목차 목 차 목차 i 표목차 iii 그림목차 iv Abstract vi Ⅰ 서론 Ⅱ 연구내용및방법 시험물질및연구개요 세포독성 평가 실험동물관찰및기관지폐포세척액분석 기도점적폐독성평가 흡입독성평가 통계처리 Ⅲ 연구결과및고찰 시험물질정보 세포독성및시험물질 분석 급성폐독성유발

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해영 순
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발간등록번호 11-148023-002101-01 NIER-RP2014-220 혼합물질유해성평가를위한흡입독성스크리닝 기법연구

1 발간등록번호 NIER-RP 혼합물질유해성평가를위한흡입독성스크리닝 기법연구 (Ⅰ) 환경건강연구부위해성평가연구과 김현미, 권정택, 권도영, 김은지, 임연미, 이두희, 노희영, 김필제, 최경희 Ⅰ 2014

2 목차 목 차 목차 i 표목차 iii 그림목차 iv Abstract vi Ⅰ 서론 Ⅱ 연구내용및방법 시험물질및연구개요 세포독성 평가 실험동물관찰및기관지폐포세척액분석 기도점적폐독성평가 흡입독성평가 통계처리 Ⅲ 연구결과및고찰 시험물질정보 세포독성및시험물질 분석 급성폐독성유발및회복평가 단회및반복흡입독성평가 세포독성 폐독성 흡입독성상관성및계산독성학 Ⅳ 결론 참고문헌 i

3 목차 표목차 ii

4 목차 그림목차 iii

5 목차 iv

6 Abstract v

7 Ⅰ. 서론 Ⅰ 서론 실내활동이증가함에따라생활환경중냄새제거를목적으로방향제와탈취제등의생활화학용품사용이증가하고있다 특히 스프레이형태의제품내에포함된물질들은미스트형태로실내공기중에분사되며 이때발생된입자들은인체에쉽게흡입이가능한작은크기를가진다 따라서 실내환경에서방향제및탈취제사용은다양한화학물질이인체폐기관지에직접적으로노출되는주요한원인이된다 그럼에도불구하고방향제및탈취제주요성분에대한흡입독성정보는경구및경피독성에비해부족한실정이다 생활화학용품은단일물질이아닌여러가지화학물질이혼합물형태로존재한다 7. 대표적으로제품내미생물오염방지를위해보존제로사용되는살생물제 (Biocide) 와함께수용성이낮은물질의용해도를높이거나제품내균일하게분포할수있도록하는용매또는유화제등이사용된다. 하지만기존흡입독성평가기법으로는이러한혼합물에대한독성을확인하기어려우며고비용및장시간의연구기간이필요한제한점이있다. 따라서생활화학용품의주요함유물질인살생물제와용매로이루어진혼합물질에대한흡입독성스크리닝을위한연구가필요하다. 독성스크리닝기법은화학물질에의한인체이상영향을염색체및단백질수준에서부터세포와동물을사용하는단계별시험을통해종합적으로유해성을평가하므로독성평가에드는비용과기간을현저히감소시키는장점을갖는다 9,. 이러한기법은유전독성분야등에서는일반적으로사용되고있으나흡입독성평가에서는초기단계이므로, 혼합물질의호흡기독성평가에이러한기법을도입및정립을통해효율적인독성평가시스템개발이필요하다. Didecyldimethylammonium chloride (DDAC) 는 4급암모늄구조를가지는살생물제로서다양한생활화학용품에미생물생장억제를위한보존제로사용된다 11. DDAC의설치류폐기관지노출은염증과섬유화등의독성을나타내었으며 12, 폐포상피세포에서산화적스트레스와함께미토콘드리아와리소좀그리고세포막손상이유발됨이보고되었다 13. Ethylene glycol (EG) 는생활화학용품에 1

8 Ⅰ. 서론 빈번히사용되는유기용매로서경구노출을통해심각한신장독성을야기한다고알려져있으나 14, 흡입에의한인체노출에비교적안전한것으로생각되고있다. 본연구의목적은 DDAC와 EG가혼합물형태로포함되어있는생활화학용품의실제적인흡입독성을종합적으로평가하고, 고비용및장기간의연구시간이소요되는흡입시험의문제점을극복하기위하여세포독성, 폐독성및흡입독성평가단계로이루어지는경제적이며효율적인스크리닝기법을탐색하는데있다. 2

9 Ⅱ. 연구내용및방법 연구내용및방법 시험물질및연구개요가 시험물질생활활동중흡입노출될가능성이높은방향제및탈취제성분중국내에서사용량이높은 ethylene glycol(eg, 99.8 % Sigma aldrich, MO, USA) 및 didecyl dimethyl ammonium chloride(ddac, Shin Won Chemtrade Co. Ltd., China) 를구입하여사용하였다. 나 연구개요국내주요생활화학물질중사용량이많은살생물제 1 종 (DDAC) 및용매 1 종 (EG) 을선정하여다양한혼합비율에따른세포독성을확인하여세포독성이가장높게나타난혼합비율을선정하였다. 선정된혼합비율은다음단계로기도점적노출에사용되었으며이에따른급성폐독성유발및회복능력을확인하였다. 마지막으로 DDAC 및 EG 각각의단일물질과혼합물질에대한단회및 28 일반복흡입독성평가를실시하여세포독성, 폐독성및흡입독성평가단계로구성되는스크리닝기법을탐색하였다. 세포독성 평가가 세포주인체정상폐상피세포주 (Human normal lung epithelial cells) 인 BEAS-2B 세포을 American type culture collection (ATCC) 에서분양받아세포배양기 (37, % CO 2 ) 에서 DMEM F12 배지 (10 % fetal bovine serum 및 1 % penicillin streptomycin) 로무균계대배양하여사용하였다. 나 세포손상평가 세포생존율은미토콘드리아손상지표인 3-(4,-dimethylthialzol-2-yl)-2,- 3

