untitled

Transcription

1 Journal of Korean Medicine Rehabilitation Vol. 25 No. 2, April 2015 pissn eissn Original Article 우창훈 오민석 * 대구한의대학교한의과대학한방재활의학교실, 대전대학교한의과대학한방재활의학교실 * Effects of Bujasasim-tang Ethanol Extract on Oxidative Stress, Inflammation and Osteoarthritic Rat Model Chang-Hoon Woo, K.M.D., Min-Seok Oh, K.M.D.* Department of Rehabilitation Medicine of Korean Medicine, College of Korean Medicine, Daegu Haany University, Department of Rehabilitation Medicine of Korean Medicine, College of Korean Medicine, Dae-Jeon University* RECEIVED March 16, 2015 ACCEPTED March 27, 2015 CORRESPONDING TO Min-Seok Oh, Department of Rehabilitation Medicine of Korean Medicine, College of Korean Medicine, Dae-Jeon University, 75, Daedeokdae-ro 176beongil, Seo-gu, Daejeon , Korea TEL (042) FAX (042) ohmin@dju.ac.kr Copyright 2015 The Society of Korean Medicine Rehabilitation Objectives This study was performed to investigate the effects of Bujasasim-tang ethanol extract (BST) on oxidative stress, inflammation and osteoarthritic rat model. Methods To ensure safety of BST, heavy metal levels were measured and cytotoxicity test was done. In vitro, To evaluate antioxidative effects of BST, total phenolic contents, 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH), 2,2 azino bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) scavenging activity, reactive oxygen species (ROS) levels were measured. Also, to evaluate anti-inflammatory effects of BST treated group, total nitric oxide (NO) and pro-inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, TNF-α) levels were measured in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW cells. In vivo, We injected MIA 50 μl (60 mg/ml) into knee joints of rats to induce osteoarthritis. Rats were divided into total 3 groups (normal, control, BST treated group, each n=7). Normal group was not treated at all without inducing osteoarthritis and taken normal diet. Control group was induced osteoarthritis by MIA and taken with 2 ml of distilled water once a day for 4 weeks. BST treated group was induced osteoarthritis by MIA and taken BST 2 ml (200 mg/kg/mouse) once a day for 4 weeks. We evaluated dynamic weight bearing with the Incapacitance Test Meter. At the end of experiment, the rats were sacrificed to observe the functions of liver and kidney, changes of WBC, neutrophil, lymphocyte, monocyte levels in blood, to evaluate the levels of pro-inflammatory cytokines, tissue inhibitor of metallopreteinases-1 (TIMP-1), matrix metalloproteinase-9 (MMP-9), prostaglandin E 2 (PGE 2), leukotriene B 4 (LTB 4) within serum. We observed change of articular structures by Hematoxylin & Eosin (H&E), safranin-o staining method and measured amount of cartilage by micro CT-arthrography. Statistical analysis was done by unpaired student s t-test with significance level at p<0.05 in SPSS 11.0 for windows. Results 1. Safety of the BST was identified. 2. AST, ALT, BUN, creatinine levels of BST treated group were within normal limit. In vitro, 1. DPPH and ABTS free radical scavenging activities of BST showed dose-dependent increase. 2. ROS production were significantly decreased. 3. Total nitric oxide (NO) and IL-1β production were decreased. 4. IL-6 and TNF-α production were significantly decreased. In vivo, 1. Weight bearing ability was significantly increased. 2. WBC, neutrophil, lymphocyte, monocyte levels in blood were decreased. 3. IL-1β and TNF-α levels in serum were significantly decreased. and the IL-6 level was decreased. 4. TIMP-1, MMP-9, LTB 4, PGE 2 levels in serum were significantly decreased. 5. Cartilage volume of BST treated group was significantly increased. Also changes of cartilage, synovial membrane, fibrous tissue were suppressed. 15

2 우창훈 오민석 Conclusions The results obtained in this study Bujasasim-tang have effects of antioxidative, anti-inflammatory, relieve pain and protection of cartilage. Therefore we expect that Bujasasim-tang is effective treatment for osteoarthritis. (J Korean Med Rehab 2015;25(2):15-35) Key words Bujasasim-tang, Osteoarthritis, Oxidative stress, Anti-inflammation, Monosodium iodoacetate (MIA) 서론»»» 골관절염은성인에서가장흔한관절질환으로퇴행성관절염또는퇴행성관절질환이라고도불리며 1), 국소적인관절에점진적인관절연골의소실및그와관련된 2차적인변화와증상을동반하는질환이다 2). 질환이진행되면연골하골 (subchondral bone) 의경화및낭종형성, 관절주변및관절내에과잉골형성, 관절의변형등이발생할수있다 2). 예전에는골관절염발생의가장중요한원인으로노령화에따른단순한퇴행성변화라고생각했지만최근에는여러연구에의해수많은요인들이관여하여발생하는것으로인식되고있다 3). 골관절염의치료목적은변형의예방과교정, 기능의보존및회복, 통증의완화에있으며, 치료방법은크게비수술적치료요법과수술적치료요법으로구분된다. 비수술적방법은일차적으로안정및약물치료, 물리치료, 보조기사용등이있으며, 비수술적치료방법을시행했으나증상의호전이없으며, 일상생활에지장이극심한경우에는수술적처치를시행한다 2). 한의학적으로골관절염은痺症에속하는데, 관절의痺症은風寒濕熱의邪氣가인체의營衛失調, 腠理空疎혹은正氣虛弱한틈을타고經絡으로침입하거나관절에응체됨으로써血氣運行을저해함으로써나타난다 1). 그증상으로는肌肉, 筋骨, 關節에麻木, 重着, 酸楚, 疼痛, 腫脹, 屈伸不利가생기며심하면관절의강직성변형을초래한다 1). 痺症의약물치료는緩急先後를구분하여隨證治之하는데 4), 寒者는溫之하고熱者는淸之하며濕痰瘀등의有形之邪가있으면去之하고虛者는補之한다 1). 實熱은淸泄하고濕熱은淸熱利水하고虛熱은滋陰淸熱시킨다 1). 최근골관절염에대한연구가활기를띠고있는데, 저출력레이저요법을이용한연구 5), 한약을이용한연구 6-15), 약침을이용한연구 16-24), 뜸을이용한연구 25), 전침을이 용한연구 26) 등에서염증억제작용, 진통작용, 연골보호작용등이보고되었다. 傷寒論 27) 에나오는附子瀉心湯은熱이胃에있어서心下痞가있고陽虛하여惡寒汗出할때陽虛를扶助하고痞熱을泄解하는처방으로 28), 淸熱瀉火, 活血逐瘀하는효능을가진大黃, 淸熱燥濕하는黃連, 黃芩, 溫裏, 扶陽, 祛寒하는附子로구성되어있다 29). 附子瀉心湯은淸熱燥濕, 溫裏祛寒, 扶陽하는효능이있어風寒濕熱이관절에응체되어발생한痺症에유효할것으로생각된다. 특히, 附子의연골보호에대한효능이여러연구 9-11,14,15) 에서보고되었기때문에附子瀉心湯역시골관절염치료에활용될수있을것으로생각되었다. 이에저자는附子瀉心湯의항산화능과항염증효능을검증하고, Monosodium iodoacetate (MIA) 로유발된골관절염 rat 모델을이용하여염증 cytokine 및염증매개인자에미치는영향에대해분석했다. 또한연골량을측정하고, 관절조직을관찰하여유의한결과를얻었기에보고하는바이다. 재료및방법»»» 1. 재료 1) 세포세포는한국세포주은행 ( 서울, 한국 ) 에서구입한 RAW 264.7을사용했다. 2) 약재약재는 ( 주 ) 옴니허브 ( 대구, 한국 ) 에서구입하였고, 대전대학교지역혁신센터난치성면역질환의동서생명의학연구센터 (TBRC) 에서정선후사용하였다. 附子瀉心湯 16 J Korean Med Rehab 2015;25(2):15-35

