대한임상병리학회지 : 제 19 권제 2 호 1999 Korean J Clin Pathol 1999; 19: 임상화학 백혈병에서 Adenosine Deaminase Isoenzyme 측정의임상적유용성 신동훈 조현찬 강성하 박일구 * 윤갑준 * 한림대학교의과대학

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1 대한임상병리학회지 : 제 19 권제 2 호 1999 Korean J Clin Pathol 1999; 19: 임상화학 백혈병에서 Adenosine Deaminase Isoenzyme 측정의임상적유용성 신동훈 조현찬 강성하 박일구 * 윤갑준 * 한림대학교의과대학임상병리과학교실, 연세대학교원주의과대학임상병리과학교실 * Clinical Utility of Adenosine Deaminase Isoenzyme Determinations in Leukemia Dong Hoon Shin, M.D., Hyun Chan Cho, M.D., Sung Ha Kang, M.D., Il Gu Park, M.D.*, and Kap Jun Yoon, M.D.* Department of Clinical Pathology, Hallym University College of Medicine, Chunchon; Department of Clinical Pathology, Yonsei University Wonju College of Medicine*, Wonju, Korea Background : Adenosine deaminase (ADA), an enzyme involved in purine metabolism, catalyzes the hydrolytic deamination of adenosine or 2 -deoxyadenosine to inosine or 2 -deoxyinosine. Human ADA consists of three molecular forms: ADA1, ADA1+CP, and ADA2. The two ADA isoenzymes represent two different gene products and have different tissue distributions, and their concentrations in serum appear to reflect different pathological conditions or physiological responses. Elevation of serum ADA activity has been described especially in leukemia and lymphoma. The purpose of this study was to evaluate the clinical utility of ADA isoenzyme determination in the diagnosis of leukemia. Methods : We studied the activity of serum ADA and its isoenzyme in 44 leukemic patients. The study population consisted of 17 patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL), 23 with acute myeloid leukemia (AML), and 4 with chronic myelogenous leukemia (CML). ADA isoenzyme was measured by erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl) adenine [EHNA] inhibitory assay using the Hitachi 7170 autoanalyzer. Results : The rates of abnormally high total ADA activity were 100% for ALL, 60.8% for AML, and 50% for CML. In isoenzyme pattern, there was a clear difference between ALL and AML. High level of ADA1 activity was found in patients with ALL (P <0.01). The ADA1/ADA2 ratio was significantly higher (P <0.001) in ALL than AML. There was a correlation between ADA1 and absolute number of peripheral blasts in AML (r=0.840). Conclusions : It is concluded that the measurement of ADA isoenzyme may be a useful biochemical marker for leukemic diagnosis. (Korean J Clin Pathol 1999; 19: 181-9) Key words : Adenosine deaminase isoenzyme, Leukemia, Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl) adenine [EHNA] 서론 Adenosine deaminase (ADA; adenosine aminohydrolase, 접수 : 1998 년 9 월 11 일접수번호 : KJCP1212 수정본접수 : 1998 년 11 월 6 일교신저자 : 신동훈우 강원도춘천시교동 153 한림대부속춘천성심병원임상병리과전화 : , Fax : EC ) 는 adenosine과 deoxyadenosine이각각 inosine과 deoxyinosine으로탈아미노반응이일어날때이를촉매하는효소로서 [1] 인체내여러조직에분포되어있으며 [2], purine nucleotide 대사에중요한역할을하는것으로알려져있다 [3]. 인체에는 3 가지분자형의 ADA가존재한다 [4, 5]. ADA1은 20번염색체에위치하는유전인자에의한단인자표현의단백으로서 35 kda 가량의분자량을갖으며 [2-5], ADA1+CP는 2번과 6번염색체의유전자로부터만들어지는 200 kda의결합단백과두개의 ADA1으 181

