특허준비와더불어사업화를추진하고있음. Cold Spring Harbor Asia: Biological Rhythm 학술대회 (2015년 10월 26~30일, 중국쑤저우개최 ) 1 미국 Cold Spring Harbor 연구소와중국이공동으로개최하는 CSH Asia Conference 시리즈의일환으로일주기생체리듬을주제로하는국제학술대회가중국쑤저우에서개최되었는데, 미국, 캐나다, 영국, 스위스, 중국, 일본, 인도등다양한국가의초청연구자들로구성된 40 여건의심포지움발표가이루어짐. 2 미국 Cold Spring Harbor 연구소와중국학술원의지원을바탕으로개최된본학술대회의특성상, 포유류의생체시계유전자를처음발견하여본분야를열었다는평가를받고있는텍사스주립대의 Josep Takahashi 교수를비롯하여미주지역의저명생체리듬연구자들이대거참석함. 3 생리적기능연구를중시하는유럽과달리미국의생체리듬연구자들은후성유전체조절기전, RNA 조절기전, 광유전학등최신분자생물학연구기법을일주기생체리듬조절연구에접목하려는시도가두드러짐. 4 특히본연구책임자는유일한한국인초청연자로서최신연구결과를소개하여호평을받았는데, 이를통해상기 Josep Takahashi 교수뿐만아니라, Samer Hatter 교수 ( 존스홉킨스대, 망막에의한생체리듬조절연구의권위자 ), Hiroki Ueda 교수 ( 일본 RIKEN 연구소, 일주기리듬의시스템생물학적연구분야의선도과학자 ), Han Wang 교수 ( 중국수초대, Zebra fish를이용한일주기질환모델링연구 ), Hugh D. Piggins 교수 ( 영국맨체스터대 ) 등과개별면담을가짐. 5 Samer Hatter 교수와는일주기리듬과우울증발병기전에대한공동연구를, Hiroki Ueda 교수와는수면조절과조울증의분자적기전에대한공동연구를추진하기로하였으며, Han Wang 교수와도지속적인연구교류를약속함. 6 특히 Hiroki Ueda 교수및 Han Wang 교수와한중일 3국의일주기생체리듬연구자들을중심으로하는생체리듬연구교류회설립추진을논의하였으며, 잠정적으로내년 10월경쑤저우에서제1회심포지움을개최하는방안을결정함. 아울러 Han Wang 교수가아시아-오세아니아비교내분비학회 20

26 를통해내년한국을방문하는것에합의함. 나. 심포지움연제를통해본일주기생체리듬연구동향 주제별 / 권역별일주기생체리듬연구경향 전술한 3건의국제학술대회에서발표된연제들을주제별로분류하면다음과같음 ( 단위 : 건 ). 표 5. 발표연제의분야별분류 분야명 EBRS/WCC AFC CSHA Conference 기초 기전연구분야분자생체시계조절인자 / 기전 21 (17.5%) 11 (32.4%) 10 (22.7%) SCN 중추시계의신경생물학적조절 8 (6.67%) 4 (11.8%) 2 (4.55%) 감각-중추시계의신경생물학적조절 15 (12.5%) 1 (2.94%) 0 (0.00%) 기능 활용연구분야시스템생물학및합성생물학 11 (9.17%) 4 (11.8%) 13 (29.5%) 생리 대사 섭식및대사성질환 24 (20.0%) 5 (14.7%) 6 (13.6%) 수면및뇌질환 26 (21.7%) 6 (17.6%) 8 (18.2%) 세포주기, 면역 염증및종양성질환 9 (7.50%) 0 (0.00%) 5 (11.4%) 공학및약화학 6 (5.00%) 3 (8.82%) 0 (0.00%) 합계 EBRS/WCC의경우유럽지역연구자의비율이 70% 에이르며, AFC는일본연구자가 60% 가량을차지함. CSHA conference의경우는중국지역참여자가 20% 선이며, 북미지역의연구자 ( 중국계포함 ) 가 60% 이상을차지함. 이를기반으로권역별연구경향을추론할수있음. 유럽 : 타권역에비해중추생체시계및망막-중추생체시계신호전달에대한신경생물학적기전연구가강세임. 생리 대사 섭식기능의조절기전에대한기초연구역시활발히진행되는편이며, 일본과더불어신경내분비학적연구가활발함. 특히시각-생체시계에대한신경생리및신경해부학적연구 21

27 는대부분유럽지역연구자들에의해이루어지고있음. 이에비해오믹스연구나공학 / 약학적활용기술개발연구는상대적으로비중이적은편임. 북미 : 유럽과비교할때일주기조절시스템에대한신경생리 / 해부학적연구의전통은짧은편이나포유류 CLOCK 유전자가발견된이래확립된분자생체시계분야의연구는가장독보적임. 이는미국이선도해온유전학 / 유전체학분야의연구기법의접목이기반이된것으로지금도오믹스기반시스템생물학적연구는대부분미국연구자들이주도하고있음. 또한생체시계조절제개발과실용화연구는미국의캘리포니아그룹 (UCSD-USC-스크립스), 텍사스주립대그룹, 펜실베니아대그룹및플로리다스크립스연구소그룹등이주도하고있음. 일본 : 현재와같이일주기생체시계연구가각광을받게된계기가일본계미국인인 Joseph S. Takahashi의발견이된것인만큼미국혹은유럽지역선도연구자에게사사한우수연구자들이다수존재하며, 연구수월성부분에서도경쟁력이있음. 또한생체리듬연구자들사이에널리쓰이는연구기법인생체인광리포터를이용한실시간유전자발현측정및이미징기술이일본연구자들에의해처음개발된만큼다양한원천기술을보유하고있음. 특히실시간이미징기술은기초연구뿐만아니라진단기술화할조짐을보이고있음. 주목할만한연구동향 일주기생체시계와대사조절연구 일주기생체리듬과대사조절연구는크게 1세포대사조절기구와일주기분자생체시계의연결고리규명, 2간, 췌장, 지방세포, 위장관등의대사기관에서국부생체시계에의한세포기능의조절기전연구, 3일주기생체시계와섭식 대사동기화기전연구를통한식이장애및비만, 당뇨병등대사성질환병인규명과실용화연구등으로요약될수있음. 세포대사및그결과로나타나는산화-환원신호경로와세포내분자생체시계사이의연결고리는진화적으로단세포생물시기부터이어져온핵심조절기전이라생각되고있음. 캠브리지대 Reddy A. B. 교수가 2011년보고한바와같이미토콘드리아활성의결과로나타나는세포내산화-환원상태의일주기리듬은세포핵에서나타나는전사-해독피드백기반의분자생체시계 ( 생체시계유전자들이구성하 22

28 는분자네트워크 ) 와는별도로세포수준의일주기리듬을만들어내는주요동인이라생각되며, 진화적으로는전사기반분자생체시계보다도더오래된세포수준의생체시계라믿어지고있음 (O'Neill and Reddy, 2011). 그결과세포내대사리듬과생체시계분자네트워크사이의연결고리를규명하려는연구들이이어지고있는데, 세포영양상태의센서단백질이라불리는 AMPK, SIRT1, NAMPT, PGC-1α 등단백질인산화효소, 대사물질조절효소, 후성유전학적조절인자등다양한계열의단백질들이세포대사와일주기분자생체리듬사이의연결고리역할을하는것이밝혀짐으로써두분자경로사이의밀접한상호작용을단적으로보여줌 (Peek et al., 2012). 이와더불어대사및내분비기관에존재하는국부생체시계에의한식이-에너지대사의동기화된일주기적조절기전과그이상이대사성질환을야기하는발병기전연구에큰진전이있음. 그결과일주기생체시계제어기술의주요적응증으로수면장애및시차증후군과더불어당뇨병이나비만등의대사성질환이최우선표적으로거론되고있음. 단적인예로서 Bass J. ( 미국노스웨스턴대, 췌장의베타세포 ), Schibler U. ( 스위스제네바대, 간세포 ), Sassone-Corsi P. ( 미국 UC 어바인, 시상하부식이중추 ) 교수등의연구자들이식이-대사장애와관련된국부생체시계의중요성을최근규명하였으며, Burris T. P. ( 플로리다스크립스연구소, 현세인트루이스대 ), Chen Z. ( 텍사스대 ) 교수등의연구자들이국부생체리듬의강화를통해대사성질환을치료할수있다는연구결과를발표하였음 (Bass, 2016; Solt et al., 2012; He et al., 2016). 수면-일주기생체리듬의통합적이해를위한빅데이터기반연구 일주기생체시계에대한이해의심화와이를활용하기위한실용화연구의시작과더불어수면-일주기리듬의통합적이해를위한거대프로젝트들이속속시작되고있는데, EBRS/WCC 및 CSHA Conference에서이들이소개됨. 주지한바와같이분자생체시계는기본적으로전사-해독분자네트워크를기반으로하며, 각각세포들이발현하는기능유전자중 5~30% 는분자생체시계의직 간접적인조절하에일주기적으로발현된다는사실이밝혀졌음. 그결과일주기출력경로의분자생물학적실체를규명하기위해전사체, 후성유전체, 단백체, 대사체등다양한수준의오믹스연구결과와그에대한생물정보학적해석이 2000년대중반이후활발히이루어졌음. 특히차세대염기서열분석 (Next-generation sequencing, NGS) 기술의비약적 23

29 발전에힘입어나타난 RNA-Seq, ChiP-Seq 등의분석기술과정량적단백체, 대사체분석기술의개발결과, 이들의일주기성을보다경제적이고, 안정적으로측정할수있게됨으로써데이터베이스구축을통한시스템생물학적분석이분자생체리듬의출력경로와기전을연구하는데에있어서필수적인요소가되고있음. 그결과구축된데이터베이스로는대표적으로 1다양한조직을대상으로한일주기적전사체발현정보를중심으로구축된 CircaDB ( 펜실베니아대의 Hogenesch J. B. 교수팀 ), 2전사체, 단백체및대사체등을망라하는다중오믹스분석기법을바탕으로하는 CircadiOmics (UC 어바인의 Sassone-Corsi P. 및 Baldi P. 교수연구팀 ), 3사후뇌조직과사망시각을바탕으로구축된일주기성뇌전사체발현데이터베이스인 Pritzker 뇌신경질환데이터베이스 ( 코넬대, 스탠포드대등 5개대학이구성한 Pritzker 뇌신경질환콘소시움 ), 4사망연령에따른일주기성뇌전사체발현데이터베이스 ( 피츠버그대 McClung C. A. 교수팀 ) 등을들수있음. 이와더불어특기할만한거대프로젝트로는독일뮌헨의루드비히막시밀리안대학교의 Roenneberg T. 교수가주도하는 Human Sleep Project 를들수있음. Human Sleep Project는그간실험실내에서이루어진수면-일주기리듬연구를탈피하고자다양한참가자를대상으로유전적배경, 직업 ( 근무패턴 ), 건강정보등과수면정보를조사하고이를데이터베이스화함으로써수면부족및일주기리듬교란과유전형및주요질환발병에대한상관관계를얻고자하는대형프로젝트임. 한화 300억원이상의예산이투입될예정인본프로젝트는 2000년에처음시작된이래로현재까지전세계에서 15 만명이상의정보가수집되었음. 특히 Human Sleep Project는 IT 기술과의접목을통해수면의양과질을보다쉽고, 경제적으로측정할수있는기술이도입되면서데이터베이스가포함하는정보의양과질이모두획기적으로개선되고있는데, 이를바탕으로실험실조건하에밝혀진수면및일주기리듬의조절기전및생리적기능등에대한정보가일상생활중에확보된데이터를통해검증되며, 추후다양한일주기성질환의진단, 예후예측, 치료기술개발에획기적인전기를마련할것으로기대됨. 일주기분자생체시계의전사후조절과정에대한이해심화 90 년대후반포유류의분자생체시계네트워크가동정되면서그동안전사 24

30 조절수준이나, 해독후단백질변형단계에서의생체시계조절기전의연구가집중되어왔음. 하지만 2000년대에들어ㅐ최되는 deep sequencing 기술의발전에힘입어다양한 non-coding RNA들이발굴되고, RNA editing의중요성이규명되는등 RNA biology가비약적으로발전하면서, 분자생체시계의조절기전역시새롭게해석되고있음. microrna에의한생체시계유전자 RNA의전사후조절과정의중요성은이미학계에널리인정받은상태임. 당초초파리에서처음제기된 microrna에의한생체시계유전자의발현조절은포유류에서도 mir-132, mir-142, mir-185 등다양한 microrna들이생체시계단백질들의발현을조절하고있다는사실이알려지면서일주기분자리듬의생성에중요한 small ncrna의발굴및기전연구가활발히이루어지고있음 (Wang et al., 2015). 최근에그중요성이점증하고있는 RNA editing 역시생체리듬의생성에중요한역할을담당하는것으로밝혀짐. 2011년 ADAR에의한 RNA editing이초파리모델에서일주기적으로나타나며, 이것이정상적인일주기리듬의생성에중요하다는것이밝혀진바있는데, 도쿄대 Fukada Y. 교수연구진은이를포유류모델로확장한연구를진행하고있으며, 특히 CSHA에서포유류에존재하는 3종의 ADAR 아형중 ADAR2에의해이루어지는 RNA-editing이정상적인일주기행동리듬의발현에필수적이라는미발표결과를소개함. 이와더불어교토대 Okamura H. 교수연구팀은 RNA methylation이일주기분자생체시계의주기결정에핵심적이라는사실을최근보고한바있음 (Fustin et al., 2013). 이상과같이 RNA의변형, 성숙, 제거와관련된전사후조절과정을규명하기위한선도연구진간의경쟁이향후몇년간지속될것으로예상되는데, 이로부터일주기생체시계제어기술의또다른분자표적이도출될가능성이매우높음. 생체이미징기술과생체시계기반진단기술의개발 2000년대초반일본의생체시계연구자들에의해 luciferase를이용한생체인광신호의실시간측정을이용한분자리듬모니터링기술이확립되면서일주기생체시계연구가비약적으로발전한바있음. 실시간생체인광분석법이다양한생체시계조절기전연구에활용되었을뿐만아니라, 단적인예로지금의 Reset Therapeutics 사라는일주기생체리듬제어기술전문회사가설립된계기를마련한 Kay S. A., Schultz P. G., Takahashi J. S. 등의생체시계조절화합물개발연구는생체인광분석기술 25

31 을기반으로한 high through-put screening 연구의결과임. 실시간생체인광분석기술의강국인일본에서개최되었던시간생물학아시아포럼 (AFC) 에서는홋카이도대학교의생체인광분석기술연구진의신기술이소개되었음 [ 그림 4]. 그림 4. 생체인광기반 in vivo 4D 이미징기술의개요 홋카이도대의과대학 Department of Chronomedicine의 Honma K. 교수와 Hamada T. 박사연구팀은최근움직이는생체인광리포터형질전환생쥐를대상으로 in vivo 4D 생체인광이미징기술의개발에성공함. 이를통해중추생체시계와국부생체시계사이의동기화양상등을살아있는생쥐에서일괄적으로분석할수있는기술적기반이확립됨. 본기술은일주기성질환의발병과정에서중추생체시계와국부생체시계의 misalignment가일어나는양상과그기능적결과분석이가능하게함으로써일주기성질환연구에획기적인계기를마련할것으로기대됨. 이와더불어 EBRS/WCC 학회에서는영국 Warwick University의 Dallmann R. 교수연구진은생체인광모니터링기술을기반으로하는종양세포진단법의개념을주창하기도함. 세포분열이빠른속도로일어나는악성종양에서는일반적으로일주기분자리듬이억제되는것으로알려져있음. Dallmann 교수는진단검사를위해적출된종양세포와생체인광리포터를이용하여종양세포의일주기생체시계특성을분석함으로써종양의특성을세분하고, 일주기적화학요법 (chronochemotherapy) 의적용을최적화할수있다는개념증명연구결과를소개하고, 진단기술화가능성을제시함. 26

32 다. 아시아주요국의일주기생체시계연구자현황 시간생물학아시아포럼에서는주요참가국들의생체리듬연구자및정부지원현황등을소개하는시간이있었음. 일본, 중국, 한국, 인도, 터키순으로발표가이루어졌는데, 한국측에서는아주대김은영교수가국내일주기생체리듬연구자현황을소개함 일본 일본은 1984년 Sapporo Symposium on Biological Rhythms (SSBR) 가개최된것을일본생체리듬연구단체의시발점으로생각함. 이는홋카이도대가일본생체리듬연구의본산으로평가받는이유임. 이를계기로 Biological Rhythm Research Group 과 Clinical Chronobiology Research Group 이조직되었으며, 1994년두단체가통합하여현재의 Japanese Society for Chronobiology (JSC) 가창립됨. JSC 는현재 600 여명의박사급정회원과 50 개이상의생체리듬연구실의연 구책임자로구성됨. 일본의대학교학과제도와국가출연연구소를고려한 다면한국기준 250~300 명이상의책임급연구자가 JSC 에소속되어있을것 27

33 으로추산됨. 전술한바와같이포유류생체시계유전자중최상위조절인자인 Clock 유전자가일본계과학자인 Takahashi 교수에의해발견되었으며, 비슷한시기에또다른최상위인자인 Bmal1과포유류의 Per1 유전자가일본내연구진에의해발견되었다는사실에대해 JSC의자긍심이매우높음. 또한 JSC는매년여름일본및아시아권대학원생들을대상으로하는 JSC Chrono Summer School 을개최함으로써생체리듬연구분야의저변확대에힘쓰고있음. 중국 중국은 2015년에처음독립적인생체리듬전문학회가창설되는등시기적으로는후발주자에속하지만현재 40 여개의생체리듬전문연구실들이운영되고있으며, 이들에대한중국정부의연간연구비투자액은한화 160억원이상임. 현재중국의일주기생체리듬연구를이끌고있는연구자들은대부분미국의 선도연구자들의지도하에박사과정혹은박사후연구과정을이수한연구 28

34 자들인데, 이를바탕으로중국은각국의선도연구자들과의교류 협력프로그램을진행하고있음. 중국의일주기생체리듬연구는주로베이징대, 수초대, 난징대등의연구그룹이주도하고있는데, 특히수초대는최근생체리듬연구자들의주도로 Sanger Institute의유전자적중생쥐배아줄기세포주은행의아시아지부를유치하여생쥐유전자중 80% 이상에대한돌연변이 ES 배아줄기세포주를확보하고, 신규수면-일주기리듬조절인자를발굴하기위한대형연구프로젝트를시작함. 일본과마찬가지로 Chronobiology Summer School 의개최를통해중국의세포생물학회, 생리학회, 의과학회등을중심으로저변확대에힘쓰고있음. 한국 한국은 2000년대중반자생적인 1세대연구진에의해생체리듬연구성과를도출하기시작함. 포유류기반의김경진교수 ( 당시서울대, 현 DGIST 및한국뇌연구원 ), 김경태교수 ( 포스텍 ), 초파리기반최준호교수 (KAIST), 식물분야남홍길교수 ( 당시포스텍, 현 DGIST 및 IBS) 등이있음. 현재 15~20개의연구실이생체리듬연구에전문화된연구실로파악이되는데, 아직일주기생체리듬전문학회 / 연구회는설립되지않음. 의과대학중심의수면학회는있으나선진국과는달리수면-일주기리듬의통합적연구는본격적으로이루어지지않고있음. 이는전술한바와같이일주기생체시계기반활용기술개발이원천적으로어려운구조적한계임. 특히국내일주기생체리듬연구자들의연령대가 60대이상의연구자들과 50 세미만의연구자로양분되는양상을보이며, 선진국에서나타나는일주기생체리듬연구의확장추세에도전문화된연구지원프로그램이없는상황임. 29

35 이는포유류에서생체시계연구가각광을받기시작한 2000 년대이전에는국 내생체리듬전공연구자가전무했던상황에기인함. 따라서국내일주기리 듬연구의저변확대가매우시급한상황이라할수있음. 인도 1977년 Indian Society for Chronobiology 가창립되었으나, 국가적특성상생태학및비교생물학적연구를수행하는연구자들이대부분이었음. 현대적인일주기생체리듬연구기관으로는 University of Lucknow에설치된 Centre for Biological Time Keeping 및 Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research Chronobiology Unit 등이인도의생체리듬연구를주도하고있음. 국내연구진의규모가크지는않으나미국소재인도계책임급연구자들이다수존재하여이들을중심으로한국제교류프로그램이활성화되어있음. 대표적인예로국제적으로도인정을받는인도의생체리듬연구자인 Kumar V. 교수와 Salk Institute의책임급연구자인인도계 Panda S. 박사와의협력을통해인도의 University of Delhi 및 University of Lucknow와캘리포니아지역 Salk Institute 및 US 샌디에고간의 Indo-US Joint Center for Biological Timing 을설립하여교류 협력을진행함. 터키 터키의 Chronobiology 전문기초연구자는전무하다시피하지만, 임상연구자중심의수면의학회가매우활발히운영되고있으며, 수면의학회내에일주기생체리듬연구회가활발히운영되고있음. 2010년부터터키수면의학회주도로국가지원의대형역학연구인 Turkish Adult Population Sleep Epidemiology Study (TAPES) 프로젝트를운영하면서일주기생체리듬연구자수가급증세를보이고있음. 30