3 1첩당용량과구성은 古方撰次 30) 를기준으로하였다 (Table I). 3) 동물 동물은수컷 6주령의 SD-Rat (170~200 g) 을사용하였는데, ( 주 ) 라온바이오 ( 용인, 한국 ) 에서골관절염유발물질인 MIA를오른쪽무릎관절강내에 50 μl (60 mg/ml) 씩투여하고 7일이지난후관절염이유발된쥐만을공급받아실험하였다. 동물은실험당일까지일반고형사료 ( 퓨리나, 서울, 한국 ) 를충분히공급하고온도 22±2 o C, 습도 55±15%, 12시간명암주기 (light-dark cycle) 의환경에서 1주간적응시킨후실험에사용하였다. 본실험은대전대동물실험윤리위원회의승인 ( 동물사용윤리위원회승인번호-DJUARB ) 을받아동물윤리준칙에의거하여실시하였다. 일반사료의 kg당조성내용과분량은다음과같다 (Table II). 4) 시약 본실험에사용된시약 lipopolysaccharide (LPS), dimethyl sulfoxide (DMSO), 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) 은 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) 에서, Dulbecco s Modified Eagle s Medium (DMEM) 배양액, Fetal Bovine Serum (FBS), Penicillin 및 Streptomycin 은 Hyclone Co. (Logan, Ut, USA), Cell viability assay kit는 Daeillab service Co. ( 서울, 한국 ), Nitric Oxide detection kit는 Intron Biotechnology Co. ( 수원, 한국 ) 에서구입하였다. 중금속분석을위한 HNO 3 은 Duksan Co. ( 안산, 한국 ) 에서, As, Pb, Hg, Cd standard solution 은 SCP Science Co. (Quebec, Canada) 에서구입하였고, HPLC 분석을위한 water와 acetonitrile 은 Ducksan Co. ( 안산, 한국 ) 의 HPLC 용매를사용하였으며, Folin-Ciocalteu s phenol reagent 는 Merck Co. (Darmstadt, Germany) 에서, gallic acid와 Table I. The Prescription of Bujasasim-tang Herbal medicine name Pharmacognostic name Weight (g) 大黃 Rhei Rhizoma 6 黃連 Coptidis Rhizoma 3 黃芩 Scutellariae Radix 3 附子 Aconiti Lateralis Radix Preparata 3 Total amount 15 sodium carbonate는 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) 에서구입하였다. Cytokine Milliplex Map Immunoassay kit는 Millipore Co. (Bellerica, MA, USA) 에서, Rat Total MMP-9 (matrix metalloproteinase-9), LTB 4 (leukotriene B 4 ), PGE 2 (Prostaglandin E 2 ) ELISA kit, Rat TIMP-1 (tissue inhibitor of metalloproteinases-1) kit, Rat IL-6 (interleukin-6) kit, Rat TNF-α (tumor necrosis factor-α) kit, Rat IL-1β (interleukin-1β) kit는 R&D System Co. (Minneapolis, USA), 주정추출에이용된주정은 ( 주 ) 주정판매월드 ( 전주, 한국 ) 에서구입하였다. 골관절염유발주사제로는 Monosodium iodoacetate (MIA) (Sigma, USA), 마취제로는 Zoletil (Virbae S.A., France) 과 Rompun ( 바이엘코리아, 서울, 한국 ) 을사용하였다. Hematoxylin and Eosin 염색과 Safranin-O 염색에는 Hematoxylin (Merck Co., Germany), Eosin Y (Wako Co., Japan), Safranin-O (Merck Co., Germany) 를, Micro CT arthrography 의조영제는 Hexabrics 320 (Guerbet Co., France) 을사용하였다. 5) 기기 본실험에사용된기기는 Rotary vacuum evaporator (EYELA, Japan), Freeze dryer ( 일신바이오베이스, 한국 ), ELISA reader (Molecular Devices, USA), Luminex (Millipore Co., USA), ICP (Shimadzu Co., Japan), 수은분석기 (TELEDYNE Leeman Labs, USA), HPLC (Shimadzu LC-20AD, Japan), HPLC column (ZORBAX Eclipse Plus C18, mm, 5 μm), Flow cytometry system (BD Biosciences immunocytometry systems, USA), Insulin syringe (0.25 mm 8 mm, BD Medical-Diabetes Care, USA), Incapacitance Test Meter (IITC Life Science, california, USA), 자동혈구측정기 (MS9-5, MELET SCHLOESING, France), Minos-ST (BECKMAN COULTER LH780, BECK- Table II. The Components of Normal Diet Components Percentage (%) Crude protein 20.0 Crude fat 4.5 Crude fiber 6.0 Crude calcium oxide 7.0 Calcium 0.5 Phosphorus 1.0 Total amount

4 우창훈 오민석 MAN COULTER, USA), Light Microscope (Carl ZEISS, Germany), micro CT arthrography (Skyscan 1076, Brucker, Germany) 를이용하였다. 2. 방법 1) 시료추출附子瀉心湯 6첩을 80% 주정 1 l에넣고 3시간동안환류추출하였다. 그여액을 rotary vacuum evaporator 를이용하여 50 ml로감압, 농축하여동결건조하였다. 완전건조된附子瀉心湯주정추출물 (BST, 10.8 g) 을냉동보관하여시료로사용하였다. 2) 중금속검사납, 비소, 카드뮴분석의경우 BST 0.5 g을극초단파시료전처리장치전용용기에넣고질산 10 ml를넣은후, 용기를후드안에정치시켜발생가스를제거하고극초단파시료전처리장치를사용하여분해하였다. 분해가끝난다음분해액을여과지로여과하여용량플라스크에넣고물을넣어적절하게표준액의농도범위로희석하여검액으로하였다. 따로질산 10 ml를극초단파시료전처리장치전용용기에넣어검액조제와같은방법으로조작하여공시험액으로사용하였다. 준비된검액, 표준액및공시험액을가지고유도결합플라즈마분광계 (ICP) 를이용하여검량선을작성하고공시험액으로보정하여검액을측정하였다. 수은분석의경우 BST 50 mg을정확하게달아특별한전처리과정없이수은분석기를이용하여측정하였다. 3) HPLC 분석 BST 30 mg을 80% 주정 1 ml에녹여 0.45 μm membrane filter로여과후이중 20 μl를 HPLC 시료로사용하였다. HPLC 는 Shimadzu Co. 의 system controller (CBM- 20A), pump (LC-20AD), column oven (CTO-20A), diode array detector (SPD-M20A), column을사용하였다. 이동상은 water (A) 와 acetonitrile (B) 로 gradient elution system을적용시켜 0~5분 (0% B), 5~40분 (30% B), 40~60분 (80% B), 60~80 분 (100% B) 으로설정하였다. 유속은 1.0 ml/min 이었으며 column 온도는 40 o C를유지하였고, UV wavelength 는 210 nm로설정하여분석하였다. 4) 총폴리페놀함량 총폴리페놀함량은 Folin-Ciocalteu 시약을이용하는방법으로측정하였다. 추출시료용액 1 ml에 50% Foiln- Ciocalteu s phenol reagent 0.5 ml를가하여실온에서 3 분간반응시켰다. 반응용액에 Na 2 CO 3 포화용액 1 ml와 7.5 ml 증류수를차례로혼합하여 30분간정치시킨뒤, 12,000 rpm에서 10분간원심분리한후상등액을취해 760 nm에서흡광도를측정하였다. 총폴리페놀함량은 gallic acid를표준물질로이용하여작성한검량선에따라함량을구하였으며측정단위로는 GAE (Gallic acid equivalent)/g을사용하였다. 3. In vitro 및 In vivo 1) In vitro (1) 세포독성검사 RAW 세포는 96 well plates 에 10 4 cells/well로분주하여 24시간동안배양하였다. 실험을하기전에새로운배양액으로교체하였고, BST 및개별약재추출물을각각 1, 10, 100 μg/ml 의농도로처리하여다시 24시간동안배양하였다. 배양후 10 μl의 WST solution을첨가하여배양기 (37 o C, 5% CO 2 ) 에서 30분간반응시켰다. 반응후 450 nm에서흡광도의변화를측정하여대조군에대한세포생존율을백분율로표시하였다. (2) 항산화능측정 1 DPPH 소거율자유라디칼소거활성시험은안정한자유라디칼 DPPH를사용하는방법으로주정에용해시킨 0.2 mm의 DPPH 용액 150 μl와 BST 및 4가지개별약재의주정추출물 1, 10, 100, 1,000 μg/ml 100 μl를각각혼합하고, 37 o C에서 30분간반응시킨후, 517 nm에서흡광도를측정하였다. 대조군은시료액대신물을넣었으며, DPPH 용액대신주정을넣어보정값을얻었다. 자유라디칼소거율은아래의식에따라계산하였다. 소거율 (%)= 대조군의흡광도 - 시료첨가군의흡광도 ( ) 100 대조군의흡광도 18 J Korean Med Rehab 2015;25(2):15-35