2 182 신동훈 조현찬 강성하외 2 인 로구성되어있다 [2-6]. 세번째형태인 ADA2의염색체내유전인자의위치는아직알려져있지않으며, 역동성 (kinetic) 뿐아니라면역화학적특성이 ADA1과다른 kda의분자이다 [7, 8]. 이와같이 ADA의두가지동위효소는각기다른유전인자에의해생성되며조직내분포또한달라혈청내두동위효소는여러생리적, 병적상태를반영한다 [8]. ADA1은인체내여러조직과세포에존재하며특히비장, 간, 소장, 림프구, 단핵구등에고활성도로존재한다 [5-8]. 반면 ADA2는단핵구에만총 ADA의 18% 의비율로존재하여단핵구 / 대식세포계통의특이효소로알려져있다 [8]. 지금까지혈청총 ADA 활성도및그동위효소의측정은주로 ADA2의혈청내활성도가세포면역반응의부분으로서대식세포의활성을반영한다는점을이용하여간질환, 결핵, 장티푸스, 전염성단핵구증등여러질환에서진단목적으로이용되어왔으며 [9-13] 또한흉수, 복수, 뇌척수액등혈청이외의다른체액에서도결핵성과비결핵성흉수의감별 [14-16], 결핵성복막염, 결핵성뇌막염 [17] 등의진단에도움이되어왔다. 그러나 ADA1이림프구와그의전구체에서유래됨으로써림프세포증식성질환에서증가하는것으로알려져있음에도불구하고백혈병에서의연구는미비하였다. 백혈병환자에서 ADA 활성도에관한연구는 1975 년 Smyth 등 [18] 이급성림프아구성백혈병과만성골수성백혈병중모세포성발증 (blastic crisis) 환자의아세포에서총 ADA 활성도가증가함을보고한이후, 만성림프구성백혈병의 T 림프구와 T세포성급성림프구성백혈병환자의림프구에서총 ADA 활성도가증가하는것이보고되었을정도이다 [19-22]. 그외에도골수이형성증후군 [23], 다발성골수종 [24] 등의환자군에서산발적으로연구가이루어졌으나총 ADA에관한연구일뿐 ADA 동활효소에관한것은없었고, 급성백혈병의림프구성과비림프구성의감별에 ADA2 동활효소가유용한표지자임을밝힌연구 [25] 가있었으나혈청이아닌림프구에서의연구였으므로실제임상검사실에서의적용은어려웠다. 급성백혈병에서림프구성백혈병과골수성백혈병의정확하고빠른진단및분류는실제환자를대하는주치의로하여금빠른시간내에적절한치료의시작을가능하게할수있다. 그러나현재사용하고있는백혈병의진단및분류방법은말초혈액과골수천자도말의 Wright 염색에의한형태관찰과 peroxidase, Sudan black B, nonspecific esterase, periodic acid Schiff (PAS) 염색과같은특수염색을이용하고있으나이와같은방법으로는명확한구분이어려울때가종종있다. 백혈병세포의면역표지자검사를이용하여좀더정확하게면역학적분류를할수는있으나복잡한술식으로인해대략하루정도의시간이소요되는단점이있다. Griend[26] 등은림프구증식성질환에관한면역학적표지자및효소분석에서면역표지자만으로진단및분류가불가능한경우에효소분석이보조적지표로유용하다고하였다. 이에저자들은급성림프구성과골수성백혈병및만성골수성백혈병환자를대상으로혈청내총 ADA 활성도와그동위효소 를측정하여백혈병의각유형별양상을확인하고, 비교분석을함으로써총 ADA 활성도측정과동위효소검사가백혈병의진단과분류에유용한검사인지를알아보고자하였다. 1. 대상 대상및방법 1) 백혈병환자군 1995년 3월부터 1998년 3월까지 3년간한림대학교부속춘천성심병원과연세대학교원주의과대학부속원주기독병원에내원하여백혈병으로진단받은환자를대상으로하였다. 유형별로보면급성림프아구성백혈병환자 17명, 급성골수성백혈병환자 23명, 만성골수성백혈병환자가 4명이었다. 급성림프아구성백혈병환자군의연령은 1세부터 62세로중앙값이 19세이었고, 급성골수성백혈병환자군은 3세에서 75세의연령분포를보였으며중앙값은 46세이었다. 그외만성골수성백혈병환자군은 47세에서 55세의환자군으로중앙값이 52세이었다. 각환자군의성비는급성림프아구성백혈병환자군에서남자가 9명, 여자가 8명이었으며, 급성골수성백혈병환자군에서는남자환자가 10명, 여자환자가 13명이었다. 그리고만성골수성백혈병환자군에서는남자가 2명, 여자가 2명이었다 (Table 1). 2) 정상대조군정기신체검사대상자중에서발열등다른감염의증상이없으면서, 일반혈액검사와임상화학검사에서이상소견을보이지않은건강인 50명을대상으로하였다. 2. 방법 1) 일반혈액검사및말초혈액도말검사백혈병으로진단당시의말초혈액을채취하여검사하였다. 한림대학교부속춘천성심병원에서의일반혈액검사는 Coulter STKS (Coulter Electronics, U.S.A.) 자동혈구계산기로측정하였으며, 연세대학교원주의과대학부속원주기독병원에서는 Technicon H-2 system (Technicon, U.S.A) 을이용하여검사하였다. 말초 Table 1. Characteristics of patient population Diagnosis No. of cases Sex (M/F) Age (yr) ALL 17 9/8 19 (1-62)* AML 23 10/13 46 (3-75) CML 4 2/2 52 (47-55) *median (range). Abbreviations: ALL, acute lymphoblastic leukemia; AML, acute myeloid leukemia; CML, chronic myelogenous leukemia.