10 Ⅱ. 연구내용및방법 diphenyltetrazolium bromide (MTT) 시험을통해측정하였으며, 세포막손상은배지내의젖산탈수소화효소 (lactate dehydrogenase, LDH) 활성을분석하여측정하였다. 단일물질독성시험은 DDAC 또는 EG 을 0.1, 0., 1, 2, 3,, 10, 20 μg/ml 농도로세포에 24 시간노출한후수행하였다. 두물질의혼합독성평가를위해서 MTT 시험에서얻은 DDAC의 IC 20 (20 % Inhibitory concentration) 농도 (2.9 μg/ml) 의근사값인 3 μg/ml 에 1, 2,, 10, 20 μ g/ml 의 EG 를첨가하여혼합물을세포에 24 시간동안처리하였다. 세포모양변화를확인하기위하여위상차현미경을통해세포형태를관찰하였다. 다 산화적손상평가활성산소종의발생은세포에 dichlorofluorescine diacetate (DCF-DA) 를처리하고형광을측정하여분석하였다. 세포내항산화물질인글루타치온 (glutathione, GSH) 농도는,-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) 와글루타치온환원효소 (glutathione reductase, GR), 그리고 NADPH를사용하여정량하였다. 산화형글루타치온 (oxidized GSH, GSSG) 은시료를 2-vinylpyridine 과반응시킨이후같은방법으로측정하였으며, 세포내산화환원상태를 GSH/GSSG 비율로나타내었다. 라 세포내흡수세포내 DDAC 흡수정도를알아보기위해 24 시간노출이후얻어진세포내에포함된 DDAC 농도를측정하였다. DDAC 정량을위해세포를용해시켜얻은시료를메탄올과 1 : 1 로섞어원심분리하고그상등액을 Betasil C18 칼럼 (100 x 2.1 mm, 3 μm, Thermo fisher scientific Inc.) 과 Betasil C18 칼럼 (12. x 2.1 mm, 3 μm, Thermo fisher scientific Inc.) 을각각분리및보호칼럼으로장착된고성능액체크로마토그래피 (Alience 269, Waters) 에주입하였다. 10 mm ammonium acetate 와 1 % acetic acid 를포함하는수용액을이동상 A로, 1 % 의 acetic acid 를포함하는 acetonitrile 을이동상 B 로하여 3 C 에서유속을 0.3 ml/min 으로하였으며, 이동상 A를 0 분에 8 %, 3 ~ 분에 0 %, 6 ~ 10분에 8 % 비율로유입시켰다. 분리된 DDAC 는 Mass spectrometer (MicromassQuattro micro API, Waters) 를사용하여 Electospray ionization probe 를 4

11 Ⅱ. 연구내용및방법 Positive ionization mode 로구동하여정량하였으며, Multiple reaction-monitoring mode 에 서측정하였다. 배지에첨가된 DDAC 총량에대한세포내흡수된 DDAC 양의비율로흡 수정도를산출하였다. 실험동물관찰및기관지폐포세척액분석가 실험동물실험동물은폐독성및흡입독성평가용으로국 내외에서널리사용되는 7 주령의특정병원체부재 (Specific pathogen free, SPF) 수컷 Sprague-Dawley rats (Orient bio, sungnam, korea) 를구입하여 1 주일간순화시킨후건강하고발육이양호한동물을선별하여사용하였다. 물과사료는자유로이급식시켰다. 사육조건은온도 21 ± 3, 상대습도 0 ± 20 %, 조명 12 시간 ( 인공조명, 오전 8 시 ~ 오후 8 시 ) 으로하였다. 순화기간중건강하다고판정된동물에대하여체중을측정하고, 평균체중에가까운개체를선택하여무작위법을이용, 군분리를실시하였으며각군의평균체중에대한군간차이는 ANOVA 검정으로통계학적검증을실시하여확인하였다. 동물의개체식별은피모색소표시법및사육상자별 tag 표시법을이용하였다. 노출군은대조군, 저농도및고농도노출군으로군당기관지폐포세척액 (Bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 분석 마리, 조직병리학적분석 마리씩합계 10 마리를설정하였다. 모든실험동물의사육및실험은국립환경과학원의실험동물윤리위원회의승인을받은후실험동물관리지침에따라실시하였다 (NIER ). 나 기관지폐포세척액채취및세포분석기관지에튜브를삽입후 phosphate-buffered saline(pbs) ml를주입및채취하는방법으로 회반복하여총 2 ml를채취하였다 ( 채취율 90 % 이상 ). 처음실시한 ml은원심분리후, 상등액을따로분리하여세포독성지표인 total protein(tp) 와 lactate dehydrogenase (LDH), 그리고염증사이토카인인 tumor necrosis factor-alpha(tnf-α) 및 Interleukin-6(IL-6) 를분석하였다. 회에걸쳐채취한모든 BALF 세포는혼합하여 Vi-Cell XR analyzer (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) 로총세포수 (total cells count, TC) 를측정하였으며모든노출군의 BALF 세포를 2 10 /ml농도로일치시킨후 Shandon