5 2 ABTS 소거율 ABTS assay 방법은기존에보고된방법을 96 well plates 에맞게수정하여실시하였다. BST는최종농도가 1, 10, 100, 1,000 μg/ml 의농도로될수있게희석시켰으며, ABTS 용액은 7.4 mm ABTS (2,2 -azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 와 2.6 mm potassium persulphate 를제조한후, 암소에하루동안방치하여양이온 (ABTS+) 을형성시킨다음 734 nm에서흡광도를측정하여흡광도값이 1.5 이하가나오도록희석하고, 희석된 ABTS+ 용액 150 μl와 BST를각각 5 μl 혼합하고, 실온에서 10분간반응시킨후, 734 nm에서흡광도를측정하였다. 항산화능은증류수를대조군으로하여대조군에대한 ABTS 라디칼소거율을백분율로나타내었다. 소거율 (%)= 대조군의흡광도-시료첨가군의흡광도 ( ) 100 대조군의흡광도 3 ROS 생성 RAW 세포내에서 reactive oxygen species (ROS) 를측정하기위하여 2,7 -dichlorofluorescin diacetate (DCF- DA) 를이용하였다. 12 well plates 에 RAW 세포를 cells/well 이되게분주하였다. 24시간동안배양한후, BST를 1, 10, 100 μg/ml 의농도로처리하고, LPS 1 μg/ml 를처리하여, 다시 24시간동안 37 o C, 5% CO 2 배양기에서배양하였다. 배양후, 1,200 rpm에서 5 분간원심분리하여모은세포를차가운 PBS로 2회세척한후, DCF-DA 10 μm이되도록첨가하여 15분동안빛이차단된상온에서염색하였다. 염색후차가운 PBS를넣어 1,200 rpm에서 5분간원심분리한다음상등액을제거하고다시 PBS 400 μl를부유시켜유세포분석기를이용하여형광강도의세기에따른변화를분석하였다. (3) 항염증효능측정 1 Total nitric oxide (NO) 생성 NO의농도는배양액내의 nitrite 농도를 Griess Reagent System 을이용하여측정하였다. RAW 세포를 96 well plates에 10 4 cells/well 로분주하여 24시간동안배양한후, BST를 1, 10, 100 μg/ml 의농도로처리하고, LPS 1 μg/ml 을처리하여, 다시 24시간동안배양하였다. N1 buffer 50 μl를각 well 에처리한후, 10분간상온에서 암소반응후, N2 buffer 50 μl를각 well에처리하고, 10분간반응시킨후, 540 nm에서흡광도를측정하였다. Nitrite standard 의농도별표준곡선을이용하여배양액의 NO 농도를결정하였다. 2 염증 cytokine 생성 RAW 세포를 12 well plates 에 cells/ml 가되도록분주하고, 24시간동안배양한후, BST를 1, 10, 100 μg/ml의농도로처리하고, LPS 1 μg/ml를처리하였다. 24시간동안배양한후세포배양액을수거하여배양액에함유된 IL-1β, IL-6, TNF-α를 custom-made 4-plex cytokine Milliplex panel을이용하여측정하였다. 2) In vivo (1) 관절염유발및실험군분류마취제 ( 졸레틸 0.5 ml+ 럼푼 0.1 ml) 로 rat를마취하고오른쪽무릎관절주변을깨끗이제모한후, 골관절염유발물질인 MIA를인슐린 1 ml 주사기로무릎관절강내에 50 μl (60 mg/ml) 씩투여하였다. MIA 희석시에는 0.9% saline 을사용하였다. 관절염의유발을확인하기위해 MIA 투여 7일후, 환측관절부위의부종과압통을기준으로선별하였다. 실험군은관절염을유발하지않은정상군과관절염을유발하고증류수를투여한대조군, 관절염을유발하고 BST를투여한실험군등총 3그룹으로각각 7마리씩분류하였다. 부종의크기는캘리퍼스를이용하여환측무릎관절의외측과내측측부인대사이의직경을 mm 단위로측정하였다. 압통의정도는 3명의실험자가각각의실험동물의다리를저는모습과관절낭에압력을가했을때통증을 Table III. Edema and Tenderness of the Right Knee on Arthritis Rats Group Knee joint diameter (mm) Tenderness* Nor before 8.38± ±0.0 (n=7) after 8.60± ±0.0 Con before 8.51± ±0.0 (n=7) after 10.40± ±0.64 BST before 8.53± ±0.0 (n=7) after 10.68± ±0.53 rats. Nor: Normal SD-rat group. Con: MIA-induced osteoarthritis group. *Pain score (0-6 point). 19

6 우창훈 오민석 피하기위한모습을육안으로관찰하였고, 각각 0~3까지등급으로배점하여합산후그평균값을아래와같이나타내었다 (Table III). ( 다리저는모습등급 0~3)+( 압통에반항하는정도 0~3)= 총계 0~6 (2) 약물투여 SD-rat 의오른쪽무릎관절강내에 MIA를주사하여관절염을유발하였다. 관절염이유발된쥐만을선택하여각각 7마리씩대조군과실험군으로분류하고, 1주일이경과된이후부터실험군에는매일오전 10시에한번씩 BST 2 ml (200 mg/kg) 를 4주동안경구투여하였다. 대조군에는같은방법으로생리식염수를경구투여하였다. (3) 체중부하검사뒷다리체중부하는 Incapacitance Test Meter를이용하여, 플라스틱방에비스듬히세운후각뒷다리에가해진세기를 10초에걸쳐평균산출하였다. 처치된환측의뒷다리에분포된체중의백분율은다음과같은방정식을이용하여계산하였다. Weight bearing (%)=( 유발된하지의무게 ) 100 정상하지의무게 (4) 혈액학적분석최종실험종료후혈청내에서 AST (aspartate aminotransferase), ALT (alanine aminotransferase), creatinine, BUN (blood urea nitrogen) 활성도를측정하기위해 EDTA 처리된튜브형주사기로심장천자법을이용하여혈액 10 ml를채취하였다. 혈액을 30분간상온에서굳힌뒤 3,000 rpm에서 15분간원심분리한후전혈과혈청을서울의과학연구소 ( 서울, 한국 ) 에분석의뢰하여총백혈구, 백혈구중호중구, 단핵구, 림프구의분포도와 AST, ALT, creatinine, BUN을측정하였다. 혈구세포수는자동혈구측정기로 Fonio법에준하여 Minos-ST 로측정했으며, AST, ALT 활성도는 JSCC UV method의원리, creatinine 의함량은 Creatinine Jaffe Method 의원리, BUN의함량은 Kinetic UV assay의원리를이용하여생화학자동분석기로측정하였다. (5) 염증 cytokine 및염증매개인자측정혈청내에서염증사이토카인을측정하기위하여 luminex를 사용하였다. 혈액을채취하여 30분간상온에서굳힌뒤 3,000 rpm에서 15분간원심분리한후혈청을분리하여 IL-1β, IL-6, TNF-α, TIMP-1을측정하였고, ELISA 를사용하여 MMP-9, LTB 4, PGE 2 를측정하였다. (6) 연골량측정연골량측정은연세대학교원주캠퍼스의공학부전산의용생체공학연구실 ( 원주, 한국 ) 에의뢰하여실시하였으며, 조형제인헥사브릭스 (HEXABRICS 320) 를꼬리정맥에주사한후 micro CT-arthrograpy 를사용하여무릎관절의연골량 (cartilage volume) 을측정및분석하였다. (7) 조직병리학적검사 Micro-CT 촬영이끝난후무릎부위를절단하여 10% EDTA가포함된 10% 포르말린용액에넣어관절조직을탈칼슘화 (decalcification) 시켰다. 방사선촬영기법 (radiographic technique) 을이용하여탈칼슘화유무를확인한후파라핀왁스에관절조직을넣고고정한다음관상절단 (coronal section) 을실시하였다. 탈칼슘화과정을거쳐파라핀으로고정된조직을 7 μm의크기로자른뒤, Hematoxylin and Eosin (H&E) 및 Safranin-O 염색을실시하여조직의상태를관찰하였다. 염증반응발생유무나활막세포의증식, 염증세포의조직침윤여부는 H&E 염색결과에서확인할수있으며, proteoglycan 층을염색하는 Safranin-O 염색결과에서는연골조직의손상여부를확인하였다. 4. 통계처리본실험에서얻은결과는세번이상의반복된실험결과를평균 ± 표준편차로나타내었고, SPSS 11.0의 unpaired student s t-test를사용하여통계처리하였다. p- values 가 0.05 이하인경우통계적으로유의성이있는것으로보았다. 결과»»» 1. 중금속함량중금속함량을측정한결과, 납과카드뮴의경우기준치이하로검출되었고비소와수은은검출되지않았다 20 J Korean Med Rehab 2015;25(2):15-35

7 (Table IV). 2. HPLC 분석 HPLC 를이용하여 pattern 분석한결과, 210 nm에서 retention time이 24.06분과 26.17분대에 peak를나타내었다 (Fig. 1). 3. 총폴리페놀함량 Gallic acid 를표준물질로하여총폴리페놀함량을측정한결과 ±1.29 mg/g 으로나타났다 (Table V). 4. In vitro 1) 세포독성에미치는영향 RAW 세포주에서세포생존율은대조군을 100.0± 1.0% 로나타냈을때, BST 투여군은 1 μg/ml 농도에서 106.0±5.9%, 10 μg/ml 농도에서 99.2±7.0%, 100 μg/ml 농도에서 102.8±5.6% 로나타났다 (Fig. 2). 2) 항산화능에미치는영향 (1) DPPH 소거율 DPPH 소거율은 1 μg/ml 농도에서 9.2±1.8%, 10 μg/ Table IV. Content of Pb, As, Cd and Hg of BST Pb As Cd Hg Permissive density (mg/kg) BST N.D.* N.D. *N.D.: Not detected. Table V. Total Phenolic Contents of BST Sample Total phenolics (mg GAE*/g ext.) BST ±1.29 *Total phenolic contents were expressed as milligram of gallic acid equivalent (GAE) per gram of extract. Fig. 2. Effects of BST on the cell viability of RAW cells. Cells were treated with 1, 10, 100 μg/ml of BST for 24 hours. Cell viability was determined using the WST assay. The results were expressed as mean±s.d. from three independent experiments. Fig. 1. HPLC chromatogram of BST. Column: ZORBAX Eclipse Plus C18 ( mm, 5 μm), sample injection volume: 20 μl, mobile phase: H 2O (A)/ACN (B) gradient elution: 0~5 mins (0% B), 5~40 mins (30% B), 40~60 mins (80% B), 60~80 mins (100% B), flow rate: 1.0 ml/min, detector: PDA detector. 21