3 백혈병에서 Adenosine Deaminase Isoenzyme 측정의임상적유용성 183 혈액도말검사는 Wright 염색하여백혈구감별계산을실시하였다. 2) 백혈병의분류백혈병의유형을나누기위해 Wright 염색에서백혈병세포의형태관찰과더불어특수염색, 면역표지자검사를실시하였다. 특수염색은 peroxidase, Sudan black B, nonspecific esterase, PAS 염색을시행하였다. 백혈병세포의면역표지자검사를위해백혈병환자의골수천자액 3 ml 또는골수천자액을얻을수없었던경우에는말초혈액 10 ml ( 백혈구수 10 7 /L 이상, 백혈병세포 50% 이상 ) 를헤파린처리또는 EDTA 처리하여검체를채취하였고, 채취된골수검체는 Ficoll-Hypaque 비중원심법으로처리하여단핵세포층을분리하였다. 분리된세포에일련의단일클론성항체 (CD2, CD5, CD10, CD13, CD19, CD20, CD33, HLA-DR, TdT) 로면역형광염색을한후유세포분석기 (FAC- Scan, Becton-Dickinson, U.S. A.) 를이용하여분석하였다. 20% 이상의세포가양성을나타낼때해당단일클론항체반응양성으로판정하였고, TdT의경우에는 10% 이상일경우에양성으로판정하였다. 3) 총 ADA 및 ADA 동활효소의활성도측정백혈병환자군의혈청은가능한한일반혈액검사또는골수검사를시행한당일에환자의혈액을채취하여원심분리하였고, 정상대조군의혈청은신체검사당일의뢰된검체에서채취하였다. 총 ADA 활성도및동활효소측정을곧바로할수없는경우는 -70 에혈청을보관하였다. 혈청총 ADA 활성도의측정은 Hitachi 7170 자동화학분석기 (Hitachi, Japan) 를이용하여검사하였고, 검사시약은 Biancolle ADA kit (Toyobo, Japan) 를사용하였다. 측정원리를살펴보면, 기질인 adenosine이혈청중의 ADA의작용을받아 inosine과암모니아가되고, 이때생성된 inosine이 purine nucleoside phosphorylase의작용하에인산과반응하여 hypoxanthine을생성한다. Hypoxanthine은다시 xanthine oxidase에의해 xanthine과과산화수소를생성하게되는데, 이때생성된과산화수소를 peroxidase 존재하에 4-aminoantipyrine과 EHSPT [N-ethyl-N(2- hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine] 로반응시키면고감도색소가발생된다. 이발색되는 quinone 색소의생성량을 555 nm 에서 rate assay법으로측정하는것이다. ADA 동위효소의활성도측정은동일검체에서 ADA1 동위효소의선택적억제물질인 erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl) adenosine [EHNA] 을사용하는효소억제법 [7, 27] 을이용하여 EHNA 첨가전후의측정값을가지고총 ADA, ADA1과 ADA2 를구하였다. 3. 통계처리정상대조군과유형별백혈병환자군의총 ADA와동위효소의 활성도, ADA1/ADA2 비의비교는 Kruskal-Wallis test를이용하였고, 급성림프아구성백혈병의면역학적분류에따른비교와급성골수성백혈병중단핵구계와비단핵구계백혈병의비교는 Mann-Whitney (Wilcoxon) rank sum test를이용하여통계처리하였다. 말초혈액내절대적아세포수와 ADA 활성도의비교는상관분석을시행하였다. P 값이 0.05 미만인경우유의한차이가있는것으로간주하였다. 결과 1. 정상대조군의혈청총 ADA와각동활효소의활성도신체검사대상자중에서발열등다른감염의증상이없으면서, 일반혈액검사와임상화학검사에서이상소견을보이지않은건강인 50명을대상으로하여얻은총 ADA 활성도 ( 평균 ±SD) 는 16.4±2.8 IU/L 이었으며 ADA1과 ADA2 동위효소의활성도는각각 4.3±1.3, 12.1±2.5 IU/L이었다. 각동위효소의총 ADA에대한비율 (%) 은 ADA1이 26.2±4.1(%) 이었으며 ADA2가 73.8 ±4.1(%) 이었다. 정상대조군으로부터산출된참고범위 ( 평균 ± 2SD) 는총 ADA가 IU/L, ADA1 동위효소가 IU/L, ADA2 동위효소가 IU/L이었다 (Table 2). 2. 각유형별백혈병환자군에서의혈청총 ADA 활성도급성림프아구성백혈병환자군에서의혈청총 ADA의활성도 ( 평균 ±SD) 는 70.3±35.5 IU/L로정상대조군의평균치인 16.4 ±2.8 IU/L 보다의의있게높았으며 (P <0.01), 증가범위는 27.1 IU/L부터 IU/L까지모든예에서참고치보다높게나타났다. 급성골수성백혈병환자군에서는총 ADA 활성도가 38.2± 31.9 IU/L로급성림프아구성백혈병환자군의평균치보다는낮았으나정상대조군보다는의의있게증가되었으며 (P <0.01), 총 23 예중 14예 (60.8%) 가참고치보다높게증가함을보였는데증가정도는참고범위에서부터 IU/L까지다양하였다. 만성골수성백혈병환자군에서는 4예중 2예에서참고치보다높게증가하였고, 혈청총 ADA 활성도가 25.0±8.8 IU/L로정상대조군보다는높았으나통계학적의의는없었으며, 백혈병환자군중가장낮았다 (Table 2). 3. 각유형별백혈병환자군에서의혈청 ADA 동위효소의활성도혈청 ADA1 동위효소의활성도 ( 평균 ±SD) 는급성림프아구성백혈병, 급성골수성백혈병, 만성골수성백혈병환자군에서각각 53.3±34.8, 15.8±16.6, 11.5±6.3 IU/L로정상대조군의평균치인 4.3±1.3 IU/L보다모든환자군에서높았으나급성골수성백혈

4 184 신동훈 조현찬 강성하외 2 인 Table 2. Serum total ADA and its isoenzyme activities in normal and leukemic population 13 Diagnosis ADA activity, IU/L (Mean±SD) Total ADA ADA1 ADA Normal 16.4± ± ±2.5 ALL 70.3±35.5* 53.3±34.8* 17.1±7.1 AML 38.2±31.9* 15.8± ±17.9* CML 25.0± ± ±3.8 *P<0.01, vs. normal; P<0.05, vs. ALL. Abbreviation: ADA, adenosine deaminase. 병과만성골수성백혈병환자군에서는정상대조군과의유의한차이를보이지않았으며 (P >0.05), 단지급성림프아구성백혈병환자군만이대조군뿐아니라다른유형의백혈병환자군보다유의하게증가하였다 (P <0.01). 