12 Ⅱ. 연구내용및방법 cytospin (Shandon, pittsburgh, PA, USA) 에 100 μl 주입및원심분리를거쳐 Diff-Quik 염색을하여검경하였다. 다 기관지폐포세척액생화학및사이토카인분석 BALF 내 TP 농도는 bicinchoninic acid(bca) protein 분석법 (intron Biotechnology, Seoul, Korea) 으로, LDH는 QuantiChrom lactate dehydrogenase kit(bioassay Systems, Hayward, CA, USA) 를이용하여분석하였다. TNF-α 및 IL-6는 ELISA Kit(R&D systems, minneapolis, MN, USA) 를이용하여매뉴얼에따라분석하였다. 라. 일반증상관찰및체중측정일반증상은모든실험동물에대한상태를매일 1 회이상동일한시간에관찰하여일반상태의변화, 독성증상발현, 사망동물의유무및시험물질노출에의해발생될가능성이있는증상에대하여관찰하였다. 일반적독성증상지표로는피부, 피모상태, 안구, 점막, 호흡기계, 순환계, 신경계, 운동량, 행동양식, 진전, 경련, 타액분비, 설사, 기면, 수면과혼수상태등을관찰하였다. 체중측정은시험에사용된모든실험동물에대하여노출전, 노출후매주 1 회각각측정하였다. 마. 조직병리학적분석모든시험동물은개체별로부검하였으며이때육안적관찰을동시에진행하였다. 장기는적출즉시 10 % 중성포르말린용액에고정하였다. 조직고정후파라핀에포매를거쳐 Hematoxylin and eosin(h&e) 염색후검경하였다. 기도점적폐독성평가 Isoflurane 흡입마취를통하여실험동물을마취한후 DDAC 및 EG 혼합비율이 1 : 1인저농도 (0 : 0 μg/body weight kg) 노출군과 DDAC 및 EG 혼합비율이 1 : 3인고농도 (0 : 10 μg/body weight kg) 노출군으로단회기도내점적노출하였다. 노출종료후 1 일및 7 일차에각각희생, 부검하여급성폐독성 6

13 Ⅱ. 연구내용및방법 유발및회복능력을평가하였다. 흡입독성평가가 노출농도전신흡입노출챔버를사용하여실험동물에게시험물질을노출하였으며챔버환기율은시간당 12 회로설정하였다. 단회흡입독성평가노출농도는폐독성평가결과및실제제품내시험물질함유량조사를바탕으로혼합비율은 1 : 1로설정하여대조군 ( 청정공기 ), 저농도 (DDAC 0.1 % + EG 0.1 %, w/w), 중농도 (DDAC 1 % + EG 1 %, w/w) 및고농도 (DDAC % + EG %, w/w) 로설정하여 4 시간단회노출하였다. 반복흡입독성평가노출농도는단회흡입독성평가결과를바탕으로혼합비율 1 : 1로설정하여대조군 ( 청정공기 ), DDAC( 단일물질노출, 0.2 %, w/w), EG( 단일물질노출, 0.2 %, w/w) 및 DDAC + EG( 혼합물질노출, 0.2% : 0.2 %, w/w) 로설정하여하루 6 시간, 주 일로 4 주 (28 일 ) 반복흡입노출하였다. 나. 노출환경모니터링시험물질노출중각군별흡입챔버내의환경조건들을모니터링하였다. 실험환경 ( 온도, 습도, 공기유속및압력등 ) 은환경모니터링장치 (Model VT3-X1, SIBATA) 를통해연속적으로측정되었다. 시험물질입자크기는 Portable aerosol spectrometer(model 1.109, Grimm aerosol technik, GMBH, German) 를사용하여측정하였다. EG 노출농도측정은 NIOSH (National institute for occupational safety and health) 측정및분석매뉴얼 23에따라서 XAD-7 ovs tube를사용하여포집후 gas chromatography-flame ionization detector(gc-fid) 를사용하여분석하였다. DDAC 노출농도측정은 PTFE (Poly tetra fluoro ethylene) 필터로포집하여 liquid chromatography-tandem mass spectrometer(lc-ms/ms) 로분석하였다. 통계처리 7

14 Ⅱ. 연구내용및방법 각항목별분석결과에대한통계학적분석은등분산일경우는 One-way analysis of variance (ANOVA) 검정을실시하였고, ANOVA 검정에서유의성이인정된경우에는 Student's t-test를 p<0.0 및 p<0.01 수준에서실시하였다. (GraphPad prism.0, GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) 8

연구결과및고찰 1. 시험물질정보가. 물리 화학적특성및유해성 DDAC는분자량 362.08의엷은노란색액체이며급성흡입독성 LC 0 (4h) 값은 0.07 mg/l이다 (Table 1). EG의특성은분자량 62.07의무색의액체이며 LC 0 값은 > 2. mg/l이다 (Table 2).

15 연구결과및고찰 1. 시험물질정보가. 물리 화학적특성및유해성 DDAC는분자량 의엷은노란색액체이며급성흡입독성 LC 0 (4h) 값은 0.07 mg/l이다 (Table 1). EG의특성은분자량 62.07의무색의액체이며 LC 0 값은 > 2. mg/l이다 (Table 2). <Table 1> Summary of physical-chemical properties and toxicity of didecyl dimethyl ammonium chloride 구조 : DDAC (didecyldimethylammonium chloride) (CAS No ) 경구 (LD 0, rat): 84~331 mg/kg 경구 (LD 0, mouse): 268 mg/kg 분자식 : C 22 H 48 NCl MW: 외관 : 엷은노란색의액체 mp: bp: 34.7 d: g cu -1 at 2 log Pow: 4.66 vp: mmhg at sol.( 물 ): 0. mg/l at 2 급성독성 유전독성 분해성 환경독성 경피 (LD 0, rat): 2,930 mg~4,30 mg/kg 흡입 (4h, LC 0 ): 0.07 mg/l 기타 - 심한피부 / 눈자극성물질 (rabbit) - 피부과민성물질아님 (guinea pig) Ames 시험 : 음성염색체이상시험 : 자료없음소핵시험 : 음성 기타 : 자료없음미생물분해성 (BOD 분해율 ): 이분해성물질비생물적분해 : 자료없음기타 : 자료없음 어류 : 송사리, 96 h-lc ~0.446 mg/l 무척추 :Daphnia magna, 48 h-ec ~0.16 mg/l 조류 :Chlorella pyrenoidosa,72 h-ec 0 3~ mg/l 농축성 (BCF): 71 9