8 우창훈 오민석 ml 농도에서 15.2±5.4%, 100 μg/ml 농도에서 84.1± 1.0%, 1,000 μg/ml 농도에서 92.4±4.7% 로나타나농도의존적으로증가되었으나유의성은없었다 (Fig. 3). (2) ABTS 소거율 ABTS 소거율은 1 μg/ml 농도에서 0.0±0.9%, 10 μg/ ml 농도에서 3.6±0.5%, 100 μg/ml 농도에서 46.1± 1.3%, 1,000 μg/ml 농도에서 92.8±1.8% 로나타나, 농도의존적으로증가되었으나유의성은없었다 (Fig. 4). (3) ROS 생성 BST의 ROS 생성저해활성은대조군을 100.0±1.0% Fig. 3. DPPH free radical scavenging activity of BST at various concentration. Extracts were incubated with DPPH solution at 37 o C for 30 mins. Activities were determined by measurement of absorbance at 517 nm. The results were expressed as mean±s.d. from three independent experiments. 로나타냈을때, 정상군은 20.11±5.6%, BST 투여군은 1 μg/ml 농도에서 96.61±6.3%, 10 μg/ml 농도에서 75.60± 8.0%, 100 μg/ml 농도에서 65.67±8.3% 로나타나, 대조군에비해 100 μg/ml 에서 34.3±8.3% 로유의성있게 (*p< 0.05) 감소되었다 (Fig. 5). 3) 항염증효능에미치는영향 (1) NO 생성 NO 생성량은대조군을 100±3.7% 로나타냈을때, 정상군은 38.0±3.3%, BST 투여군은 1 μg/ml 농도에서 100.5±4.1%, 10 μg/ml 농도에서 100.6±2.2%, 100 μg/ ml 농도에서 72.2±9.7% 로나타나, 대조군에비해 100 μg/ml 농도에서 27.8±9.7% 감소되었으나유의성은없었다 (Fig. 6). (2) 염증 cytokine 생성 1 IL-1β BST의 IL-1β 생성량을측정한결과, 대조군이 21.6± 2.3 pg/ml, 정상군이 1.2±0.2 pg/ml, BST 투여군은 1 μg/ml 농도에서 19.5±4.2 pg/ml, 10 μg/ml 농도에서 13.8±4.1 pg/ml, 100 μg/ml 농도에서 12.0±3.2 pg/ml 로나타나, 대조군에비해모든농도에서각각 9.7±19.6%, 36.1±18.8%, 44.4±15.0% 감소되었으나유의성은없었다 (Fig. 7). Fig. 4. ABTS free radical scavenging activity of BST at various concentration. Extracts were incubated with ABTS solution at RT for 10 mins. Activities were determined by measurement of absorbance at 517 nm. The results were expressed as mean±s.d. from three independent experiments. Fig. 5. Effects of BST on the ROS production in RAW cells. The RAW cells were stimulated with LPS 1 μg/ml and treated with BST 1, 10, 100 μg/ml for 24 hours. The ROS production was analysed following incubation with DCFH-DA by flow cytometry. The results were expressed as mean±s.d. from three independent experiments. Significant value was calculated by compared with control group by unpaired student s t-test (*p<0.05). 22 J Korean Med Rehab 2015;25(2):15-35

9 Fig. 6. Effects of BST on NO production in LPS-stimulated RAW cells. Cells were treated with LPS 1 μg/ml and 1, 10, 100 μg/ml of BST for 24 hours. The results were expressed as mean±s.d. from three independent experiments. Fig. 8. Effects of BST on LPS-stimulated IL-6 production in RAW cells. Cells were treated with LPS 1 μg/ml and 1, 10, 100 μg/ml of BST for 24 hours. The results were expressed as mean±s.d. from three independent experiments. Significant value was calculated by compared with control group by unpaired student s t-test (*p<0.05). Fig. 7. Effects of BST on LPS-stimulated IL-1β production in RAW cells. Cells were treated with LPS 1 μg/ml and 1, 10, 100 μg/ml of BST for 24 hours. The results were expressed as mean±s.d. from three independent experiments. 2 IL-6 BST의 IL-6 생성량을측정한결과, 대조군이 ± pg/ml, 정상군이 13.8±5.0 pg/ml, BST 투여군은 1 μg/ml 농도에서 ±485.1 pg/ml, 10 μg/ml 농도에서 ±971.2 pg/ml, 100 μg/ml 농도에서 ±789.8 pg/ml 로나타나, 대조군에비해 10 μg/ ml 농도에서 31.2±13.9%, 100 μg/ml 농도에서 62.3± 11.3% 로유의성있게 (*p<0.05) 감소되었다 (Fig. 8). 3 TNF-α BST의 TNF-α 생성량은대조군을 ±143.7 pg/ Fig. 9. Effects of BST on LPS-stimulated TNF-α production in RAW cells. Cells were treated with LPS 1 μg/ml and 1, 10, 100 μg/ml of BST for 24 hours. The results were expressed as mean±s.d. from three independent experiments. Significant value was calculated by compared with control group by unpaired student s t-test (**p<0.01). ml로나타냈을때, 정상군은 638.7±65.9 pg/ml, BST 투여군은 1 μg/ml 농도에서 ±210.6 pg/ml, 10 μg/ ml 농도에서 ±256.3 pg/ml, 100 μg/ml 농도에서 ±161.8 pg/ml 로나타나, 대조군에비해 100 μg/ ml 농도에서 35.0±6.8% 로유의성있게 (**p<0.01) 감소되었다 (Fig. 9). 23

10 우창훈 오민석 5. In vivo 1) 체중부하에미치는영향체중부하정도를측정한결과, 대조군의측정값을 100±14.7% 로나타냈을때, 정상군에서 202.6±5.5%, BST 투여군은 135.0±6.2% 로나타나, 대조군에비해 BST 투여군에서유의성있게 (*p<0.05) 증가되었다 (Fig. 10). 2) 간기능에미치는영향 ALT의경우대조군 (36.1±2.8 U/L) 이정상군 (23.3± 0.9 U/L) 에비하여높았으며, BST 투여군 (32.0±4.1 U/L) 은대조군에비해 11.4±11.5% 감소되었으나유의성은없었다 (Fig. 11). AST의경우대조군 (139.7±9.5 U/L) 이정상군 (92.7± 2.3 U/L) 에비하여높았으며, BST 투여군 (110.1±11.2 U/L) 은대조군에비해 21.2±8.0% 감소되었으나유의성은없었다 (Fig. 11). 3.8% 감소되었으나유의성은없었다 (Fig. 12). (2) BUN 혈청중의 BUN 농도를측정한결과, 정상군은 16.76±1.59 mg/dl, 대조군은 17.87±0.80 mg/dl, BST 투여군은 17.51±1.77 mg/dl로나타나, 대조군에비해 2.0±9.9% 감소되었으나유의성은없었다 (Fig. 13). 4) 혈액내면역세포에미치는영향 (1) 총백혈구생성량백혈구생성량은대조군의생성량을 11.93±1.29 Thous/ μl로나타냈을때, 정상군이 10.87±0.82 Thous/μl, 3) 신장기능에미치는영향 (1) Creatinine 혈청중의 creatinine 농도를측정한결과정상군은 0.54±0.02 mg/dl, 대조군은 0.59±0.04 mg/dl, BST 투여군은 0.57±0.02 mg/dl 로나타나, 대조군에비해 3.4± Fig. 11. Effects of BST on the ALT and AST in MIA-induced osteoarthritis rat. rats. Fig. 10. Effect of BST on weight change in the hind paw of MIA-induced osteoarthritis rat. rats. Statistically significant value compared with control group by unpaired student s t-test (*p<0.05). Fig. 12. Effect of BST on the creatinine in MIA-induced osteoarthritis rat. rats. 24 J Korean Med Rehab 2015;25(2):15-35

11 Fig. 13. Effect of BST on the BUN in MIA-induced osteoarthritis rat. rats. Fig. 15. Effect of BST on level of neutrophil in the blood of MIA-induced osteoarthritis rat. rats. Fig. 14. Effect of BST on level of WBC in the blood of MIAinduced osteoarthritis rat. rats. Fig. 16. Effect of BST on level of Lymphocyte in the blood of MIA-induced osteoarthritis rat. rats. BST 투여군이 11.23±1.04 Thous/μl 로나타나, 대조군에비해 BST 투여군에서 5.9±8.7% 감소되었으나유의성은없었다 (Fig. 14). (2) 호중구생성량백혈구에대한호중구의비율은대조군을 7.30±0.38% 로나타냈을때, 정상군이 2.00±0.24%, BST 투여군이 5.90±0.71% 로나타나, 대조군에비해 BST 투여군에서 19.2±9.8% 감소되었으나유의성은없었다 (Fig. 15). (3) 림프구생성량백혈구에대한림프구의비율은대조군을 80.57± 3.15% 로나타냈을때, 정상군이 64.60±3.12%, BST 투여 군이 73.13±2.33% 로나타나, 대조군에비해 BST 투여군에서 9.2±2.9% 감소되었으나유의성은없었다 (Fig. 16). (4) 단핵구생성량백혈구에대한단핵구의비율은대조군을 5.61±0.38% 로나타냈을때, 정상군이 2.09±0.23%, BST 투여군이 4.36±0.30% 로나타나, 대조군에비해 BST 투여군에서 22.3±10.4% 감소되었으나유의성은없었다 (Fig. 17). 25