급성림프아구성백혈병환자군의경우에 는 ADA1 동위효소의활성도가모든예에서참고치보다증가하였 으며최고 119 IU/L까지증가한예도있었다. 급성골수성백혈병환자군에서는 23예중 16예 (69.6%) 에서 ADA1 동위효소의활성도가참고치보다높게증가하였고, 증가정도는 2.0 IU/L의참고범위부터 77.6 IU/L까지다양한증가양상을보였다. 만성골수성백혈병환자군의 ADA1 동위효소활성도는총 4예중 1예에서만참고범위를보였고나머지예에서는참고치보다증가하였다 (Table 2). 혈청 ADA2 동위효소의활성도는급성림프아구성백혈병, 급성골수성백혈병, 만성골수성백혈병환자군에서각각 17.1±7.1, 22.3 ±17.9, 13.6±3.8 IU/L로정상대조군의평균치인 12.1±2.5 IU/L보다는높았으나, 급성골수성백혈병환자군에서만정상대조군에비해통계학적으로의의있는증가를보였다 (P <0.01). 급성림프아구성백혈병환자군의 ADA2 동위효소활성도의분포는 8.5 IU/L부터 31.8 IU/L로총 17예중 9예는참고치보다증가하였으며, 나머지 8예는참고범위였다. 급성골수성백혈병환자군에서는 23예중 10예 (43.5%) 에서 ADA2 동위효소의활성도가참고치보다높았고최고 68.5 IU/L까지증가하였다. 만성골수성백 혈병환자군의 ADA2 동위효소활성도는총 4예중 1예에서만증 가하였다 (Table 2). 4. 각유형별백혈병환자군에서의혈청 ADA1/ADA 2 비 혈청 ADA1/ADA2 동위효소의비는급성림프아구성백혈병, 급성골수성백혈병, 만성골수성백혈병환자군에서각각의평균이 3.8, 0.7, 0.9로급성림프아구성백혈병환자군에서통계학적으로유의하게높았다 (P <0.001)(Fig. 1). 5. 말초혈액내아세포의절대수와혈청총 ADA 및 ADA 동위효소활성도와의상관관계 유형을구분하지않은급성백혈병환자군에서의말초혈액내절 ADA1/ADA2 ratio ALL AML CML Fig. 1. ADA1/ADA2 ratio in sera of patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL), acute myeloid leukemia (AML), and chronic myelogenous leukemia (CML). Results are expressed as mean±sem. *P<0.001 compared with AML group. Total ADA (IU/L) ALL, r=0.558 AML, r= Absolute number of blasts ( 10 9 /L) Fig. 2. Correlation between total ADA and absolute number of peripheral blasts. 대적아세포수와총 ADA, ADA1 동위효소활성도와의상관계수는각각 0.639, 0.595로유의한상관성을보였으며, ADA2와의상관계수는 0.324로관련성이적었다. 각유형별급성백혈병에서의말초혈액내절대적아세포수와총 ADA 활성도와의상관계수는급성림프아구성백혈병에서 0.558, 급

5 백혈병에서 Adenosine Deaminase Isoenzyme 측정의임상적유용성 ALL, r=0.447 AML, r=0.840 Table 3. Serum total ADA, ADA1, and ADA2 activities according to the immunologic classification of acute lymphoblastic leukemia ADA1 (IU/L) Diagnosis No. of Cases Non-T ALL ± ± ± ±2.3 T ALL ± ± ±0.8* 8.9±3.2 *P<0.01, P<0.05, vs. non-t ALL. Abbreviations: See Table 1, 2. ADA activity, IU/L (Mean±SD) Total ADA ADA1 ADA2 ADA1/ADA2 Ratio Absolute number of blasts ( 10 9 /L) Fig. 3. Correlation between ADA1 and absolute number of peripheral blasts. Table 4. Serum total ADA, ADA1, and ADA2 activities according to the immunologic classification of acute myeloid leukemia Diagnosis No. of Cases ADA activity, IU/L (Mean±SD) Total ADA ADA1 ADA2 ADA1/ADA2 Ratio AML (M1-M3) ± ± ± ±0.4 AML (M4, M5) ±13.8* 15.0±3.0* 23.7±11.2* 0.7±0.2* 80 ALL, r=0.606 AML, r=0.527 *Not significant (P>0.05), vs. AML (M1-M3). Abbreviations: See Table 1, 2. ADA2 (IU/L) 구성환자군에서더높게증가하였으나통계학적으로유의한차이는없었으며 (P=0.208, 0.101), ADA2 동위효소의평균활성도는 non-t세포성급성림프구성백혈병환자군에서 18.8±6.6 IU/L, T세포성급성림프구성백혈병환자군에서 9.0±0.76 IU/L 로유의한차이를보였다 (P <0.01). 또한 ADA1/ADA2 비도두환자군사이에서통계학적으로유의한차이를보였다 (P <0.05) (Table 3) Absolute number of blasts ( 10 9 /L) Fig. 4. Correlation between ADA2 and absolute number of peripheral balsts. 성골수성백혈병에서는 0.732로두환자군에서모두유의한상관성을보였으며 (Fig. 2), ADA1과 ADA2 동위효소에대한상관계수는급성림프아구성백혈병에서 0.447, 0.606이었고급성골수성백혈병에서는 0.840, 0.527로 ADA1 동위효소와말초혈액내아세포수와의관련성은급성골수성백혈병에서더높았으며 ADA2 동위효소와의상관성은두급성백혈병환자군이비슷하였다 (Fig. 3, 4). 6. 급성림프아구성백혈병의면역학적분류에따른혈청총 ADA와 ADA 동위효소의활성도 T세포성급성림프구성백혈병환자군과 non-t세포성급성림프구성백혈병환자군의혈청총 ADA와 ADA1 활성도는 T 림프 7. 급성골수성백혈병중단핵구계와비단핵구계백혈병의혈청총 ADA와 ADA 동위효소의활성도급성골수성백혈병의유형중단핵구계백혈병인 M4와 M5의총 ADA와 ADA1, ADA2 동위효소의활성도는비단핵구계백혈병 (M1-M3) 의활성도와유의한차이를보이지않았다 (P >0.05) (Table 4). 8. 급성백혈병에서의특수염색의불명확한결과시면역표지자검사와혈청총 ADA 및 ADA 동위효소활성도의비교급성백혈병환자군중 6예에서세포형태의관찰과특수염색만으로림프아구성과골수성의구분이불확실하였다. 그중 2예에서는 peroxidase 염색에음성이면서 PAS 염색은약양성을보인경우였으며, 3예에서는 peroxidase 염색에양성이면서 PAS 염색은약약성을보였고, 1예에서는 peroxidase와 PAS 염색모두음성이었다. 6예중 4예에서총 ADA 및 ADA 동위효소의활성도가모두증가하였으며, 참고범위를보였던 2예는면역표지자