16 <Table 2> Summary of physical-chemical properties and toxicity of ethylene glycol 구조 : 분자식 : C 2 H 6 O 2 MW: 외관 : 무색의액체 mp: -13 bp: at 1013 hpa d: 1.11 g cm -3 at 20 log Pow: vp: hpa at 2 sol.( 물 ):1000 g/l at 20 EG (ethylene glycol) (CAS No ) 급성독성 유전독성 분해성 환경독성 경구 (LD 0, rat): 4,000 mg/kg 경피 (LD 0, rabbit): 10,600 mg/kg 흡입 (LC 0,rat, 6hr): > 2. mg/l air 기타 : 피부, 눈자극성 / 부식성물질아님 Ames 시험 : 음성 염색체이상시험 : 자료없음 소핵시험 : 자료없음 기타 : 자료없음 미생물분해성 (DOC 제거율 ): 이분해성물질임 ( 실험값 ) 비생물적분해 : 자료없음 기타 : 자료없음 어류 : Pimephales promelas, 96 h-lc 0 8,00mg/L 무척추 : Daphnia magna, 48 h-ec 0 41,100 mg/l 조류 : Pseudokirchnerella subcapitata, 96 h-ec 0 6,00-13,000 mg/l 농축성 (BCF): 자료없음 나. 제품내함유량 국내방향제및탈취제품은대부분스프레이형태로내용물이미스트형태로발 생되며제품내 DDAC 및 EG 함유량은 1 % 내외인것으로확인되었다 (Table 3). <Table 3> Didecyldimethylammonium chloride and ethylene glycol contents in household products 물질명 Didecyldimethylammonium chloride (DDAC) 제품형태 함유량 방향제 탈취제 (%) 스프레이형태 스프레이형태 0.1 ~ 1 Ethylene glycol (EG) 스프레이형태스프레이형태 1 ~ 2 10

2. 세포독성및시험물질 uptake 분석가. 단일물질세포독성 DDAC와 EG 각각의미토콘드리아손상에따른세포독성을확인하기위하여 MTT 시험을수행한결과 DDAC는 1 μg/ml 이상에서농도의존적으로세포생존율을감소시켰으며, 10 과 20 μg/ml 농도에서 10 % 이하의세포생존율이관찰되었다 (Figure 1A). DDAC의 IC 20 은 2.

17 2. 세포독성및시험물질 uptake 분석가. 단일물질세포독성 DDAC와 EG 각각의미토콘드리아손상에따른세포독성을확인하기위하여 MTT 시험을수행한결과 DDAC는 1 μg/ml 이상에서농도의존적으로세포생존율을감소시켰으며, 10 과 20 μg/ml 농도에서 10 % 이하의세포생존율이관찰되었다 (Figure 1A). DDAC의 IC 20 은 2.9 μg/ml, IC 0 은.8 μg/ml 로나타났다. EG는사용된모든농도에서세포생존율에변화를야기하지않았으며따라서세포독성이없는것으로판단되었다 (Figure 1B). <Figure 1> Cell viability after exposure of BEAS-2B cells to DDAC or EG for 24 h. (A) DDAC (B) EG. Mean ± S.E.M. **P<0.01 and ***P<0.001 vs. control. 나. 혼합물질세포독성 DDAC(3 μg/ml) 를 EG와혼합하는경우, EG 농도 2 μg/ml 이상에서 DDAC 에의한미토콘드리아손상을증가시켰으며 (Figure 2A), μg/ml 이상의 EG는 DDAC 에의해유발되는세포막손상을증가시켰다 (Figure 2B). 또한, EG의농도가높아질수록세포모양변화와함께세포생존율감소가현미경으로관찰되었다 (Figure 2C). 11

<Figure 2> Cytotoxicity induced by the exposure of BEAS-2B cells to DDAC in combination with EG for 24 h. (A) Cell viability (B) Cell membrane disruption (C) Cell morphological changes: 1. Control, 2.

18 <Figure 2> Cytotoxicity induced by the exposure of BEAS-2B cells to DDAC in combination with EG for 24 h. (A) Cell viability (B) Cell membrane disruption (C) Cell morphological changes: 1. Control, 2. DDAC 3 μg/ml, 3. DDAC 3 μg/ml + EG 1 μg/ml, 4. DDAC 3 μg/ml + EG μg/ml,. DDAC 3 μg/ml + EG 10 μg/ml, 6. DDAC 3 μg/ml + EG 20 μg/ml. Mean ± S.E.M. * P<0.0, ** P<0.01 and *** P < vs. control. # P<0.0, ## P<0.01, and ### P<0.001 vs. DDAC alone. 다. 혼합물의세포독성기전평가 DDAC는인체폐포상피세포 (A49) 에서활성산소종 (reactive oxygen species, ROS) 발생을통해항산화물질인글루타치온 (glutathione, GSH) 농도를감소시키는등산화적스트레스를유발시켜세포독성을야기함이보고되었다 11. 본연구에서는무독용량의 EG이 DDAC 독성을강화시키는기전을확인하기위하여 DDAC에의한산화적스트레스발생에 EG이미치는영향을측정하였다. 실험결과, DDAC와 EG 혼합노출군에서 DDAC 단독처리군에비해세포내 ROS 생성이 12

19 크게증가하였고 (Figure 3A), GSH 농도가감소하였다 (Figure 3B). 또한, 산화적스트레스상황에서 GSH이산화되어생성되는 GSSG의농도를증가시켜, 세포내산화 환원상태를나타내는 GSH/GSSG 비율을현저히감소되었다 (Figure 3C). 따라서 EG의첨가는 DDAC에의해유발되는산화적스트레스유발을증폭시켜세포독성을야기하는것으로생각된다. <Figure 3> Oxidative stress induced by the exposure of BEAS-2B cells to the mixtures of DDAC and EG for 24 h. (A) ROS generation (B) Cellular GSH levels (C) GSH/GSSG ratio. Mean ± S.E.M. * P<0.0, ** P<0.01 and *** P < vs. control. # P<0.0, ## P<0.01, and ### P<0.001 vs. DDAC alone. 라. 세포내흡수평가 EG가 DDAC 독성및산화적스트레스유발을증가시킨원인을규명하기위해 DDAC의세포흡수에 EG가미치는영향을살펴보았으며, 이를위해세포내로유입된 DDAC 농도를정량하였다. DDAC 단독처리시에는 0.39 % 의 DDAC 가세포내로흡수된반면, 및 20 μg/ml 의 EG가 DDAC와함께노출된경우에는 DDAC 흡수율이 0.46 % 와 0.3 % 로증가되는등 EG 농도의존적으로 DDAC의 13

20 세포내유입이증가됨이확인되었다 (Figure 4). <Figure 4> Cellular uptake ratio for DDAC in the presence of EG. Mean ± S.E.M. # P<0.0 and ## P<0.01 vs. DDAC alone. 과거연구에서 polyoxypropylene glycol 등의비이온성계면활성제들이 DDAC 의살균효과를증가시킴이보고되었다 1. 이는본연구결과와유사한데, EG 가계면활성작용을통해세포막을통한 DDAC의투과를촉진시킨것으로추측된다. DDAC는세포막뿐아니라세포내에서미토콘드리아및리소좀손상을유발하는물질이므로 13 EG에의한세포내 DDAC 농도상승이세포독성증가의유력한원인으로생각된다. 3. 급성폐독성유발및회복평가가. 임상증상및체중변화 DDAC와 EG 혼합물을기도내에점적하여폐독성을관찰하였으며, 실험기간동안특이적인임상증상및사망동물은관찰되지않았다. 체중변화는모든노출군에서노출후 3 일차에대조군대비약 10 % 감소하였으나시험종료 7 일차에회복됨을확인하였다 (Figure ). 14

21 <Figure > Body weight changes of animals after pulmonary exposure to the mixtures of DDAC and EG. Arrow : A point of time of intratrcheal instillation to animals. 나. 기관지폐포세척액분석 (1) 세포분석 DDAC 및 EG 혼합물질을기관내점적후 1 일및 7 일에대조군대비저농도노출군에서통계적으로유의성있는총세포수증가가관찰되었다 (Figure 6A). 염증세포인다형핵호중구 (polymorphonuclear neutrophils, PMNs) 분석결과모든노출군에서노출후 1 일차에대조군대비현저한증가가관찰되었다 (Figure 6B and C). 노출 7일차에는 1일차에비해염증세포수가감소하였지만대조군대비여전히유의적인증가가유지되었으며, 이러한결과는 DDAC 및 EG 혼합물질의단회노출시 7 일간의회복기간이경과하여도지속적으로폐장내에서염증반응이유발됨을나타낸다. 1

22 <Figure 6> Characteristics of bronchoalveolar lavage fluid(balf) cells after intratracheal instillation of DDAC and EG mixtures. (A) Total cells count (B) Percent of polymorphonuclear leukocytes (PMNs) in total cells from BALF (C) Cell morphology in BALF. Mean ± SEM, *P<0.0 and **P<0.01 vs. control. (C) Diff-Quick staining of BALF cell. The arrows indicate PMNs. Arrowheads point to macrophages. (2) 생화학적분석기관지폐포액내세포손상지표인젖산탈수소효소 (LDH) 항목을분석한결과 DDAC 및 EG 혼합물질노출시대조군대비유의성있는변화는관찰되지않았다 (Figure 7A). 하지만폐기능지표인총단백질 (TP) 항목분석결과유의성은없으나고농도노출군에서대조군대비증가하는양상이관찰되었다 (Figure 7B). 16

23 <Figure 7> Analysis of pulmonary cytotoxicity using bronchoalveolar lavage fluid (BALF). (A) Lactate dehydrogenase (LDH), (B) Total protein (TP) (3) 염증사이토카인분석염증발생시생성및분비가증가하는사이토카인인 TNF-α와 IL-6 변화를확인한결과통계적인유의성은없으나 TNF-α는노출후 1 일차때저농도및고농도노출군에서대조군대비증가하는경향이나타났으나노출후 7 일차에회복됨이관찰되었다 (Figure 8A). IL-6는노출후 1 일차에서고농도노출군에서만증가하는양상이관찰되었으나노출후 7 일차때는저농도노출군에서증가하는양상을보여주었다 (Figure 8B). TNF-α와 IL-6는폐장내에서다형핵호중구에의해분비되며또한다형핵호중구를활성화시키는등다양한염증반응을야기한다 16. 본연구에서 BALF 내 TNF-α와 IL-6 농도와염증세포분석결과를통해 DDAC와 EG 혼합물이폐장내에서다양한세포및사이토카인의상호복합적인영향을통해염증반응을유발할수있음을나타낸다. 17

24 <Figure 8> Analysis of cytokine concentrations in bronchoalveolar lavage fluid(balf). (A) Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) (B) Interleukin-6 (IL-6) (4) 조직병리학적분석 DDAC 및 EG 혼합물질을기관내점적노출후 7 일차에부검한랫드의폐장및간장에서특이할만한이상소견은관찰되지않았다 (Table 4). 또한노출후 1 일차에부검한동물의경우말단세기관지와폐포연접부를중심으로폐포염 (aveolitis) 이발생하였으나 7 일후에는모두정상으로회복되었음을확인하였다. <Table 4> Summary of histopathology of the liver and lung after intratracheal instillation Histopathology Group control low high Liver (No. examined) 4 No specific lesion 4 4 Mononuclear cell infiltration, multifocal Lung (No. examined) No specific lesion 18

4. 단회및반복흡입독성평가가. 단회흡입독성평가 (1) 챔버내노출농도 Aerosol atomizer(dongsung, 6-Jet) 를이용하여 DDAC 및 EG 혼합물질미스트를발생시켜각각의전신흡입노출챔버를통하여실험동물에게흡입노출시켰다. 챔버내공기중 DDAC 및 EG의농도를분석한결과, 저농도노출군 (DDAC 0.1% + EG 0.