12 우창훈 오민석 Fig. 17. Effect of BST on level of Monocyte in the blood of MIA-induced osteoarthritis rat. rats. Fig. 19. Effect of BST on level of IL-6 in the serum of MIA-induced osteoarthritis rat. rats. Fig. 18. Effect of BST on level of IL-1β in the serum of MIAinduced osteoarthritis rat. rats. Statistically significant value compared with control group by unpaired student s t-test (**p<0.01). Fig. 20. Effect of BST on level of TNF-α in the serum of MIA-induced osteoarthritis rat. rats. Statistically significant value compared with control group by unpaired student s t-test (**p<0.01). 5) 염증 cytokine 및염증매개인자에미치는영향 (1) IL-1β 혈액내의 IL-1β 생성량을측정한결과정상군은 2.6±0.5 pg/ml, 대조군은 ±16.9 pg/ml, BST 투여군은 97.8±13.8 pg/ml 로나타나, 대조군에비해 BST 투여군에서 29.2±10.0% 로유의성있게 (**p<0.01) 감소되었다 (Fig. 18). (2) IL-6 혈액내의 IL-6 생성량을측정한결과정상군은 144.3± 28.3 pg/ml, 대조군은 962.7±84.3 pg/ml, BST 투여군은 771.2±165.0 pg/ml 로나타나, 대조군에비해 BST 투여군에서 19.9±17.1% 감소되었으나유의성은없었다 (Fig. 19). (3) TNF-α TNF-α 생성량을측정한결과정상군은 12.8±5.3 pg/ml, 대조군은 67.0±9.9 pg/ml, BST 투여군은 52.2±8.9 pg/ml 로나타나, 대조군에비해 BST 투여군에서 22.1±13.3% 로유의성있게 (**p<0.01) 감소되었다 (Fig. 20). (4) TIMP-1 혈액내의 TIMP-1 생성량을측정한결과정상군은 26 J Korean Med Rehab 2015;25(2):15-35

13 7435.8±703.5 pg/ml, 대조군은 ± pg/ml, BST 투여군은 ± pg/ml 로나타나, 대조군에비해 BST 투여군에서 33.0±10.8% 로유의성있게 (**p< 0.01) 감소되었다 (Fig. 21). (5) MMP-9 혈액내의 MMP-9 생성량을측정한결과정상군은 0.84±0.06 pg/ml, 대조군은 7.88±0.90 pg/ml, BST 투여군은 5.41±1.00 pg/ml 로나타나, 대조군에비해 BST 투여군에서 31.4±12.6% 로유의성있게 (*p<0.05) 감소 되었다 (Fig. 22). (6) LTB 4 혈액내의 LTB 4 생성량을측정한결과정상군은 306.9±10.1 pg/ml, 대조군은 535.2±56.5 pg/ml, BST 투여군은 431.0±56.0 pg/ml 로나타나, 대조군에비해 BST 투여군에서 19.5±10.5% 로유의성있게 (*p<0.05) 감소되었다 (Fig. 23). (7) PGE 2 혈액내의 PGE 2 생성량을측정한결과정상군은 Fig. 21. Effect of BST on level of TIMP-1 in the serum of MIA-induced osteoarthritis rat. rats. Statistically significant value compared with control group by unpaired student s t-test (**p< 0.01). Fig. 23. Effect of BST on level of LTB 4 in the serum of MIAinduced osteoarthritis rat. rats. Statistically significant value compared with control group by unpaired student s t-test (*p<0.05). Fig. 22. Effect of BST on level of MMP-9 in the serum of MIAinduced osteoarthritis rat. rats. Statistically significant value compared with control group by unpaired student s t-test (*p<0.05). Fig. 24. Effect of BST on level of PGE 2 in the serum of MIAinduced osteoarthritis rat. rats. Statistically significant value compared with control group by unpaired student s t-test (**p<0.01). 27

14 우창훈 오민석 368.8±25.4 pg/ml, 대조군은 665.6±52.2 pg/ml, BST 투여군은 522.6±43.6 pg/ml 로나타나, 대조군에비해 BST 투여군에서 21.5±6.6% 로유의성있게 (**p<0.01) 감소되었다 (Fig. 24). 6) 연골량에미치는영향무릎관절의연골파괴정도를 micro CT- arthrography 를이용하여측정한결과정상군의연골량은 1.39±0.16 mm 3 로, 대조군의연골량은 0.28±0.05 mm 3 로, BST 투여군의연골량은 0.70±0.14 mm 3 로나타나, 대조군에비해 BST 투여군에서 153.2±48.8% 로유의성있게 (***p< 0.001) 증가되었다 (Fig. 25). 7) 조직병리학적변화에미치는영향 (1) Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색무릎관절내활막세포의변화및염증세포침윤여부를관찰하기위해 H&E 염색을실시한결과, 정상군의연골, 활막, 섬유조직은정상적이었다. 대조군은골관절염이유발되어정상군보다연골, 활막, 섬유조직의변형이현저하게나타났다. BST 투여군은대조군에비해연골, 활막, 섬유조직의변형이억제되는것으로나타났다 (Fig. 26). (2) Safranin-O 염색 Safranin-O 염색을실시한결과정상군의관절조직은 Fig. 25. Effect of BST on imaging of cartilage degeneration using micro CT-arthrography in joint tissue of MIA-induced osteoarthritis rat. rats. Statistically significant value compared with control group by unpaired student s t-test (***p<0.001). 28 J Korean Med Rehab 2015;25(2):15-35

15 Fig. 26. Effect of BST on joint pathology (Hematoxylin & Eosin staining) from joint tissue of MIA-induced osteoarthritis rat. Normal group shows the presence of slightly thickened synovium (arrow). Control group shows isolated areas with chronic inflammation (arrow). BST treated group shows signs of tissue integrity with a thick layer of cartilage compared with control group (arrow). Fig. 27. Effect of BST on joint pathology (Safranin-O staining) from joint tissue of MIA-induced osteoarthritis rat. Normal group shows stain intensity of red color in proportion to proteoglycan content (arrow). Control group shows red color disappeared in most of articular cartilage (arrow). Proteoglycan contents in articular cartilages of the BST treated group were increased compared with control group (arrow). 정상적이고, 활막주변에연골세포의분포가관찰되었다. 대조군은골관절염이유발되어관절조직이변형되고, 활막주변에연골세포의손실이많이일어났다. BST 투여군은대조군에비해관절조직의변형이억제되고, 연골세포의손실도억제되는것으로나타났다 (Fig. 27). 고찰»»» 골관절염은관절연골의손상및관절주변부위골의변화와연관되어동반되는여러관절증상을일으키는데 31), 관절연골과연골하골조직의항상성을변화시키는생체역학과물질대사요인이복합적으로작용하며동화작용보다이화작용이증가한다 32). 최근에골관절염의발생기전으로유력한가설은세단계의중복되는과정으로설명된다. 첫번째단계는여러기계적인자극이나염증으로인한효소반응, 대사의변화등으로시작되며, 분자수준에서기질고분자 (matrix macromolecule) 의격자 (frame work) 가파괴되며수분함량에변화가생겨추가손상에매우약한상태가된다. 두번째단계는연골세포가조직손상이나변화를감지하면서시작되는데동화작용및이화작용이모두증가된다. 이화작용및파괴에관여하는효소 (cytokine) 로 IL-1과 TNFα가중요하다. 기질고분자의생성을촉진하고연골세포의증식을자극하는동화작용에관여하는인자로는 IL-6, 성장인자, 인슐린, 인슐린양성장인자 (IGF-1), 염기성섬유모세포성장인자 (bfgf), β변형성장인자 (TGF-β) 등이있다. 세번째단계는치유와재형성과정이실패함으 29

16 우창훈 오민석 로써진행되며점진적인관절연골의소실및연골세포의동화작용및증식반응의감소가나타난다. 이러한안정과증식의감소는물리적손상뿐만아니라연골세포를보호하는기질에의해더이상보호받지못하는연골세포의사멸에의해발생하며관절염의진행을촉발시킨다 2). 한의학적으로痺症은風寒濕邪가함께인체에침입하여나타나는데, 그증상은때로아프고, 때로아프지않고, 때로감각이없으며, 때로차갑고, 때로열이있고, 때로건조하고, 때로축축하다 33). 痺症의병인병리와임상증상은서양의학의각종관절염과근골격계통증질환과유사한데, 특히골관절염과상당히일치하며, 痛症이가장중요한임상증상이다 1). 痺症의치료원칙은宣通이며氣血과營衛가順行하면痺痛은자연스럽게소실된다. 風寒濕痺는辛溫한약으로陽氣를고조시켜邪氣를축출하고, 風熱濕痺는散風淸熱祛濕시키며, 虛한사람의久痺는溫通溫散시키거나滋陰시킨다 1). 痺症의병인과증상의특성으로볼때 傷寒論 에나오는附子瀉心湯이痺症에효과가있을것으로생각되었다. 附子瀉心湯은 心下痞而復惡寒汗出者附子瀉心湯主之 라하여表症을誤下함으로써熱邪가胃內에들어가痞가되고, 體內의眞陽이허약하므로衛氣가충실하지못하여汗孔이不閉해땀이나고, 外氣를不勝해惡寒하는증상을다스린다고하였다 27). 附子瀉心湯은大黃, 黃連, 黃芩, 附子등으로구성되어있는데 27), 이중大黃은瀉下藥으로性味가苦寒沈降하고力猛善行하여下焦에直達하므로腸胃의積滯를蕩滌하고, 血分의實熱을淸熱瀉火하는효능을도와血로들어가降泄시키며, 活血逐瘀의효능이있어攻積, 瀉火, 逐瘀의要藥이다 29). 大黃물추출물이 MAO-B 활성및 radical 소거효과와밀접한관련성이있는파키슨씨병및알츠하이머씨병과같은퇴행성뇌질환에효과가있을것이라는연구 34), 大黃뿌리에있는항산화물질에대한연구 35), 大黃과大黃錠劑丸이지질의과산화작용과혈청내지질의개선을위한기능성식품의원료로활용이가능하다는연구가있었다 36). 大黃의 elastase 활성억제와 tyrosinase 억제연구에서 MMP-1 저해활성이관찰되었고大黃추출물은노화방지와미백에좋은효과를가진다는내용이보고되었다 37). 黃芩은淸熱燥濕藥으로寒性은淸熱하며苦味는燥濕하여淸熱燥濕하는常用藥物이다. 濕熱諸證에사용하는 데, 肺經의熱을瀉하는데우수하다. 黃連과配伍하면淸心解毒하는작용이증가한다 29). 黃芩의물추출액이항염효과와진통효과가있다는연구 38), 黃芩열수추출물이대식세포에대한유의한세포독성을유발하지않았으며, 항염증효과가유의하다는것도보고되었다 39). 또한黃芩추출물겔은쥐의 paw joint에염증을일으키는세포들을유의하게감소시켰으며 IgG 및 IgM의혈중항체를유의하게감소시켰다는연구 40) 와黃芩추출물이조골세포와파골세포에미치는영향을관찰한결과골다공증을포함한골질환예방에효과가있었다는연구 41) 도보고되었다. 黃連은淸熱燥濕藥으로性味가大苦大寒하여大寒은淸熱하고, 苦味는燥濕하여瀉火燥濕의효능을가지고있어心火를瀉하고腸胃의濕熱을淸하는特長이있어淸心, 除煩, 消痞, 止痢등濕火가鬱結된것을치료하는要藥이다 29). 黃連추출물은합성항산화제와거의같은항산화력을나타내었으며, 천연항산화제보다는아주우수한것으로보고되었고 42), 川黃連추출물은 LPS에의해유도된 NO 및 TNF-α의생성을유의적으로감소시켰고, inos 유전자발현을억제했다는연구 43) 가보고되었다. 또한黃連에는항염증에관여하는기능성물질들이있다는연구 44) 와 LPS 유도 RAW 세포내 TNF-α 생산을유의하게억제시켰다는보고도있다 45). 附子는溫裏藥으로辛熱燥烈하고走而不守하며純陽의성질을가지고있어위로는心陽을도와通脈하고, 가운데는脾陽을溫하게하여健運시키고, 아래로는腎陽을補하여益火하며밖으로는衛陽을固하여祛寒하므로溫裏, 扶陽, 祛寒의要藥이다 29). 附子藥鍼이류마티스관절염에서윤활세포증식과연골파괴를조절하는효과를가진다는연구 46) 와흰쥐에 Adjuvant 관절염을유발시키고, 附子藥鍼液을注入한後, 부종억제율, 혈장 serotonin 함량, 백혈구수, 적혈구수, 혈색소및적혈구침강속도등의변화를측정하여유의한결과를얻었다는보고 47) 도있다. 三氣飮加味方이파골세포분화와관련유전자발현을감소시킴으로써골흡수를감소시키고, 조골세포기능을증가시킴으로써골형성을증가시켰다는연구 48) 와黃連및附子추출물을생쥐에게 LPS 100 ng을주입하여유발된혈중 corticosterone 농도와직장온도변화를확인한결과黃連은염증스트레스감소에큰의미가없지만, 附子는소량의투여시유의성있는효과가있었다는보고 49) 도있다. 30 J Korean Med Rehab 2015;25(2):15-35

17 이와같이大黃, 黃芩, 黃連의항산화효과, 黃芩, 黃連, 附子의항염증과진통효과, 黃芩과附子의조골세포의기능증진등이실험을통해검증되었다. 附子瀉心湯의개별약재가항산화, 항염증, 진통효과, 골질환예방효과등이있으며, 약재간상호작용으로그효과는더욱증가될것이라생각되어附子瀉心湯의산화적손상, 염증및골관절염동물병태모델에미치는영향에대한실험을실시하게되었다. 본실험을위해 rat를대상으로정상군과 MIA로관절염을유발하고증류수를투여한대조군, 관절염을유발하고附子瀉心湯주정추출물 (BST) 을투여한실험군등총 3그룹으로분류하였다. 동물실험에앞서약물의안정성을확보하기위해중금속함량을측정한결과, 납과카드뮴의경우기준치이하로검출되었고비소와수은은검출되지않았으며 (Table Ⅳ), 세포독성검사에서세포생존율에는이상이없었다 (Fig. 2). BST의 DPPH와 ABTS free radical 에대한소거율이농도의존적으로증가했으며, ROS 생성저해활성에미치는영향이유의하게감소되었다 (Table V, Fig. 3-5). 동물실험을끝낸후실시한간기능검사에서 ALT 의경우 BST 투여군은대조군에비해서는감소했으나유의한차이가없었고, AST의경우도 BST 투여군은대조군에비해서는감소하였으나유의한차이가없었다 (Fig. 11). 신장기능검사에서혈청 creatinine 농도를측정한결과 BST 투여군은대조군과유의한차이가없었고 (Fig. 12), 혈청 BUN 농도를측정한결과, BST 투여군은대조군과유의한차이가없었다 (Fig. 13). ALT와 AST는간기능을평가하는지표가되고, creatinine 과 BUN은신장기능을평가하는지표가되는검사항목으로 50), BST 및 BST 투여군에대한평가결과를볼때약물의안정성에이상이없다고할수있었다. MIA 유발골관절염동물모델은 Kalbhen 과 Blum이처음으로연구한것으로성인의관절연골에서동화작용과이화작용이평형을이룬다는사실에근거하여실험적으로동화작용을감소시키면관절연골에서퇴행성변화가생길것이라는가설에서연구되었다 51). 암탉의무릎관절강내에 MIA를주입하면 6-8주후연골세포의동화작용이차단되어관절연골세포의괴사가초래되며연골의조직학적및생화학적변화가사람의골관절염과유사하여골관절염과관련된연구에서많이이용되고있다 51). MIA는만성적으로관절의퇴화를유도하며관절염이 유발된다리쪽의체중부하감소로만성통증이유발된다. 체중부하검사는관절염이유발된다리에체중을부하하지않으려는특징을이용해체중부하를측정하는검사법으로 52), 통증을감소시키기위해서나타나는자세의변화, 몸웅크리기, 핥기와같은행동을관찰하는것보다통증의정도를객관적으로측정할수있다 53,54). 체중부하검사를실시한결과 BST 투여군은대조군에비해유의하게증가되었다 (Fig. 10). 혈액내면역세포에미치는영향을검증하기위해총백혈구, 호중구, 림프구, 단핵구의생성량에대해검사했다. 그결과 BST 투여군의총백혈구, 호중구, 림프구, 단핵구의생성량이대조군에비해서감소를나타냈으나유의성이없었다 (Fig ). 골관절염에대한치료효과를검증하기위해서는혈액내염증 cytokine (IL-1β, IL-6, TNF-α) 및염증매개인자 (TIMP-1, MMP-9, LTB 4, PGE 2 ) 의영향이중요하다. IL-1은면역반응의조절, 염증반응, 조혈작용에관여하는 cytokine으로연골세포로부터 MMPs의생성과분비를촉진시켜연골기질의고분자 (macromolecules) 의파괴를증가시키며 PGE 2 의생성을촉진시킨다 2,55). IL-1β, TNF-α 등은 NO와 PGE 2 의생산을증가시키고 56), cytokine으로유도된 PGE 2 합성과 COX-2 활동은 rat 골아세포실험에서 NO에의존적인기전과독립적인기전모두에의해조절된다는연구결과도있다 57). IL-6은주요한염증 cytokine으로만성염증면역반응의영구화뿐만아니라급성염증의시작에있어중요하며병인과급성스트레스가있을때숙주방어에중요한역할을한다 58,59). MMPs 는분비되는세포에따라연골세포, 활액, 활막세포등으로부터나오는 collagenase, stromelysin, gelatinase 등의효소로서연골내의 aggrecan 및 collagen 을파괴한다. 또한 MMPs는 IL-1, tissue plasminogen activator, MMP activator 등에의해활성화되고 TGF-β, TIMP, plasminogen activator inhibitor-1 등에의해억제된다 2). 비가역적인 MMP-9 의억제는염증, 혈관, 종양의병인을유의하게치료할수있다고생각된다 60). TIMP는종양세포의이동, 침입, 전이를포함하여세포외기질을재건하는 MMPs 의내적인길항제이다. MMPs 와 TIMPs 사이의불균형은다양한질병상태와관련되는데 61), 골관절염에서혈액내 MMP-9 생성량은증가하고이것이골관절염에서연골을파괴하는데기여한다고알려져있으나어떤 31

18 우창훈 오민석 연구에서는골관절염환자가정상인보다혈액내 TIMP-1 생성량이유의하게증가하고혈액내 MMP-9 생성량은오히려정상인보다낮았다는결과도있다 62,63). Leukotriene은여러유형의세포에서지방산화효소 (lipoxygenase) 경로에의해생성되는아라키돈산 (arachidonic acid) 유래지질성염증매개체의일종이다 64). PGE 2 는염증, 세포소멸, 혈관형성, 관절구조변화를일으키고골관절염과류마티스관절염에서연골세포가콜라겐을생산하는것을억제하고 MMPs 의생산을증가시켜서연골의분해를촉진시킨다 64). LTB 4 와 PGE 2 는관절염의중요한병인으로작용하며관절염에서생성량이증가하는데 LTB 4 의억제는관절염을치료하는데도움이된다 66,67). 혈액내의 IL-1β 생성량을측정한결과, BST 투여군은대조군에비해유의성있게감소되었고 (Fig. 18), IL-6 생성량은 BST 투여군이대조군에비해감소되었으며 (Fig. 19), TNF-α 생성량은 BST 투여군이대조군에비해유의성있게감소되었다 (Fig. 20). 관절염초기에는연골세포에대한이화작용을하는 IL-1β, TNF-α와동화작용을하는 IL-6의생성량이증가한다. BST 투여군에서는연골세포에대한이화작용을하는 IL-1β와 TNF-α 생성량이감소하면서동화작용을하는 IL-6의생성량도상대적으로감소하여동화와이화작용이상대적인균형을이루게되었다. 이와같은결과를볼때 BST 투여군은염증매개인자의생성을억제하였다. 혈액내의 TIMP-1 생성량을측정한결과, BST 투여군은대조군에비해유의성있게감소되었고 (Fig. 21), MMP-9 생성량은 BST 투여군이대조군에비해유의성있게감소되었다 (Fig. 22). 관절염의초기에 MMP-9 가증가하면연골을파괴하는작용을하며그후 TIMP-1 도증가하여이것을억제하는작용을하는데, 이과정이균형을이루면서점차 MMP-9 와 TIMP-1 모두감소하게되었는데 63,64), BST 투여군이연골파괴를억제했다고할수있다. 혈액내의 LTB 4 생성량을측정한결과, BST 투여군은대조군에비해유의성있게감소되었고 (Fig. 23), PGE 2 생성량은 BST 투여군이대조군에비해유의성있게감소되었다 (Fig. 24). LTB 4 는염증매개체의일종으로관절염이발생했을때생성량이증가하고, PGE 2 는염증반응을일으키고연골분해를촉진한다. BST 투여군에서 LTB 4 와 PGE 2 의생성량이감소한것은염증반응이억제되고연골분해작용이감소되었다고할수있다. Micro CT-arthrography 는지주골지수를분석하여연골량을측정하고, 연골하골판두께, 골극형성과연골하골의골흡수의변화를포함한골관절염소견을평가할수있다 68). 무릎관절의연골파괴정도를측정한결과 BST 투여군은대조군에비해유의성있게증가되어연골의파괴가억제되었다고할수있다 (Fig. 25). 무릎관절내활막세포의변화및염증세포침윤여부를관찰하기위하여 H&E 염색을실시한결과, BST 투여군은대조군에비해연골조직과활막조직, 섬유조직의변형이많이억제되는것으로나타났으며 (Fig. 26), 연골조직으로부터 proteoglycan 층을잘보존하여연골상태를잘관찰할수있는 Safranin-O 염색을실시한결과 69), 대조군에비해 BST 투여군의활막주변에빨간색으로염색된연골세포가많이분포되어있어서연골세포의파괴가억제되었다는것을알수있었다 (Fig. 27). 이상의실험결과로볼때附子瀉心湯은항산화작용과골관절염의병리기전에작용하는염증 cytokine 을억제하는항염증효능이있었다. 또한염증반응을촉진하고파골작용이있는염증매개인자들의생성을유의하게감소시켜염증반응을억제하고, 통증을감소시키며, 관절연골을보호하는작용이있으므로골관절염에대한효과적인치료제로사용될수있다고생각한다. 결론»»» 附子瀉心湯이산화적손상, 염증및골관절염동물병태모델에미치는영향을관찰한결과다음과같은결론을얻었다. 1. 중금속검사결과납과카드뮴의경우기준치이하로검출되었고비소와수은은검출되지않았다 2. 총폴리페놀함량은높게나타났다. 3. 세포독성은없었으며, 간과신장기능에도영향을미치지않았다. In vitro 1. DPPH 와 ABTS 소거율은농도의존적으로증가하였다. 2. ROS 생성량은 100 μg/ml 에서유의성있게감소하였다. 3. NO와 IL-1β 의생성량은감소했으나유의성은없었다. 4. IL-6은 10, 100 μg/ml 농도에서유의성있게감소 32 J Korean Med Rehab 2015;25(2):15-35

19 하였고, TNF-α는 100 μg/ml 농도에서유의성있게감소하였다. In vivo 1. 체중부하측정에서유의성있게증가하였다. 2. 총백혈구수, 호중구, 림프구, 단핵구생성량은감소했으나유의성은없었다. 3. cytokine IL-1β와 TNF-α 생성량은유의성있게감소하였고, IL-6 생성량은감소했으나유의성은없었다. 4. 염증매개인자 TIMP-1, MMP-9, LTB 4, PGE 2 생성량은유의성있게감소하였다. 5. 연골량이유의성있게증가하였으며, 연골의염색결과연골, 활막, 섬유조직의변형이억제되고 proteoglycan 함유량의손실도억제되었다. 이상의결과로보아附子瀉心湯은염증 cytokine 을조절하여항산화, 항염증, 진통, 연골보호작용이있었으며, 골관절염을진행시키는인자를효과적으로억제하였다. 또한활막, 연골, 섬유조직등의손상을억제하여관절과관절주위조직을보호하는효능이있어골관절염치료에효과가있을것으로기대된다. References»»» 1. 한방재활의학과학회. 한방재활의학제 3 판. 서울 : 군자출판사. 2011: 대한정형외과학회. 정형외과학제 6 판. 서울 : 최신의학사. 2006: 한태륜, 방문석외 57 인. 재활의학제 3 판. 서울 : 군자출판사. 2009: 張介賓. 景岳全書上. 서울 : 대성문화사. 1988: Kim YE, Kim EJ. 저출력레이저요법이흰쥐의콜라겐유발관절염에미치는항염증효과. 동의생리병리학회지. 2011; 25(5): Kim SH, Na JY, Song KB, Choi DS, Kim JH, Kwon YB, Kwon JK. 흰쥐관절연골세포에서과산화수소로유도된산화스트레스에대한진세노사이드 Rb 1 의보호효과. 고려인삼학회지. 2012;36(2): 이성규, 이은주, 박우동, 김종부, 최상원. 한방처방제추출물의항산화및항염증활성. 한국식품과학회지. 2011; 43(5): 박동수, 정수현, 김순중, 서일복. 加減小續命湯이 Monosodium Iodoacetate 로유발된골관절염의초기변화에미치는영향. 한방재활의학과학회지. 2011;21(4): 이정민, 홍서영, 오민석. Papain 으로유도된골관절염생쥐모델에서芍藥甘草附子湯의항골관절염효능에관한연구. 대한한의학회지. 2013;34(1): 장효길, 허동석. 麻黃附子湯이 Papain 으로유도된골관절염생쥐모델에미치는영향. 한방재활의학과학회지. 2012; 22(4): 공상은, 오민석. Papain 으로유도된골관절염생쥐모델에서四逆湯의항골관절염효능에관한연구. 동의생리병리학회지. 2013;27(2): 박동수, 김순중, 정수현, 서일복. 蠲痺湯이 Monosodium Iodoacetate 로유발된골관절염의초기변화에미치는영향. 동의생리병리학회지. 2011;25(1): 신예지, 백용현, 박동석, 김재규, 고형균. 퇴행성관절염에대한獨活. 升麻복합처방의대사조절을통한연골보호효과. 대한침구학회지. 2010;27(4): 최재영, 오민석. 甘草附子湯이 Papain 으로유도된골관절염에미치는실험적연구. 한방재활의학과학회지. 2012; 22(4): 성영석, 최학주, 오정민, 지중구, 박지원, 김동희. 乾薑附子湯이 papain 으로誘導된骨關節炎생쥐모델에미치는영향. 대전대학교한의학연구소논문집. 2012;21(1): 박동수, 정수현, 김순중, 서일복. 蜂毒藥鍼이 Monosodium Iodoacetate 로유발된골관절염통증모델에서중추신경내 NOS, C-fos, Serotonin, Substance P 발현에미치는영향. 한방재활의학과학회지. 2007;17(3): 강미숙, 백성욱, 김갑성. 楡根皮藥鍼液이생쥐의두개골파골세포에서골재흡수의저해에미치는영향. 대한침구학회지. 2008;25(2): 김현수, 서일복, 박세근, 김정선, 서정철, 최선미, 구성태, 김이화. 秦芃藥鍼이 collagenase 로유도된흰쥐골관절염모델에서 NOS 발현에미치는영향. 대한경락경혈학회지. 2006;23(1): 송계화, 이진석, 조진형, 박기범. 紫河車藥針의退行性膝關節炎治療에대한임상적고찰. 대한침구학회지. 2006; 23(4): 김용문, 김순중, 서일복. 蜂毒藥鍼이 Monosodium Iodoacetate 로유발된흰쥐의골관절염에미치는영향. 동의생리병리학회지. 2007;21(5): 박동석. 땅두릅藥鍼의연골보호와 Apoptosis 억제에대한효과. 대한한의학회지. 2007;28(4): 이태호, 이은용. 絡石藤藥鍼이 Collagen 유발관절염에미치는영향. 대한침구학회지. 2009;26(6): 김환영, 최진봉. 蜂毒藥鍼과鹿茸藥鍼이 MIA 유도골관절염흰쥐에미치는영향. 한방재활의학과학회지. 2010; 20(1): 김은정, 김계엽. 蜂毒을이용한흰쥐연골세포에서의염증성 cytokine 생성조절. 동의생리병리학회지. 2011;25(1): 박영배, 강성길, 김혜경. 施灸方法이 Adjuvant 관절염흰쥐의혈액에미치는영향. 대한침구학회지. 1995;11(2): 서병관, 박동석, 백용현. Collagenase-induced Arthritis Rat Model 에서 Thermal Hyperalgesia 에대한전침의진통효과및기전연구. 대한침구학회지. 2011;28(2): 채인식. 傷寒論譯詮. 서울 : 고문사. 1971:123,