6 186 신동훈 조현찬 강성하외 2 인 Table 5. Serum total ADA, ADA1 & ADA2 activities, and ADA1/ADA2 ratio in acute leukemic patients showing discrepancy between immunologic and cytochemical results Cases Special stain Positive ADA activity, IU/L MPO PAS Cell Markers Total ADA ADA1 ADA2 ADA1/ADA2 Ratio 1 + ± TdT, HLA-DR, CD13, CD33, CD ± TdT, HLA-DR, CD19, CD ± TdT, HLA-DR, CD13, CD33, CD ± HLA-DR, CD13, CD ± TdT, HLA-DR,CD2, CD5, CD TdT, HLA-DR, CD19, CD Abbreviations: MPO, myeloperoxidase; PAS, periodic acid Schiff; TdT, terminal deoxynucleotidyl transferase; HLA-DR, major histocompatibility complex class II antigen; CD, cluster of differentiation. 검사상모두급성골수성백혈병으로진단되었다. ADA1/ADA2 비는급성림프아구성백혈병으로진단된 6예중 3예는모두 2이상이었으나, 급성골수성백혈병으로진단된나머지 3예는모두 1이하였다 (Table 5). 고찰 Adenosine deaminase (ADA) 의동위효소인 ADA1과 ADA2 는각기다른유전인자에의해생성되며분자량이다를뿐아니라 [4-7, 27] 반응 ph, 미하엘리스상수 (Km; Michaelis constant), 상대적기질특이성면에서차이를보인다 [28]. ADA1은낮은 ( M) 미하엘리스상수를갖으며적정반응 ph가 이고 adenosine 및 2 -deoxyadenosine과의친화정도는비슷하여 2 -deoxyadenosine/ada의비가 0.75 정도이다. 반면 ADA2는매우높은 ( M) 미하엘리스상수와 6.5 정도의적정 ph를보이며 2 -deoxyadenosine에대한친화력이적어 2 -deoxyadenosine/ada의비가 0.25 정도이다 [29, 30]. 분포조직과역할면에서도차이를보이는데, ADA1은간장, 신장, 소장등모든조직에분포하며면역반응에필수적인역할을한다 [2]. 만약선천적으로림프구와적혈구에 ADA1이결핍이있을경우중증혼합성면역결핍증을보인다. ADA2는중증혼합성면역결핍증과는관련이없으며, 단지단핵구및대식세포에존재하면서 [7, 31] 감염세균의자극에의해세포밖으로유출되는것으로알려져있다 [32]. 정상혈청에는 ADA1+CP와 ADA2 두가지형태만존재하고 ADA1은존재하지않는다. ADA1이혈청내없는것은결합단백이다량혈청내존재하기때문에 ADA1이 ADA1+CP 형태로바뀌는것으로추측되고있다 [8]. 환자혈청에서높은 ADA 활성도를보이는경우는 ADA1+CP와 ADA2의증가에의한것이지만, 대부분은 ADA2의증가가주된원인이다. 물론급성림프아구성백혈병과같은림프세포증식성질환인경우는림프구에서유래된 ADA1과 ADA1+CP가 ADA2보다많은비율로존재하기도한다. 그러나단핵구계통이관계하는세포면역성질환에서는 ADA2가주로증가하게된다 [14]. 단핵구의 ADA 동위효소는 ADA1이 82% 이고 ADA2가 18% 이지만혈청내 ADA2의비율이더높은것은아마 ADA2가단핵구로부터더능동적으로분비되거나또는 ADA1보다수명이길기때문일것으로생각한다 [8]. ADA 동위효소에대한참고범위는아직까지기준이되는검사법이없고검사방법과검사장비에따라차이를보일수있으므로각임상검사실마다참고치를설정하는것이매우중요하다. Muraoka 등 [33] 이 Hitachi 705 자동화학분석기에 Ellis 변법 [34] 을적용하여산정한 ADA1과 ADA2의참고범위는각각 , U/L였으며, Ohata 등 [35] 이 COBAS MIRA로검사한총 ADA, ADA1, ADA2의참고범위는각각 , , IU/L였다. 본연구에서구한총 ADA의참고범위는 IU/L로다소높았으며, ADA1과 ADA2의참고범위도각각 , IU/L로다른연구자들의결과에비해다소높았으나참고범위의폭 (2SD) 은유사하였다. Smyth와 Harrap [18], Morisaki 등 [36] 은급성림프아구성백혈병의아세포에서구조적으로정상인 ADA의합성이증가하고따라서혈장 ADA 활성도의증가가골수내백혈병세포의증가를반영한다고하였다. 특히 T세포성급성림프구성백혈병의림프구인경우에 non-t 림프구보다그증가의폭이크며 [21, 22, 37, 38], 심지어 3배정도더증가한다는보고도있다 [39]. 만성림프구성백혈병의림프구에서 ADA 활성도는 B 림프구성인경우에오히려정상보다감소하고 [20], T 림프구성인경우에만 2-3배증가한다고하는 Tung 등 [19] 의보고를접할수있다. 본연구에서검사한급성림프아구성백혈병환자의혈청총 ADA는 70.3 ±35.5 IU/L로정상대조군뿐만아니라급성골수성백혈병과만성골수성백혈병환자군보다도유의하게높았다. 또한 T세포성급성림프구성백혈병환자군의혈청총 ADA와 ADA1 활성도가 non-t세포성급성림프구성백혈병환자군보다는증가하였으나유의한차이는없었다. 반면 ADA2 활성도는 T세포성급성림프구성백혈병환자군에서의의있게낮았으며, ADA1/ADA2 비도유의한차이를보였다. 그러나본연구에서의 T세포성급성림프구