36 2. 일주기성질환연구동향 : 대사성질환 가. 일주기생체리듬과식이 / 비만 비만의사회적심각성 비만은체내에너지대사의지속적불균형으로인하여지방세포의양적 수적증가와지방산대사의증가로야기됨. 따라서비만은기본적으로식이섭취량이증가하여잉여에너지의저장이늘어나거나, 또는운동과같은활동량의감소로에너지소비가줄어들어나타나는질환임. 이렇게유발된비만의가장큰문제는단순체중증가뿐만아니라, 고지혈증, 고콜레스테롤증등을포함하는지방산대사이상과인슐린저항성, 심혈관질환, 동맥경화와당뇨병과같은대사성질환의발병에중요한위험인자로밝혀졌기때문임. 미국의경우, 성인 3분의 1 이상 (34.9%) 인 7,860만명이비만환자이며, 2008 년한해에미국에서비만질환의치료목적으로 1,470억달러가지출된것으로추정됨 (Finkelstein et al., 2009). 일주기리듬과비만질환 일주기리듬장애는비만질환유행과밀접한관계가있음이다음과같은다양한연구결과들을통해보고되었음. 임상연구를예로들면, 야간과주간근무자들을대상으로비만질환유병률을분석한결과, 야간근무자들에서비만질환이발병할확률이높았고, 장기적으로교대근무를할경우, 체질량지수 (Body Mass Index, BMI) 가유의적으로증가함 (Pan et al., 2011). 건강한성인들을대상으로수행한연구에서도 6일간교대근무를할경우, 2 일과 3일째의하루에너지소비량이각각 3% 씩감소함 (McHill et al., 2014). 또한, 수면장애가있는환자들은비만질환이발병할확률이높으며, 건강한남성과여성에서는수면시간과체중의상관관계가반비례적으로나타남 (Mozaffarian et al., 2011). 사람의내장지방조직에서생체시계유전자들의 24시간발현패턴을분석한결과, 정상인 (BMI kg/m 2 ; n=21) 에비해비만인여성 (BMI > 40 kg/m 2 ; n=28) 에서 Clock, Bmal1, Per1, Cry2와 Nr1d1의유전자발현패턴에이상이 31

37 나타난다는사실이보고됨 (Vieira et al., 2014). 실험동물을이용한연구들을통해서도일주기리듬장애와비만질환이높은상관관계를보임. 예를들면, 지속적으로빛에노출된생쥐는운동성활동리듬 (locomotor activity rhythms) 에이상이발생하고, 식이섭취량의증가없이비만이유도됨 (Shi et al., 2013). Clock 유전자의 19번째 exon이제거된 ClockΔ19 생쥐에서는과식행동이보고된바있으며, 식습관일주기의변화로인해낮시간동안의섭취량증가로비만이유도된다는사실이입증됨 (Turek et al., 2005). 또한 Per2 유전자가결핍된생쥐에서는야간에증가하는글루코코르티코이드리듬이사라지고, 정상군에비해식이섭취리듬에이상이나타나낮시간동안의식이섭취량이증가함. 그결과고지방식이에의한체중및체지방증가가현저히나타남 (Yang et al., 2009). 최근중국난징대학의 Xu 그룹이핵심생체시계조절유전자인 Per1의 714 번째 Serine 잔기의인산화가식이섭취리듬을직접적으로조절할수있음을규명하였는데, Serine 잔기를 Glycine으로치환한 Per1 S714G 생쥐는낮시간에도식이를섭취함으로써고지방식이에의해급속도로비만이유도됨 (Liu et al., 2014). 이와더불어지방세포특이적으로생체시계조절유전자 Bmal1을제거한생쥐에서도식이섭취리듬에이상이발견되었고고지방식이에의한체중증가가나타남 (Paschos et al., 2012). 일주기리듬과지질대사 생체시계조절유전자들의변이는지방세포분화와지질의항상성에큰영향을미치는것으로보아일주기리듬과지질대사는직접적으로연결되어있음을알수있음. Bmal1 유전자는지방세포분화과정중에그발현이증가하여분화된지방세포에많이발현되는데, 이때 Bmal1 유전자의발현을저해할경우지방세포분화가저해되었고, 반대로과발현할경우지방산합성이증가함 (Shimba et al. 2005). ClockΔ19 생쥐또는 Bmal1 -/- 생쥐의혈액과지방조직을분석한결과, 정상생쥐보다지방산의분해속도가감소하였고, 혈중지방산과글리세롤의주기적인분비가현저히둔화됨 (Shostak et al., 2013). 지방세포에특이적으로 Bmal1을제거하여지방세포의리듬을제거하였을때, 지방세포의불포화지 32

38 방산합성및혈관으로의분비가감소함 (Paschos et al., 2012). 또한생체시계조절유전자인 Clock과 Nocturnin이위장관에서의지방흡수를조절하는데중요한역할을담당하는것으로보고되었음. Clock의지방흡수조절의분자적인기전은다음과같은데, Clock이 small heterodimer partner (Shp) 유전자의프로모터직접적으로결합하여전사발현을증가시키고, 증가된 Shp는 hepatocyte nuclear factor 4α (HNF-4α) 전사인자와결합하여 microsomal triglyceride transfer protein (MTP) 유전자의프로모터에결합하여그발현을저해함으로써낮시간동안의지방흡수를감소시킴. 반대로 Nocturnin은지방흡수를증가시키는기능을하나, 그의정확한기전은아직밝혀지지않음 (Hussain et al., 2012). 일주기리듬과식욕조절의연결고리 : 렙틴 (leptin) 에너지항상성은중추신경계와말초기관과의상호신호조절에의해유지되는데, 그대표적인예로식욕억제물질인렙틴을들수있음. 렙틴에의한식욕조절은지방세포에서분비되는렙틴의분비량과혈중렙틴의수치, 그리고시상하부궁상핵 (arcuate nucleus, ARC) 부분에분포하여있는신경세포들에의해이루어지는데, 혈중렙틴수치는음식섭취와체중증가에의해높아지며, 체지방함량에비례함. 렙틴의표적신경세포는시상하부의궁상핵에존재하며, 렙틴수용체를발현하는 neuropeptide Y (NPY)/agouti-related peptide (AgRP) 신경세포와 proopinomelanocortin (POMC) 신경세포가이에해당함. NPY/AgRP 신경세포는식욕촉진제인 NPY와 AgRP를분비하고, 또한, 억제성신경전달물질인 GABA 신호를 POMC 신경세포에보냄으로써식욕을조절함. POMC 신경세포는 POMC의잘려진형태인 α-msh를분비하며, 이 α-msh 는 melanocortin 신호를활성화시킴으로써식욕을저해하고에너지소비를증가시킴. 반면, AgRP는 melanocortin 수용체의저해제로작용하며, NPY는그수용체를발현하는신경세포에작용하여식욕을촉진함. 최근베일러의과대학의 Fu 교수그룹에서렙틴이일주기리듬장애와비만을연결할수있는새로운연결고리임을제안한바있음 [ 그림 5] (Kettner et al., 2015). 정상생쥐에서는 SCN 중추생체시계와말초생체시계인지방조직과의동기화과정을통해렙틴리듬이조절되고, 분비된렙틴은시상하부 POMC 신경 33

39 세포에작용하여 STAT3의인산화리듬을조절함으로써적절한식이섭취량과생체에너지의항상성을유지함. 그러나시차피로와같은장기적인일주기리듬장애로인해지방조직의렙틴과 POMC 신경세포의 STAT3 인산화리듬이교란되면, 비정상적인식이섭취로인해생체내에너지균형이깨어지게됨 (Kettner et al., 2015). 그림 5. 랩틴을매개로한일주기생체시계와체내에너지균형조절. 이와함께 Fu 교수그룹연구자들은다양한생체시계유전자돌연변이생쥐들을이용하여정상적인일주기리듬과장기적인시차피로 (chronic jet lag) 실험을통하여생체시계유전자가결핍된동물모델에따라에너지항상성과체중변화가달리나타남을확인함. 정상적인일주기상태에서 Per1/Per2 유전자가결핍된생쥐는체중이증가하였으며, Cry1/Cry2 유전자가결핍된생쥐에서는현저한체중감소가나타남. 그러나 Bmal1 유전자가결핍된생쥐는정상군과유사한체중변화를보임. 장기적인시차피로실험에서는 Per1/Per2와 Cry1/Cry2 유전자가각각결핍된생쥐들에서에너지항상성이깨짐이확인되었으나, Bmal1 유전자가결핍된생쥐는장기적인낮과밤의명암주기 (light-dark cycle) 변화를인지하지못하여정상군과유사한에너지항상성을보임. 일주기생체리듬조절을통한비만치료연구 34

40 최근중국지앙난대학의 Le 교수그룹은폴리페놀계의레스베라트롤 (resveratrol) 이 SIRT1과 PPARα을직접적으로조절함으로써고지방식이로인해망가진지방산대사의일주기리듬을회복시킬수있다고제안하였음. 또한이그룹은레스베라트롤에의해활성화된 Sirt1은생체시계유전자들의발현을회복시키고, 활성화된 PPARα에의해서는지방산합성관련유전자들의발현이저해되는것으로보고함 (Sun et al., 2015). 미국플로리다에있는스크립스연구소 ( 현, 세인트루이스대학교 ) 의 Burris는 2012년에 NR1D1에작용하는화합물을개발하여 NR1D1 리간드가수면질환치료뿐만아니라비만을포함한대사성질환치료의좋은약물타겟이될수있음을제안하였음. NR1D1 (REV-ERBα) 는 Clock과 Bmal1에의해증가하고 Per와 Cry에의해감소하며, 다시 Bmal1의발현을감소시키는역할을담당함. REV-ERBs의합성리간드인 SR9011와 SR9009는먹이를통해서비만이유발된생쥐의총지방량을감소시켰으며, 이상지질혈증및고콜레스테롤혈증을개선하는효과를보임 (Solt et al., 2012). Burris 교수연구진은지속적으로 REV-ERBs를타겟으로하여골격근질환, 수면질환, 동맥경화증, 유방암등에활발한연구를수행하고있는데, 최근같은연구소에소속되어있는 Griffin과 Kamenecka는 REV-ERB에길항적으로작용하는 RORs (retinoic acid receptor-related orphan receptors) 을표적으로하여일주기리듬장애와관련질환치료제를개발하는연구를진행하고있으며, 2015년 8월에미국국립보건원 NIMH (National Institute of Mental Health) 로부터연간 140만불의연구비를지원받음. 이스라엘바이츠만연구소 (Wizmann Institute of Science) 의 Elinav 박사는일주기리듬장애와이로인한불규칙한식생활이위장관세균의생체시계를교란하여비만이나당뇨를유발할수있음을보고함 (Thaiss et al., 2014). 그림 6와같이, 마우스의대변을분석한결과, 주로음식물을섭취하는활동기인밤에는 Clostridiales 와 Odoribacter 같은장내세균의개체수가가장많았고, 이들세균들은주로영양소를소화시키고손상된 DNA를회복시키며증식을하였음. 반면, 휴식기에채취한대변에서는젖산균 (Lactobacillus) 의개체수가많았고이들세균들은주로해독작용과주변의화학물질을탐지하거나편모를주로생성함. 그러나정상생쥐의식이섭취시간을바꾸자위장관세균의개체수, 유형및활성도도함께변화함. 35

41 그림 6. 위장관세균과숙주인사람의일주기생체리듬동기화 미국에서이스라엘로여행한승객들을대상으로한소규모연구에서는시차적응이안된사람들의위장관세균구성이비만이나당뇨환자의것들과유사하였으며, 시차적응이완료된다음에는세균구성이정상으로회복됨을발견함. 또한시차적응이안된사람의대변샘플을건강한생쥐에이식한결과, 이생쥐들의체중과체지방이증가하였고혈당도상승하였는데, 위와같은일련의연구들을통해위장관세균의생체시계가숙주인사람의생체시계와서로연동되어있음이규명됨. 나. 일주기생체리듬과당뇨병 당뇨병의사회적심각성 당뇨질환 ( 당뇨병 ) 은최근생활습관의변화로인해전세계적으로급증하고있는대사성질환임. 국제당뇨연맹 (International Diabetes Federation, IDF) 의 Diabetes Atlas (5 th Edition, 2011) 자료에따르면중국과미국의당뇨병환자는각각 9,000만명과 2,370만명으로집계되었으며, 2030년에는각각 12,970 만명과 2,960만명으로증가할것으로전망함. 우리나라는만 30세이상에서의당뇨병유병율이 2001년에는 8.6% 에서

42 년에는 9.6% 까지증가하는추세였으나이후로는 10% 이내수준으로계속유지되고있음. 그러나고령인구가증가하면서당뇨병유병율도함께지속적으로늘어날것으로전망됨. 현대산업화의발달로인해밤샘일을하는사람이나야간교대와같은일주기리듬을무시하는환경에서근무하는사람들이늘어나고있는것이당뇨질환의증가와깊은관련이있음. 특히, 미국에서는약 80만명의근로자들이야간교대근무를하고있으며, 이와같은근무환경에서는생체리듬에이상이발생하여체온, 심장박동, 혈압, 신경전달물질및호르몬분비리듬등에문제가발생함. 더놀라운점은짧은기간의일주기리듬교란에의해서도일주기성호르몬인멜라토닌과코티졸분비에이상이발생하며, 렙틴분비는감소하고혈액내당과인슐린분비는반대로증가함. 국제당뇨연맹에서조사한 2010년전세계당뇨병치료시장은 3,760억달러였고, 2030년에는 4,900억달러를넘어설것으로예상하고있음. 당뇨병 (Diabetes Mellitus) 당뇨병은근본적인치유가되지않는만성소모성질환중의하나로인슐린감수성 (insulin sensitivity) 또는인슐린분비 (insulin secretion) 에문제가발생하여나타나거나, 또는이두가지모두의결함으로발생하는대사장애증후군임. 당뇨병은인슐린의존형인제1형당뇨병과인슐린은정상적으로생성분비되나인슐린감수성에문제가발생하여나타나는인슐린비의존형제2형당뇨병으로구분됨. 제1형당뇨병은대부분자가면역반응으로인해췌장베타세포 (pancreatic β cell) 가파괴되어인슐린이정상적으로생성되지못하는경우임. 제2형당뇨병은전체당뇨병환자의 95% 를차지하고있으며대부분중년이후에발병하나최근에는비만인구의증가와함께젊은층에서도그수가늘어나고있음. 제2형당뇨병은다양한유전및환경적요인들로인해췌장베타세포에서인슐린분비가저하되거나당대사 (glucose metabolism) 에중요한근육과간에지방축적이늘어나서인슐린저항성 (insulin resistance) 이증가하여나타남. 현재제2형당뇨병치료제로는메트포민 (metformin), 설폰요소제 (sulphonyl urea), 치아졸리딘디온 (thiazolidinedione), 알파글루코시다아제 (α-glucosidase) 억제제, Pramlintide (Amylin 유사체 ), Exenatide (GLP-1 유사체 ) 와 DPP-IV 억제제들과같은혈당강하제들이주로사용되고있음. 37

43 혈중포도당의농도는주로인슐린과글루카곤 (glucagon) 에의해조절됨. 음식물섭취로인해혈중포도당수치가높아지면, 췌장베타세포에서인슐린이분비되어간과골격근의글리코겐합성 (glycogenesis) 과지방조직의중성지방합성 (lipogenesis) 을촉진함. 공복상태에서는인슐린분비가저하되고, 췌장알파세포 (pancreatic α cell) 에서글루카곤이분비되어간에서글리코겐의분해를촉진하여부족한포도당을공급함으로써적정수준의혈중포도당농도를유지하는것이기본임 [ 그림 7]. 그림 7. 인슐린과글루카곤에의한혈중포도당조절기전 일주기생체리듬과당뇨병 최근미국보스턴대학의 Vimalananda 박사등은미국내흑인여성 (12.2%) 이백인여성 (4.5%) 에비해 2.7배나높게당뇨질환이발생한다는점에착안하여, 미국흑인여성들을대상으로 (28,041명) 8년이상의추적연구를수행하였음. 메타분석결과, 야간근무경험이많을수록당뇨질환이발생할확률이더높아짐을입증함. 따라서흑인여성에서의높은당뇨질환유병율은백인여성에비해야간근무가많은직업적인원인에기인하는것으로나타남 (Vimalananda et al., 2015). 중국화중과학기술대학연구팀은야간근무와당뇨질환과의관련성을평가한 12건의이전연구결과 (226,652명) 들에대한메타분석을실시하여그관련성을재검증하였고다음과같이두가지발병기전을제안하였음. Gan 교수는우선 vitamin D의농도감소에주목함. 교대및야간근무자들은낮동안수면을취해야하므로충분한태양광자외선-B을받지못하게되며, 이는 38

44 vitamin D 및당뇨질환과연관된 25-hydroxyvitamin D 의생성부족으로이어질수있음. 둘째, 남성에서의제2형당뇨병과인슐린저항성에는낮은혈중안드로겐 (androgen) 수치가관련될수있음. 테스토스테론 (testosterone) 농도의하루변동패턴은일주기리듬에따라조절되며야간및교대근무로인해생활리듬이반복적으로교란되면시상하부-뇌하수체-성선계를통한안드로겐의분비에문제가발생하기때문임 (Gan et al., 2015). 일주기생체리듬과당대사 인슐린의작용과내당능 (glucose tolerance) 은일주기리듬에크게영향을받는것으로알려져있음. 유전적으로생체시계조절유전자들을결핍시킨다양한실험동물모델들에서당대사에큰문제가발생한다는사실이이를강력히지지함 [ 표 6]. Clock과 Bmal1 유전자가변이된생쥐에서는혈중포도당과중성지방의일주기적변화 (diurnal variation) 가소실되어있었으며, 또다른연구에서는이들의변이로인해인슐린분비가감소하고내당능뿐만아니라랑게르한스섬 (islet of Langerhans) 의분화와크기에이상이발생하였음 (Marcheva et al., 2010). Clock 유전자기능의소실은일주기적섭식리듬을파괴하여과식과비만으로고지혈증, 지방간과함께고혈당과고인슐린혈증을발생시킴. 또한다른연구에서는 Clock 유전자의변이에의해간의글리코겐과글리코겐합성을조절하는 glycogen synthase 2 (Gys2) 유전자발현의리듬이망가진것을보고함 (Turek et al., 2010). Bmal1이제거된생쥐에서는간에서포도당합성에문제가발생함. 간조직에서만특이적으로 Bmal1을제거한연구에서는간에서포도당을조절하는 glucokinase와 pyruvate kinase 등과같은유전자들의발현리듬이소실되어간에서당의생성에결함이관찰됨. 또한췌장베타세포에서만특이적으로 Bmal1을제거한생쥐를이용한연구에서는 Bmal1에의해조절되는항산화조절인자인 nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) 가감소하여활성산소의축적으로미토콘드리아호흡이상 (mitochondrial uncoupling) 이나타났고, 이로인해포도당자극인슐린분비 (glucose-stimulated insulin secretion, GSIS) 가감소하여당뇨질환이발생하는것으로밝혀짐 (Marcheva et al., 2010). 그러나이들 Bmal1이유전적으로결핍된생쥐들에서췌장소도에있는총인슐린양은정상생쥐와유사한 39

45 것으로보아인슐린합성보다는분비에문제가발생한것으로추측됨. 표 6. 생체시계유전자기능이상에의한당대사변조양상 유전자변형형태당대사변화참고문헌 Reduced gluconeogenesis and increased insulin sensitivity Rudic et al., 2004 Clock Whole-body loss of function Hyperglycemia and hypoinsulinemia Increased plasma glucose level and reduced glucose tolerance Turek et al., 2005 Marcheva et al., 2010 Damped oscillation of hepatic glycogen and glycogen synthase 2 Doi et al., 2010 Bmal1 Whole-body knockout (KO) Liver -specific KO Increased insulin sensitivity Rudic et al., 2004 Glucose intolerance Lamia et al., 2008 Increased glucose tolerance Lamia et al., 2008 Pancreas -specific KO Impaired glucose tolerance and hypoinsulinemia Marcheva et al., 2010 Sadacca et al., 2011 Per1 Per2 Whole-body double KO Glucose intolerance, enhanced insulin-induced hypoglycemia Lamia et al., 2008 Per2 Whole-body Brdm1 mutation Whole-body Brdm1 mutation Reduced fasting glycemia and altered glycogen storage Hyperinsulinemia, increased glucose tolerance and insulin sensitivity Zani et al., 2013 Zhao et al., 2012 Cry1 Cry2 Whole-body double KO Increased plasma glucose and reduced glucose tolerance Lamia et al., 2011 핵심생체시계조절인자인 Clock과 Bmal1 이외에도 Per와 Cry 유전자들의변이에의해서도체내당대사가변조될수있음. Per1/Per2가결핍된생쥐에서는내당능이발생하고, 인슐린주사에의해저혈당 (hypoglycemeia) 이보고됨. Per2가결핍될경우에도, 공복혈당이감소하고, 간내의글리코겐축적에이상이발생하며, 포도당자극인슐린분비가촉진되어혈중인슐린수치 40

46 가증가하였고인슐린제거에문제가발생하였음 (Lamia et al., 2008). Clock과 Bmal1에의해조절되는 Cry1과 Cry2가모두결핍된생쥐에서는시상하부-뇌하수체-부신축의억제가감소하여부신피질호르몬인코티코스테론 (corticosterone) 의혈중농도가증가하면서내당능이발생함 (Lamia et al., 2011). 임상연구에서는핀란드국립보건원의 Ani Englund 그룹이메타분석을수행한결과, Cry2 유전자의다형성과혈당사이의상관관계가나타났고, 517명을대상으로한 SNP (single-nucleotide polymorphisms) 연구에서는 Per2가높은공복혈당과연관됨. 또한제2형당뇨병환자에서는정상인에비해생체시계조절유전자의주기적인 mrna 발현이감소하였으며, 최근연구에서는수면시간과무관하게수면주기가불규칙한야간근무자에서인슐린저항성이더높아졌다는결과가보고되기도함 (Leproult et al., 2014). 당대사관련말초기관들의국부생체시계 췌장의국부생체시계 췌장소도 (pancreatic islet) 에서분비되는인슐린과글루카곤은포도당항상성에필수적인내분비신호이며, 이들의분비는생체시계조절인자들에의해직접적으로조절됨. 최근미국노스웨스턴의과대학의 Joseph Bass 교수그룹은췌장베타세포특이적인 enhancer들에의해인슐린분비관련유전자들의일주기적전사조절이이루어짐을규명함 (Perelis et al., 2015). 췌장의국부생체시계들이포도당항상성을수면-각성주기에따라유지하는데, 췌장베타세포에서인슐린이분비될때인슐린분비소포체 (insulin secretory vesicles) 의조립과수송에관련된일단의유전자들이유전체수준에서동기화된일주기성발현이유도됨 [ 그림 8]. 분자생체시계전사인자들이일주기적유전자의 enhancer에결합함으로써밤낮의생체주기에따라전사와생리학적수준의일주기성대사가동기화됨. 이그룹연구자들은 2010년에췌장에서도독자적인 24시간생체시계가존재하여인슐린분비와관련된유전자와단백질의활동을조절하고이생체시계에이상이생기면인슐린분비가줄면서당뇨병이발생한다고제안한바있음 (Marcheva et al., 2010). 41