20 우창훈 오민석 28. 문준전, 안규석, 최승훈. 동의병리학. 서울 : 고문사. 1990: 전국한의과대학본초학공동교재편찬위원회. 본초학개정판. 서울 : 영림사. 2010:216-21, 283-5, 이숭인. 古方撰次. 부산 : 교정의서국. 2008: Altman R, Asch E, Bloch D, Bole G, Borenstein D, Brandt K, Christy W, Cooke TD, Greenwald R, Hochberg M, et al. Development of criteria for the classification and reporting of osteoarthritis. Classification of osteoarthritis of the knee. Diagnostic and Therapeutic Criteria Committee of the American Rheumatism Association. Arthritis Rheum. 1986;29(8): Iannone F, Lapadula G. The pathophysiology of osteoarthritis. Aging Clin Exp Res. 2003;15(5): 배병철역. 今釋黃帝內經素問. 서울 : 성보사. 1994: 김태은, 윤여민, 박용인, 김윤석, 전병훈, 김명동. 한약재물추출물의생리활성검색및 MPTP- 유도신경독성에대한大黃의보호효과. 동의생리병리학회지. 2004;18(6): 오성준, 백남인, 김해영. 大黃 (Rheum undulatum L.) 뿌리의항산화활성물질, Piceatannol. 한국응용생명화학회지. 2001;44(3): 장연희, 최상원, 조성희. 고지방식이급여흰쥐에서大黃및大黃錠劑丸의혈청지질개선효과. 한국영양학회지. 2008;41(1): 이종철, 김경준. 大黃의 Elastase 활성억제와 Tyrosinase 억제연구. 한방안이비인후피부과학회지. 2009;22(3): 이중근, 송윤경, 임형호. 黃芩의진통효과와항염효과. 대한한의학회지. 2007;28(4): 윤석빈, 한효상, 이영종. 黃芩이 LPS 로유발된 RAW Cells 의염증인자에미치는영향. 대한본초학회지. 2011; 26(2): 김태균, 안효초, 윤미영, 임재윤, 채병숙, 김대근, 박병현, 양재헌. 콜라겐으로유발된관절염에대한피록시캄및黃芩가수분해물복합히드로겔의항염효과. 약학회지. 2008; 52(5): 신정민, 박찬경, 신은주, 조태형, 황인경. 黃芩추출물이조골세포와파골세포의활성에미치는영향. 한국식품과학회지. 2008;40(6): 김용주, 이문조, 박진우, 김준기, 최달영, 김철호. 黃連열수추출물의항산화활성효과. 생명과학회지. 2000;10(3): 정효원, 박용기. 黃連의쥐대식세포로부터 LPS 에의해유도되는 nitric oxide 및 TNF-α 의생성억제효과. 대한본초학회지. 2006;21(2): 윤광로, 김영진, 이은, 이준무. 黃連의항염증효과. 대한본초학회지. 2009;24(3): Cho JY, Park JS, Kim PS, Chae SH, Yoo ES, Baik KU, Lee JS, Park MH. 지질다당류 - 유도 RAW264.7 세포내종양괴사인자생성에미치는한방의억제효과. Natural Product Sciences. 1999;5(1): 김윤희, 임윤경, 이현. 附子藥鍼이흰쥐의 Collagen 유발관절염에미치는영향. 대한경락경혈학회지. 2006;23(2): 정선희, 박동석. 附子藥鍼이鎭痛및消炎作用에미치는영향. 대한침구학회지. 1997;14(1): 박선민, 유동열. 三氣飮加味方이파골세포의분화및조골세포의활성에미치는영향. 대한한방부인과학회지. 2012; 25(2): 조은호, 이태희. LPS 에의해유발된炎症스트레스에대한黃連과附子의효과. 대한본초학회지. 2006;21(2): 대한임상병리학회. 임상병리학제 3 판. 2001: Kalben DA, Blum U. Hypothesis and experimental confirmation of a new pharmacological model of osteoarthrosis. Arzneimittelforschung. 1977;27(3): 이용수. Monosodium iodoacetate(mia) 로유발된관절염흰쥐의행동학적조직학적변화. 고려대학교대학원. 2008: Fernihough J, Gentry C, Malcangio M, Fox A, Rediske J, Pellas T, Kidd B, Bevan S, Winter J. Pain related behaviour in two models of osteoarthritis in the rat knee. Pain. 2004;112(1-2): Zhu CZ, Wilson SG, Mikusa JP, Wismer CT, Guavin DM, Lynch JJ. Role of cetral and peripheral mglur5 receptors in post-operative pain in rats. Pain. 2005;114: Sims JE, March CJ, Cosman D, Widmer MB, MacDonald HR, McMahan CJ, Grubin CE, Wignall JM, Jackson JL, Call SM, et al. cdna expression cloning of the IL-1 receptor, a member of the immunoglobulin superfamily. Science. 1988;241(4865): Sidney LE, Kirkham GR, Buttery LD. Comparison of osteogenic differentiation of embryonic stem cells and primary osteoblasts, revealed by responses to IL-1β, TNFα and IFN-γ. Stem Cells Dev. 2014;23(6): Hughes FJ, Buttery LD, Hukkanen MV, O Donnell A, Maclouf J, Polak JM. Cytokine-induced prostaglandin E2 synthesis and cyclooxygenase-2 activity are regulated both by a nitric oxide-dependent and -independent mechanism in rat osteoblasts in vitro. J Biol Chem. 1999;274(3): Iking-Konert C, Bartz-Bazzanella P, Falagan D, Hofman MW, Schwarting A, Dörner T. Interleukin-6 inhibition as a potential therapeutic target in rheumatic diseases. Z Rheumatol. 2014;73(3); Yao X, Huang J, Zhong H, Shen N, Faggioni R, Fung M, Yao Y. Targeting interleukin-6 in inflammatory autoimmune diseases and cancers. Pharmacology and Therapeutics. 2014;141(2): Farina AR, Cappabianca L, Di Ianni N, Ruggeri P, Ragone M, Merolle S, Gulino A, Mackay AR. Alendronate promotes plasmin-mediated MMP-9 inactivation by exposing cryptic plasmin degradation sites within the MMP-9 catalytic domain. FEBS Letters. 2012;586(16): Kim YS, Kim SH, Kang JG, Ko JH. Expression level and glycan dynamics determine the net effects of TIMP-1 on cancer progression. BMB reports. 2012;45(11): J Korean Med Rehab 2015;25(2):15-35

21 62. Lipari L, Gerbino A. Expression of gelatinases (MMP-2, MMP-9) in human articular cartilage. Int J Immunopathol Pharmacol. 2013;26(3): Naito K, Takahashi M, Kushida K, Suzuki M, Ohishi T, Miura M, Inoue T, Nagano A. Measurement of matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1) in patients with knee osteoarthritis: comparison with generalized osteoarthritis. Rheumatology. 1999;38(6): Martel-Pelletier J, Pelletier JP, Fahmi H. Cyclooxygenase- 2 and prostaglandins in articular tissues. Semin Arthritis Rheum. 2003;33(3): Abbas A, Lichtman A, Pillai S. Cellular and Molecular IMMUNOLOGY seventh edition. 세포분자면역학교재연구회역. 세포분자면역학. 서울 : 범문에듀케이션. 2013: Grespan R, Fukada SY, Lemos HP, Vieira SM, Napimoga MH, Teixeira MM, Fraser AR, Liew FY, McInnes IB, Cunha FQ. CXCR2-specific chemokines mediate leukotriene B4-dependent recruitment of neutrophils to inflamed joints in mice with antigen-induced arthritis. Arthritis & Rheumatism. 2008;58(7): Atik OS. Leukotriene B4 and prostaglandin E2-like activity in synovial fluid in osteoarthritis. Prostaglandins, leukotrienes, and essential fatty acids. 1990;39(4): Kwon JW, Kang HS, Hong SH. Micro-CT Arthrographic Analysis of Monosodium Iodoacetate-Induced Osteoarthritis in Rat Knees. J Korean Soc Radiol. 2010;62(5): Király K, Lammi M, Arokoski J, Lapveteläinen T, Tammi M, Helminen H, Kiviranta I. Safranin O reduces loss of glycosaminoglycans from bovine articular cartilage during histological specimen preparation. Histochem J. 1996; 28(2):