7 백혈병에서 Adenosine Deaminase Isoenzyme 측정의임상적유용성 187 성백혈병환자군의수가적어정확한평가를위해서는좀더많은증례에대한연구가필요할것으로사료된다. Storch 등 [24] 은급성골수성 ( 비림프구성 ) 백혈병환자의혈장과림프구에서 ADA 활성도가증가한다고하였다. Ratech 등 [25] 도단핵구성백혈병의백혈병세포에서더높게증가함을보고하였고, 특히 ADA2가비림프구성백혈병세포에서유의하게증가하므로써이를비림프구성백혈병의유용한표지자로이용할수있다고하였다. 본연구에서의급성골수성백혈병환자군의혈청총 ADA 활성도는대조군및급성림프아구성백혈병환자군에비해유의한차이를보였으며, 혈청 ADA2 활성도는대조군에비해의의있게높았으나급성림프구성백혈병환자군과는유의한차이를보이지않아 Ratech 등 [25] 의보고와는차이가있었다. 본연구의결과로는혈청 ADA1/ADA2 동위효소의비가급성림프아구성백혈병환자군에서급성골수성백혈병환자군보다의의있게높으므로두환자군을구분하는데유용한지표가될것으로사료된다. 급성골수성백혈병가운데단핵구계백혈병과비단핵구계백혈병간의혈청총 ADA와 ADA 동위효소활성도의비교는증례수가적어정확한평가는어려우나유의한차이는보이지않았다. 만성골수성백혈병의경우아구성발증이일어나기전에세포내 ADA 활성도가먼저증가하므로아구성발증의예측이가능하다는보고가있다 [18, 40]. 본연구에서는만성골수성백혈병환자를추적관찰하지는않았으며, 병원에내원하여진단당시에 ADA 활성도검사를실시하였다. 만성골수성백혈병환자군의증례수가적어통계학적의의를두기는어려우나혈청총 ADA와 ADA 동위효소의활성도는대조군과유의한차이를보이지않아만성골수성백혈병에서는 ADA 동위효소측정의진단적가치는적은것으로사료되며만성골수성백혈병의아구성발증과혈청 ADA 동위효소의활성도에대한연구가필요할것으로생각한다. Blaszczyszyn 및 Klos [41] 는백혈병환자의혈청총 ADA 활성도는정상대조군보다높으며그증가정도는말초혈액내백혈구의수와관계가있다고주장하였다. 또한 Ohata 등 [35] 도 ADA1 동위효소와말초혈액내아세포의절대수사이에상관관계가있으며, 급성림프아구성백혈병과급성골수성백혈병에서상관계수가각각 r=0.7648, r=0.4877이라고보고하였다. 본연구에서도급성림프아구성백혈병에서혈청총ADA, ADA1, ADA2 활성도와말초혈액내아세포의절대수사이에상관계수 (r) 는각각 0.558, 0.447, 0.606이었고, 급성골수성백혈병에서는각각 0.732, 0.840, 0.527로상관성이있음을확인하였다. 그러나혈청 ADA1 동위효소의경우급성골수성백혈병에서급성림프아구성백혈병보다더좋은상관성을보여 Ohata 등 [35] 의결과와다른양상을보였다. 유형을구분하지않은전체급성백혈병환자군에서말초혈액내아세포의절대수와총ADA 및 ADA1 동위효소의활성도사이에유의한상관성을보였으며 ADA2와는상관성이적었다. 세포형태의관찰과특수염색만으로림프아구성과골수성의구분이불확실하였던급성백혈병환자 6예중면역표지자검사에서 림프아구성으로진단된 3예는모두혈청총 ADA 및 ADA 동위효소의활성도가증가하였고, 골수성으로진단된 3예의경우 2 예는참고범위의활성도를보였으며 1예는증가된활성도를보여 ADA 활성도로는구분이어려웠다. 그러나 ADA1/ADA2 비는급성림프아구성백혈병의 3예에서는모두 2이상이었고, 급성골수성백혈병의 3예에서는모두 1이하로두환자군의구분이면역표지자검사와일치하였다. 세포의형태관찰과특수염색상의모호한결과외에도실제골수검사를하다보면백혈병환자의경우골수가충전 (packed) 되어무효천자 (dry tap) 가생기는경우가많다. 이런경우에말초혈액에아세포수가적으면면역표지자검사도어려움을겪게된다. 이러한골수검사의무효천자시혈청검체는쉽게얻을수있으므로혈청총 ADA와 ADA 동위효소의활성도및 ADA1/ADA2 비는백혈병의유형을구분하는데매우유용하리라사료된다. 결론적으로본연구결과급성백혈병환자의혈청총 ADA 및 ADA 동위효소의활성도는정상보다유의하게증가함을알수있었으며, 혈청내 ADA의활성도는말초혈액내총백혈구수및절대적아세포의수와상관관계가있음을확인하였다. 또한 ADA1/ADA2 비가급성림프아구성백혈병과급성골수성백혈병을구분할수있는표지자로서의진단적가치가있으며세포형태관찰, 특수염색, 면역표지자검사와더불어또하나의보조적역할을할수있으리라사료된다. 요약배경 : Adenosine deaminase (ADA) 는 purine 대사에관여하는효소로서 adenosine이탈아미노반응을하여 inosine으로되는과정을촉매하는역할을한다. ADA의두가지동위효소는각기다른유전인자에의해생성되며조직내분포또한달라혈청내두동위효소는여러생리적, 병적상태를반영한다. 저자들은백혈병에서총 ADA 활성도측정과동위효소검사가백혈병의진단과분류에유용한검사인지를알아보고자하였다. 방법 : 급성림프아구성백혈병환자 17예, 급성골수성백혈병환자 23예, 만성골수성백혈병환자 4예를대상으로혈청총 ADA 와 ADA 동위효소를 Hitachi 7170 자동화학분석기를사용하여측정하였다. 혈청내 ADA 동위효소는 erythro-9-(2-hydroxy-3- nonyl) adenine [EHNA] 를이용한효소억제법으로검사하였다. 결과 : 급성림프아구성백혈병환자군의모든예 (100%) 에서총 ADA와 ADA1 동위효소의활성도가참고치보다유의하게증가하였으며, 정상대조군및급성골수성백혈병환자군과유의한차이를보였다 (P <0.01). 급성골수성백혈병환자군에서도총 ADA 활성도는 23예중 14예 (60.8%) 에서참고치보다증가하여정상대조군과유의한차이를보였으며, ADA2 동위효소의활성도도정상대조군보다의의있게증가하였다 (P <0.01). ADA1/ ADA2 비는급성림프아구성백혈병환자군에서급성골수성백혈병

8 188 신동훈 조현찬 강성하외 2 인 환자군보다유의하게증가하였다 (P <0.001). 또한말초혈액내총백혈구수및절대적아세포수는혈청총 ADA 와 ADA 동위효소의활성도와상관성이있었고, 특히급성골수성백혈병환자군에서혈청 ADA1과의상관계수는 0.840으로유의한상관성을보였다. 결론 : 혈청총 ADA 및 ADA 동위효소의활성도검사는백혈병의진단및분류에있어서세포형태관찰, 특수염색, 면역표지자검사와더불어또하나의유용한검사로활용될수있을것으로사료된다. 