47 그림 8. 췌장베타세포-특이적 enhancer 들에의한인슐린분비조절유전자들의일주기적전사조절 간의국부생체시계와당대사조절 주지한바와같이간은혈액내포도당수치를적정수준으로유지하는중요한역할을담당함. 간조직특이적으로생체시계조절유전자들이결핍된생쥐들에서글루코겐합성의문제로인해포도당생성이저해되고내당능이증가하는것이보고되었음. 미국 UC 샌디에고의 Kay S. A. 교수연구팀은간에서포도당생성의일주기리듬이분자생체시계조절자인 Cry1과 Cry2에의해조절된다고보고함 (Zhang et al., 2010). 즉, 단식과정에서 CRY1과 CRY2는 CREB 작용을조절하여, 글루카곤에대한반응을낮추고포도당생성을감소시키는 G protein-coupled receptors (GPCRs) 신호들을저해하였는데, 이들연구팀은 CRY1의발현을높일경우, 간에서포도당의생성이저해되어내당능이개선됨을확인하여간의생체시계를조절함으로써당뇨병을치료할수있는가능성을제시함. 따라서간에서밤낮주기에따른포도당대사의조절은핵심생체시계조절인자들의복합적인신호뿐만아니라생체시계및대사성신호경로의복잡한연결들에의해조절된다고할수있음 [ 그림 9]. 특히 Kay 교수는 CRY에대한활성제인 KL001의개발에관여한핵심연구자중 1인이며 CRY 활성제기반 First-in-Class 대사질환치료제를개발하고있는 Reset Therapeutics의이사진중한명이라는사실을고려하면, 본연구 42

48 결과는생체시계조절화합물의실용화를위한핵심성과라고할수있음. 그림 9. 간에서포도당을조절하는생체시계조절인자와그기전 위장관의분자생체시계 Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) 은주로하부소장에존재하는 L 세포에서생산분비되며, 이는췌장베타세포와델타세포에서인슐린과소마토스타틴 (somatostatin) 의분비를늘리고, 췌장알파세포에서글루카곤의분비를저해하여인슐린저항성을개선시키는역할을담당함. 또한 GLP-1은췌장베타세포의증식과인슐린합성을높이고베타세포의세포사멸 (apoptosis) 을감소시키는기능을지니고있기때문에당뇨병치료제개발의타겟으로주목을받아 GLP-1 유사체와 GLP-1 분해효소인 dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4) 의저해제가개발되었고현재임상에서당뇨병치료제로사용되고있음. 최근캐나다토론토대학 Patricia L Brubaker 교수그룹은생쥐의 L 세포에서일주기성 GLP-1 분비를처음으로발견하여보고함. 이들은영양소섭취에의한 GLP-1 분비가 thyrotroph embryonic factor (Tef) 와 protein tyrosine phosphatase 4a1 (Prl1) 에의해조절됨을증명함 [ 그림 10]. 본연구는 NTS (nucleus of the solitary tract) 에존재하는 preproglucagon 신경세포에서분비되는 GLP-1에도적용되는지추가연구가필요하며, 대사성질환과야간근무와의관련성과 GLP-1을표적으로한당뇨병치료연구에중요한자료가될것으로기대됨. 43

49 그림 10. 생체시계조절인자들과위장관 L 세포에서의 GLP-1 분비 다. 간대사일주기리듬조절에서핵수용체전사인자의역할 핵수용체 (nuclear receptor) 계열의전사인자 핵수용체는리간드에의해조절되는전사인자를통칭하며다양한생체내항상성유지에중요한역할을담당하고있음. 특히간대사조절과정에서 Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (PPARs), Farnesoid X Receptor (FXR), Glucocorticoid Receptors (GR), Liver X Receptors (LXRs) 와같은다양한핵수용체들이인슐린저항성, 지방산합성, 염증반응조절등을담당하는것이밝혀져이를이용한대사성질환치료제의새로운가능성도함께제시되고있음. 최근에는이러한핵수용체들이뇌에서뿐만아니라주변부조직에서도일주기리듬을직접적으로조절하고있다는사실이지속적으로보고되고있으며, 이중핵수용체의일종인 REV-ERBs와 ROR 등은이미 BMAL, CLOCK등과더불어일주기생체리듬조절에가장필수적인한축을담당하고있다는사실이보고된바있음. 이외에도다양한핵수용체들이일주기리듬을조절하거나일주기리듬교란에따른간질환과밀접한관련성을가지고있음. 다양한간질환에서발견된일주기리듬의교란 정상적인상태에서는혈중인슐린농도, 지방산합성, 포도당분해와같은일련의대사과정들이 sleep/wake와 fasting/feeding 주기와맞물려규칙적인일주기리듬을보이고있음. 이와더불어간조직에서도지방산대사, 당대사, 담즙산대사등다양한대사조절과정들이일주기리듬에따라생체내에너지항상성을유지하고있음이알려져있음. 44

50 하지만비알콜성지방간염 (Non-alcoholic steatohepatitis), 간섬유화 (Hepatic fibrosis), 간암 (Hepatocellular carcinoma) 등과같은간질환을가진환자에서일주기리듬이교란되어있는것이임상적으로알려져있음. 또한일주기리듬이망가져있는유전자조작생쥐에서간암, 림프종등여러종류의암이발병하거나담즙산순환의장애로인한담즙산정체 (Cholestasis) 가나타나는등, 간대사관련질환들의빈도가현저히증가되어있음이보고됨 (Lee et al., 2010; Ma et al., 2009). 최근에는간조직특이적으로일주기리듬이교란될경우, 미토콘드리아장애로인한활성산소의증가및인슐린저항성의증가도유발한다는것이보고됨 (Jacobi et al., 2015). 이러한결과들은주 / 야교대근무, 여행으로인한시차, 수명장애와같은상황에자주노출된사람들이다양한대사성질환을가지고있다는사실을실험적으로뒷받침해주고있음 (Ferrell et al., 2015; Mazzoccoli et al., 2015). 이와더불어후술할다양한핵수용체들이일주기생체시계와간기능을연결하는중요분자고리라는사실이밝혀지면서핵수용체의활성제 / 저해제들을간질환의치료제로개발하려는연구들이더욱활성화되고있음. REV-ERB의분자적기전및새로운기능연구 REV-ERBα/β이 1989년과 1994년각각발견된이래, 일주기리듬을조절하는중요한전사인자중하나로서많은관심을받아오고있음 (Everett, 2014). 특히, 2012년 Salk 연구소의 Ronald Evans 그룹과펜실베니아대학교의 Mitchell Lazar 그룹에서각각 REV-ERBα/β 유전자조작생쥐에서일주기리듬및대사조절이심각하게교란되어있는것을확인함으로써 REV-ERB α/β의중요성에대해다시한번주목을받게됨 (Bugge et al., 2012; Cho et al., 2012). 이후 Lazar 그룹은 REV-ERBα의 ChIP-seq 및 ChIP-exo (ChIP-exonuclease; ChIP-seq을기본으로하여단백질의결합위치를 1 bp 단위까지고해상도로분석하는방법 ) 를이용하여, REV-ERBα가일주기리듬조절과대사관련유전자조절과정에서상이한염기서열에결합한다는사실을보고함 (Zhang et al., 2015). 이에따르면, REV-ERBα는기존알려진염기서열 (RevDR2 및 RORE) 에서 Retinoid-related Orphan Receptor (ROR) 와경쟁함으로써일주기리듬조절유전자의발현을조절하는것이외에조직특이적으로다른염기서열에도결합할수있음을보고함. 예를들어, 지방조직에서는 HNF4A 또는 HNF6를 tethering 인자로활용하여 REV-ERBα가 HDAC3를가져옴으로써해 45

51 당유전자의전사를억제하는기전도함께가지고있음. 이는 REV-ERBα의일주기리듬조절및조직특이적인유전자발현조절이실제적으로어떻게일어나는지에대한깊은이해를가능하게해줌. REV-ERBα는간세포 (hepatocyte) 에서의기능이외에도간성상세포 (Hepatic stellate cell) 의교차분화 (trans-differentiation) 도조절하는것으로보고된바있음 (Li te al., 2014). 간성상세포는간손상이일어날경우근섬유아세포 (myofibroblast) 로분화되어간섬유화를촉진하는것으로알려져있음. 정상상태에서간성상세포의 REV-ERBα는기본적으로세포질에존재하며섬유화반응을유도하지만, REV-ERBα의리간드를처리할경우핵으로들어가과도한섬유화반응을억제하는반대작용을보이기때문에이를기반으로간섬유화의새로운치료제개발에활용될가능성이제시됨. ROR의에너지대사조절기능 Retinoic acid receptor-related orphan receptor (ROR; RORα, RORβ, ROR γ) 들은 REV-ERBα/β와더불어, 기존에일주기리듬을조절하는중요한전사인자로알려져있음. 최근연구결과들은비만, 당뇨, 인슐린저항성, 당대사등다양한생체내대사조절기능에초점을맞춘 ROR의역할을규명하는데초점이맞추어져있음. 이중 RORα, RORβ은뇌조직에서높게발현되며주로뇌신경조직에서일주기리듬을조절하는것으로알려진반면, 간이나지방조직과같은주변부조직에서는 RORα, RORγ이높게발현되어다양한대사과정및에너지항상성을조절한다는사실이수차례보고됨 (Solt et al., 2011). RORα의경우, 유전자변형생쥐 (=Staggerer mice) 에서전반적인비만및지방간염은감소해있으나심각한동맥경화를일으키는것으로보아, 여러세포 / 조직에서각기다른유전자의발현을조절하는것으로생각됨. 이와더불어, 간에서당대사조절, 담즙산합성등의다양한역할을수행하고있다는사실도보고됨 (Byun et al., 2015; Pathak et al., 2013). RORγ는 2개의동형유전자로나누어지는데, RORγ1의경우생체내기능에대해아직많은보고가되어있지않은반면, RORγ2 (=RORγt) 는흉선세포 (thymocyte) 생성, 림프절형성, Th17 세포 (Interleukin-17을분비하며적응면역 (adaptive immunity) 에서중요한역할을담당 ) 분화등에중요한역할을담당하고있음이잘알려져있음. 처음에는 RORγ 유전자결손생쥐가전반적으로큰문제점을보이지않으며 46

52 혈당농도만약간낮은편으로알려져있었지만 (Solt et al., 2011), 최근에는간특이적 RORγ 유전자결손생쥐에서인슐린민감성이높아져있으며, 일주기동안글리코겐합성, 포도당신합성 (gluconeogenesis) 등의당대사조절에도크게영향을받는다는사실이보고됨 (Takeda, 2014). 지방산에의한 PPAR의일주기리듬조절 PPAR (Peroxisome proliferator-activated receptor; PPARα, PPARδ/β, PPAR γ) 은기본적으로지방산분해, 당대사조절, 지방세포분화등을담당하는핵수용체로서널리알려져있었으나, PER2, BMAL1 등의발현을직접조절하는등일주기리듬조절에도참여한다는사실이밝혀짐 (Mazzoccoli, 2014). 최근에는지방산과같은대사물질이 PPAR의활성화를조절함으로써일주기생체리듬을변화시키는과정에대한자세한기전이제시된바있음. 예를들어, UC Irvine의 Paolo Sassone-Corsi 교수연구팀에따르면, 기본적으로일주기패턴을보이는유전자발현이고지방식섭취에의해큰변화를보이게되는데, PPARγ가간조직에서고지방식섭취에서만특정패턴을보이는유전자의발현조절을매개하고있음 (Eckel-Mahan et al., 2013). 또한특정종류의혈중지방산들이간조직에서의 PPARδ/β의활성을일주기변화에따라조절한다는사실이하버드대학교의 Chih-Hao Lee 교수에의해발견되었으며, 이는일주기리듬에따른간조직과근육조직의상호작용을이해할수있는중요한기전으로평가받고있음 (Liu et al., 2013). 새로운일주기리듬의조절자로서핵수용체 Cofactor의부각 핵수용체가리간드에의해활성화 / 비활성화될때, 다양한 cofactor들이핵수용체와결합하여그활성을조절함. 이과정에서많은 cofactor들또한핵수용체와함께일주기리듬을조절하는것으로보고되고있는데, PPARγ coactivator 1 (PGC-1), Histone deacetylase 3 (HDAC3), Steroid receptor coactivator-2 (SRC-2=NCo-A2, GRIP-1, TIF-2) 등이대표적인예임. PGC-1이일주기리듬과에너지대사를매개한다는사실은이미오래전미시건대학교의 Jiandie D. Lin 교수에의해밝혀진바있음 (Liu et al., 2007). 그후로도상세기전에대한추가연구가계속되고있음. HDAC3는주로펜실베니아대학교의 Lazar 교수연구팀에의해꾸준히연구되어왔는데, Chip-seq 및 Chip-exo 방법을이용하여 HDAC3의염색체결합 47

53 부위를밝혀냄으로써일주기리듬에따른간지방대사및당대사를조절한다는사실을입증함 (Alenghat et al., 2008; Feng et al., 2011; Sun et al., 2012). 최근에는베일러의과대학의 Bert W. O'Malley 교수에의해또다른 cofactor 인 SRC-2가 BMAL1:CLOCK 전사인자와직접적으로결합하여일주기리듬을조절한다는사실을보고하기도함 (Stashi et al., 2014). 라. 세포대사의일주기적조절과자가포식작용 자가포식작용과일주기리듬 자가포식작용 (autophagy) 은세포가자기자신의구성성분을스스로분해하는활동을의미함. 이자가포식작용의대상이되는것은 DNA, 지질, 단백질등세포내다양한거대분자들은물론, 생존에필수적인구조단백질이나세포소기관 (organelle) 들도포함함. 이는세포내에서필요를다한혹은손상된구성요소들을선택적으로분해하여이로부터에너지와자원을재활용하는것은물론, 각종원인에의해기능에문제가생긴구성요소들을분해하고재생성을촉진하여세포기능의항상성을유지하는일종의정도관리 (quality control) 의역할을한다고알려져있음. 자가포식활동은세포의생존이위협받는환경적요인, 즉스트레스에직면할때이를극복하기위한세포의방어기전으로서영양분이결핍되거나세포가손상되는상황에서생존에지대한영향을미침. 이때문에자가포식작용은치매나파킨슨씨병등의비정상적인세포사멸과정은물론각종종양과자가면역성질환및대사성질환에있어서도관여한다고알려져있음 (Levine and Kroemer, 2008). 영양상태는일주기생체시계의활성에영향을미치는중요한요소중하나인데, 이는상술한바와같이자가포식작용을유도하는스트레스중하나임. 일주기생체시계와자가포식작용이둘다세포의대사과정과대사성질환에서역할이주목받고있는주제라는점도주지할만한사실임. 실제자가포식작용와일주기생체시계사이의상관관계에대해서는이미많은연구가진행되어있으며, 대사성질환이나이와관련된장기의병리적상태에서두신호전달경로의역할을주목하는연구가최근각광받고있음 (Ma et al., 2012). 48

54 자가포식작용의분자기전과그일주기성 자가포식작용을조절하는주요분자인자 자가포식과정은크게세가지형태로분류하는데, 1거대자가포식작용 (macroautophagy), 2미소자가포식작용 (microautophagy) 및 3샤페론매개성자가포식작용 (chaperon mediated autophagy) 이있음. 이중에서도현재많은연구가생물학적의의와임상적중요성이밝혀진거대자가포식작용에집중되어있음. 자가포식작용의개략적인분자기전은다음과같이요약할수있음. 1격리막 (isolated membrane 혹은 phagophore) 의형성과성장, 2자가포식소체의형성과목표운반체의소체내수용, 그리고 3소화효소를포함한리소좀 (lysosome) 과의융합으로자가용해소체 (autolysosome) 를형성하고내부운반체를분해하는과정임. 각과정에는모두다수의 ATG 유전자들과연관단백질들이복합적으로작용하는막수송체계 (membrane trafficking machinery) 가동원됨. 평상시, 자가포식작용은낮은수준으로유지되지만특정상황에서강하게발현되는데상술한바대로영양상태는가장강력한신호중하나임. 여기에관여하는대표적인유전자가 ULK1 (unc-51 like kinase 1) 이며, 평상시에는 AMPK (AMP-activated protein kinase) 에의해서불활성화되어있으나, 기근상태에서는 AMPK와함께 mtorc1 (mammalian target of rapamycin) 가활성화되어 ULK1을각각서로다른위치에서인산화시키고최종적으로자가포식작용을활성화함. 활성화된 ULK1은 ATG13과 FIP200 등과복합체를이루고컵모양으로생긴독특한구조의격리막형성을개시하게됨. 또하나중요한자가포식작용의조절유전자로는 BECN1 (beclin-1) 을들수있음. BECN1 역시기근상황에서활성화되며 ATG14, VPS32, VPS15 등과복합체를이루어막수송체계를활성화하고, 자가포식소체의형성에기여함. 자가포식소체가성숙하는데에있어서효모의 ATG12 유전자의 ortholog인 LC3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3) 의역할이필수적이라고알려져있음. LC3의활성화와자가포식소체의성숙에 ATG3, 4B, 5, 7, 10, 12 등다양한유전자들이관여하는것으로알려져있음 (Klionsky, 2007). 자가포식조절인자들의일주기적발현조절 흥미롭게도인디애나주립대학의 Dong 교수팀의연구에따르면, ATG14 는 49

55 프로모터상에 E-box 서열을가지고있고, 이들이 CLOCK-BMAL1 이합체에의해조절을받으며, 간에서의 ATG14의유전자의발현수준역시강한일주기성을보임 (Xiong et al., 2012). 상술한바와같이 ATG14는격리막을형성하는자가포식작용의초기단계에서핵심적인유전자이므로, 간에서의자가포식작용전체가일주기성을가지고변동할가능성이매우높다고볼수있음. 또다른 ULK1의조절자인 mtor 역시일주기생체시계의조절대상인데, 생체시계의핵심유전자중하나인 BMAL1이 mtor의활성을억제하여기근상태의인식과하위신호전달경로를활성화하는수준을일주기적으로조절한다는것이클리브랜드주립대학의 Kondratov 교수연구팀에의해서규명됨 (Khapre et al., 2014). 이와같이최근일주기생체시계와자가포식작용사이의분자적연결고리를찾고자하는연구들이활발히진행되고있음. 자가포식작용-일주기생체시계의연결고리로서 SIRT1의기능 특히최근에는자가포식작용-일주기생체시계의연관연구에있어서 SIRT1 이크게부각되고있다. SIRT1은 NAD를조효소로하는탈아세틸화효소로서, 효모의 sirtuin 유전자의 ortholog 중하나로알려져있음. SIRT1은히스톤단백질탈아세틸화효소 (histone deacetylase, HDAC) 의한계열이지만그성격이약간다른데, 핵내뿐만아니라세포질의단백질도탈아세틸화를통해조절함으로써다양한단백질의전사후조절에관여하는주요조절인자임이이미밝혀짐 (Houtkooper et al., 2012). SIRT1은 NAD를조효소로삼기때문에세포의대사상태에도큰영향을받는데이는세포의영양상태를모니터링하는센서로서의역할이가능하다는의미로서실제로기근상태일때, 즉고에너지환원력전달체인 NADH를많이소모하고 NAD의활성이높은시기에 SIRT1의활성도높아진다는것이알려져있음 (Nemoto et al., 2004). 또한 SIRT1은일주기생체시계의직접적인조절을받으면서동시에핵심생체시계유전자들의활성을조절하는일주기분자생체시계네트워크의주요구성요소로서최근에각광받고있는조절인자중하나임 (Nakahata et al., 2009). 따라서 SIRT1은영양공급과세포내에너지상황을반영하여핵과세포질의주요단백질의활성을조절함으로써일주기생체시계의영향을반영하는분자적연결고리로서도기능한다고할수있음. 최근 SIRT1과이에의한탈아세틸화의중요성이자가포식작용에미치는영 50