25 4. 단회및반복흡입독성평가가. 단회흡입독성평가 (1) 챔버내노출농도 Aerosol atomizer(dongsung, 6-Jet) 를이용하여 DDAC 및 EG 혼합물질미스트를발생시켜각각의전신흡입노출챔버를통하여실험동물에게흡입노출시켰다. 챔버내공기중 DDAC 및 EG의농도를분석한결과, 저농도노출군 (DDAC 0.1% + EG 0.1%, w/w) 에서는 DDAC가 0.19 ± 0.01 mg m -3 이며 EG는정량한계 (limit of quantification, LOQ = 0.94 mg m -3 ) 이하였다. 중농도노출군 (DDAC 1% + EG 1%, w/w) 에서는 DDAC 1.98 ± 0.13 mg m -3, EG는 3.68 ± 0.3 mg m -3 였고, 고농도노출군 (DDAC % + EG %, w/w) 에서는 DDAC 7.98 ± 0.1 mg m -3, EG 7.01 ± 2.43 mg m -3 로서두물질의농도의존적으로공기중노출농도증가가관찰되었다 (Figure 9). <Figure 9> Concentrations of DDAC and EG in chamber atmosphere during acute inhalation exposure to the mixtures. (2) 임상증상및체중변화 DDAC 및 EG 혼합물질을 4 시간노출시킨후대조군, 저농도노출군, 중농도 노출군및고농도노출군을포함한모든군에서관찰기간 (14 일 ) 동안동물의외 19

26 관, 운동성, 출혈, 호흡이상등에대하여 14 일간매일 1 회임상관찰하였으나시험물질에기인된특이한임상증상을보이는동물은없었다. 또한고농도노출군 (DDAC 7.98 ± 0.1 mg m -3 및 EG 7.01 ± 2.43 mg m -3 ) 을포함한모든노출군에서사망한동물은없으므로반수치사농도 (LC 0, 4 h, rat) 는 DDAC 및 EG 1 : 1 혼합비율을가지는 DDAC 7.98 ± 0.1 mg m -3 및 EG 7.01 ± 2.43 mg m -3 의노출농도보다높은것으로평가된다. 실험동물의체중변화는 4 시간단회노출후 14 일관찰기간동안고농도노출군에서노출후 3 일차부터 14 일차까지지속적으로대조군대비 1 % 감소됨이관찰되었다. 하지만저농도및중농도노출군은대조군대비차이를보이지않았다 (Figure 10). <Figure 10> Changes of body weight in rats after 4 h inhalation of DDAC and EG mixtures. (3) 기관지폐포세척액분석 ( 가 ) 세포분석 DDAC 및 EG 혼합물질단회흡입노출결과, 4 시간노출직후중농도및고농도노출군에서대조군대비유의성있는총세포수및염증세포인다형핵호중구증가가관찰되었다 (Figure 11). 하지만이러한결과는 DDAC 및 EG 혼합물질단회노출 14일후에는회복되는것으로확인되었다. 20

<Figure 11> Characteristics of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) cells after acute inhalation of DDAC and EG mixtures. (A) Total cells count in BALF.

27 <Figure 11> Characteristics of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) cells after acute inhalation of DDAC and EG mixtures. (A) Total cells count in BALF. (B) Percent of polymorphonuclear leukocytes (PMNs) in total cells from BALF. (C) Cell morphology in BALF. Mean ± SEM, *P<0.0 and **P<0.01 vs. control. C: Diff-Quick staining of BALF cell. The arrows indicate PMNs. Arrowheads point to macrophages. ( 나 ) 생화학적분석 BALF 내폐기능지표인총단백질 (TP) 농도는 4 시간노출직후모든노출군에서대조군대비유의적인증가가관찰되었다 (Figure 12A). 또한세포손상지표인젖산탈수소화효소 (LDH) 농도는 DDAC 및 EG 혼합물질단회흡입노출시고농도노출군에서현저한증가가관찰되었다 (Figure 12B). 하지만이러한급성폐독성반응은관찰기관 14 일이후회복되었다. 21

( 다 ) 염증사이토카인분석 DDAC 및 EG 혼합물질의 4 시간단회흡입노출직후모든노출군에서대조군대비유의적인 IL-6 증가가관찰되었다 (Figure 13A). TNF-α 는중농도및고농도노출군에서증가하였다 (Figure 13B).

28 <Figure 12> Analysis of pulmonary cytotoxicity using bronchoalveolar lavage fluid (BALF) after acute inhalation of DDAC and EG mixtures. (A) Total protein (TP) content, (B) Lactate dehydrogenase (LDH). Mean ± S.E.M. *P<0.0 and **P<0.01 vs. control. ( 다 ) 염증사이토카인분석 DDAC 및 EG 혼합물질의 4 시간단회흡입노출직후모든노출군에서대조군대비유의적인 IL-6 증가가관찰되었다 (Figure 13A). TNF-α 는중농도및고농도노출군에서증가하였다 (Figure 13B). 특히, 고농도노출군에서 IL-6 와 TNF-α의농도는대조군대비각각 19 배와 4 배로현저히증가하였다. <Figure 13> Cytokine concentrations in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) after acute inhalation of DDAC and EG mixtures. (A) Interleukin-6 (IL-6), (B) Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α). Mean ± S.E.M. *P<0.0 and **P<0.01 vs. control. 22

29 나. 반복 (28 일 ) 흡입독성평가 (1) 챔버내노출농도 Aerosol atomizer(dongsung, 6-Jet) 를이용하여 DDAC 단일물질 (0.2 %, w/w) 과 EG 단일물질 (0.2%, w/w) 그리고 DDAC (0.2 %, w/w) + EG (0.2 %, w/w) 혼합물질미스트를발생시켜각각의전신흡입노출챔버를통하여실험동물에게하루 6 시간씩, 28 일동안반복흡입노출시켰다. 챔버내 DDAC 및 EG의농도를분석한결과, DDAC 단일노출군의농도는 0.73 ± 0.33 mg m -3, EG 단일물질노출군의농도는 0.66 ± 0.28 mg m -3 으로측정되었으며혼합물질노출군의 DDAC의농도는 0.70 ± 0.22 mg m -3 이며 EG는 0.80 ± 0.18 mg m -3 으로측정되었다 (Figure 14). (2) 임상증상및체중변화 DDAC 및 EG 혼합물질을 28 일반복흡입노출기간동안대조군및모든노출군에서시험물질에기인된특이한임상증상을보이는동물은없었으며사망개체또한발생하지않았다. 체중변화는 28 일반복흡입노출종료시점에혼합물질및 DDAC 단독노출군에서대조군대비 % 감소됨이관찰되었으나통계적인유의성은없었다 (Figure 1). <Figure 14> Concentrations of DDAC and EG during repeated inhalation exposure. <Figure 1> Changes of body weight of rats during repeated inhalation of DDAC and EG for 28 d. 23

30 (3) 기관지폐포세척액분석 ( 가 ) 세포분석 DDAC 단일물질및 DDAC+EG 혼합물질노출군에서대조군대비유의성있는총세포수및염증세포인다형핵호중구증가가관찰되었으나 EG 단독노출군에서는변화가관찰되지않았다 (Figure 16). 또한 DDAC+EG 혼합물질에의해 DDAC 단일물질보다두지표의변화량이증가하였으며, 이러한결과는두물질이혼합되어흡입될경우염증반응이상승될수있음을나타낸다. <Figure 16> Bronchoalveolar lavage fluid(balf) cell analysis after repeated inhalation of DDAC and EG. (A) Total cells count in BALF (B) Percent of polymorphonuclear leukocytes (PMNs) in total cells from BALF (C) Cell morphology in BALF. Mean ± SEM, *P<0.0 and **P<0.01 vs. control. C: Diff-Quick staining of BALF cell. The arrows indicate PMNs. Arrowheads point to macrophages. 24

( 나 ) 생화학적분석기관지폐포액내폐기능지표인총단백질 (TP) 농도는대조군대비유의성은없으나 DDAC+EG 혼합물질노출군에서증가하는양상이관찰되었다 (Figure 17A). 세포손상지표인젖산탈수소효소 (LDH) 항목분석에서는모든단일물질및혼합물질노출군에서대조군과차이가관찰되지않았다 (Figure 17B).

31 ( 나 ) 생화학적분석기관지폐포액내폐기능지표인총단백질 (TP) 농도는대조군대비유의성은없으나 DDAC+EG 혼합물질노출군에서증가하는양상이관찰되었다 (Figure 17A). 세포손상지표인젖산탈수소효소 (LDH) 항목분석에서는모든단일물질및혼합물질노출군에서대조군과차이가관찰되지않았다 (Figure 17B). <Figure 17> Analysis of pulmonary cytotoxicity using bronchoalveolar lavage fluid (BALF) after repeated inhalation of DDAC and EG. (A) total protein (B) LDH Mean ± S.E.M. *P<0.0 and **P<0.01 vs. control. ( 다 ) 사이토카인분석혼합물질및단일물질노출군을포함한모든노출군에서 BALF 내급성염증사이토카인인 TNF-α 및 IL-6 농도가대조군대비차이가관찰되지않았다 (Figure 18). 2

<Figure 18> Analysis of inflammatory cytokines in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) after repeated inhalation of DDAC and EG. (A) Interleukin-6 (IL-6) (B) Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α).

32 <Figure 18> Analysis of inflammatory cytokines in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) after repeated inhalation of DDAC and EG. (A) Interleukin-6 (IL-6) (B) Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α). Mean ± S.E.M. *P<0.0 and **P<0.01 vs. control. ( 라 ) 조직병리학적분석 DDAC 와 EG 단일물질또는 DDAC+EG 혼합물질 4 주반복흡입노출후간장과 폐장및신장에서의병리학적변화를관찰하였다 (Table ). <Table > Sumarry of histopathology of the liver, lung and kidney after repeated inhalation of DDAC, EG and DDAC/EG Histopathology Group control EG DDAC DDAC+EG Liver (No. examined) No specific lesion Mononuclear cell infiltration, multifocal Lung (No. examined) No specific lesion Fibrosis, terminal bronchioles and alveoli Cell aggregation, macrophages, multifocal Kidney (No. examined) No specific lesion Focal nephropathy Tubular dilatation, distal tubules, cortex Cyst(s)

시험물질의흡입에따른변화로폐장의말단세기관지와폐포벽의섬유화가 DDAC 단일물질및 DDAC+EG 혼합물질흡입시킨실험동물에서미약하게관찰되었다 (Figure 19). 말단세기관지와폐포벽의섬유화는대조군과 EG 단독흡입군에서는관찰되지않고, DDAC 단독흡입군과 DDAC+EG 혼합물질노출군에서만관찰되어이병변이 DDAC의흡입에의한것으로판단된다.

33 시험물질의흡입에따른변화로폐장의말단세기관지와폐포벽의섬유화가 DDAC 단일물질및 DDAC+EG 혼합물질흡입시킨실험동물에서미약하게관찰되었다 (Figure 19). 말단세기관지와폐포벽의섬유화는대조군과 EG 단독흡입군에서는관찰되지않고, DDAC 단독흡입군과 DDAC+EG 혼합물질노출군에서만관찰되어이병변이 DDAC의흡입에의한것으로판단된다. 하지만그병변의정도는매우경미하였다. <Figure 19> Histopathology of the representative lung of each group. Note the thickened wall of terminal bronchioles and alveoli with fibrosis (circle in DDAC and arrows in DDAC-EG). t, terminal bronchiole. H&E. X 200 for all. 27

34 간장에서관찰된단핵구의국소성침윤소견은대조군에서도관찰되고있듯이 정상동물에서도자주관찰되는소견으로시험물질과는무관하다. 따라서간장에 서는대조군을포함한모든노출군에서정상의모습을나타내었다 (Figure 20). <Figure 20> Histopathology of the representative liver of each group. No abnormal findings were noted in all the groups. p, portal triad; c, central vein. H&E. X

35 신장에서는대조군을포함하여전관찰군에서세관확장소견이관찰되었으나, 그정도가경미하고, 사구체와세뇨관에서의이상변화가관찰되지않아네프론의손상에의한것으로보이지않는다 (Figure 21). 또한, 대조군에서도관찰되고있어시험물질과는무관한변화로판단된다. <Figure 21> Histopathology of the representative kidney of each group. g, glomerulus; t, dilated distal tubules. H&E. X 100 이상의결과를종합하여, DDAC 와 EG 를혼합한시험물질을랫드에흡입시켰 을때 DDAC 에의해말단세기관지와폐포벽에경미하지만섬유화를유발할수 있는것으로판단되었다. 29

36 세포독성 폐독성 흡입독성상관성및계산독성학세포독성평가결과에서 DDAC 혹은 EG 단독처리시보다혼합물질로처리시세포독성이증가하였으며, DDAC 및 EG 혼합비율 3 : 10 수준에서부터 EG 농도의존적인독성이증가를보였다. 하지만이러한결과는 DDAC 및 EG 혼합비율 1 : 1 및 1 : 3 을바탕으로기도점적노출한폐독성평가결과와는일치하지않았다. 즉, 폐독성평가결과에서는 DDAC 및 EG 혼합비율 1 : 1 이 1 : 3 보다급성폐염증반응이높게관찰되었다. 이러한결과는 1 차적으로세포독성평가에서단일물질및혼합물질처리에따른혼합독성유발가능성을평가할수있으나실제혼합비율은폐독성평가단계에서확인되어야함을의미한다. 최근계산독성학을이용하여혼합물질노출에따른혼합독성결과를분석및예측한연구가보고되었다 17. 일반적인혼합물질의독성유발기전은크게 CA (concentration addition, dose addition) 법이나 IA (independent action, response addition) 법으로나타나다. CA법은유사한독성기전을가지고있는물질에적용되며 IA법은서로다른독성기전을가지고있는구성물질이서로독립적으로작용할때사용된다. 하지만실제혼합물질의독성평가방법은일률적으로단순하게구분되지않으며이들의독성기전을판별하는방법은복잡하다. 본연구에서는 EG 가폐세포및폐기관에서독성을나타내지않았음에도불구하고, DDAC 와혼합될경우독성을증폭시키는독성상승작용이관찰되었다. 두물질이세포내에서독성을미치는기전이상이하므로이러한경우 IA 법을통해독성예측이가능할것으로기대되었지만, 본실험결과에서두단일물질에의한독성반응의합보다혼합물에의한독성반응이더컸으므로, 계산독성학에기반한 IA 법으로도실제독성예측에는한계가있음을보여준다. 따라서계산독성학을이용한혼합물질독성평가는각구성물질별독성유발기전뿐아니라다양한변수가고려되어야하며 실제시험을바탕으로가장적합한기법선택을통해그한계점을극복해야할것이다 30

37 Ⅳ 결론 다양한화학물질을함유하는방향제및탈취제제품의실제적이며종합적인흡입독성평가는고비용및장기적인실험기간이필요한한계를가지고있다. 따라서본연구에서는국내주요생활화학물질중사용량이많은 didecyldimethylammonium chloride (DDAC) 및 ethylene glycol (EG) 을선정하여세포독성, 폐독성및흡입독성평가단계로구성된경제적이며효율적인스크리닝기법을도출하고자하였다. 1. 폐세포영향평가결과, DDAC 및 EG 각각의단독물질처리시보다혼합물질처리 시세포독성이강하게나타났다. 2. 랫드의기도점적단회노출에따른폐독성평가결과, DDAC 와 EG 혼합물질이급성 폐독성을유발할가능성이있음을확인하였다. 3. DDAC, EG 각각의단일물질및 DDAC 와 EG 혼합물질 (1 : 1) 을랫드에게 28 일반 복흡입노출결과, 혼합물질노출군에서기관지폐포세척액내총세포수및다형핵 호중구 (PMNs) 의현저한증가가관찰되었으며폐섬유화가유발되었다. 4. 세포독성시험에서얻은결과를통해설정한혼합비율에따른독성예측정도는설치류기도점적실험에서얻어진폐독성평가결과와는일치하지않았으며, 이는세포와생체내노출환경차이로인한것이며향후세포독성평가기법에대한보완이필요함을의미한다.. 세포및설치류를이용한단계적폐독성실험결과 EG 은그자체로폐독성을유발 하지않지만 DDAC 와혼합될경우그독성을상승시켜폐손상을유발할가능성이 있다. 본연구를통해혼합물질흡입독성평가를위한세포독성시험, 설치류폐독성및흡입독성시험을연계하는스크리닝기법제안을위해각물질별혼합비율의중요성을확인하였으며, 실질적생활화학물질에적용하려면향후체계적인각시험단계별후속연구가필요할것으로판단된다. 31

38 참고문헌 참고문헌 32

39 참고문헌 33

환경중잔류의약물질대사체분석방법확립에 관한연구 (Ⅱ) - 테트라사이클린계항생제 - 환경건강연구부화학물질연구과,,,,,, Ⅱ 2010

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