참고문헌 1. Conway EJ and Cooke R. The deaminase of adenosine and adenylic acid in blood and tissues. Biochem J 1939; 33: Van der Weyden MB and Kelley WN. Human adenosine deaminase: distribution and properties. J Biol Chem 1976; 251: Giusti G. Adenosine deaminase. In: Bergmeyer HU, ed. Method of enzymatic analysis. New York: Academic Press Inc, 1974; Spencer N, Hopkinson DA, Harris H. Adenosine deaminase polymorphism in man. Ann Hum Genet 1968; 32: Edwards YH, Hopkinson DA, Harris H. Adenosine deaminase isoenzymes in human tissues. Ann Hum Genet 1971; 35: Schrader WP, Woodward FJ, Pollara B. Purification of an adenosine deaminase complexing protein from human plasma. J Biol Chem 1979; 254: Ratech H and Hirschhorn R. Serum adenosine deaminase in normals and in a patient with adenosine deaminase deficient-severe combined immunodeficiency. Clin Chim Acta 1981; 115: Ungerer JPJ, Oosthuizen HM, Bissbort SH, Vermaak WJH. Serum adenosine deaminase: isoenzyme and diagnostic application. Clin Chem 1992; 38: Kobayashi F, Ikeda T, Marumo F, Sato C. Adenosine deaminase isoenzymes in liver disease. Am J Gastroenterol 1993; 88: Mishra OP, Gupta BL, Ali Z, Nath G, Chandra L. Adenosine deaminase activity in typhoid fever. Indian Pediatr 1994; 31: Chiba S, Matsumoto H, Saitoh M, Kasahara M, Matsuya M, Kashiwagi M. A correlation study between serum adenosine deaminase activities and peripheral lymphocyte subsets in Parkinson s disease. J Neurol Sci 1995; 132: Meunier P, Filipe P, Emerit I, Freitas J, Guerra-Rodrigo F, Manso C. Adenosine deaminase in progressive systemic sclerosis. Acta Derm Venereol 1995; 75: Tsuboi I, Sagawa K, Shichijo S, Yokoyama MM, Ou DW, Wiederhold MD. Adenosine deaminase isoenzyme levels in patients with human T-cell lymphotropic virus type 1 and human immunodeficiency virus type 1 infections. Clin Diagn Lab Immunol 1995; 2: Ungerer JPJ, Oosthuizen HM, Retief JH, Bissbort SH. Significance of adenosine deaminase activity and its isoenzymes in tuberculosis effusions. Chest 1994; 106: Shibagaki T, Hasegawa Y, Saito H, Yamori S, Shimokata K. Adenosine deaminase isoenzymes in tuberculous pleural effusion. J Lab Clin Med 1996; 127: Villena V, Navarro-Gonzalvez JA, Garcia-Benayas C, Manzanos JA, Echave J, Lopez-Encuentra A, et al. Rapid automated determination of adenosine deaminase and lysozyme for differentiating tuberculous and nontuberculous pleural effusions. Clin Chem 1996; 42: Piras MA and Gakis C. Cerebrospinal fluid adenosine deaminase activity in tuberculous meningitis. Enzyme 1973; 14: Smyth JF and Harrap KR. Adenosine deaminase activity in leukemia. Br J Cancer 1975; 31: Tung R, Silber R, Quagliata F, Conklyn M, Gottesman J, Hirschhorn R. Adenosine deaminase activity in chronic lymphocytic leukemia. Relationship to B- and T-cell subpopulations. J Clin Invest 1976; 57: Ramot B, Brok-Simoni F, Barnea N, Bank I, Holtzmann F. Adenosine deaminase (ADA) activity in lymphocytes of normal individuals and patients with chronic lymphatic leukaemia. Br J Hematol 1977; 36: Coleman MS, Greenwood MF, Hutton JJ, Holland P, Lampkin B, Krill C, et al. Adenosine deaminase, termianl deoxynucleotidyl transferase (TdT), and cell surface markers in childhood acute leukemia. Blood 1978; 52: Iizuka H, Ohkawara A, Koizumi H, Aoyagi T, Miura Y, Taniguchi N, et al. Adenosine deaminase in adult T cell leukemia. J Dermatol 1983; 10: Van der Weyden MB, Harrison C, Hallam L, McVeigh D, Gan TE, Taaffe LM. Elevated red cell adenosine deaminase and haemolysis in a patient with a myelodysplastic syndrome. Br J Haematol 1989; 73: Storch H, Kruger W, Rotzsch W. Adenosine