56 향이활발하게연구되고있음. 이분야의중요한돌파구가미국국립보건원 (NIH) 소속의 Finkel 교수의연구팀에의해서이루어졌는데, Finkel 교수연구팀은자가포식작용의주체인 ATG5, ATG7, LC3 등다수의자가포식관련유전자들이기근상황에서 p300에의해서아세틸화, SIRT1에의해서탈아세틸화된다는사실을규명하였음 (Lee et al., 2008; Lee and Finkel, 2009). 이러한아세틸화를통한전사후조절 (post-translational modification) 은자가포식작용에직접적으로영향을미칠뿐만아니라, 영양상태에따른자가포식작용의활성화및불활성화에큰영향을미치는것으로생각됨. 특히 SIRT1의활성이생체시계의일주기리듬을반영한다는것을고려하면일주기적으로변하는영양공급상태에따른적응기제로서자가포식작용이큰역할을하고있을것으로예측할수있음 [ 그림 11]. 그림 11. 일주기생체시계와자가포식작용조절. SIRT1 은개체의영양상태는물론일주기생체시계에의해서조절받으면서, 동시에탈아세틸화를통해다수의핵심자가포식작용단백질의활성을조절함으로써세포의대사작용과세포사멸에영향을미치는자가포식작용을조절함. 이때문에 SIRT1 은생체시계와자가포식작용및세포대사를연결하는중요한분자표적으로주목받고있음 허혈및재관류상황에서의세포사멸과 SIRT1 및자가포식작용의역할 간세포의허혈 (ischemia) 및재관류 (reperfusion) 에의해유래되는광범위한간손상은심혈관계질환이나과도한출혈등에서발생할수있음은물론간절제, 간이식등의외과적시술에서도필연적으로따라오는과정이자환자의예후에중대한영향을미치는요소중하나임. 그러나아직까지허혈및재관류과정에동반되는세포손상과정의분자기전을명확하게알지못하고있으며이를완화하는분명한치료법도발견되지않은상태임. 허혈과재관류에의한간세포손상과정에는일시적인양분및산소공급이 51

57 저하됨으로인해발생하는미토콘드리아구성요소의손상과그로인한미토콘드리아막투과성전이현상 (mitochondrial permeability transition, MPT) 이라고부르는현상이주요원인으로지목되고있음 (He and Lemasters, 2002). 이 MPT에의한세포손상을완화하는것이자가포식작용으로알려져있으며, 허혈및재관류상황에서자가포식작용을인위적으로활성화시킬경우세포손상이완화되는현상이나타남 (Rubinsztein et al., 2012). 이는자가포식작용이불가피한허혈및재관류가일어나는상황에서의도치않은손상을최대한막을수있는분자표적이될수있음을의미함. 최근플로리다주립대학의한국인과학자인김재숭교수가 Cell Death and Differentiation지에발표한연구에따르면, 허혈및재관류상황에서인간과쥐의간에서 SIRT1의농도가크게저하되며자가포식작용을억제하여세포사멸을촉진시키는결과를가져오는것으로밝혀짐. 반면간세포에서 SIRT1 을과발현시켜이러한 SIRT1의결핍을완화시킬경우, 재관류로인한세포사멸의수준이크게개선되는효과가나타났음. 이는 SIRT1의활성이허혈및재관류과정에서의세포사멸을완화시킬수있는가능성이있음을직접적으로입증한연구임. 또한김교수의연구팀은 SIRT1과자가포식작용의조절과정에관여하는새로운분자표적으로서 mitofusin 2 (MFN2) 라고하는소포체와미토콘드리아의연결역할을하는 GTP 분해효소를최근발굴함. SIRT1은이 MFN2와직접적으로결합하고 MFN2의탈아세틸화를촉진하는데, 흥미롭게도 SIRT1에의한허혈 / 재관류과정에서의세포보호작용은 MFN2를반드시필요로하였으며, SIRT1 혹은 MFN2 단독으로는이러한효과가나타나지않음. 이는 SIRT1에의한 MFN2의탈아세틸화가자가포식작용과세포보호에필수불가결한분자기전임을의미함 (Biel et al., 2015). 이연구에서특히주목할만한부분은 SIRT1이간세포에서나타나는미토콘드리아자가포식작용에서핵심적인기능을하고있으며, 세포내 SIRT1의양에따라서자가포식작용은물론허혈및재관류로인한세포손상정도역시크게영향을받는다는것임. 자가포식작용전반에걸친 SIRT1의영향력을고려하면이는당연한귀결로보이나, 이를확장하여 SIRT1을기점으로일주기생체시계와연결시켜보면상당히흥미로운결과가예상됨. 특히허혈및재관류현상이외과적시술상황에서일어나는데간에서보이는 SIRT1 의강한일주기성을고려하면, chronotherapy의관점을도입한발전된형태의수술요법을고려할수있을것임. 52

58 3. 일주기성질환연구동향 : 뇌질환 가. 일주기생체리듬과퇴행성질환 퇴행성뇌질환에동반되는일주기리듬이상 주지한바와같이수면장애를비롯한일주기리듬의이상이노화에수반되는인지기능의저하와더불어각종퇴행성뇌질환과높은상관관계를보인다는사실에대해서는학계의동의가모아지고있는상황임. 알츠하이머병 (Alzheimer s disease, AD), 파킨슨병 (Parkinson s Disease, PD), 헌팅턴병 (Huntington s disease, HD) 등은가장대표적으로알려진퇴행성뇌질환 (Neuro degenerative diseases) 임. 이들주요퇴행성뇌질환환자들에서발병초기부터발견되는증상중하나가바로생체리듬이상에의한수면장애임. 지금까지는퇴행성뇌질환의결과로서수면장애가나타나는것으로보는시각이대부분이었지만, 최근들어반대로수면장애및일주기생체시계의기능이상이퇴행성뇌질환의병리적원인중하나일수도있다는연구결과가속속발표되고있음. 이는수면장애치료법들이퇴행성뇌질환치료에효과적일수도있다는가설을가능하게함으로써, 새로운퇴행성뇌질환치료법에대한기대치를높이고있음. 알츠하이머병과일주기생체리듬장애 알츠하이머병은노화와함께가장많이발생하는퇴행성뇌질환의하나로서, 전세계적으로노인에게서발병하는치매 (dementia) 의가장대표적인원인으로여겨지고있음. 알츠하이머환자들은초기단순한기억력감퇴를시작으로언어능력저하, 시공간파악능력저하, 판단력및일상생활수행능력저하등의증상을보이며, 병이진행되면성격변화, 우울증, 망상, 환각등의정신행동이상증세도나타냄. 아직까지발병원인이정확히규명되지않아치료법이없는상황이고, 단지발병이후증상을완화하거나지연시키는치료만진행되고있음. 병리학적으로는응집 / 축적된형태의 β-amyloid나변형된 Tau 단백질등이특징적으로나타남 (Musiek et al., 2015). 수면장애는알츠하이머발병초기부터매우흔하게관찰되며, 수면분절 53

59 (sleep fragmentation) 을보이거나정상적이지않은수면위상패턴으로인해낮-밤이바뀌는등의양상이매우흔하게나타남 (Hatfield et al., 2004) 년동안미국워싱턴대의 Knight Alzheimenr s Disease Research Center에서는 45-75세의인지장애가없는성인을대상으로수면과알츠하이머의상관관계를조사하는연구가진행되었음 (Ju et al., 2013). Holtzmen 박사그룹에의해진행된이연구에서, 연구진들은뇌척수액 (cerebrospinal fluid) 에서 β-amyloid가발견되는그룹은대조군에비해수면의질이유의미하게저하된다는사실을발견하였음. 흥미로운것은수면의전체시간과 β -amyloid 사이에서는상관관계가발견되지않았다는점임. 따라서수면의양이아닌수면의질과알츠하이머진행의상관관계를보여주는결과라할수있음. 이와유사한양상으로 Baltimore Longitudinal Study of Aging에서 70명의노인 (53-91세, 평균연령 76세 ) 을대상으로진행한연구에서자가기록된수면기록상으로수면이짧거나수면의질이떨어진다고응답한그룹이대조군에비해 β-amyloid가더높은수준으로축적되어있음을 Positron Emission Tomography (PET) 기술을이용하여입증함 (Spira et al., 2013). 후속연구로진행된초파리를이용한실험에서수면장애가실제신경세포의흥분도를증가시킴으로써 β-amyloid를증가시킨다는결과를발표함 (Tabuchi et al., 2015). 정상초파리의신경세포흥분도를인위적으로높여주면, 정상초파리도수면장애가있는초파리와같이 β-amyloid가증가되었으며, 신경세포흥분도를낮추는약물을투여할경우 β-amyloid가감소하면서, 수면장애도개선되는효과가나타남. 또한 Bennett 박사연구진은나이가들어감에따라짧아지는수면시간과뇌의인지능력감퇴는서로연관성을보이지않지만, 수면분절의증가는알츠하이머의대표적병리현상인 β-amyloid나 Tau 단백질의생성을촉진시키며, 6년이내치매로이어질수있는확률이 1.5배로높아진다는연구결과를발표하였음 (Lim et al., 2013). 이상의임상연구에서나타난수면의질저하와알츠하이머증상의상관관계에대해최근수면중뇌내독성대사산물을제거하는과정에서 β-amyloid 역시제거되기때문이라는사실이밝혀져서학계의큰주목을받은바있음 (Xie et al., 2013). 특히유전학적연구를통해일주기생체시계유전자의다형성과 SCN 중추생체시계의특성이이러한수면장애와퇴행성뇌질환의상관관계를매개하는 54

60 주요인자가될수있다는증거들이꾸준히보고되고있으며, 동시에최근발견된세포내대사활성의일주기리듬역시퇴행성뇌질환의발병에핵심적인역할을담당할것으로기대됨 (Musiek et al., 2015) [ 그림 12]. 대표적인일주기성호르몬인멜라토닌의분비감소가알츠하이머환자에게서특히두드러진다는사실은일주기리듬이상과알츠하이머병사이의연관성을보여주는또다른예가될수있음. 중증의알츠하이머환자에서는 MT1 멜라토닌수용체를발현하는신경세포의숫자가 SCN에서감소되어있으며, neurofibrillary tangle이 SCN 신경세포에축적됨이보고된바있음 (Stopa et al., 1999; Wu et al., 2007). 그림 12. 일주기생체리듬이상과알츠하이머발병모델 알츠하이머병은초기에발견하여그진행을늦추는것이현재유일한치료법이기에조기발견이매우중요한데, 비정상적인수면패턴을이용하여알츠하이머발병여부를초기에알아내고자하는연구들이다양한연구진들에의해이루어지고있음 (Potvin et al., 2012; Sterniczuk et al., 2013; Hahn et al., 2014). 파킨슨병과일주기리듬이상 파킨슨병은중뇌도파민신경세포가소실되면서나타나는퇴행성질환으로 알츠하이머다음으로가장많이나타나는퇴행성뇌질환임. 주로 60 대이후 55

61 의노인들에게서많이나타나며주요증상으로는운동신경이상으로인한손이나팔의떨림, 근육의경직, 느린운동, 자세불안정등이있고많은경우초기부터우울증을동반함. 알츠하이머병과마찬가지로병의직접적인원인은아직확실히알려지지않았으며, 도파민신경세포의소실을보완해주기위해도파민전구물질인레보도파 (levodopa) 등의도파민성약물요법이주로사용되고있음. 파킨슨병과일주기리듬의상관관계는오래전부터인지되어왔는데, 환자들의증상부터하루주기로변화함. 대표적인예로많은환자들이오후에서저녁시간대에더심한운동장애를나타냄 (Bonuccelli et al., 2000). 더불어수면장애는파킨슨병환자들에게서나타나는비운동성증상중가장흔히발생하는증상으로, 90% 에이르는환자들에서수면장애가함께나타남 (Raggi et al., 2013). 주지할만한사실은수면장애환자들에게오래전부터광범위하게사용되어진보조적인치료법인광치료요법 (light therapy) 이, 노인들이나치매환자들에게도움이되는것으로나타난다는것임. 특히파킨슨병환자들의근육경직이나운동장애에빛치료가긍정적인효과를낼수있다고보고되고있음. 헌팅턴병과일주기리듬장애 헌틴턴병은헌팅틴유전자의 CAG 염기가비정상적으로신장되어발생하는유전성질환으로주로 30-40대에발병하며, 100,000명당 14-16명의환자가발생하는것으로알려져있음. 무도증 (chorea), 우울증, 불안및치매가주된증상인데, 발병초기에신경세포퇴화 (neurodegenaration) 가관찰되며, 병이진행됨에따라기저핵 (basal ganglia) 의대사가저하됨 (Musiek, 2015). 병의초기단계에서는무도증이신체의일부에국한되어나타나지만병이진행됨에따라점차전신으로퍼지는경우가대부분임. 헌팅턴병환자수는앞서언급한질환들에비해적은편이어서, 광범위하고조직적인연구를진행하기에는한계가있음. 하지만유전자변형에의한질병이기때문에돌연변이생쥐모델을이용한연구는더욱활발하게진행되고있음. 흥미롭게도헌팅턴병생쥐모델에서의일주기생체리듬이상은동물의연령뿐만아니라 gene dosage와도높은상관관계를보이는데, homozygous mutation에서더명백한이상증상이나타나는것으로보고됨 (Loh et al., 2013). 56

62 헌팅턴병환자들의경우, 혈중멜라토닌농도가정상에비해낮고, 분비시기가일정치않으며, 분비지연정도가운동능력저하를비롯한증상의정도와비례한다는연구결과가보고됨 (Kallioila et al., 2014). 또한헌팅턴병환자들은일반적으로기상시간이정상인에비해늦고, 수면의질이떨어지는등의수면조절이상이매우흔하게관찰됨 (Aziz NA et al., 2011). 이러한연구결과들은헌팅턴병환자들의일주기리듬에이상이있다는사실을직접적으로보여주는예로서향후둘사이의인과관계에대한집중적인연구가진행될것이라예상됨. 경련성질환 (Spasticity) 에서의일주기리듬장애 Spasticity는주로운동신경세포의이상으로인해근육의경련과마비가생기는증상을의미함. 이는다양한유전적인요인에의해나타나기도하고, 척수손상이나다발성경화증에의해서도발병할수있음. Spasticity를가지고있는환자들에게서도불면과같은일주기성이상증세가빈번하게보고됨. 현재까지이와관련해서알려진분자생물학적연구는거의전무한상황이나몇몇임상연구들에서는일주기생체리듬과경련성질환사이에상관관계를보고하고있음. 흥미롭게도 spasticity가있는환자에게주로처방되는약은중추신경계의억제성신경전달물질인 GABA 수용체에대한효현제인 baclofen임. 2006년 spasticity를앓고있는환자들에대한보고에따르면, baclofen의척수강내주입은 spasticity 환자의수면상태, 그리고수면에영향을주는호흡기관련증상을통계적으로유의미한수준으로완화시키는결과를보여줌 (Bensmail et al., 2006). 특히척수손상환자들의경우, complete injury 환자에서는경련증상이주로밤시간대부터아침까지심하다가오후가될수록약화되는양상을보이는반면, 경부의 incomplete injury를가진환자는증세가아침에가장심하고오후, 저녁에는감소하는것으로나타나는등경련발작기전과일주기리듬사이의상관관계를강력히시사함 (Skold et al., 2000). 나. 일주기생체시계와정신질환 기분장애의사회적부담 기분장애는크게우울증 (major depressive disorder, MDD, 주요우울장애 ) 과 57

63 조울증 (bipolar disorder, BPD, 양극성우울장애 ) 으로구분되며, 조울증은조증을보이는 1형과경조증을보이는 2형으로구분됨 [ 그림 13]. 우울증은평생유병율이 16.6% 에이르는가장흔한정신장애중하나일뿐만아니라 (Kesseler, 2005, Handbook of depression 2nd edition), 2001년부터정기적으로이루어진국내정신질환역학조사결과지속적인증가추세를나타내고있음. 조울증은평생유병율이 3.9% 로주요우울증에비해서는낮은편이지만, 우울증으로진단받은환자들중에서 15% 정도가조울증으로이행하며, 특히조울증의재발성이매우높다는점에서정신건강상간과할수없는위협이되고있음. 그림 13. 기분장애의분류 우리나라의자살률은 1990년대초반에는인구 10만명당 10명이하였으나이후지속적으로증가하여 2011년에는 33.3명이되었으며 (OECD 국가평균 12.4 명 ), 이는 OECD 국가중에서가장높은상황임. 더욱심각한문제는자살증가율또한 1990년이후계속증가하여현재 OECD 국가중에서가장높은수준을나타내고있음. 우울증환자의 10-15%, 조울증환자의 25% 가자살을시도한다는점을고려할때자살과관련된기분장애의특성을규명하는것은사회적으로매우중요한과제임 (2012 자살실태조사, 중앙자살예방센터 ). 2012년기준으로전세계의항우울제시장규모만 205억달러 ( 약 24조원 ) 규모로추산되고있는데, 이는현행분류상단일질환으로는뇌신경계질환중가장시장규모가큰질환의하나임. 58

64 일주기생체리듬과기분장애 기분조절의일주기리듬이상이우울증, 조울증, 불안장애, 계절성기분장애등다양한형태의정서장애의발병및증상과깊은연관이있다는사실은주지의사실로서, 실제수면박탈이나광치료등일주기리듬교정이정서장애치료법으로임상적으로사용되고있음 (McClung, 2013). 특히기분장애중에서도양극성기분장애와일주기생체리듬 / 생체시계의연관성연구는지난 10여년동안상당한진척을보이고있음. 예를들면급성조증상태의환자는극도로혼란된수면-각성주기를보이며, 수면부족이조증발생전에선행하는경우가흔함. 특히조울증의가족력이있거나, 경조증의과거력이있는경우에 24시간생활리듬의혼란이자주나타남 (Ankers and Jones, 2009). 유전학적연구결과, 생체시계유전자의다형성이단극성혹은양극성기분장애에대한취약성과더불어치료제반응성과높은상관관계를보여주고있는데, 흥미롭게도수면-각성주기의일주기형 ( 저녁형 / 아침형 ) 이이들을매개하는중요한요인으로나타나고있음 (McCarthy and Welsh, 2012). 이와함께현재까지가장효과적인조울증치료제로알려져있는리튬이설치류에서일주기분자리듬을연장시킨다는증거가있으며, 그작용기전이 GSK3β와 REV-ERBα 분자경로를매개한다는사실이밝혀짐 (Kaladchibachi et al., 2007; Yin et al., 2006). 2005년피츠버그대 McClung 교수등이생체시계최상위인자인 CLOCK 돌연변이생쥐를이용하여분자생체시계와조울증의인과관계를처음으로주장한바있는데 (McClung et al., 2005), 본연구책임자를포함하는국내연구진이분자생체시계구성인자중특히 REV-ERBα의활성이정상적인기분조절과함께조울증의발병에핵심적이라는사실을규명하여그결과를 2014년 Cell 지에발표하였음 (Chung et al., 2014). 우울장애기전최신연구동향과일주기생체리듬과의연관성 우울장애에대한분자생물학적접근 우울장애는유전형과환경의상호작용에의해유발되는대표적주요질환으로서발병기전의특성상오랫동안실험적모델링이어려운분야로생각되어져왔음. 실제로유전체분석기술의발달에힘입어대규모의우울증환자 59

65 에대한유전자서열분석이시도되기도했지만, 많은경우명확한유전적변이를찾아내는데실패함 (Major Depressive Disorder Working Group of the Psychiatric GWAS Consortium, 2013). 하지만 2015년에 CONVERGE 컨소시엄 (Virginia Commonwealth 대학, Oxford 대학과중국여러연구기관의협력연구 ) 에서수행한연구결과, 우울증과유의미하게연관된두곳의단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP) 이밝혀짐으로써우울증역시분자유전학적으로접근할수있다는사실을입증함 (CONVERGE consortium, 2015). 해당연구의가장큰성공요인은환자집단의선정에있는데, 유전적오차를줄이기위해대상을중국한족여성으로제한하여환자군과대조군각 5000여명을연구대상으로하였으며, 환자군의대부분이심각한수준의우울증 (Melancholia) 을앓고있는사람으로국한함. 발견된 SNP는각각 SIRT1과 LHPP 유전자부위에존재하는데, LHPP는그기능이아직완전히밝혀지지않은유전자인반면, 전술한바와같이 SIRT1은노화및에너지대사, 일주기생체리듬의핵심조절인자인탈아세틸화효소 (histone deacetylase) 임. 우울증동물모델의개발 우울증연구는환자에대한제한적인연구와뇌조직확보의난점등으로시료확보와유전적조작이가능한동물모델의개발이필수적으로요구되지만, 1동물모델에서의우울증지표측정이어렵고 ( 사람에서나타나는임상증상이측정이힘들거나동물에서나타나지않는경우가많음 ), 2현재임상적으로정의된우울증자체가매우비균질적인 (heterogenous) 질병으로예상되며, 그개별적인생물학적기전이잘밝혀지지않아실험적모델링이매우어려움. 그동안다양한형태의동물모델및행동실험들이제시되어왔지만, 항우울제등의개발에많이활용되고있는강제수영실험 (Forced swim test) 과같은행동검사들은우울증의지표로서여전히논란이있음. 최근가장잘정립된우울증모델의하나는 사회적패배모델 (chronic social defeat stress paradigm) 로서사회적패배스트레스후의사회적상호작용 (social interaction) 의감소는비교적신뢰성있는동물모델의우울증지표로서활용되고있음 (Golden et al., 2011). 실험은장기적으로물리적, 심리적인사회적스트레스 ( 공격성이높은 CD1 쥐 60

66 가선별사용됨 ) 에노출된쥐 (C57BL6) 를대상으로이루어짐. 매일 5~10분가량물리적공격을받은피험쥐는이후공격자와같은우리내에서구멍이뚫린투명칸막이로분리된공간에서지내며여전히감각을통한스트레스에노출됨 [ 그림 14]. 통상 10일동안의스트레스노출후사회적상호작용을검사해보면, 사회적접촉을피하고우울증유사행동을보이는 (susceptible) 집단 ( 대체로전체실험개체의절반이상 ) 과저항성 (resilient) 집단으로나뉘게되는데, 이는사람에서나타나는스트레스에대한반응의개인차와그에따라우울증상을보이는환자가나타나는것과연결지어볼수있는현상임. 이모델은반복적인형태로다수의쥐에대해적용할수있으며, 비디오행동분석시스템을활용하여각개체의사회적상호작용정도를쉽게정량화할수있는장점이있음. 그림 14. 우울증의사회적패배모델과저항성및우울증집단의구분 최근까지사회적패배모델을활용하여 BDNF, ΔFosB, mglur5 등을비롯한다양한우울증관련유전자와기전들이밝혀져왔으며, 특히저항성집단과우울증집단의비교는사람에서나타나는스트레스에대한반응성의차이와우울증에취약한사람의기전을연구할수있도록해주는장점을지니고있음. 또한체내스트레스조절축인시상하부-뇌하수체-부신 (Hypothalamuspituitary-adrenal axis) 축을지속적으로활성화할수있는점또한다른환경적스트레스에대비한장점으로여겨지고있음. 이에따라현재여러연구진에의해세부적인실험조건에따라다양한형태로변형되어활용되고있음. 61

67 사회적패배모델을활용한후성유전학적연구 현재우울증의유전에대한연구 ( 일란성쌍둥이연구등 ) 결과로볼때, 우울증의대략 40% 정도만이기존의유전적요인으로설명되기때문에, 우울증관련뇌부위에서특이적으로일어나는후성유전학 (epigenetics) 적변화에대한기전연구가각광받고있는추세임. 스트레스와같은외부의자극이후성유전학적조절을일으키는데는크게두가지경로가제시되고있는데, 시냅스를통한신호전달이나신경세포활성의변화가세포내신호전달경로를통해 1CREB, FOS와같은전사인자등의활성이나발현을조절하여해당전사인자결합부위의염색질구조변형을유도하거나, 2직접적으로염색질조절단백질들의활성을제어함으로써대상유전자의발현이조절될수있음. 실제로탈아세틸화효소에대한억제제나히스톤이나 DNA 메틸화효소의제어가항우울제와비슷한효과를보일수있음이동물모델을활용한다양한연구에서입증된바있음 (Peña et al., 2014). 하지만이러한효소들의작용자체는여러유전자에대해광범위하게작용할수있으므로, 최근의연구는특정후성학적조절을표적유전자특이적으로적용하는방식으로진행되고있음. 그림 15. Zinc finger 를활용한 FosB 유전자특이적인인공메틸화효소 (ZFP35-G9a) 의제작 (A) 과측좌핵발현시에나타나는우울증유사행동 (B) 일례로 Mount Sinai 의대 Eric Nestler 교수연구진은, MIT McGovern 연구소 Feng Zhang 박사연구진과의공동연구를통하여메틸화혹은탈메틸화효소를결합한 Zinc finger 단백질을활용하여직접적으로우울증관련유전자의제어가가능함을보여주었음 (Heller et al., 2014). 연구진은 FosB 유전자의프로모터상특정위치에대한직접적인 H3K9 메틸화를증가시킴으로써우울증유사행동을유도할수있다는사실을실험적으로입증함 [ 그림 15]. 62

68 또한한편에서는 DNA 메틸화나히스톤단백질의잔기분석에서벗어나, 주어지는스트레스에따른세포내염색질리모델링 (chromatin remodeling) 이나좀더상위단계의염색질구조변화를분석하는방향으로이뤄지고있음. 최근 Nestler 박사연구팀은사회적패배모델에서직접적으로우울행동과관련된염색질리모델링조절이일어남을입증함 (Sun et al., 2015). 이연구에서는지금까지알려진 4가지주요염색질리모델링복합체 (chromatin remodeling complex) 중 ISWI에속하는 ACF 복합체에의한측좌핵 (nucleus accumbens) 부위에서의예하유전자의염색질구조변형이우울증그룹쥐에서의신경입력과신호를필요충분한양상으로중계함을입증하였음. 그림 16. 우울증생쥐에서나타나는염색질리모델링의예. ACF 복합체의조절을받는유전자의뉴클레오좀위치변화양상 특히 ACF 복합체가결합하는유전자에대한 ChIP-seq 분석을통하여우울증쥐에서특이적으로나타나는뉴클레오좀 (nucleosome) 위치변화가유전자발현변화의원인이며, 우울증에서지속되는병인으로서치료를위한표적이될수있음을제시함 [ 그림 16]. 광유전학적연구를통한우울증신경회로망동정 과거부터심부뇌자극술 (deep brain stimulation) 을통해전전두엽이나측좌핵과같은영역의신경회로를자극하여우울증을제어해온것은익히알려진바임. 이와함께최근연구를통하여우울증증상에다양한뇌영역들간의회로가관여함이알려진바, 광유전학 (Optogenetics) 을활용하여특정회로를제어하고자하는연구들또한활발히이뤄지고있음. Mount Sinai 의대의 Ming-Hu Han 교수연구진은실제로대표적보상회로인 63

69 중뇌복측피개야영역 (ventral tagmental area, VTA) 에서측좌핵으로뻗은회로에서주기적인빠른활성화 (phasic firing) 를인위적으로유도했을때, 사회적상호작용의감소와무쾌감증 (anhedonia) 이나타남을입증함 (Chaudhury et al., 2013). 하지만 Stanford 대학의 Karl Deisseroth 박사연구진은유사한실험에서반대의결과가나타남을보였는데 (Tye et al., 2013), 이는사용한스트레스모델의차이로보이며 ( 강한스트레스-사회적패배스트레스-와약한스트레스-강제수영실험등-에대한반응의차이로추정됨 ), 우울증동물모델에서개체에가하는스트레스조건에따라해석에유의해야함을보여주는사례임. 최근의연구는측좌핵내에서의특정신경세포군에의한조절, 해마와같은다른뇌부위에서오는경로연구등으로세분화및확장되어가고있는추세임 (Francis et al., 2015; Bagot et al., 2015). 최근국내연구진또한사회적패배모델을활용한광유전학적연구에서쥐의왼쪽전전두엽 (prefrontal cortex) 의활성이저하된것이우울증행동양상에기여할수있음을보고한바있음 (Lee et al., 2015). 신경후성유전체학 (Neuroepigenomics) 그림 17. 대규모데이터베이스를활용하는우울증연구 한편최근의발달된지놈시퀀싱기술은동물모델에서또한대규모의유전자분석방법을적용할수있도록함. 특히 ChIP-seq과같은연구는후성유전학적변화의전반적인변화와염색질구조까지도추적할수있도록해주었으 64

70 며, 이렇게모인데이터를 RNA-seq, 마이크로어레이등의유전자발현결과와함께종합하여대상유전자를탐색하는신경후성유전체학이최근대두되고있음. 현재발표되는많은논문들에서는이러한데이터를온라인으로제공하고있는데, 최근에는이러한대규모시퀀싱결과들을저장하는데이터베이스들이속속생겨나고있음 (Maze et al., 2014). 앞으로는이러한데이터베이스분석을통하여우울증의가능성있는조절인자나예하조절경로들을찾고실험적으로검증하는연구방식이성행할것으로기대됨 [ 그림 17]. 일주기생체리듬관점의우울증연구와전망 주지한바와같이우울증과관련하여정서, 수면조절의일주기적조절이상이 1950년대이후로꾸준히보고되어왔으나, 그생물학적기전은불확실한상황이었음. 하지만분자생체시계기전이밝혀지고, 그관련유전자들의동정및동물모델을활용한연구가활발히진행되면서, 관련기전들에대한연구가서서히진행되고있는추세임. 최근주요우울증환자의사후뇌조직에대한유전체분석을통해일주기생체시계유전자의일주기적발현양상에서심대한교란이발견된것은본분야에있어서획기적인발견임 (Li et al., 2013). 이와같은맥락에서본연구진에의해 2014년보고된바와같이중뇌에서의도파민합성리듬이생체시계분자네트워크의직접적인조절을받으며, 그결과가일주기적기분조절과직결됨은매우중요하고연구사례라할수있음 (Chung et al., 2014). 이외에도 Clock, Bmal1, Cry2와같은생체시계유전자와우울증의연관성은최근까지꾸준히보고되어왔는데, 이러한맥락에서 CONVERGE 컨소시엄의연구가규명한두유전자좌위중하나가 SIRT1 유전자부위임은시사하는바가매우큼. 실제로 SIRT1이일주기분자생체시계의주요조절자로알려지게되면서이미알려진노화, 에너지대사를비롯한 SIRT1의다양한기능들이일주기생체시계와분자적으로연관될것임에많은연구자들이주목하여왔음 (Bellet et al., 2011). 이전에 SIRT1은이미우울증과깊이연관된 MAO-A의발현을증가시켜행동 65

71 에영향을준다는사실이보고된바있는데, 최근 SIRT1에의한직접적인우울증조절기전이뇌보상회로를중심으로측좌핵, 해마영역등에서규명되고있음 (Libert et al., 2011). SIRT1의일주기생체시계조절기능과앞서제시된일주기리듬과우울증의상호관련성을고려해볼때, 일주기리듬과정서조절을잇는또하나의핵심분자고리로서 SIRT1의역할이규명될것으로전망함. CRISPR/Cas9 등으로대표되는유전체조작기술의급속한발전을바탕으로환자의유전적변이를이식한동물모델의개발이나특정유전자에대한직접적인후성유전학적조절등을통해우울증기전발굴연구가급물살을타게될것으로기대됨. 일주기생체리듬과자폐범주성장애 앞서예시한기분장애와더불어최근사회적으로큰주목을받고있는발달성뇌질환인주의력결핍과행동증후군 (Attention-deficit hyperactivity disorder, ADHD) 및자폐범주성장애 (Autism spectrum disorders, ASD) 환자들사이에서도비정상적인일주기생체리듬혹은생체시계활성이연이어보고되고있음 (Tordjman et al., 2015; Coogan et al., 2016). 자폐범주성장애 자폐범주성장애는사회적교류에대한무관심및언어발달의장애혹은지체, 제한되거나반복적인행동으로특징지어지는뇌발달장애의일환임. 1990년대만하더라도 500명중에한명정도에불과하던발병률이최근급격히증가하기시작하여 2014년미국질병관리본부집계에서는 68명의어린이중 1명 ( 남아의경우 42명중 1명 ) 이자폐범주성장애로진단받기에이르렀음 [ 그림 18A]. 2012년 London School of Economics의 Martin Knapp 박사와 University of Pennsylvania의 David Mandell 박사의연구에따르면자폐범주성장애는미국내에서만연간 1,260억달러의사회적비용을초래하는것으로조사됨. 자폐범주성장애는주로지능발달장애, 불안장애, 간질성발작및특히수면장애등다양한질환을동반하는데, 핵심진단기준에있어서도환자에따른다양성을보이는특징이있음. 아울러발병원인에있어서도유전적요인에의한영향이큰것으로판단되는한편, 환경적영향도발병에기여하는 66

72 것으로알려지며자폐위험유전인자를종합적으로파악하는것이급선무로여겨짐. 이를위해서는대규모유전체연구및이를연구주체간에효율적으로공유하는시스템이필수적임. 실제로이를위해서미국의 Simons Foundation Autism Research Initiative (SFARI) 에서는 SFARIGENE이라는데이터베이스를구축하여소속연구자들이확보한유전정보를비롯한방대한자료를공유하고있고, 미국의비영리단체인 Autism Speaks에서는중국의 Beijing Genomics Institute 사와협력하여 Autism Genome 10K 프로젝트를이미수년전선도적으로시작하였음 [ 그림 18B]. 그림 18. 자폐범주성장애의가파른증가세와이의해결을위한대규모사업추진현황. (a) 2014년미국자폐진단아동비율및 2000년대자폐진단증가추이. (b) 자폐관련대규모연구결과공유를위한 SFARIGENE 과선도적유전체연구프로그램이었던 Autism Genome 10K 프로젝트 자폐환자대상유전체연구동향 자폐범주성장애가유전자의강한영향을받는다는사실이알려졌음에도불구하고, 질환자체의복잡성으로인해기존의유전적분석을통한유전자발굴에한계를겪고있음. 이를돌파하고자선도연구그룹에서는환자와그들의부모, 형제로구성된체계적인검체를확보하는한편, 비약적으로발달한유전체검색기술을활용하여유전체수준에서자폐위험유전인자발굴에결실을얻고있음. 67

73 대표적인사례로, 2015년 Harvard University의 Mark Daly 교수와 Icahn School of Medicine at Mount Sinai의 Joseph D. Buxbaum 교수를중심으로결성된 Autism Sequencing Consortium에서는 3,871명의자폐환자와이들과혈연관계에있는 9,937명의정상인의 DNA를엑솜시퀀싱 (exome sequencing) 법으로분석하였음. 이를통해 160개의자폐고위험유전인자를발굴하고이들의기능적네트워크를제시함. 위험유전인자의대부분은시냅스연결및전사조절, 신경퇴행, 세포연결에집중적인관련을보였고, 특히시냅스연결및전사조절과정의전반에다양한위험유전인자가분포하였음 (De Rubeis et al., 2014) [ 그림 19]. 그림 19. 자폐환자를대상으로한지놈연구. (a) 액솜시퀀싱을통해밝힌자폐위험유전인자네트워크. (b) 시냅스기능관련자폐위험유전인자모식도. (c) 해당유전자들중전사조절관련후성유전조절자의분포 본연구는기존의인식과마찬가지로자폐범주성장애가굉장히다양한원인이의해서발병할수있음을재확인하였으나, 전체위험유전인자를기능상세가지범주로압축하여제시함으로써향후연구의큰방향을제시함. 68

74 개별자폐위험유전인자연구 앞서살펴본유전체전체에대한자폐위험유전인자발굴연구와더불어발굴된유전자들에대한개별적인연구또한활발하게진행되고있음. 노벨상수상자인스탠포드대학의 Thomas Südhof 교수가 Cell지에발표한논문에서는잘알려진자폐위험유전인자인 Neuroligin-3이반복되는행동을유발하는원인에대해규명함 (Rothwell et al., 2014). 자폐환자의 Neuroligin-3 유전자에서는단일염기돌연변이나유전자의손실등다양한돌연변이가발견되었는데, 이를생쥐모델에서는일관적으로설명할수없었음. 이에 Südhof 교수연구진은기존의 Neuroligin-3 적중생쥐와점돌연변이생쥐와더불어이들의조건적돌연변이생쥐를제작하고, 바이러스유전자도입및두뇌영역 / 뉴런타입특이적 Cre 발현기술과접목시켜다양한행동실험에서그영향을평가하였음. 그림 20. Neuroligin-3 유전자돌연변이에의한자폐병인기전연구. (A) Neuroligin-3 유전자결함에의한도파민수용체뉴런불균형및자폐관련행동유발모델. (B) 뉴런타입특이적으로 Neuroligin-3 돌연변이를야기하는동물제작모식도. (C) 선조체뉴런타입에따른유전자발현패턴의유전체수준분석 이를통해선조체 (striatum) 도파민수용체발현신경세포들이돌연변이형태와무관하게 Neuroligin-3의다양한형태의돌연변이에서공통적인증상의발 69

75 현에핵심적인영역임을규명하고, 이를자폐증연관신경회로로지목함. 나아가선조체뉴런을도파민수용체종류에따라분류하고각각의유전자발현을 PCR array로분석함으로써 Neuroligin-3 손상에의한자폐모델관련유전적변화를유전체수준에서분석함 [ 그림 20]. 또한 Yale 대학의 Flora Vaccarino 교수연구팀에서는자폐범주성장애가뇌발달장애라는점에착안하여인공적으로신경발달을모델링하는삼차원오가노이드배양 (organoid culture) 에서자폐위험유전인자를연구함 (Mariani et al., 2015). 이를위해원인이밝혀지지않은자폐환자와그들의정상가족의조직에서유도만능줄기세포를제작하고, 이를신경오가노이드로배양하면서 RNA 시퀀싱기법으로유전인자를발굴하였음. 여기에서 FOXG1 유전자가강력한후보유전자로제시되었으며, FOXG1 유전자가 GABA 뉴런발달을과도하게증가시켜자극 / 억제균형이붕괴됨으로써자폐범주성장애가생길가능성을제시함 [ 그림 21]. 그림 21. 유도만능줄기세포및오가노이드를통한유전자연구. (A) 일반인에서유래한오가노이드 ( 왼쪽 ) 과자폐환자에서유래한오가노이드. (B) 오가노이드에서분석한유전체정보를기존데이터베이스상에서분석해 FOXG1 유전자를핵심자폐위험유전인자로지목. (C) FOXG1 유전자발현억제시 ( 우측회색막대 ) 자폐환자오가노이드의억제성뉴런마커발현 ( 중앙검은색막대 ) 이정상인수준으로감소함 ( 좌측흰색막대 ) 70

76 자폐범주성장애의치료법개발현황 현재까지자폐범주성장애의치료목적으로미국 FDA 승인을받은치료법은도파민길항제인리스페리돈 (risperidone) 과도파민작용제인아리피프라졸 (aripiprazole) 뿐이며, 이들역시원인치료가아닌증상치료를위해쓰이고있음 (Sahin and Sur, 2015). 자폐범주성장애는앞서살펴본바와같이발병원인과증상이다양하기때문에자폐전반에대한치료제보다는환자개인에맞는맞춤형치료제개발이요구됨. 예를들어, X 염색체의구조적돌연변이에의해발생하는취약 X 증후군 (Fragile X Syndrome) 는과잉행동, 불안장애등과더불어자폐증상을수반하기에자폐범주성장애의한원인으로분류됨. 이증후군을모사한동물모델에서는대사형글루탐산수용체 (mglur: metabotropic glutamate receptor) 활성화에따른신호전달경로에여러가지문제가발생하고, 이를통제하는것이증후군의각종증상경감효과를보임 (Krueger and Bear, 2011). 주요거대제약회사에서는이를타겟으로하여신약개발경쟁을진행중이며로쉐 (Roche) 사의바심글루란트 (Basimglurant), 노바티스 (Novartis) 사의마보글루란트 (Mavoglurant), 어덱스 (Addex) 사의디프라글루란트 (Dipraglurant) 가임상실험중에있음 (Scharf et al., 2015). 그밖에도신경펩타이드인옥시토신 (oxytocin) 처리가자폐범주성장애치료제로시험중이라는사실은주목할만함. 옥시토신은포유류의짝짓기행태, 모성행동, 다른동물을기억하는것과같은다양한사회적행동에중요하다는것이알려져있는데, 옥시토신은사람의비강에분무하는경우사회적신뢰감, 시선응시정도, 상대의감정을읽는능력등전반적사회적능력을향상시키는것이잘알려져있음. 뿐만아니라자폐동물모델에서도옥시토신투여혹은옥시토신뉴런활성화가사회성개선에효과가있는것이나타남. 예컨대 UCLA의 Geschwind 교수가 2015년 Science Translational Medicine에발표한연구에서는자폐위험유전인자의하나인 Cntnap2 (contactin-associated protein-like 2) 유전자적중생쥐가보이는사회성결여가옥시토신투여를통해개선됨을보고함 (Penagarikano et al., 2015). 나아가 2015년 10월에는호주시드니대학의 Guastella 교수연구팀이분무식옥시토신장기투여에의한자폐범주성장애개선을보고하여기대감을높 71

77 이고있음 (Yayawara et al., 2015). 하지만사람을비롯한동물에서비강옥 시토신투여법의경우작용위치와기전이알려지지않은상태이므로과학 적, 임상적추가연구가필요함. 그림 22. 자폐범주성장애치료제개발현황. (a) 취약 X 증후군등치료목적으로임상실험진행중인대사형글루탐산수용체활성제목록. (b) 자폐모델생쥐 (Cntnap2-/-) 에서옥시토신처리에의한사회성개선. (c) 장기간의옥시토신비강분무에의한자폐환자사회성개선결과 자폐범주성장애에서보이는일주기리듬장애 전술하다시피자폐범주성장애는다양한원인으로일어나고, 동시에다양한종류의증상이환자개인에따라복잡한형태로함께나타남. 이중에서도 40-80% 에달하는많은자폐범주성장애환자가수면장애를함께겪는다는사실은주목할만함 (Tordjman et al., 2015). 수면장애로인해정상적인뇌발달에필요한수면을취하지못하면자폐증상을심화시킬뿐아니라자폐환자보호자및간병인의부담을가중하기때문임. 자폐증환자에서는일주기리듬의형성과유지에핵심적역할을수행하는호 72

78 르몬인멜라토닌 (melatonin) 과코티졸 (cortisol) 의수치가비정상으로보고된바있음 (Tordjman et al., 2005; Tordjman et al., 2014). 아울러프랑스에서발표된연구에서는일부자폐환자에서멜라토닌합성에관련된유전자의이상이발견되기도하였음 (Melke et al., 2008). 하지만이와관련한과학적인이해는미진한수준으로체계적인임상연구와함께기전연구가시급한실정임. 그림 23. 자폐범주성장애에서흔히함께나타나는일주기장애. (A) 정상아동에비해짧은자폐아동의수면시간. (B) 자폐환자에서흔 히나타나는멜라토닌일주기성이상 (Humpreys et al., 2014) 기술활용전망 자폐범주성장애진단율은유례를찾아볼수없는정도로급격한증가세를보이고있음. 이에대처하기위해선도그룹에서는대규모유전체분석을위한공조체제를구축하였고, 최근급속히발달한첨단유전체분석기술을이용하여자폐위험유전인자발굴및개별유전자분석, 치료제개발에나서고있음. 자폐범주성장애가무척다양한원인에의해야기되는질환이며사회성결여와같은핵심적증상이외에수반되는증상이다양하고개인차가크기에, 자폐범주성장애의치료법은다른뇌질환에비해환자맞춤형의성격이강할것으로전망됨. 한편, 일주기성장애는자폐범주성장애와깊은연관관계를보이며, 자폐환자에서발견되는일주기리듬장애는병세심화를촉진할가능성이크고사회적부담을증가시키지만, 이분야의이해는위험유전인자발굴등여타분야에비해미진한실정임. 한국의자폐범주성장애발병률은세계최고수준이며, 이를해결하기위한 73

79 맞춤형전략이절실한실정임. 한국인자폐환자를대상으로한유전체연구등국제적선도그룹의전략을도입하는추격형연구와더불어상대적으로블루오션이라고할수있는자폐범주성장애와일주기생체리듬이상의연관관계규명을통한선도적인연구가수반되었을때자폐범주성장애해결에국제적경쟁력을갖출수있을것으로예상됨. 4. 일주기생체리듬의시스템생물학적연구 가. 오믹스기반분자생체시계기전 / 기능연구 일주기생체시계의작동원리와시스템생물학적연구 단일세포수준에서기능유전자네트워크의발현을분자생체시계가일주기적으로동기화 (synchronization) 하며, 동시에 SCN의중추생체시계가하위국부생체시계를자신의위상에동기화하는위계적인조절구조가일주기생체리듬의근간이라는사실이규명되면서그분자기전에대한시스템생물학적연구가크게각광받고있음. 주지한바와같이분자생체시계는기본적으로전사-해독분자네트워크를기반으로하며, 각각세포들이발현하는기능유전자중 5~30% 는분자생체시계의직 간접적인조절하에일주기적으로발현된다는사실이밝혀졌음. 유전자발현뿐만아니라그결과로생성되는단백질및대사산물역시일주기적으로조절된다는사실로부터전사체 (transcriptome), 단백체 (proteome), 후성유전체 (epigenome) 및대사체 (metabolome) 를아우르는다중오믹스분석과그결과로얻어지는방대한정보에대한생물정보학적분석이일주기리듬연구분야의핵심이슈로떠오르고있음. 이에따라분자수준에서생리 / 행동을아우르는일주기리듬을통합적으로이해하고자하는다중오믹스연구의일종인 Circadiomics 라는학문분야가새롭게태동하고있음 (Eckel-Mahan et al., 2012; Partel et al., 2012). 특히후성유전체학 (epigenetics) 의발달에힘입어분자생체시계에의한다수유전자의통합조절기전에대한연구가활발히진행되면서, 반대로역동적인유전자발현의후성유전학적조절기전에대한생물학적이해의폭을크게신장함 (Koike et al., 2012; Vollmers et al., 2012). 이와더불어차세대염기서열분석 (Next-generation sequencing, NGS) 기술의 74

80 비약적발전에힘입어나타난 RNA-Seq, ChiP-Seq 등의분석기술과정량적단백체, 대사체분석기술의개발결과, 이들의일주기성을보다경제적이고, 안정적으로측정할수있게됨으로써데이터베이스구축을통한시스템생물학적분석이분자생체리듬의출력경로와기전을연구하는데에있어서필수적인요소가되고있음. 그결과구축된데이터베이스로는대표적으로 1다양한조직을대상으로한일주기적전사체발현정보를중심으로구축된 CircaDB ( 펜실베니아대의 Hogenesch 교수팀 ), 2다중오믹스분석기법을바탕으로하는 CircadiOmics (UC 어바인의 Sassone-Corsi 및 Baldi 교수연구팀 ), 3사후뇌조직과사망시각을바탕으로구축된일주기성뇌전사체발현데이터베이스인 Pritzker 뇌신경질환데이터베이스 ( 코넬대, 스탠포드대등 5개대학이구성한 Pritzker 뇌신경질환컨소시움 ) 등을들수있음. 일주기적전사체발현분석과후성유전체학적기전연구 2000년대중반이후마이크로어레이및 RNA-Seq 분석법이일반화되면서전사체수준에서일주기적인 RNA 발현양상에대한방대한정보가수진ㅂ되고있음. SCN 중추생체시계, 대뇌피질, 뇌하수체, 간, 폐, 심장, 신장, 췌장, 부신등다양한조직을대상으로일주기적전사체발현양상이조사되었음. 특히간조직의경우획득이용이하고, 분자생체시계의진폭이매우크기때문에분자생체시계에의한전사체수준의하위유전자조절기전연구에폭넓게사용되고있음. 2012년 Salk Institute의 Panda S. 박사팀은간조직을대상으로 RNA-Seq 분석기법을이용하여 coding/non-coding RNA의일주기적발현양상을분석하고, 이들의유전자에대한후성유전체학적분석결과와비교 분석함으로써일주기적전사조절및 cis-element를중심으로한후성유전학적조절기전에대한핵심원리를제시하였음 (Vollmers et al., 2012) [ 그림 24]. 해당연구에서 Panda 박사연구팀은기존의일주기성 mrna 뿐만아니라 microrna를포함한다양한 non-coding RNA들중상당수가일주기적으로발현된다는사실을보고함. 특히다수의유전자좌위에서 sense 및 anti-sense RNA가동시에일주기적전사조절을받고있다는점을입증함. 이상의전사체분석결과를유전자발현활성의지표가될수있는히스톤단백질의변조양상과비교 분석하였는데, promoter 영역에서히스톤 H3 단 75

81 백질의 H3K4me3, H3K9ac 및 H3K27ac 등의변조양상이일주기적전사조절과매우유사한양상으로역동적으로변화하고있음을입증함. 특히 H3K4me3 변조양상분석을통해기존의 mrna 외에도다양한일주기성 non-coding RNA를동정하였음. 그림 24. 일주기성유전자의프로모터영역에서관찰되는히스톤단백질의다양한변조양상과 RNA 발현수준과의상관관계분석결과 이와더불어 enhancer element들이위치하는영역에서는히스톤단백질의 H3K27ac 변조가근처에위치하는일주기성유전자혹은유전자군의전사활성과강한상관관계를보인다는사실을증명함. 일주기성전사인자의 DNA 결합활성의역동성규명 비슷한시기에텍사스대 Takahashi 교수연구팀은역시간조직을대상으로 76

82 일주기적유전자발현을촉발하는핵심전사인자들의하위유전자프로모터에대한결합양상을 ChIP-Seq 기법을이용하여분석함으로써전사인자의 DNA 결합자체가일주기적으로조절된다는사실과그결합부위를유전체수준에서규명함 (Koike et al., 2012). 그림 25. 하루중시간대에따른일주기성전사인자의작동지도 이상의연구결과를바탕으로 Takahashi 교수팀은일주기적인전사인자결합 지도를제시함 [ 그림 25]. 일주기생체리듬에대한단백체학적접근 2차원전기영동및 LC-MS/MS 등을이용한 peptide fingerprinting 기법등의기술을바탕으로단백체학이발전해왔으나, 여전히정량분석이약점으로지적되어왔기에역동적인변화양상분석이필수적인일주기생체리듬연구분야에서전사체에비해단백체에대한연구가상대적으로늦었음. 하지만최근에는이러한단점을보완할수있는 Stable-Isotope Labeling by Amino acids in Cell culture (SILAC) 기술이개발되어정량적단백체분석이가능해지면서일주기적단백체분석연구성과가도출되기시작함. SILAC 기술은단백질의특정리신아미노산을동위원소로표지한 reference 세포또는조직을이용하게되는데, 표지되지않은단백질과질량분석을통해두 77

83 그룹간단백질의정량적비교가가능하도록하는방법임. 최근 SILAC 기술을이용한정량적단백체분석기술을이용하여 SCN 및간조직에서일주기적으로발현되는단백질군을동정하고, 이를 RNA 발현양상과비교 분석함으로써일주기분자리듬생성에있어서전사후조절과정및해독후조절과정에대한중요정보를규명하였음 (Mauvoisin et al., 2014; Robles et al., 2014) [ 그림 26]. 그림 26. SILAC 기반일주기성단백체분석연구 정량적인단백질의발현변화가매우중요한요소이긴하지만 RNA와는달리단백질간의상호작용 (protein-protein interactions) 이시간의존적으로어떻게변하는지에대한정보역시기능연구에핵심적임. 그럼에도불구하고생체시계단백질상호작용에대한오믹스수준의연구는현재까지도매우제한적으로만진행되고있음. Genome-wide 단백질상호작용연구는전통적으로 yeast two-hybrid 방법또는면역침강법 (Immunoprecipitation) 을통해얻어진단백질을질량분석방법으로확인하는방법이주로사용되고있는데, 최근중추생체시계단백질및이와연관성이높은 46종의단백질을중심으로단백질상호작용네트워크를분석한연구결과가발표됨 (Wallach et al., 2013) [ 그림 27]. 독일샤리테의과대학의 Kramer A. 교수연구팀은총 11,040 (46 preys X 46 baits and 6 independent combinations) 조합의상호작용을조사하여 150 조합의상호작용을확인하였고, 기존에알려지지않은 109 조합의상호작용을 78

84 새롭게동정하였으며, 이들의일주기적조절양상을검증함. 그림 종의생체시계단백질및유사단백질을중심으로한단백질-단백질상호작용네트워크규명 또한본연구결과에대한생물정보학적심화분석을통해 24 종의중추생체시계단백질을포함하는 134 핵심단백질들사이에서 625 조합의단백질상호작용네트워크를완성하고, 이를하루중시간대에발현양상결과와비교함으로써일주기적인단백질발현양상과단백질상호작용변화양상을통합적으로분석함. 이상의예시와같이다양한수준의오믹스기반빅데이터들이수집되고, 이들을통합하는연구들이활성화되면서분자, 세포수준에서일주기생체리듬생성원리에대한분자네트워크관점의이해를심화하고, 이를기반으로신규분자표적발굴및 drug repositioning과같은활용기술개발연구가미국을중심으로확산되고있음. 나. 주요데이터베이스소개 전술한바와같은오믹스기반분자생체리듬연구가활발해지면서 2010년대에접어들어서는도출되는빅데이터들을체계적으로수집하고, 통합적으로분석하려는시도들이이어지고있음. 특히생각했던이상으로광범위한기능유전자들이분자생체시계의전사조절인자들에의해일주기적으로조절된다는사실이널리받아들여지면서, 이제는일주기분자리듬의분석에있어서시스템생물학적접근이필수불 79

85 가결한요소가되고있음. 본절에서는현재일주기생체시계연구를통해조출된빅데이터의수집및이를기반으로하는활용연구를선도하고있는선도연구진이구축한데이터베이스를소개하고자함. CircaDB (Circadian Gene Expression Atlas): 펜실베니아대 Hogenesch 교수팀 CircaDB는 Hogenesch 교수의주도로다양한생쥐 / 인체조직및세포주들을대상으로규격화된일주기적전사체발현조사및이에대한통계적분석을통해획득한결과들을바탕으로구축된유전자발현양상데이터베이스임. 그림 27. CircaDB ( 2014년말부터공개된 CircaDB는현재 14종이상의생쥐혹은인간유래조직및배양세포주의일주기적 RNA 발현양상을수록하고있는데, 마이크로어레이및 RNA-Seq 기법을기반으로획득한전사체발현양상에대해 JTK_Cycle, Lomb Scargle 및 DeLichtenberg 등 3종의족립적인알고리즘을이용하여통계적으로유의한수준의일주기성을나타내는유전자들을도출하였으며, Cytoscape 및 REACTOME DB 기반의생물정보학적경로분석결과를함께제공하고있음 (Zhang et al., 2014). Hogenesch 교수팀은 CircaDB의공개와함께발표한논문을통해단백질코딩유전자의 43% 가조직특이적으로, 즉다양한조직중어딘가에서는일주 80

86 기적으로발현된다는사실을발견하였으며, 1,000 종이상의일주기성 ncrna 를발굴하였음 [ 그림 28]. 그림 28. 각조직간일주기성유전자비교결과 흥미롭게도일주기적으로발현되는 RNA들은 mrna/ncrna를막론하고생쥐와인간사이에상당히높은진화적보존성을나타내고있으며, 40% 이상의유전자들이질환연관유전자로기보고된것이며, 25% 이상의일주기성유전자들이이미약물표적으로사용되거나, 개발되고있는유전자들이었음. 실제로 2014년기준 100대베스트셀러약물중 23종의표적이일주기적발현을보이는유전자를표적으로하고있으면서, 약동력학적으로짧은 half-life 를가지는것이었음. 이같은사실을바탕으로 Hogenesch 연구진은이들의효능이극대화될수있는최적의투약시간을제시함으로써 chronotherapy 전략을제안함 [ 그림 29]. 이상의결과는일주기적유전자발현지도가 1신규약물표적의발굴, 2기존약물의효율적투여전략수립및 3기존약물의 repositioning 등에활용될수있음을강력히시사함. 81

87 그림 29. 일주기성단백질을표적으로하는주요약물현황 이러한활용잠재성을인정받아 Hogenesch 연구팀은 2014년부터연간 20억원규모의 NIH 연구비를수혜하여 CircaDB의보강및유용정보도출연구를수행하고있는데, 최근에는본데이터베이스를이용하여심근병증에관련한핵심조절인자 / 신약표적을발굴하기도함. CircadiOmics: UC 어바인의 Sassone-Corsi 및 Baldi 교수팀 전술한 CircaDB가다양한세포 / 조직의일주기적전사체발현양상에주력하는데이터베이스라면 CircadiOmics는다양한수준의오믹스기술을복합적으로분석하는다중오믹스분석알고리즘에기반을두고있음. CircadiOmics는공개데이터베이스및문헌자료로부터수집되거나, 실제실험을통해생성된데이터세트의유전체, 후성유전체, 전사체, 단백체및대사체수준의일주기적변화정보를통합적으로분석함으로써분자네트워크를도출하고, 최종작용물질인단백질혹은대사산물의일주기적조절양상과그를통해예상되는생리적 기능적변조양상을예상함 (Patel et al., 2012) [ 그림 30]. 본연구진은기계학습기반분석알고리즘개발과정에서생쥐의간조직을대상으로한전사체-대사체통합분석을통해대사산물의일주기적변화양상과전사체기반의조절기전을제시하였음 (Eckel-Mahan et al., 2012). 82

88 그림 30. CircadiOmics 을이용한일주기적세포대사경로분석예시 ( CircaDB와달리아직전체알고리즘이완성된것은아니기때문에실용화연구성과는없으며, 2016년 4월현재 metabolite 기반의분석기능은정지된상태임. 알고리즘의재조정과정인것으로추정됨. 사후뇌전사체발현양상데이터베이스 : 프리츠커뇌질환연구콘소시움 (Pritzker Neuropsychiatric Disorders Research Consortium) 프리츠커뇌질환연구콘소시움은미시간대, UC 어바인, 스탠포드대, 허드슨알파연구소, 코넬대등의연구진들이구성한컨소시움으로우울증, 조울증및조현병을중심으로정신질환의주요표적뇌영역을대상으로인간및영장류뇌조직의전사체발현양상, 사망시각및질환정보를포함하는통합적인정신질환전문뇌유전체 / 전사체데이터베이스임 [ 그림 31]. 일주기적인유전자발현의흔적은사망시각에따라사후뇌조직에서도측정할수있음. 따라서사망시각에따라각검체에서측정된사후 RNA 발현수준을배열한후, 비선형회귀분석을통해일주기적유전자발현양상을추정하는방식을이용함 [ 그림 32]. 2013년주요우울증환자와대조군의사후뇌전사체발현양상을비교 분석하여우울증환자의뇌영역에서나타나는일주기적유전자발현의동기화및주기성의약화현상을인체뇌조직에서는처음으로규명함으로써우울증 83

89 발병과일주기생체시계의연관성을제시하였음 (Li et al., 2013). 그림 31. Pritzker Neuropsychiatric Disorders Research Consortium ( 하지만본컨소시움의데이터를현재는참여연구자들에게만제공하고, 논문화된극히일부의결과만을공개하는등폐쇄적으로운영되고있음. 그림 32. 사후뇌조직에서측정되는일주기적유전자발현의흔적 84

90 5. 일주기분자생체시계제어기술개발현황 가. 일주기생체시계의화학적조절제개발현황 표적기반화학적조절제개발현황 그림 33. Chemical Chronobiology: 생체시계기반신약후보물질개발전략 일주기생체리듬과분자생체시계로대표되는 24시간주기의내재적변화는낮과밤의일정한흐름을인간에서부터박테리아에이르는대부분의생물체들이받아들임으로써만들어진생물들의일정한리듬임. 전술한바와같이일주기리듬은단순히낮과밤을인식하는것뿐만아니라오랜시간동안의연구에의해대사성질환, 뇌질환, 심장질환또는종양과같은다양한질병과연관되어있다는것은이미주지의사실임. 따라서비정상적인일주기리듬을조절하거나이를관장하는단백질들의기능을조절함으로써, 다양한질병들을치료할수있을것임. 최근일주기생체리듬활용기술개발동향을보면 REV-ERBα 또는 RORα 등을조절하는저분자화합물들의개발이활발하게이루어지고있으며, 중추고리에포함되어있는 CRY와같은단백질에직접작용하여, 일주기생체리듬을조절하는저 85

91 분자화합물들도보고되고있음. 이와같이일주기생체시계를표적으로하는화학적조절제개발연구는 circadian parameter를측정할수있는 high-throughput screening 방법과 structural chronobiology의발달로가속화되고있음 [ 그림 33]. 1 REV-ERBs (NR1D1/2) 를표적으로하는화학적조절제 REB-ERBs의화학적조절제로 natural ligand인 hemin, chemical agonist인 GSK4112, protein destabilizer로 lithium chloride가발굴된후일주기리듬분야선도그룹을중심으로 REB-ERBs 조절제개발연구가활발히이루어져왔음. GSK4112는최초의 REB-ERBs에대한 synthetic ligand로알려져있는데처음보고될때만해도충분히 characterize되어있지못했기에스크립스연구소 /Saint Louis 의과대학 Thomas P. Burris 교수연구팀은독립적으로 SR6452로명명하였음. 나중에타연구그룹들에서 GSK4112에의한 REB-ERBs 조절및그영향에대한논문이보고되면서 GSK4112로계속해서명명되었고 Burris 연구팀에서도그뒤로는 GSK4112로명명하기시작하였음. GSK4112는약동학적으로부적절한 profile을보였기때문에복강내투여하였을때매우약한 in vivo REB-ERBs agonism을보임. REB-ERBs에대한화학적조절제의적응증에대한연구중 Burris 그룹의연구결과가가장주목할만한데, Burris 연구팀은 GSK4112의 scaffold를기반으로하여 in vivo에서충분한 REB-ERBs agonism을나타낼수있는화합물인 SR9009와 SR9011을합성하여보고하였음. SR9009와 SR9011은 GSK4112와비교하였을때 potency, efficacy, pharmaco -kinetic profile 모두향상된것으로확인되었음 (Solt et al, 2012). 또한 Burris 연구팀은 synthetic REB-ERBs modulator의개발및적용연구를지속하여최근유방암 (Wang et al. 2015), 동맥경화 (Sitaula et al. 2015) 등에유효한효과가있음을입증하였음. 최근 GSK 연구팀에서도 GSK4112의 scaffold를기반으로의약화학적접근법을통한최적화연구를통해 in vivo에서 potency, selectivity, bioavailability가개선된 GSK2945, GSK0999, GSK5072, GSK2667을연이어합성하여보고하였음 (Trump et al. 2013). 또한이탈리아의 Grimaldi 연구팀에서는 REB-ERBs와 autophagy의 dual 86

92 inhibitor인 ARN5187을개발하여항암효과를증명하였음 (Torrente et al, 2015). 현재 REB-ERBs 길항제로보고된화학적조절제는 Burris 그룹에서개발한 SR8278이유일함 (Kojetin et al, 2011). SR8278은 heme과 GSK4112에의해활성화된 REB-ERBs에의한 glucose-induced insulin secretion을억제하는것으로확인되었음 (Vieira et al, 2012). 2 ROR을타겟으로하는화학적조절제 그림 34. 선택적인 ROR ligand 개발전략. Nuclear receptor superfamily 에대한 screening 을통해 LXR 효현제인 T 이 ROR ligand로확인되었고 T 에대한의약화학적접근을통해선택적 ROR ligand인 SR1078, SR1001, SR2211이개발되었음. 최초의 ROR ligand는 melatonin과 CGP52608임 (Wiesenberg et al, 1998; Missbach et al. 1996). 최근 LXR 효현제인 T 이 ROR ligand로확인되었고 (Houck et al. 2004), T 에대한의약화학적접근을통해선택적 ROR ligand인 SR1078, SR1001, SR2211 등이개발되었음 (Kojetin et al. 2014) [ 그림 34]. 그외에 digoxin (Huh et al. 2011), ursolic acid (Xu et al. 2011) 등의 natural ligand들이 RORγ에대한 inverse agonist로확인되었으며, 다수의 arylamide 류가 RORγ의효현제로알려져있음. 87

93 3 생체시계단백질인산화효소를표적으로하는화학적조절제 단백질인산화효소는다양한생리활성을조절하는것으로알려진 global regulatory enzyme이며이들은일주기생체리듬의조절에도관여하는것으로알려짐. 이중 CKI 억제제들이 reporter cell에서주기를증가시킨다는사실이알려진후 (Ralph and Menaker, 1998), CKIε 억제제 (PF ), CKIδ 억제제 (PF ), GSK-3β 억제제등특정 isotype에선택적인화학적조절제들이개발되어왔음 (Walton et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2009, 330:430, T. Hirota et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 2008, 105:20746.). 일본의 Uchiyama 연구팀은 84종의 kinase 억제제에대한 screening을통해 CKIε/δ 억제제 (IC261), CKII 억제제 (DMAT), PI3K 억제제 (LY294002), JNK 억제제 (SP600125) 등다수의단백질인산화효소억제제가일주기생체리듬의조절에관여하는것을확인하였음 (Yagita et al. 2009). 나. 분자생체시계조절물질발굴플랫폼현황 전사활성기반스크리닝전략 전술한바와같이분자생체시계는중추고리를구성하는 Per, Cry 유전자의프로모터영역에존재하는 E-box element에의존적인 CLOCK/BMAL1 이합체전사활성에촉발되고, 그산물인 PER, CRY 단백질이이를억제하는 negative feedback loop을통해작동함. 따라서세포수준에서 E-boxluciferase (E-box-Luc) 리포터를사용하여 CLOCK/BMAL1의전사활성을측정함으로써일주기생체시계의화학적조절제를발굴할수있음. 가장선도적인예로는 Antoch 교수연구팀은 CLOCK/BMAL1 이합체의전사활성을강화할수있는화합적조절제를탐색하였는데, 1280개의화합물중 Per1 프로모터활성에대한 14개의억제제와 17개의효현제를발굴한초창기보고를들수있음. 이중에는 forskolin (PKA 활성제 ) 와글루코코르티코이드등이미알려진일주기생체시계조절제들이포함되어있음 (Gorbacheva et al. 2005). 국내에서도본과제연구자들을포함한서울대학교김경진 / 서영거교수공동연구팀이변형된 E-box-Luc 리포터를발현하는섬유아세포주를이용하여 88

94 1000여개의약물성화합물로구성된 chemical library로부터약 70여개의잠재적일주기생체리듬조절제를도출하였으며, 그중 CRYs의저해제인 2-ethoxypropanoic acid 유도체를도출함 (Chun et al. 2014). 후속연구에서는 CRYs가종양억제유전자의발현을조절한다는보고에착안하여도출된일주기생체리듬조절제의항암제로서의잠재성을평가하기도하였음 (Lee et al. 2013; Chun et al., 2016). 일주기성표현형기반스크리닝전략 세포수준에서일주기분자생체리듬은 Bmal1이나 Per1/2 프로모터등을이용한분자생체시계의존적인리포터를사용함으로써측정할수있음. 뿐만아니라 Per2::Luc KI 생쥐로부터획득한조직이나세포는 PER2-LUC fusion protein이발현되어있기때문에역시일주기생체리듬을단백질수준에서측정할수있음. Peter Schultz 및 Steve A. Kay 교수의공동연구팀은 Bmal1 프로모터에의해유도되는 Luc 리포터 (Bmal1p-Luc) 를발현하는 U2OS 세포주를이용하여 circadian period를농도의존적으로늘리거나줄이는 11개의화합물을발굴하였는데, 당시발굴된대부분의화합물이단백질인산화효소활성에영향을주는것으로확인됨 (Hirota et al. 2008). 또한도쿄대 Ueda 교수연구팀역시 Schultz/Kay 연구진과동일한 chemical library를이용하여 NIH3T3 섬유아세포와 U2OS Per2-Luc 리포터세포주를이용하여 circadian period를늘리는 10개의화합물을발굴하였음 (Isojima et al., 2009). Schultz/Kay 공동연구팀은후속연구에서 Bmal1p-Luc 리포터를발현하는있는동일세포주를이용하여 12만개에달하는 chemical library에대해서대규모스크리닝을통해 circadian period에영향을주는 longdaysin 등다수의화합물을발굴하였으며 (Hirota et al. PLoS Biol. 2010, 8:e ), 계속된스크리닝연구를진행하여 2년뒤에는 5만개의약물성화합물로구성된 chemical library에대한연구를통해 LH846 등을발굴하였음. LH846의약물표적은 CKIδ로확인되었으며일주기진폭에는영향없이주기만을증가시키는것으로나타남 (Lee et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50:10608.). 일주기생체리듬분야의선도연구자인텍사스대 Takahashi 교수연구팀에서 89

95 도 Per2::LucSV 리포터를갖는섬유아세포주를이용하여 20만개의화합물로이루어진 chemical library에대한대규모스크리닝연구를수행하였는데, 530 여개의 1차선도물질로부터일주기생체리듬에농도의존적효과가있는 11 개의화합물을발굴하였음 (Chen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 2012, 109:101.). 가장주목할만한화합물발굴연구는 Schultz 교수와 Kay 교수의공동연구로, 이공동연구팀은후속연구에서 6만여개의화합물로구성된 chemical library에대한대규모스크리닝연구를통해최초로 core clock component인 CRY에직접적으로결합하는 KL001을발굴하였음 (Hirota et al. Science, 2012, 337:1094.). Structural chronobiology 기반생체시계조절제최적화플랫폼 그림 35. Structural chronobiology: 생체시계단백질에대한구조적 / 생화학적분석을통해 in silico 리간드발굴및최적화 최근일주기생체리듬의화학적조절제를발굴및개발하기위한플랫폼으로주목받고있는것은 Structural chronobiology 기반화합물최적화플랫폼임 [ 그림 35]. X-ray crystallography 등관련기술의발달로분자수준의다양한구조정보 90

96 가보고되면서일주기생체시계에관여하는단백질을분자표적으로한 in silico drug design이가능하게됨. PER 단백질의 PPI를위한 PER-ARNT-SIM domain의구조정보 (Yildiz et al., 2005; Henning et al., 2009), CLOCK/BMAL1 이합체의구조정보및저분자물질결합모델링 (Huang et al., 2012), FBXL3-CRY2 복합체의구조정보 (Czarna et al., 2013; Schmalen et al., 2014), CRY1 구조정보및 KL001 결합모델링연구등을통해신규조절제개발및기존조절제의최적화연구가활발히진행되고있음. 신규화학적조절제발굴플랫폼 : 일주기리듬이식모델 일주기생체리듬에대한화학적조절제개발연구는확립된일주기리듬모델을필요로함. Takao Kondo 교수연구팀은 KaiA, B, C 그리고 ATP를이용하여, in vitro 상에서 Cyanobacteria의일주기생체시계분자네트워크를재현한바있음. KaiC 단백질은낮동안 KaiA 단백질의영향으로 autokinase 기능이활성화되어인산화상태가증가하며, 밤동안은 KaiB 단백질이 KaiA 단백질을억제하며, 그결과 KaiC 단백질의인산화가감소함. 이러한 oscillation은유전자의발현영향을주어특정유전자의발현이주기적으로증가하거나감소하면서생리활성을조절하게됨. 최근 Harvard Medical School의 Pamela Silver 교수연구팀은 KaiA, KaiB 그리고 KaiC 단백질을일주기리듬이없는장내세균인 E. coli에발현시킨후, 일주기리듬을이종생물에이식하여일주기리듬모델을확립할수있음을증명한바있음. Cyanobacteria의일주기분자생체시계는고등생물들보다간단한구조이지만 KaiA, KaiB 그리고 KaiC로명명된세가지단백질들이서로영향을주면서일주기리듬을조절한다는사실이밝혀져있는데, Silver 교수연구팀이 Synthetic biology 기술을통해확립한 E. coli 일주기리듬모델은확연한 24 시간주기의일주기리듬을나타냄 (Chen et al., 2015) [ 그림 36]. 최근의연구에의하면, feeding rhythm과관련이있는것으로알려진장내세균총의일주기리듬이상은숙주의위장관질병또는비만이나포도당과민증과같은대사성장애와관련이있는것으로보고되고있는데, Silver 교수연구팀의해당연구성과를이용하여, 장내세균총의일주기리듬을제어 91

97 함으로써이러한질병들에의한위장관부조화등에대한새로운치료법을 개발하고있음. 그림 36. Silver 교수연구팀에의해 E. coli 에이식된 Cyanobacteria 일주기리듬모델. (A) Pamela Silver 연구팀의 circadian rhythm 이식모형도, (B) Cyanobacteria circadian-responsive promoter 에의한리포터 fluorescence 의 kai clock 유무에따른발현정도차이, (C) E. coli의 house keeping gene인 ifhb의 promoter 에의한리포터 fluorescence 의 kai clock 유무에따른발현정도차이 합성생물학적으로구성된일주기분자생체시계를이용하여특정주기에따라약물이자동적으로전달될수있는 drug delevery 기술개발이진행되고있으며, 같은방식으로산업적으로사용되는미생물의활동을조절하는기술역시활발히연구되고있음. 이러한신기술이상용화되기까지여전히많은기술적장벽들이존재하지만거시적인관점에서보면, 이러한미생물의일주기생체시계뿐만아니라, 정상적인인간의일주기생체시계를비정상적인일주기성을가지는환자에게주입함으로써이에기인하는다양한질병들의치료에도활용할수있을것으로기대됨. 예를들어이러한단일세포수준의일주기분자생체시계이식기술을통해 92

98 일주기리듬의이상이발생한종양세포의분자생체시계를정상화함으로써암세포의사멸을직접적으로유도하거나기존의치료법들이좀더효율적으로작용할수있도록도와주는역할을할수있을것으로기대됨. Silver 교수팀이제안한개념은장기를개체간에이식하는것과같이일주기생체리듬을한개체에서다른개체로, 혹은세포간에이식함으로써비정상적인일주기리듬을조절하거나, 새로운일주기리듬을만들어질병을치료하고자하는기술임. 6. 일주기생체시계분야산업화동향 가. 일주기생체시계관련제약기업동향 미국 Reset Therapeutics 사 미국 Salk 연구소의 Ronald Evans 박사, Texas Southwestern Medical Center 의 Joseph Takahashi 박사와 Masashi Yanagisawa 박사, 벤처캐피탈회사인 Bay City Capital 등이 2008년공동으로창업한일주기생체시계전문벤처회사임. KL001 개발자인 Steve Kay 교수와 Peter Schultz 교수가이사진으로참여하고있음. 그림 37. Reset therapeutics 사의신약개발플랫폼 Reset Therapeutics사의신약개발플랫폼은일주기생체시계화학적조절제발굴로부터시작됨 [ 그림 37]. 특수한생체시계리포터를갖는세포를이용하여세포수준에서다수의화학적조절제후보군에의한표현형을검색하는 High-throughput 스크리닝기술을보유한것으로알려짐. 선별된화학적조절제선도물질에대해서는역시특수한생체시계리포터를가지는조직을분리하여약물학적효과를검증하고선도물질의직접적인타 93

99 겟이무엇인지확인하는연구를수행함. 선별된선도물질에대해의약화학적접근을통해 focused chemical library를구축한후전임상평가를통해특정질병에대한치료제를선별하고임상으로진입할수있는시스템과기술력을보유한것으로알려짐. Reset Therapeutics는최근 KL001 유도체인 SHP-1의전임상개발에성공함. SHP-1은 CRY의화학적조절제로그적응증은당뇨병, 비만, 대사성질환, 쿠싱병, 녹내장등임. 최근쿠싱병, 제2형당뇨병에대한치료효과를검증하는단계를지나전임상평가에서우수한결과를획득한것으로알려져있음. 그림 38. Reset therapeutics 사의신약개발파이프라인 또한 Reset Therapeutics사는최근 Alkermes사와공동으로수면-각성상태를조절하는신경펩타이드인 Orexin의신규조절제를개발중임. Orexin 조절제의적응증은과수면증과관련된질환으로알려짐. Alkermes사에서 Reset Therapeutics에제공한것으로알려진기술플랫폼은 Medisorb, LinkeRx, NanoCrystal 등체내에서약물이정해진방출속도로특정시간동안방출될수있게하는일종의 long-acting injectable technology임 [ 그림 38]. 다국적제약회사 GSK 다국적제약회사인 GSK사는 REV-ERBs 조절제인 GSK4112를최초로보고한바있으며최근에는일주기생체시계조절제의전임상개발에성공한것으로알려짐. GSK의일주기생체시계조절제는비만등대사성질환뿐만아니라만성폐 94

100 쇄성폐질환 (COPD), 폐기종, 낭성섬유종, 급성순환기장애등염증성질환에도효과를보인것으로알려짐. 또한최근에는 GSK4112의 scaffold를기반으로의약화학적접근법을통한최적화연구를통해 in vivo에서 potency, selectivity, bioavailability가개선된 GSK2945, GSK0999, GSK5072, GSK2667 등을연이어개발하여전임상시험을진행중임. 나. 일주기생체시계관련실용화 / 산업화동향 일주기생체리듬기반약물전달시스템 약물치료시일주기리듬의위상을고려하는치료법인 Chronotherapy (Treatment scheduling) 는일주기생체리듬조절제투여에가장적합한방법임. 따라서일주기생체리듬조절제를이용한실용화, 산업화를위해서일주기리듬을고려한투여방법이꼭필요함. 종래의 DDS 기술 (Modified release drug products) 중 ChrDDS에적용가능한것으로알려진시스템의일반적특징은아래와같음. 1 Extended release: 투여빈도를일반제형에비해 1/2로감소시킬수있음. 2 Controlled release: 서방형제제로투여가능하나용출속도, 시간을조절하기어려움. 3 Sustained release: 용출속도를조절함으로써장기간정해진속도로약물방출이가능한시스템. 4 Prolonged Action: 용출속도를조절함으로써장기간동안약물을공급해줄수있는시스템. 5 Delayed Release: 약물투여후정량의약물을정해진시간에방출시키는시스템. 약물일부가투여직후방출될수있는단점이있. 음 6 Targeted Release: 약물을정해진위치에서방출시킬수있으며 Extended release 제제의특성을포함할수있음. 7 Repeated Action: 약물일부를투여후방출, 일정시간후에약물나머지를방출할수있음. 투여빈도를감소시킬수있음. 신규약물전달시스템개발동향 최근 Chronotherapeutic drug delivery system (ChrDDS) 의개발로일부문제 95

101 가해결되면서실용화를위한기술수준이상당한수준에도달하였음. 대표적동향이 Pulsatile drug delivery system을이용한 ChrDDS 개발사례인데, 이시스템은미리조절가능한시간후에단기간에약물을즉시방출할수있는장점이있는일종의 delayed fast release 제형임 [ 표 7]. 표 7. Marketed products of pulsatile drug delivery system 제형상품명주성분기전적응증 CODAS Verelan PM Verapamil CONTIN Uniphyl Theophylline Extended release capsule Extended release tablet 고혈압 천식 OROS Covera-HS Propranolol Verapamil Extended release table 고혈압 DIFFUCAPS Innopran XL Verapamil Extended release capsule 고혈압 OROS Invega Paliperidone Tablet 조현병 PULSYS Pulsincap Dofetilide Rupturable tablet 부정맥 OROS Concerta Methylphenidate Tablet 정신질환 PULSYS Moxatag Amoxicillin TIMERx OPANA Oxymorphone Multiparticulate system Erodible/soluble barrier 감염증 진통 CEFORM Cardiazem Diltiazem Verapamil Extended release coating tablet 고혈압 약물변형체 Pepcid Famotidine Tablet 궤양 약물변형체 Zocor Simvastatin Tablet 고지혈증 PROCARDIA XL Procardia XL Nifedipine Sustained release 고혈압 Pulsatile drug delivery system의장점은 1약물흡수및생체이용률증가 ( 저용량의약물로동일한효과기대 ), 2Site targeting ( 특히위장관내불안정한약물, ex. peptide, protein 약물 ), 3부작용감소, 4CYP450s 와상호작용감소, 5Food effect 감소, 6순응도 (compliance) 증가, 7Chronotherapy, 또는 Programmed release를통한최적의약물전달시스템구축가능, 8단회투여 96

102 제형으로다중투여효과기대, 9국소투여효과, 10미세환경변화 ( 위장관내 ph, agitation) lumen contents에따른점도 ) 에영향받지않음, 11다양한제형에적용가능 (granules, microspheres, microparticle, tablet, capsule, pellet 등 ) 등을들수있음. 이상적인 Chronotherapeutics 개발을위한최대난관은정해진시간에고농도의약물을방출하고그외의시간동안약물을방출하지않도록억제하는것임. 이를위해최근적용되고있는기술은다음과같음 [ 그림 39]. 그림 39. 대표적인 Pulsative drug delivery systems. OROS는 Covera ( 고혈압치료제 ), DIFFUCAPS 는 Innopran XL( 고혈압치료제 ), PULSYS 는 Pulsincap ( 부정맥치료제 ) TIMERx는 OPANA ( 진통제 ) 로, 일주기생체리듬을고려한치료제로각각개발된바있음. 1 CONTIN: 셀룰로스고분자를휘발성극성용매에녹여알콜과반응하여균일한다공성물질로만든것. 물리화학적변형을통해용해도, 침투성, 약물분배계수의조절이가능함. 고지혈증치료제및항궤양제의 chronopharmaceutics로개발되었음. 2 OROS: 삼투성을조절하여 programmed controlled release 개발. OROS delayed push pull TM system, covera-hs R 등의제형이개발된바있음. 특히 verapamil 제제는 Morning blood pressure spike 개선용으로개발되었음. 3 CODAS: multiparticular system으로투여 4-5시간후약물이방출됨. Verapamil 제제 (Verelan R PM) 개발되었음. 4 CEFORM: 생분해성 polymer와약물배합후 thermal gradient, mechanical 97

103 forces, flow rate 조절을이용한 melting spinning 기술로균일한크기와모양의 microsphere 제조. Diltiazem 제제 (Cardiazem R LA) 개발됨. 5 DIFFUCAPS: Unit dosage form으로제조되어심혈관질환의일주기를모방한혈중농도-시간 profile을만들수있는장점. 고혈압치료제로 Propranolol 제제 (Innopran R XL) 개발됨. 6 TIMERx R : xanthan gum과 locust bean gum을 dextrose에섞어수용액중에서결합력이강한겔제조. 매질중수분침투속도에따라겔형성속도가달라지므로이를이용해약물을방출함. 경구용 oxymorphone 제제가개발중임. 7 3D printing: 3D printing 기술을이용해복잡한 geometry를갖는제형개발가능. Immediate extended release tablet, pulse release, breakaway tablet, dual pulsatory tablet 등개발중이며미래기술로유망함. 8 Controlled release microchip: microfabrication 기술을이용하여개발에요구되는약물방출역학을조절할수있음. 9 PULSYS TM : 빠르게성장하는시기의세균을타겟으로하는 pulsative design. 항생제 amoxicillin 제제를개발중임. 10 SODAS: spheroidal oral drug absorption system. controlled release beads를이용한제형. pulsatile release 설계가능함. 11 IPDAS: intestinal protective drug absorption system. 고밀도약물 beads를정제로찍어낸제형. 위장내에서분해되어장관내고밀도약물 beads 방출. 섭식상태와무관하게약물방출가능함. 12 GEOCLOCK: 소수성왁스로코팅된정제. ph 의존적으로일정시간후약물방출. 류마티스성관절염치료제 Lodotra TM (SkyPharma) 개발됨. Alkermes 사 Alkermes사는중추신경계관련질환에특화된글로벌바이오제약회사로 2011년 Alkermes, Inc와 Elan Drug Technologies의합병으로만들어졌음. Yale 대학의 Floyd E. Bloom 교수와 BMS, GSK 등에서잔뼈가굵은 Wendy L. Dixon 박사가자문을맡고있음. 최근 Alkermes사는 Reset therapeutics사와공동으로 Orexin 조절제개발을진해앟고있고이프로젝트에서약물전달시스템을담당하고있는것으로생각됨. Alkermes사의대표적인기술플랫폼은 Medisorb, LinkeRx, NanoCrystal 등체내에서약물이정해진방출속도로 98

104 특정시간동안방출될수있게하는일종의 long-acting injectable technology 임. 이기술은특히 psychiatric disorder 등중추신경계관련질환에유효하고환자순응도를증가시켜긍정적결과를만들어내는것으로평가됨. 또한 Alkermes사는독자적인중추신경계질환타겟신약개발파이프라인을확보하고있음 [ 그림 40]. 그림 40. Alkermes 사의신약개발파이프라인. Alkermes 사는중추신경계에특화된신약개발파이프라인과관련기술, 특히첨단 DDS 기술을보유하고있는것으로알려져있음. 중국 Soochow 대학교약학대학연구팀 Controlled release 분야전문가인 Soochow 대학교약학대학의 Qingri Cao 교수는최근미세환경반응성탄소나노튜브를이용한약물전달시스템을개발한바있고이기술을 ChrDDS 에적용하는연구를진행중임. 탄소나노튜브는 dendrimers, polymers, liposomes에비해 drug loading capacity가크고세포투과성이우수한장점이있음. 특히탄소나노튜브는튜브안쪽으로약물을봉입할수있는장점이있어서약물방출을제어하기에우수한소재임. 일반적으로탄소나노튜브에봉입한약물은용해도혹은수용액중분산성이증가하여생체이용률이우수하고독성이감소할것으로기대됨. 동대학 Jinghao Cui 교수역시 controlled release 분야전문가로 macromolecular drug delivery system을이용한약물전달시스템을 ChrDDS에적용하는연구를진행중임. 99

105 7. 일주기생체리듬분야선도연구진동향 본절에서는동향조사사업을통해직접접촉하고대면정보를획득한연구 진, 특히차세대우수연구자들을대상으로현재진행중인연구현황을소 개함으로써향후연구의방향을가늠하고자함. 가. 일본의일주기생체리듬연구진 Hiroki R. Ueda 교수 ( 일본 University of Tokyo) ( 도쿄대 ) (RIKEN) Ueda 교수는도쿄대의과대학을졸업한후, Sony Computer Science Lab 및 Yamanouchi Pharmaceutical 연구원을거쳐박사학위취득이전인 2003년일본이화학연구소 (RIKEN) 의 Laboratory for Systems Biology 연구책임자가된특이한이력의소유자임. 2013년모교의교수로부임하면서, 현재는고베소재의 RIKEN 연구실과도쿄대연구실등 3개의연구실을함께운영하고있음. 2000년대초반부터생체시계전사조절네트워크에대한연구와일주기성대사체분석연구등일주기생체리듬의시스템생물학적연구를수행하여 Cell, Nature, Nat Genetics, Neuron, PNAS USA 지등에우수논문을발표해왔음. 최근에는 1뇌투명화기술 (CUBIC), 2CRISPR-Cas9 기반의단일세대유전자적중생쥐제작기술, 33D 뇌전사체발현분석기술및 4자동화된실험동물용수면측정기술 (FASTER) 개발등의연구를진행하고있음 (Susaki et al., 2015; Sunagawa et al., 2016; Tatsuki et al., 2016). 다소거리가있어보이는연구주제들이라생각되었으나, 도쿄대실험실을 100

106 직접방문하여확인한결과, 2014년부터연간 30억원씩일본정부의지원을받아수면-일주기리듬통합조절기전의근본적이해를위한대형유전학적스크리닝프로젝트를개시하였음. 상기기술들이모두이를위한요소기술임 [ 그림 41]. 그림 41. Ueda 교수팀의수면조절뇌회로및분자표적발굴전략 텍사스대 Takahashi J. S. 교수의유전학적스크리닝연구에의해포유류의 Clock 유전자가동정된이후, 일주기생체리듬연구분야가비약적으로성장했다는사실을고려하면, Ueda 교수의연구는향후수면의분자생물학적, 신경과학적기전이해를한단계높임으로써관련분야의연구의패러다임을바꿀가능성이매우높은연구임. 특히 Ueda 교수의접근법과실험적전략은신경활성기반뇌회로망발굴과핵심유전자발굴이동시에이루어지는방식으로서향후약리적, 공학적활용기술개발이매우용이할것으로예상되므로그파급효과가더클것으로예상됨. 개발된 CUBIC 기술이나수면단계측정기술및관련장비는현상태에서도연구기자재로서당장상용화가가능한수준이며, 고속녹아웃생쥐제작기술은 RIKEN을통해전세계연구자에게제공될예정임. 101

107 Hitoshi Okamura 교수및 Doi Masao 교수 ( 일본 University of Kyoto) 좌 ) Hitoschi Okamura 교수우 ) Masao Doi 교수 일본의일주기생체리듬연구학계에서 Hitoshi Okamura 교수는비도쿄대출신을대표하는연구자로평가받고있음. 1995년부터고베의과대학에서연구를진행해왔으며, 2007년부터교토대약학대학의시스템생물학교실책임교수로재직하고있음. Okamura 교수는 SCN 중추생체시계의신경해부학적, 신경생리학적연구로일주기생체리듬연구를시작하였으며, 1997년포유류의 Period 유전자를최초로발견함. 이후 Per/Cry의분자생체시계억제자들의작용기전연구를통해 Cell, Science, Nature, Cell Metabolism 등에우수논문을발표하였음. 특히 2000년대중반에는세포증식조절기구와분자생체시계의연결고리, SCN에의한말초생체시계조절기전등일주기생체시계출력경로에서큰업적을이루었으며, 2013년에는 RNA methylation에의한생체시계의속도조절기전을규명하여분자생체시계연구분야에또다시새로운패러다임을제시하였음 (Matsuo et al., 2003; Ishida et al., 2005; Fustin et al., 2013). 일주기생체리듬연구에있어서빼놓을수없는 Okamura 교수의업적은생체인광을이용한분자생체시계활성의 in vivo 실시간분석기술의개발임. 2001년 Okamura 교수연구팀은 Per1 유전자의프로모터에의해 luciferase의발현이제어되는형질전환생쥐를제작하고, luciferase에의해생성되는생체인광신호를생쥐의 SCN에서측정하는기술을개발함으로써살아있는생쥐의 SCN 중추생체시계에서생체시계유전자발현이일주기적으로조절되고있다는사실을직접적으로입증함 (Yamaguchi et al., 2001). 최근에는그연장선상에서 Per1과 Per2의발현을동시분석할수있는기술을개발하기도함 (Yamaguchi et al., 2016). Doi 교수는 UC 어바인의생체시계선도연구자인 Paolo Sassone-Corsi 교수 102

108 연구실에서박사후연구원으로경력을쌓았으며, 교토대이직시에 Okamura 교수의연구진에합류하여현재교토대약학대학의시스템생물학교실부교수로재직중임. Doi 교수는박사후연구원시절분자생체시계의일주기적조절기전, 특히후성유전체학적기전에대한연구를통해 Cell, PNAS USA, Mol Cell 등에우수논문을발표한바있음. Okamura-Doi 교수연구팀은최근 SCN 중추생체시계를신경약리학적으로제어할수있는기술을개발하기위해분자표적탐색및조절약물개발연구를활발히진행하고있음. 이를위해 SCN 영역에특이적으로발현되는분비성인자들과 GPCR을대상으로한탐색연구를통해수행해왔음. 그림 42. Okamura-Doi 교수연구진에의한 GPR176 발굴연구 올해초리간드가알려지지않은고아수용체인 GPR176이 SCN 중추시계에작용하여일주기생체리듬을조절한다는사실을발견함 [ 그림 42]. GPCR이가장대표적이고성공확률이높은신약표적이라는사실을고려하면 Okamura 교수팀의접근법은결정적으로일주기리듬을신경생물학적으로제어할수있는표적분자를찾았을가능성이높음. 103

109 나. 미국샌디에고스크립스연구소의일주기생체리듬연구진 Peter G. Schulz 교수 ( 미국샌디에고스크립스연구소 ) Peter G. Schultz 교수는 Caltech 에서 Peter Dervan 교수지도하에 DNA를염기서열에따라선택적으로절단하는저분자화합물개발연구를수행하여박사학위를취득하고 MIT 에서 Christopher Walsh 교수지도하에박사후연수를마쳤음. 1985년 UC Berkeley 교수로임용된후저분자화합물부터항체, 단백질, 핵산등에이르기까지폭넓은영역에서화학-생물학통합연구로두각을나타내어 1999년 TSRI로자리를옮겼고다학제적연구를기반으로 GNF (Genomic Institute of the Novartis Research Foundation), CALIBR (California Institute for Biomedical Research), Affymax Research, Syrrx, Kalypsys, Phenomix, Symyx Therapeutics, Ilypsa, Ambrx, Ardelyx, Wildcat Technologies 등수많은바이오벤처를성공적으로설립하여관련분야최고의연구자로손꼽히고있음. 최근 TSRI의 CEO로임명되었음. Schultz 교수는 John B. Hogenesch, Joseph S. Takahashi, Steve A. Kay 교수와공동연구를통해대부분의 cycling transcript가시교차상핵과간의생체시계에의해조절됨을확인한바있음 (Panda et al., 2012). 이후 Schultz 교수는 Kay 교수와지속적인공동연구를통해화학적조절제를이용한일주기생체시계의조절이가능함을증명하였는데, 대표적인연구성과는 GSK-3β 억제제를이용한 period shortening 효과 (Hirota et al., 2008), CKIα의일주기생체시계조절확인및 CKIα 억제제발굴 (Hirota et al., 2010), CKIδ의일주기생체시계조절확인및 CKIδ 인산화조절제발굴 (Lee et al., 2011) 등임. 최근 Schultz 교수와 Kay 교수의 10년에걸친공동연구를통해가장주목할만한연구성과가도출되었는데이것은 core feedback loop의주요구성요 104

110 소인 CRY 효현제 KL001의개발임. Schultz 교수연구팀은 6만여개의저분자화합물로구성된화합물라이브러리를 Bmal1-dLuc luciferase reporter를갖는 U2OS (human osterosarcoma) 및 NIH-3T3 (murine fibroblast) cell line을이용한 high-throughput screening을통해 KL001의 period lengthening effect를확인하고 affinity-based proteom approach를통해 KL001의분자표적이 CRY임을밝혀내었음. [ 그림 43] CRY는간에서 fasting hormone에의해유도되는 gluconeogenesis의속도조절단계효소들을만들어내는 Pck1, G6pc genes의전사를억제하는것으로알려져있기때문에 KL001은당뇨등대사성질환의잠재적억제제로볼수있고, Schultz 교수의연구에서도 KL001이 basal glucose production이나 cellular lactate dehydrogenase activity에영향을주지않고 fasting hormone induced gluconeogenesis 만을선택적으로억제함이확인되었음. 그림 43. Schultz 교수와 Kay 교수의공동연구로발굴된 KL001. KL001 은 CRY와직접결합하여 CRY degradation 을억제함으로써 agonist 처럼작용하는것으로밝혀짐. Schultz 교수와 Kay 교수의공동연구성과는최근실용화 / 산업화로이어지고있는데바이오벤처인 Reset Therapeutics사가 Schultz 교수의연구성과를기반으로출범하게되었고 Reset Therapeutics사는 KL001에대한의약화학적접근을통해 KL001 유도체인 SHP-1의전임상개발에성공한것으로알려졌음. SHP-1은 CRY의화학적조절제로그적응증은당뇨, 비만, 대사성질환, 쿠싱병, 녹내장등임. 최근쿠싱병, 제2형당뇨병에대한치료효과를검증하는단계를지나전임상평가에서우수한결과를얻었다고함. 105

111 Schultz 교수연구팀의최근연구동향 그림 44. Schultz 교수의 chemical library 를활용한신약후보물질발굴연구개요도. Chemical library 에대한 high-throughput screening 을통해 hit 화합물을도출한후의약화학적접근을통해 focused library 를구축하여화합물의최적화연구를수행하고여기서도출된화합물을이용해 affinity chromatography, genomic/proteomic profiling, 또는 gene complementation 을통해분자표적을확인함. Schultz 교수연구팀의연구주제는화학의원리와도구와살아있는세포의생명활동을결합하여새로운생리적, 화학적, 생물학적기능을갖는분자나분자결합체를합성하는것임. 그리고 Schultz 연구팀은연구의결과로도출되는분자의구조와기능에대해연구하여복잡한생물학적또는화학적체계의기전에대한새로운통찰을도출할수있다고믿음. 이와같은화학적 / 생물학적접근방법을통한동반상승효과는새로운생물학적, 화학적, 생리학적성질을갖는 unnatural amino acid, genetic code를도입하거나줄기세포의자가복제혹은특정방향으로분화시키거나체세포를 reprogramming하는 Schultz 연구팀의최근연구에서증명되고있음. Schultz 교수는 2015년 3월개최된제 251회미국화학회에서원핵세포나진핵세포에새로운 genetic code를도입하여 100여개이상의 non-cannonical 106

112 amino acids가도입된단백질을만들어내는기술에대해발표하였음. Schultz 교수가도입한아미노산중에는형광을갖는아미노산, 광화학반응을수행할수있는아미노산, 특정금속과결합할수있는아미노산, bioorthogonal reaction을수행할수있는아미노산등이포함되어있고이러한아미노산이도입된단백질을이용하여세포생물학이나의약학에적용하는방법들은일주기생체리듬에대한연구나이를조절할수있는화학적조절제개발에새로운통찰력을제공할것으로보임. Schultz 교수가 251회미국화학회에서발표한내용중주목할만한것은세포기반스크리닝시스템을이용한신약후보물질발굴방법에대한연구임 [ 그림 44]. Schultz 교수는실제생리학적현상을잘반영할수있는세포기반스크리닝이신약후보물질발굴에가장중요한요소가됨을역설하고이를이용하여 in vivo neurogenesis, MSC의선택적분화, 가역적베타세포증식, MEF reprogramming, human ESC self renewal 또는분화, cancer stem cell의선택적사멸을유도할수있는신약후보물질발굴에대해발표하였음. Kay 교수와공동연구를통해도출해낸 KL001 또한같은방법으로도출된신약후보물질임. Enrique Saez 교수 ( 미국샌디에고스크립스연구소 ) Enrique Saez 교수는 1995년 Harvard 대학교에서유전학전공으로박사학위수여후 The Salk Biological Institute에서박사후연수를마침. 그후다국적거대제약회사인 Novartis 의비영리연구기관인 GNF (The Genomics Institute of the Novartis Research Foundation) 에서 Group Leader로근무하였으며현재 Scripps 연구소부교수로당뇨, 대사성질환학회활동이특히활발함. 최근 Circadian oscillation에따라역동적으로변화하는동일개체내 UCP1 발현양상을 in vivo에서모니터링할수있는시스템으로 ThermoMouse 107

113 를개발함 (Galmozzi et al., 2014). 그림 45. ThermoMouse 를이용한신약개발플랫폼 ThermoMouse는 transgenic model로내인성 UCP1을발현시킨동물모델임. ThermoMouse로부터유도된 Ucp1 luciferase brown preadipocyte line은 in vivo에서 brown adipose tissue (BAT) capacity를갖고있음. 따라서이를이용하면 Ucp1 발현을증가시키는화학적조절제를발굴할수있고, 역으로발굴된화학적조절제를 ThermoMouse에적용하면 adrenergic stimulation에따른에너지소모가증가하는지확인할수있음 [ 그림 44]. 그림 46. REV-ERBα 에의한체온의일주기조절기전. REV-ERBα 가직접 thermogenesis 와 brown adipose tissue activity 를조절함으로써체온의일주기가조절됨. 낮시간에추위에강한저항성을보이는이유역시설명가능함. 108

114 UCP1은 mitochondrial uncoupling protein의일종으로에너지대사와밀접한관련이있음. 이와관련하여 RREV-ERBα는 BAT 기능의조절을통한일주기성 thermogenic network과관련이있음. 생쥐의경우 17:00 경 REV-ERBα가감소하면추위에대한저항성이증가하는것으로알려져있고, 이는외부환경에따른 REV-ERBα의 thermogenic response에기인하는것으로보임. Brown adipose tissue의 REV-ERBα가 down regulation되면 UCP1 발현이증가하므로 brown adipose tissue에서 REV-ERBα가 Ucp1을억제하는것으로생각됨. 또 REV-ERBα-null mouse 모델에서는항온환경에서도 BAT의 UCP1이상당히과발현되어있음 (Gerhart-Hines et al., 2013) [ 그림 46]. 그림 47. Activity-based protein profiling. 대부분의단백체학기법이 protein abundance 를측정하는방법이기때문에 protein activity 의간접측정법인것과달리 ABPP는 active-site directed chemical probe를이용하여활성단백질을표지하는점에서큰차이가있음. Saez 교수연구팀은 ThermoMouse를활용하여일주기생체리듬과관련된신약개발연구를진행하고있음. 관련연구성과를 GNF 및 California 지역바이오벤처들과실용화작업진행중이라고함. Saez 교수가발굴한신약후보물질들은 brown adipose tissue를활성화하여에너지대사에관여하는것으로확인되었으며최근동연구소의 Benjamin Cravatt 교수와공동연구를통해 ABPP (Activity based protein profiling) 의분자표적이확인되었다고함. 109

115 Katja A. Lamia 교수 ( 미국샌디에고스크립스연구소 ) Lamia 교수연구실은 Biological rhythms과세포내기능, 간상호작용, 특히 CRY1/2와같은 circadian transcriptional repressor나 nuclear hormone receptor 에관심을갖고연구하고있음. 부가적으로 AMPK 인산화효소의조절하에 Cryptochrome 단백질의역할과암대사에대해연구를진행중임 [ 그림 48]. 그림 48. Lamia 교수연구팀의연구주제개요도. Lamia 교수연구팀은 CRY1/2의영향을받는전사인자에관심을갖고있으며그결과물의대사및생리작용에대해연구하고있음. Lamia 교수에따르면 CRY1/2 단백질이 CLOCK, BMAL1 뿐만아니라다른전사인자들도광범위하게억제한다고함. Lamia 교수연구팀은대규모의 master metabolic regulators, nuclear hormone receptors에대해조사하고, CRY1이물리적으로 steroid hormone receptors를포함한다수의핵수용체와상호작용함을밝혀냈음 (Lamia et al., 2011). 연구방법으로 wild type 혹은 Cry1 -/- ;Cry2 -/- 녹아웃생쥐로부터분리한세포나조직을이용해 CRY가 transcriptional regulation에어떤역할을하는지연구하고돌연변이생쥐의생리학적측면에대해연구하여검증함 특히 Lamia 교수연구팀은단백체분석기법을이용하여세포나조직선택적으로 CRY1/2와상호작용하는단백질을동정하는기술을보유하고있음. 이방법은 110

116 CRY1/2을함유하는분획의 mass spectrometry를분석하는방법으로 CRY에의해조절되는전사혹은일주기기능과관련된 CRY1/2 유관단백질이나전사인자를발굴해낼수있는효율적인방법임. Lamia 교수연구팀은최근 CRY의에너지센서로서의기능에대해보고한바있으며 (Lamia et al., 2009), 현재질환모델에서의중추혹은국소일주기생체시계의기능과대사기능의연관관계에대해연구중임. 연구방법은 CRY1의 71번 phospho-acceptor serine 아미노산변이생쥐 (S71A 또는 S71D) 를제작하여연구함. 이생쥐에 AMPK를활성화하는것으로알려진 metformin 등의화학적조절제를투여하여 AMPK에의한 CRY1 인산화의생리적기능에대해연구를수행하고있음. 그림 49. 일주기분자생체시계에대한세포대사신호입력경로 Lamia 교수연구팀의최근연구성과중주목할만한것은생체시계의주요구성요소인 CLOCK, BMAL1의문제가 hypoinsulinamia와당뇨병발병으로이어진다는것을밝힌것임 (Lamia et al., 2010). 매일반복되는명암주기가생체시계의활동을통해생리학적측면에영향을준다는사실은알려져있었으나췌장세포가갖고있는분자생체시계가에너지대사에직접적으로영향을주어질병으로직접연결된다는사실은 Lamia 교수연구팀에의해최초로규명된것임. 111

117 다. 영국캠브리지대일주기리듬연구진 Michael Hastings 교수 (MRC Laboratory of Molecular Biology: LMB) 일주기성을유지하는핵심전사인자의피드백만으로는개체수준에서다양한생리적현상이일주기적으로조절되는지를이해할수없는데, 이이론적공백을메우기위한연구를수행하고있음. Hastings 교수는일주기리듬분야연구를선도하는캠브리지대 LMB의생체리듬연구팀전체를이끌고있으며, 오랫동안일주기리듬의분자 신경생물학적기전을연구해왔음. 2015년에도일주기분자리듬을조절하는새로운전사인자를발견하여 Cell지에논문을발표함 (Parsons etal., 2015). 생쥐에서운동활성의일주기리듬이저하된새로운돌연변이를발견하였으며, 이는 SCN에서발현하는전사인자 Zfhx3의아미노산하나가바뀌는돌연변이임. 돌연변이 Zfhx3는전사표적인 AT 모티프를가지는서열에대한결합능을상당부분상실함. 흥미롭게도이돌연변이생쥐의핵심전사인자분자고리의피드백에는변화가없었으나, Zfhx3의표적유전자발현의일주기적조절에이상이발생함. John O'Neill 교수 (MRC Laboratory of Molecular Biology: LMB) 일주기성을유지하는핵심전사인자의피드백만으로는개체수준에서다양한 생리적현상이일주기적으로조절되는지를이해할수없는데, 이이론적공 112

118 백을메우기위한연구를수행하고있음. 최근세포대사의일주기성조절신규기전규명을통해 2016년 4월 Nature지에논문을발표함 (Feeney et al., 2016). 세포내마그네슘이온의농도는일주기성을띄며이는단세포동물부터인간의세포까지보존되어있는보편적인생명현상임. 최근 O'Neill 박사연구팀에서는마그네슘이온농도의일주기적변화에따라세포내에너지원인 ATP의활성이역시일주기적으로변화하며, 이를통해핵심전사인자의일주기성발현양상이조절된다는것을규명하였음. 세포내이온농도의일주기성에의해핵심전사인자의피드백뿐만아니라 ATP를사용하는세포내의다양한대사가일주기적으로조절될것이라는사실을밝힘으로써일주기성의근원에대한새로운가설을제시하였으며인간대사질환을새롭게이해할수있는바탕을마련함. Alex Webb 교수 ( 식물과학과 ) Webb 교수는식물의일주기성을주로연구하고있는데, 최근광합성이식물의일주기생체시계를재설정하는기전을규명함 (Haydon et al., 2013). 오랫동안식물의광합성은생체시계에의해일주기적으로조절된다고믿어져왔는데그결과세포내당 (sugar) 농도의일주기리듬이생성됨. Webb 교수연구팀은당이애기장대의핵심일주기제어전사인자의발현을직접적으로조절한다는사실을규명하였음. 당을조절하면식물의일주기적유전자발현을재설정시킬수있는데, Prr7 이라는유전자의돌연변이가발생할경우당을처리해도일주기유전자발현의재설정이일어나지않음. Prr7 유전자는당에의해조절되며아침에많이발현되는데, 이유전자가핵심일주기제어전사인자의발현을조절함으로써매일아침생체시계를재설정한다는사실이규명됨. 113

119 Christine Holt 교수 ( 생리, 발생및신경과학과 ) Holt 교수는눈에서얻은시각정보를뇌로전달해주는신경세포인망막신경절세포의발생과정을연구함. 주로망막신경절세포의축삭이어떻게뇌의시각중추에있는신경세포를찾아가서연결을맺는지를세포및분자적인수준에서연구하고있는데, 양서류모델인 Xenopus laevis의배아를이용하며, 최근에는생쥐모델을함께사용함. 주실험기술은유전자발현제어, 고해상도실시간형광이미징, in vitro 축삭배양모델을이용한세포반응이미징등이있음. 영국에서박사학위를받은후미국의 UC 샌디에고 (University of California, San Diego) 에서교수로재직하다가 2000년대초반에영국캠브리지대학으로소속을변경하였음. 신경발생분야, 특히 axon guidance 분야의세계적대가이며영국과학자최고의영예인 Fellow of Royal Society를취득하였음 (FRS; 유명한 FRS 멤버로는다윈, 뉴튼등이있음 ). 축삭말단에서일어나는단백질합성및분해가망막과뇌의연결을조절하는원리를발견하여최근 5년간 Cell, Science, Nature Neuroscience, Neuron 등의선도저널에논문을발표하였음. Holt 교수팀은일주기중추생체시계의재설정에핵심적인망막신경절세포가뇌와연결되는분자기전을연구함. 망막신경절세포중 melanopsin을함유하는세포는발생과정중뇌의특정부위 (SCN 등 ) 으로축삭을뻗어연결을맺은후, 성체에서는빛을인식하여생체시계를재설정하는역할을수행함. 왜특정망막신경절세포는시각정보인지를담당하는뇌부위 ( 간뇌및중뇌 ) 로축삭을내보내고, melanopsin 망막신경절세포는 SCN으로축삭을내보내는지는전혀알려지지않았음. 114