deaminase activity in plasma and blood cells of patients with haematological and autoimmune diseases. Acta Haematol 1981; 65: Ratech H, Martiniuk F, Borer WZ, Rappaport H. Differential expression of adenosine deaminase isozymes in acute leukemia. Blood 1988; 72: van de Griend RJ, van der Reijden HJ, Bolhuis RL, Melief CJ, von dem Borne AE, Roos D. Enzyme analysis of lymphoproliferative diseases: a useful addition to cell surface phenotyping. Blood 1983; 62: Schrader WP, Pollara B, Meuwissen HJ. Characterization of the residual adenosine deaminating activity in the spleen of a patient with combined immunodeficiency disease and adenosine deaminase deficiency. Proc Natl Acad Sci USA 1978; 75: Gakis C, Calia GM, Naitana AGV, Ortu AR, Contu A. Serum and pleural adenosine deaminase activity. Correct interpretation of the findings. Chest 1991; 99:

9 백혈병에서 Adenosine Deaminase Isoenzyme 측정의임상적유용성 Giusti G and Gakis C. Temperature conversion factors, activation energy, relative substrate specificity and optimum ph of adenosine deaminase from human serum and tissue. Enzyme 1971; 12: Gakis C. Adenosine deaminase (ADA) isoenzymes ADA1 and ADA2: diagnostic and biological role. Eur Respir J 1996; 9: Zuckerman SH, Olson JM, Douglas SD. Adenosine deaminase activity during in vitro culture of human peripheral blood monocytes and pulmonary alveolar macrophages. Exp Cell Res 1980; 129: Gakis C, Calia G, Naitana D, Pirino D, Serru G. Serum adenosine deaminase activity in HIV positive subjects. A hypothesis on the significance of ADA2. Panminerva Med 1989; 31: Muraoka T, Katsuramaki T, Shiraishi H, Yokoyama MM. Automated enzymatic measurement of adenosine deaminase isoenzyme activities in serum. Anal Biochem 1990; 187: Ellis G, Spooner RJ, Goldberg DM. Automated kinetic assays for routine determination of adenosine deaminase and guanase activities of human serum. Clin Chim Acta 1973; 47: Ohata M, Masuda I, Nonaka K, Sugiura K, Uchida H, Mori T. Serum adenosine deaminase and its isozyme activity in leukemia and MDS. Rinsho Byori 1990; 38: Morisaki T, Fujii H, Miwa S. Adenosine deaminase (ADA) in leukemia: clinical value of plasma ADA activity and characterization of leukemic cell ADA. Am J Hematol 1985; 19: Brusamolino E, Isernia P, Lazzarino M, Scovassi I, Bertazzoni U, Bernasconi C. Clinical utility of terminal deoxynucleotidyl transferase and adenosine deaminase determinations in adult leukemia with a lymphoid phenotype. J Clin Oncol 1984; 2: Morisaki T, Horiuchi N, Tsutsumi H, Ogura H, Kanno H, Tani K, et al. Genetic analysis of adenosine deaminase expression in adult T-cell leukemia. Am J Hematol 1988; 28: Smyth JF, Poplack DG, Holiman BJ, Leventhal BG, Yarbro G. Correlation of adenosine deaminase activity with cell surface markers in acute lymphoblastic leukemia. J Clin Invest 1978; 62: Grever MR, Coleman MS, Balcerzak SP. Adenosine deaminase and terminal deoxynucleotidyl transferase: biochemical markers in the management of chronic myelogenous leukemia. Cancer Res 1983; 43: Blaszczyszyn M and Klos M. The activity of adenosine deaminase in serum and leukocytes of leukemic patients. Adv Exp Med Biol 1984; 165: