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1 Journal of Korean Medicine Rehabilitation Vol. 24 No. 1, January 2014 pissn eissn Original Article 理中湯이골관절염유발생쥐에미치는영향 국길호 오민석대전대학교한의과대학한방재활의학과교실 Effects of Leejung-tang ( 理中湯 ) on MIA-Induced Osteoarthritis Rat Kil-ho Kook, K.M.D., Min-Seok Oh, K.M.D. Department of Korean Rehabilitation Medicine, College of Korean Medicine, Dae-jeon University RECEIVED December 17, 2013 REVISED December 31, 2013 ACCEPTED January 3, 2014 CORRESPONDING TO Min-Seok Oh, Department of Korean Rehabilitation Medicine, College of Korean Medicine, Dae-jeon University, 1136, Dunsan-dong, Seo-gu, Daejeon , Korea TEL (042) FAX (042) ohmin@dju.ac.kr Copyright 2014 The Society of Korean Medicine Rehabilitation Objectives This study intends to clarify how Leejung-tang (here in after reffered to LJT) affect Wistar Rat whose osteoarthritis was induced by MIA. Methods Osteoarthritis was induced into rat by injecting MIA in its knee joint. Rats are divided into a total of 4 groups (n=6). Normal group are not treated at all without inducing osteoarthritis whereas control group were induced for osteoarthritis by MIA and oral medicated with 2 ml of physiological saline per day. Positive comparison group (Indomethacin) was injected with MIA and after 7 days, 2 mg/kg of Indomethacin was medicated. Experimental group (LJT) was injected with MIA and after 7 days that was medicated with 23 mg/kg of LJT. Indomethacin and LJT were oral medicated for each substance a total of 4 weeks with one time per day. After experiments (from 1 week after injection of MIA to 4 weeks elapsed), Hind paw weight bearing ability, Functions of liver and kidney, Serum prostaglandin E 2, TNF-α, IL-1β, IL-6, Osteocalcin, TIMP-1, MMP-9, LTB 4 and amount of cartilage were measured and histopathological variations for knee joint structures were observed. Results 1) Hind paw weight bearing ability of LJT administration group was increased but there was no statistical significance. 2) Functions of liver and kidney were not affected. 3) Serum prostaglandin E 2, IL-1β, Osteocalcin, MMP-9 were significantly decreased and TNF-α, IL-6, TIMP-1, LTB 4 were also decreased but there were no statistical significance. 4) In H&E staining and Safranin-O staining, there were small histopathological changes in LJT administration group than control group. 5) In micro CT (computed tomography)-arthrography, cartilage destruction was more suppressed in LJT administration group than control group. Conclusions Based on all results mentioned above, Leejung-tang (LJT) is believed to be meaningful for suppressing the progress of osteoarthritis and its treatments because of its anti-inflammatory effects and alleviation of pain with histopathological effective efficacy. (J Korean Med Rehab 2014;24(1):31-45) Key words Leejung-tang (LJT), Osteoarthritis, MIA-induced osteoarthritis, Cytokine, Indomethacin 서론»»» 골관절염은성인에서가장흔한관절질환으로퇴행성 관절염또는퇴행성관절질환이라고도불리운다. 주로체중부하관절을많이침범하여관절연골의국소적인퇴행성변화, 연골하골의비대, 주변골연골부의과잉골형성, 31

2 국길호 오민석 관절의변형등을특징으로하며임상적으로는반복적인동통, 관절강직감및점진적인운동장애등을초래한다 1). 골관절염의병인적요인에근거하여질환의경과를바꿀수있는다양한약물들이소개되고있지만아직뚜렷한효과를보이는약물은없는실정이며 2), 만성적이고진행성인질환의특성상 3) 더욱효과적인치료방법이요구되고있다. 한의학에서의골관절염은關節痺證에속하며, 인체에風 寒 濕의邪氣가침범하여유발되는데關節酸楚, 疼痛, 重着, 腫大그리고활동장애를주요특징으로한다. 치료법은氣血宣通이며, 風寒濕痺는辛溫한약으로陽氣를고조시켜邪氣를축출하고, 風熱濕痺는散風淸熱祛濕시키며, 虛하고久痺한者는溫通溫散하거나滋陰하도록한다 1). 한의학계에서도 monosodium iodoacetate, papain, collagenase, carrageenan 등을투여하여유발된관절염동물모델에한약 4-10), 침구 11,12) 및약침 13,14) 을활용하여항염및진통효과를실험적으로입증한연구들이많이발표되고있다. 理中湯은漢代張仲景이저술한 傷寒論 辨癨亂病脈證幷治 15) 에理中丸으로처음으로기재된처방으로 治心下痞鞕小便不利或急痛或胸中痺者 16) 라하여裏가虛하고冷하며水가있는虛寒症을다스리는처방이다 17). 따라서노령화에따라유병률이높아지는골관절염의특성상正氣가부족하고虛寒해진상태 1) 에서발병한골관절염에대한치료효과가기대되나현재까지이에관한연구는거의없는실정이다. 이에저자는골관절염에대한理中湯의효과를규명하고자 RAW 세포를이용하여염증사이토카인에미치는영향을측정하였고, monosodium iodoacetate ( 이하 MIA) 로유발된골관절염 rat 모델을이용하여뒷발체중부하, 간 신장기능, 염증사이토카인, osteocalcin, prostaglandin E 2, TIMP-1, MMP-9, LTB 4 및활막조직관절의병리조직학적변화에미치는영향등을측정한결과유의성있는결과를얻었기에보고하는바이다. 재료및방법»»» 1. 재료 1) 세포실험에사용된 RAW 세포는한국세포주은행 (Seoul, Korea) 에서구입하였다. 2) 약재본실험에사용한理中湯 (Leejung-tang 이하 LJT) 의구성약재들은대전대학교둔산한방병원에서구입하여정선후사용하였고, 그내용과분량 (1첩) 은 傷寒論 15) 에근거하였다 (Table I). 3) 동물실험에사용한동물은수컷 6주령의 Wistar Rat (170~200 g) 로 ( 주 ) 오리엔트바이오 (Seong-nam, Korea) 에서공급받았다. 동물은실험당일까지고형사료 (5L79, 오리엔트바이오, Seong-nam, Korea) 를충분히공급하고온도 22±2 o C, 습도 55±15%, 12시간명암주기 (light-dark cycle) 의환경에서 1주간적응시킨후실험에사용하였다. 본실험은대전대동물실험윤리위원회의승인 ( 승인번호-DJUARB ) 을받아동물윤리준칙에의거하였다. 4) 시약 Lipopolysaccharide (LPS), dimethylsulfoxide (DMSO), 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) 는 Sigma-Aldrich 사 (st. Louis, MO, USA) 에서, Dulbecco s Modified Eagle s Medium (DMEM), Fetal Bovine Serum (FBS), Penicillin 및 Streptomycin 은 Hyclone사 (Logan, Ut, USA) 에서, Cell viability assay kit은 Daeillab sevice사 (Seoul, Korea) 에서, Nitric Oxide detection kit은 Intron Table I. The Prescription of Leejung-tang (LJT) Name of herb Pharmacognostic name Amount (g) 人蔘 Ginseng Radix 6 白朮 Atractylodis Rhizoma White 6 乾薑 Zingiberis Rhizoma 6 甘草 Glycyrrhizae Radix 6 Total amount J Korean Med Rehab 2014;24(1):31-45

3 理中湯이골관절염유발생쥐에미치는영향 Biotechnology 사 (Suwon, Korea) 에서구입하였다. Cytokine Milliplex Map Immunoassay kit은 Millipore사 (Bellerica, MA, USA) 에서, HPLC 분석에이용된 water와 acetonitrile은 Ducksan사 (Ansan, Korea) 에서, Rat Total MMP-9 kit, LTB 4 Kit, Rat TIMP-1 Kit, Rat IL-6 Kit, Rat TNF-α Kit, Prostaglandin E 2 Kit, Rat IL-1β Kit은 R&D System사 (Minneapolis, USA), 주정추출에이용된주정은 ( 주 ) 대한주정판매 (Jeon-joo, Korea) 에서구입하였다. 양성대조군에는 Indomethacin (Sigma 사, USA), 골관절염유발주사제로는 Monosodium iodoacetate (MIA) (Sigma. Chemical 사, Cat. No. I2512, USA), 마취제로는 Zoletil (Virbae사, France) Rompun ( 바이엘코리아, Seoul, Korea) 을사용하였다. Hematoxylin and Eosin 염색과 Safranin-O 염색에는 Hematoxylin (Merck 사, Germany), Eosin Y (Wako사, Japan), Safranin-O (Merck사, Germany) 를사용하였다. 5) 기기본실험에사용된기기는 Rotary vacuum evaporator (EYELA, Japan), Freeze dryer (Ilshin, Korea), ELISA reader (Molecular Devices, USA), Luminex (Millipore, USA), HPLC (Shimadzu LC-20AD, Japan), HPLC column (ACE 5 C18, mm, 5μm), Flow cytometry system (BD Biosciences immunocytometry systems, USA), Incapacitance Test Meter (IITC Life Science, california, USA), BD Ultra-Fine ll (Becton, Dickinson and Company, USA), Light Microscope (Carl ZEISS AXIOSKOP-40, Germany), μ CT arthrography (SKYSCAN, Optoscan, Belgium) 를이용하였다. 2. 방법 1) 시료추출 LJT 한첩을분말한후 0.8 L의 70% 주정에 24시간침지후여과하여, 그여액을 rotary evaporator 를이용하여 50 ml로감압, 추출하여동결건조하였으며추출수율에따른한첩분량은 2.76 g이었다. 2) 관절염유발및실험군의분류마취제 (Zoletil 0.5 ml+rompun 0.1 ml) 로 rat을마취 시킨후왼쪽무릎주변을깨끗이제모하고골관절염유발물질인 MIA (Sigma. Chemical Co. Ltd, Cat. No.I2512) 를인슐린주사기 (1 ml, 0.28 mm (31G) 8 mm) 를사용하여왼쪽무릎관절강내에 50μl (60 mg/ml) 씩투여하였다. MIA 희석시에는 0.9% Saline 을사용하였다. MIA 투여 7일후에관절염유발유무를확인하여관절염이유발된동물만을대조군, 양성대조군 (Indomethacin 투여군 ), 실험군 (LJT 투여군 ) 으로나누었으며 MIA를투여하지않은정상군을포함한각군당 Rat은 6마리씩사용하였다. 3) 약물투여 Wistar Rat에 MIA를주사하여관절염을유발시킨후, 일주일이경과된이후부터매일오전 10시에양성대조군에는 Indomethacin (Sigma. Chemical Co. Ltd, USA) 을 2 mg/kg/rat, LJT 투여군에는 LJT를 23 mg/kg/rat 로 4주동안경구투여하였으며, 대조군에는생리식염수를 2 mg/kg 씩투여하였다. 정상군은자유식이하였다. 4) 뒷발체중부하측정뒷발체중부하는 Incapacitance Test Meter (IITC Life Science, california, USA) 를이용하여, 플라스틱방에비스듬히 ( 기울기 60 o ) 세운후각뒷발에가해진세기를 10 초에걸쳐평균산출하였다. 처치된동측의뒷발에분포된체중의백분율은다음과같은방정식을이용하여계산하였다. 백분율 (%)=( 유발된하지의무게 / 정상하지의무게 ) 100 5) 혈액분석최종실험종료후튜브형주사기를이용하여심장에서채혈하였다. 전혈을바이오톡스텍 ( 주 )( 청주, 한국 ) 에의뢰하여 AST, ALT, BUN, Creatinine 을측정하였다. 6) 혈청내염증관련매개인자측정 (1) Prostaglandin E 2 (PGE 2 ) Calibrator Diluent RD5-56을비특이적결합 (non-specific binging) 을한 well에 200μl, zero standard well에 150μl 넣고 standard, sample ( 정상군, 대조군, 양성대조 33

4 국길호 오민석 군, LJT투여군 ) 을 150μl 씩넣었다. NSB well을제외한나머지 well에 Primary Antibody Solution 을 50μl 넣고 1시간동안실온에서반응시킨뒤 PGE 2 conjugate를 50 μl 넣고 2시간동안실온에서반응시켰다. 수세용액 (400μl) 으로 4회 wash한뒤 Substrate Solution을 200μl 넣고빛을차단한뒤 30분동안실온에서반응시킨후마지막으로 Stop solution을 100μl 넣고 microplate reader 로 450 nm에서흡광도를측정하였다. (2) Tumor necrosis factor-α (TNF-α) Diluent RD1-41을 50μl 넣은후에 standard, sample ( 정상군, 대조군, 양성대조군, LJT 투여군 ) 을 50μl씩넣고 2시간동안실온에서배양하였다. 5회 wash한뒤 TNF-α conjugate를 100μl 넣고 2시간동안실온에서배양하였다. Substrate Solution을 100μl 넣고빛을차단한뒤 30분동안실온에서배양하였다. Stop solution 을 100μl 넣고 microplate reader로 450 nm로측정하였다. (3) Interlukin-1β (IL-1β) Diluent RD1-21을 50μl 넣은후에 standard, sample ( 정상군, 대조군, 양성대조군, LJT 투여군 ) 을 50μl씩넣고 2시간동안실온에서배양하였다. 5회 wash한뒤 IL-1 β conjugate를 100μl 넣고 2시간동안실온에서배양하였다. Substrate Solution을 100μl 넣고빛을차단한뒤 30분동안실온에서배양하였다. Stop solution 을 100μl 넣고 microplate reader로 450 nm로측정하였다. (4) Interlukin-6 (IL-6) Diluent RD1-54를 50μl 넣은후에 standard, sample ( 정상군, 대조군, 양성대조군, LJT 투여군 ) 을 50μl씩넣고 2시간동안실온에서배양하였다. 5회 wash한뒤 IL-6 conjugate를 100μl 넣고 2시간동안실온에서배양하였다. Substrate Solution을 100μl 넣고빛을차단한뒤 30 분동안실온에서배양하였다. Stop solution 을 100μl 넣고 microplate reader로 450 nm로측정하였다. (5) Osteocalcin Biotinylated Osteocalcin을각 well에 100μl씩넣고실온 (18~22 o C) 에서 30±5분동안배양하였다. 수세용액 (400μl) 으로 5회 wash한뒤 Primary Antibody와 Primary Incubation Buffer 를 1:100 비율로혼합하여각 well에 150μl씩넣고, Standards (CAL0-5), sample ( 정상군, 대조군, 양성대조군, LJT 투여군 ) 을각각 20μl씩넣은후커버를닫고실온에서 microplate shaker (300 rpm) 로 60±5분혼합하였다. 5회 wash 후, Secondary Antibody를각 100μl씩넣고 microplate shaker (300 rpm) 로 60±5분혼합하였다. 다시 5회 wash 후, Substrate Solution를각 100μl씩넣고빛을차단한상태로 microplate shaker (300 rpm) 로 15±2분혼합하였다. Stop solution을 100μl 넣고 microplate reader로 450 nm로측정하였다. (6) Tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1) Assay Diluent RD1-21을각 well 50μl씩넣고 Standard, sample ( 정상군, 대조군, 양성대조군, LJT 투여군 ) 을 50μl 씩넣고 1분동안가볍게두드려혼합한후커버를닫고, 실온 (18~22 o C) 에서 2시간배양하였다. 5회 wash 후 Rat TIMP-1 Conjugate 100μl를각 Well에넣고실온에서 2시간배양하였다. 다시 5회 wash 후 Substrate Solution 100μl씩넣고빛을차단한상태로실온에서 30분배양하였다. Stop Solution 100μl 씩넣고잘혼합한후 microplate reader로 450 nm로측정하였다. (7) Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) Assay Diluent RD1-34를각 well 50μl씩넣고 Standard, sample ( 정상군, 대조군, 양성대조군, LJT 투여군 ) 을 50μl 씩넣고 1분동안가볍게두드려혼합한후커버를닫고, 실온 (18~22 o C) 에서 2시간배양하였다. 5회 wash 후 Rat MMP-9 Conjugate 100μl를각 Well에넣고실온에서 2시간배양하였다. 다시 5회 wash 후 Substrate Solution 100μl씩넣고빛을차단한상태로실온에서 30 분배양하였다. Stop Solution 100μl 씩넣고잘혼합한후 microplate reader로 450 nm로측정하였다. (8) Leukotriene B 4 (LTB 4 ) Calibrator Diluent RD5-52를비특이적결합 (non-specific binging) 을한 well에 100μl, zero standard well에 50μl 넣고, standard, sample ( 정상군, 대조군, 양성대조군, LJT 투여군 ) 을 50μl씩넣었다. NSB well을제외한나머지 well에 Primary Antibody Solution 을 50μl 넣고커버를닫은후 microplate shaker (500±50 rpm) 로 60±5분동안실온 (18~22 o C) 에서반응시킨뒤 LTB 4 - conjugate를 50 μl 넣고 microplate shaker (500±50 rpm) 로 180±5분동안실온에서반응시켰다. 수세용액 (400μl) 으로 4회 wash한뒤 Substrate Solution을 200μl 넣고빛을차단한뒤 30분동안실온에서반응하게한후마지막으로 Stop solution 을 100μl 넣고 microplate 34 J Korean Med Rehab 2014;24(1):31-45

5 理中湯이골관절염유발생쥐에미치는영향 reader로 450 nm에서흡광도를측정하였다. 7) 병리조직학적검사 Micro-CT (SKYSCAN, Belgium) 촬영이끝난후무릎부위를절단하여 10% EDTA가포함된 10% 포르말린용액에넣어관절조직을탈칼슘화시켰다. Radiographic technique 을이용하여 decalcification 유무를확인한후파라핀왁스에관절조직을넣고고정한다음 coronal section 을실시하였다. 탈칼슘화과정을거쳐파라핀으로고정된조직을 7μm의크기로자른뒤, hematoxylin and eosin (H&E) 및 safranin-o 염색을실시하여조직의상태를관찰하였다. 염증반응발생유무나활막세포의증식, 염증세포의조직침윤여부는 H&E 염색결과에서확인할수있으며, proteoglycan 층을염색하는 Safranin-O 염색결과에서는연골조직의손상여부를확인하였다. 8) Micro CT-arthrograpy 검사 Micor CT 측정은조영제인 HEXABRICS 320 (Guerbet, France) 를무릎관절에주사후 micro CT-arthrograpy 를사용하여무릎관절연골파괴정도를분석하기위해연골량 (cartilage volumne) 을 Fig. 1과같이측정하였다. 3. 통계처리 결과»»» 1. 뒷발체중부하에미치는영향 Hind paw weight bearing 측정결과, 정상군은 166.9± 2.3%, 대조군은 100±11.2%, 양성대조군은 164.1± 4.7%, LJT 투여군은 111.6±9.9% 로나타나대조군에비해 LJT 투여군에서유의성있는변화는없었다 (Fig. 2). 2. 간기능에미치는영향간기능측정의지표성분인 ALT는정상군이 32.0±1.7 (U/L), 대조군이 33.7±1.2 (U/L), 양성대조군이 37.7±4.2 (U/L), LJT 투여군이 39.0±4.6 (U/L) 로나타났고, AST는정상군이 130.0±8.7 (U/L), 대조군이 162.7±7.1 (U/L), 양성대조군이 160.0±15.1 (U/L), LJT 투여군이 172.7± 38.2 (U/L) 로나타나유의성있는변화는없었다 (Fig. 3). 3. 신기능에미치는영향혈청중의 BUN 농도를측정한결과, 정상군이 15.30± 0.89 mg/dl, 대조군이 18.10±1.45 mg/dl, 양성대조군이 18.90±2.03 mg/dl, LJT 투여군이 16.97±3.97 mg/dl 로 실험결과는 SPSS 11.0의 unpaired student s t-test를사용하여통계처리하였으며, p<0.05 수준에서유의성을검정하였다. Fig. 1. Image of cartilage degeneration using micro CT-arthrography in joint tissue of MIA-induced rat osteoarthritis. Fig. 2. Effects of LJT on weight changes in the hind paw of MIA-induced osteoarthritis rat. compared with control by T test (**p<0.05). 35

6 국길호 오민석 나타났고 (Fig. 4A), 혈청중의 creatinine 농도는정상군이 0.530±0.020 mg/dl, 대조군이 0.547±0.015 mg/dl, 양성대조군이 0.583±0.012 mg/dl, LJT 투여군이 0.587± mg/dl 로나타나유의성있는변화는없었다 (Fig. 4B). 4. 혈청내염증관련매개인자측정 1) Prostaglandin E 2 생성량 양성대조군이 42.2±9.5%, LJT 투여군이 52.8±24.3% 로대조군에비해 LJT 투여군에서유의성있는 (p<0.05) 감소를나타내었다 (Fig. 5). 2) TNF-α 생성량혈청내의 TNF-α 생성량은대조군의생성량을 100.0± 6.4% 로나타냈을때, 정상군이 82.8±18.5%, 양성대조군 혈청내의 Prostaglandin E 2 생성량은대조군의생성량을 100.0±13.2% 로나타냈을때, 정상군이 24.7±4.9%, 250 AST ALT ALT & AST level in serum (U/L) Normal Control Indomethacin LJT Fig. 3. Effect of LJT on the ALT and AST in MIA-induced osteoarthritis rat. Values represent the means±sd. Fig. 5. Effects of LJT on levels of Prostaglandin E 2 in the serum of MIA-induced osteoarthritis rat. The levels of Prostaglandin E 2 were determined using a ELISA system. compared with control by T test (*p<0.05, ***p<0.001). 4A 4B Fig. 4. Effect of LJT on the BUN and creatinine in MIA-induced osteoarthritis rat. group treated with Indomethacin, LJT: MIA-induced osteoarthritis Values represent the means±sd. 36 J Korean Med Rehab 2014;24(1):31-45

7 理中湯이골관절염유발생쥐에미치는영향 이 85.0±9.0%, LJT 투여군이 84.8±14.0% 로대조군에비해 LJT 투여군에서유의성있는변화는없었다 (Fig. 6). 3) IL-1β 생성량혈청내의 IL-1β 생성량은대조군의생성량을 100.0± 1.3% 로나타냈을때, 정상군이 67.8±3.6%, 양성대조군이 80.2±4.1%, LJT 투여군이 81.7±5.7% 로대조군에비해 LJT 투여군에서유의성있는 (p<0.001) 감소를나타내었다 (Fig. 7). 6) TIMP-1 생성량 혈청내의 TIMP-1 생성량은대조군의생성량을 100.0± 1.1% 로나타냈을때, 정상군이 54.4±3.9%, 양성대조군이 4) IL-6 생성량혈청내의 IL-6 생성량은대조군의생성량을 100.0± 14.5% 로나타냈을때, 정상군이 77.2±11.4%, 양성대조군이 78.5±11.1%, LJT 투여군이 85.4±17.9% 로대조군에비해 LJT 투여군에서유의성있는변화는없었다 (Fig. 8). 5) Osteocalcin 생성량혈청내의 Osteocalcin 생성량은대조군의생성량을 100.0±12.0% 로나타냈을때, 정상군이 41.2±3.0%, 양성대조군이 60.1±4.1%, LJT 투여군이 57.9±5.8% 로대조군에비해 LJT 투여군에서유의성있는 (p<0.001) 감소를나타내었다 (Fig. 9). Fig. 7. Effects of LJT on levels of IL-1β in the serum of MIA-induced osteoarthritis rat. The levels of IL-1β were determined using a ELISA system. compared with control by T test (***p<0.001). Fig. 6. Effects of LJT on levels of TNF-α in the serum of MIA-induced osteoarthritis rat. The levels of TNF-α were determined using a ELISA system. compared with control by T test (*p<0.05). Fig. 8. Effects of LJT on levels of IL-6 in the serum of MIA-induced osteoarthritis rat. The levels of IL-6 were determined using a ELISA system. compared with control by T test (*p<0.05). 37

8 국길호 오민석 Fig. 9. Effects of LJT on levels of Osteocalcin in the serum of MIA-induced osteoarthritis rat. The levels of Osteocalcin were determined using a ELISA system. compared with control by T test (***p<0.001). Fig. 10. Effects of LJT on levels of TIMP-1 in the serum of MIA-induced osteoarthritis rat. The levels of TIMP-1 were determined using a ELISA system. compared with control by T test (***p<0.001). 72.0±4.2%, LJT 투여군이 91.2±14.8% 로대조군에비해 LJT 투여군에서유의성있는변화는없었다 (Fig. 10). 7) MMP-9 생성량혈청내의 MMP-9 생성량은대조군의생성량을 100.0± 0.0% 로나타냈을때, 정상군이 50.0±4.1%, 양성대조군이 64.6±1.0%, LJT 투여군이 79.1±3.3% 로대조군에비해 LJT 투여군이유의성있는 (p<0.001) 감소를나타내었다 (Fig. 11). 8) LTB 4 생성량 혈청내의 LTB 4 생성량은대조군의생성량을 100.0± 12.3% 로나타냈을때, 정상군이 67.4±10.2%, 양성대조군이 69.8±6.5%, LJT 투여군이 83.4±6.7% 로대조군에비해 LJT 투여군에서유의성있는변화는없었다 (Fig. 12). 4. 병리조직학적변화에미치는영향 1) Hematoxylin & Eosin 염색조직염색결과정상군의관절은활막조직이정상적으로위치한반면, 대조군은연골과뼈의침하로관절조 Fig. 11. Effects of LJT on levels of MMP-9 in the serum of MIA-induced osteoarthritis rats. The levels of MMP-9 were determined using a ELISA system. compared with control by T test (***p<0.001). 직에손실이일어난것으로나타났다. LJT 투여군은관절주변에대조군에서관찰된대식세포, 과립구세포, 단핵구세포의과다침투에의한연골과뼈의침하등이상대적 38 J Korean Med Rehab 2014;24(1):31-45

9 理中湯이골관절염유발생쥐에미치는영향 Fig. 12. Effects of LJT on levels of LTB 4 in the serum of MIA-induced osteoarthritis rats. The levels of LTB 4 were determined using a ELISA system. compared with control by T test (***p<0.001). Fig. 13. Effects of LJT on the joint pathology (Hematoxylin & Eosin staining) from joint tissue of MIA-induced osteoarthritis rats ( 100). 으로감소하였다 (Fig. 13). 2) Safranin-O 염색조직염색결과정상군의관절은연골조직이정상적으로위치하였다. 대조군은관절주변에염증세포의침투가일어나빨간색으로염색된정상조직이 MIA로연골의파괴가나타나사라진것을관찰할수있었다. LJT 투여군은연골의파괴정도가대조군에비해빨간색염색조직이활막주변에많이분포하는것으로나타났다 (Fig. 14). 5. 연골량에미치는영향연골량 (cartilage volume) 을측정한결과 (Fig. 15), 정상군이 4.64 mm 3, 대조군이 1.15 mm 3, 양성대조군이 3.70 mm 3, LJT 투여군이 1.95 mm 3 로대조군에비하여 LJT 투여군에서연골량파괴가억제되었다 (Fig. 15, 16). 고찰»»» 골관절염은가장흔한관절질환으로서관절구조의 Fig. 14. Effects of LJT on joint pathology (Safranin-O staining) from joint tissue of MIA-induced osteoarthritis rats ( 100). 변형, 유전적요인, 연골에가해지는물리적압력, 연골세포의대사변화및관절강내생화학적변화등이공통으로관련되어초래되는질환으로인식된다 18). 골관절염의주된증상은관절주위의통증이며, 경도의관절종창, 관절경직, 관절의마찰음, 운동범위의감소등의증상을나타 39

10 국길호 오민석 5 Cartilage volume(mm 3 ) Normal Control Indomethacin LJT Fig. 16. Effects of LJT on cartilage volume using micro CT-arthrography in joint tissue of MIA-induced osteoarthritis rats. Normal: Normal wister rat group, Control: MIA-induced osteoarthritis Fig. 15. Imaging of cartilage degeneration using micro CT-arthrography in joint tissue of MIA-induced osteoarthritis rats. 내고, 노인에서흔히신체장애를초래하게된다 19-21). 골관절염은원발성과이차성으로나눌수있으며, 원발성은다발성퇴행성관절염으로특히체중부하되는관절에많이발생하는데 50세이상비만한환자에서많이발생하는것으로알려져있다 1). 2011년통계청조사 22) 에따르면, 우리나라 65세이상고령인구는 2010년 545만명으로 16개시 도전체가고령화사회로진입하였고, 2030년에는 2.3배, 2060년에 3.3배증가하는것으로나타났다. 2009년도국민건강영양조사 23) 에서골관절염환자는만 50세이상에서여자 32.5%, 남자 14.7% 로여자가월등히높았고, 특히노령화될수록유병률도높아져 65세이상은 37.8% 로보고되었다 3). 한의학에서골관절염은痺證의범주에속한다고볼수있으며 24), 인체의營衛失調, 腠理空疎, 正氣虛弱시風寒濕熱의邪氣가체내에침입하여관절에응체됨으로써발생한다 1). 즉痺證은正氣不足이발병의내재적소인이고風, 寒, 濕의感受가外因이되며 25), 이로인하여經絡이阻滯되고氣血運行이不暢하여肌肉, 筋骨, 關節에痠痛, 痲木, 重着, 屈伸不利를야기하거나, 심하면關節腫大灼熱등을나타낸다 24). 黃帝內經 素問 26) 痺論에서 風寒濕三氣雜之, 合而爲痺也 라하여痺證은風寒濕에의하여발생한다고하였으며行痺, 痛痺, 着痺, 肝心脾肺腎의五 臟痺, 筋脈肌皮骨의五痺에대해언급하였다. 漢代張仲景은 傷寒論 27) 太陽病脈證幷治篇과 金匱要略 28) 痙濕暍病脈證幷治篇, 中風歷節病脈證幷治篇에서太陽風濕, 濕痺, 歷節病을언급하며그증상으로 歷節痛不可屈伸, 其痛如掣, 諸肢節疼痛身體魁脚腫如脫 하다고기술하였다. 痺證의치료원칙은風寒濕의邪氣에의한경우에는邪氣의輕重에따라淸熱, 祛風, 散風, 除濕, 活血을하고, 虛弱한경우에는調補氣血, 補腎助陽, 滋陰養肝한다 24). 골관절염의병태생리는여러주장과가설이있을수있는데크게두가지로살펴볼수있다. 첫째, 연골기질 (cartilage matrix) 의손상과변화, 둘째조직의손상에대한연골세포의감소로나누어진다. 첫째는여러기계적인자극이나, 염증으로인한효소반응, 대사의변화등으로시작되며, 기질고분자 (matrix macromolecule) 의격자가파괴되고, 수분함량의변화가일어난다. 둘째는연골세포가조직손상이나변화를감지하면서시작되는데동화작용및이화작용이모두증가된다. 이는주로 IL-1과종양괴사인자인 TNF-α와같은 cytokine 에의해이뤄지는파괴와재형성과정이다 29,30). 관절연골의손상은여러기계적인자극이나, 염증으로인한효소반응, 대사의변화등으로시작되며, proteoglycan 의감소및 glycosaminoglycan chain의길이가감소함으로써수분보유능력이감소하여추가손상에매우약한상태가된다. 이후연골세포는조직손상이나변화를감지하면서동화작용및이화작용이증가하는데, 이때 IL-1, TNF-α는연골기질을파괴하는이화작용에관여하는효소로작용을하고, NO 40 J Korean Med Rehab 2014;24(1):31-45

11 理中湯이골관절염유발생쥐에미치는영향 가연골에작용하는부하와함께 MMPs 의분비를촉진시키고기질의변화와세포사멸을가져오는반면, IL-6, 성장인자, 인슐린, IGF-1, bfgf, TGF-β 등은기질고분자의생성을촉진하고연골세포의증식을자극하여동화작용에관여한다. 이단계에서동화및치유과정은이화작용에반하여수년간지속될수있으나치유와재형성과정이실패함으로써점진적인관절연골의소실및연골세포사멸에의하여골관절염의진행이촉진된다 19). 서양의학에서의골관절염의일반적인치료는적당한휴식과운동, 약물요법, 관절에대한국소치료등의보존적치료와보존적치료에반응하지않거나관절의변화가진행하는경우에는수술적방법을시행하게된다 19). 그러나서양의학에서골관절염초기에쓰는약물중아세트아미노펜은단순한진통효과만있어골관절염의진행을억제하는효과는미미하고, 비스테로이드성소염제는장기간사용시위장관질환과신장기능저하를야기할수있으며 31,32), 특이적 COX-2 억제제는심혈관계통의부작용으로사용이제한적이어서보다안전하고효과적인치료제가필요한실정이다 33). 그러므로적극적인증상의호전및연골의보호와재생효과를목표로한천연물을이용한개발이필요한시점이라고생각된다. 이번연구에사용된理中湯은漢代張仲景의 傷寒論 15) 에기재되어있는처방으로人蔘, 乾薑, 白朮, 甘草로구성되어있으며, 溫中祛寒하고補氣健脾하는효능 34) 이있다. 人蔘은 藥徵 35) 에서 主治心下痞堅痞鞕支結也. 旁治不食嘔吐喜唾心痛腹痛煩悸 라하였고강등 36) 은人蔘뇌두 butanol 분획물을유효성분으로함유하는약학적조성물은관절염유발시생기는부종이나발적을감소시킨다고하였다. 정 37) 은人蔘의 saponin 추출물은 TNF-α, IL-1β 등염증관련물질의혈중농도를감소시켜 collagen-induced arthritis (CIA) mouse model에서관절염개선효과가있다고하였으며, 최 38) 는人蔘이항산화작용을갖고있어노화의예방과치료를겸한노화억제생약으로서가치가있다고하였다. 乾薑은 藥徵 35) 에서 主治結滯水毒也. 旁治嘔吐咳下利厥冷煩躁腹痛胸 39) 痛腰痛 이라하였고, 溫中逐寒, 回陽通脈, 治風寒濕痺 의효능이있어류마티스성관절염, 신경통등에사용한다고하였다 40). 유 41) 는乾薑의주요성분중 gingerol 관련화합물들이항산화및진통억제효과가있다고보고하였다. 白朮은 藥徵 35) 에서 主利水也. 故能治小便自利 不利旁治身煩疼痰飮失精眩冒下利喜唾 라하였으며, 최 42) 는현저한 NO, free radical scavenging activity 와 lipid peroxidation 의억제기능을가지고있으며, NO의생성과그생성효소인 inos 양도현저히억제함으로써생체에서각종 inflammation 과 oxidative stress에대한억제적인효과를유도할가능성을제시하고있다고보고하였다. 김등 43) 은白朮의 ethanol 추출물이 collagen-induced arthritis (CIA) mouse에서관절염으로인한손상을억제하는효과가있다고하였다. 甘草는 藥徵 35) 에서 主治急迫也. 故治裏急急痛攣急, 而旁治厥冷煩躁衝逆之等諸般急迫之毒也 라하여和中緩急, 潤肺, 解毒 39) 의효능을가지고있으며, 甘草에서분리한 18α-glycyrrhetinic acid가당질코르티코이드와유사한항염증성작용을나타낸다는보고 44) 가있다. 한의학에서는골관절염에해당하는痺病의치료에加味羌活湯, 大羌活湯, 香蘇散, 獨活寄生湯, 蠲痺湯, 附子湯, 活絡湯, 防己黃芪湯, 烏藥順氣散, 疎風活血湯, 靈仙除痛飮등 1) 의辛溫解表, 活血祛瘀, 祛風寒濕시키는처방을주로사용하여왔으며, 상대적으로溫裏劑, 補益劑에대한연구는부족한실정이다. 저자는연령이증가함에따라유병률도높아지는골관절염의특성상, 溫中祛寒劑인理中湯이正氣가不足하여虛寒한상태인노인의신진대사작용을향상시키고아울러혈액순환을개선시킬수있어적합할것으로생각하였다. 이에본연구에서는항염증및진통효과가있는약물을포함하고있는理中湯이골관절염에미치는치료효과를규명하고자하였다. MIA (Monosodium iodoacetate) 로유도된골관절염 rat 모델을이용하여理中湯의골관절염치료효능을분석하였다. 본연구에사용된 MIA는관절강내에주입시관절연골세포에서진행되는해당과정의 glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase 활성을억제하여관절연골의대사과정을저해시키고, 관절연골의변성을일으켜골관절염을유발시키는물질로, 쥐를대상으로한골관절염유발실험에서관절연골의손상, 관절의기능장애, 통증등의양상이사람의골관절염과매우유사하다고보고되었으며 45-47), 용량의조절을통해골관절염의정도를조절할수있다 48). MIA로유도된골관절염을대상으로한한의학계의최근연구들을살펴보면한약에서는加減小續命湯 4), 附子湯 49), 疎風活血湯 50), 二妙散 51) 52), 加味消炎湯등이있었으나정상군, 대조군, 실험군으로만나누어비 41

12 국길호 오민석 교하였고양성대조군을설정하지않았다. 약침의효과를연구한김등 13) 의논문에서도정상군, 대조군, 실험군으로만나누었으며혈청내인자중 PGE2, COX-1, COX-2 만측정하였다는한계가있었다. 본연구에서양성대조군으로사용된 indomethacin 은미국의 Merk Sharp & Dohme 사의 Sharett 등 53) 이합성한 350종의 indole 화합물을 Winte 등 54) 이 1963년에 screening하여서발견하였으며소염, 진통작용이강력하여세계각지의임상시험에서 rheumatism 질환에효력이인정되어제품화되었다. 본연구에서는간 신장기능에미치는영향, 뒷발체중부하에미치는영향, 염증성지표로서 IL-1β, IL-6, TNF-α의염증사이토카인에미치는영향, prostaglandin E2, TIMP-1, MMP-9, LTB4 등의염증성매개인자에미치는영향, 연골및활막조직의조직학적변화등을비교 분석하였다. 뒷발체중부하에미치는영향을알아보기위해 weight bearing ability를측정한결과대조군에비해 LJT 투여군에서증가를보였으나유의하지는않았다 (Fig. 2). 간기능과신기능에미치는영향을알아보기위해혈청중의 ALT, AST, BUN, creatinine 농도를측정한결과간과신장기능에영향을미치지않는것으로나타났다 (Fig. 3, 4). Prostaglandin E2는여러질환에서염증, 신장혈류량과기능유지, 신체의평형유지등에매우중요한역할을하는물질로알려져있다 55). 이는 cyclooxygenase 의활성화에따른산물로서염증질환, 자가면역질환등에중요한역할을하며, 특히염증반응의중요한매개물질로작용하고혈관확장외에통증과발열반응을유도한다 56). TNF-α와 IL-1β는골관절염의진행시증가하는대표적인 cytokine 으로많은연구에서골관절염진행의지표로쓰인다 57,58). TNF-α는활성화된단핵구와대식세포에의하여생산되어, 염증의활성화, 호중구활성화, 단백질합성, 세포고사등을유발하는상위 cytokine 으로서 59,60), IL-1, IL-6, IL-8, IL-10 및 MMPs와같은하위염증매개물질의생성을유발하여염증을증폭시키고관절연골기질로부터 prostaglandin 소실율증가및재합성억제를통해관절연골을손상시키고골관절염의진행을유도한다 61,62). IL-1β는연골및활막세포로부터 prostaglandin E 2, NO 를포함한다른염증매개체의생산과, MMPs 의발현을 자극하여골관절염에서연골분해를일으키는강력한 cytokine 으로알려져있다 63,64). IL-6은 IL-1과 TNF-α에의해분비가촉진되는급성조절단백질로골관절의염증반응에주된매개작용을하여혈청및관절염으로손상된관절의관절액에서활성도가증가하며, 골관절염의활성도와연관성이있다 65,66). 또한 Katherine 등 67) 은 IL-6이활액막이나관절조직의혈관에서분비되어혈청에서보다관절액에서더높은활성도를보인다고하였는데, 이는 IL-6이골관절염에서면역반응의매개체로서중요한역할을담당함을알수있다. Osteocalcin 은골단백질의 1% 를차지하며비교원성단백질중가장풍부한단백질로 1,25 dihydroxy-vitamin D3, vitamin K, vitamin C가관여하여골아세포에서생성되어골의무기질침착과정에작용하며정상성인에서새롭게형성된 osteocalcin 의 1/3이직접혈류로포함된다. 혈중 osteocalcin 대부분이골아세포에서새로운단백질의합성시생성되므로골아세포의활성도를반영한다 68-70). 골아세포의활성도를알수있는여러가지지표중에서임상에서가장널리쓰이는 ALP는다양한골질환에서증가되며임상적유용성에도불구하고혈중농도를증가시킬수있는골질환외에다른질환이존재함으로인해제한적으로사용되어왔으며예민도및특이도에서 osteocalcin 이골대사의지표로써더우수한것으로알려져있다 71,72). TIMPs 는 MMPs 와 1:1로결합하여 MMPs 의활성화를억제하며 73), MMPs 와 TIMPs 의발현의부조화가염증성질환에서조직의분해를일으킨다고추측된다 74). MMPs 의역조절단백인 TIMPs 는세포외기질의항상성을유지하는중요한인자이며, 이중 TIMP-1 은 MMP-9 의역조절단백으로서 1:1로복합체를이루어 MMP-9 의활성을저하시킨다고알려져있다 75). MMPs 는단백분해효소군으로서정상적인생리환경에서세포외기질의조절된분해를담당하는데그작용이조절되지않고, 과도하게표현되는경우에는세포외기질성분을광범위하게분해하여조직의손상을초래한다 76). MMP-9 은기저막에포함된 type IV collagen 등의파괴를촉진시켜세포외기질의파괴를동반하는여러질환과암세포의침윤및전이등에밀접히관련되어있다 77). MMPs 는최소한가지이상의세포외기질을분해하고, 아연이온을가지며, 킬레이트약제에의해억제되고, 비활 42 J Korean Med Rehab 2014;24(1):31-45

13 理中湯이골관절염유발생쥐에미치는영향 성전효소의형태로합성된후단백질용해에의해활성화되어야하며, TIMP에의해억제되는특징을가진다 78). LTB 4 는 prostaglandin 과마찬가지로 arachidonic acid 에서 5-lipoxygenase 에의해생합성된다. 감각과민을일으키는내인성화학물질로서항원을파괴하는염증반응으로인하여축적되는다핵중성구에대한화학주성인자라고알려져있으며 79), 염증성반응의중개자로작용하는많은물질중에서히스타민보다수백배정도로강력하게작용한다고한다 80). 본연구에서혈청내인자에미치는영향을알아보고자 prostaglandin E 2, TNF-α, IL-1β, IL-6, osteocalcin, TIMP-1, MMP-9, LTB 4 의생성량을측정한결과 prostaglandin E 2, IL-1β, osteocalcin, MMP-9 항목에서는 LJT 투여군에서대조군보다유의한감소를보였으며 (Fig. 5, 7, 9, 11), TNF-α, IL-6, TIMP-1, LTB 4 항목에서는 LJT 투여군이대조군에비하여감소하였으나유의하지는않았다 (Fig. 6, 8, 10, 12). 염증반응발생유무나활막세포의증식, 염증세포의조직침윤정도등의조직학적변화를파악하기위해무릎관절조직을 H&E로염색하여관찰하였으며, 연골조직의손상여부를확인하기위해 proteoglycan 층을 Safranin-O 로염색하여결과를확인하였다. H&E 염색에서관절주변에대식세포, 과립구세포, 단핵구세포의과다침투가일어난대조군에선관절조직의손실이일어났으나 LJT 투여군에서는관절주변에대조군에서관찰된연골과뼈의침하등이상대적으로감소하였다 (Fig. 13). Safranin-O 염색에서 MIA로연골의파괴가나타난대조군에서는빨간색염색조직이사라졌으며, LJT 투여군은빨간색염색조직이활막주변에많이분포하고있어대조군과비교하여연골의파괴정도가적었다 (Fig. 14). 연골파괴에미치는영향을알아보기위해 micro CT-arthrography를사용하여무릎관절의연골량을측정하였으며, 대조군에비해 LJT 투여군에서연골량파괴가억제되었다 (Fig. 15, 16). 이상의실험결과를종합하면理中湯은 MIA로유도된생쥐의골관절염모델에서혈청내염증매개인자인 prostaglandin E 2, IL-1β, osteocalcin, MMP-9 를유의하게감소시켰고, 관절의병리조직학적손실을억제하였다. 따라서理中湯은골관절염의염증유발인자및매개인자를억제함으로써연골손실에긍정적인효과를보이는것 으로사료되며, 향후임상적인활용이기대된다. 결론»»» 理中湯이골관절염유발생쥐에미치는영향을실험적으로규명하기위하여간 신장기능, 혈청내염증사이토카인생성량, 염증성매개인자의생성량, 연골량및활막조직의병리조직학적변화등을관찰한결과다음과같은결론을얻었다. 1. Hind paw weight bearing ability는증가하였으나유의하지는않았다. 2. 간과신장기능에는독성을나타내지않았다. 3. 혈청내염증매개인자인 prostaglandin E 2, IL-1β, osteocalcin, MMP-9 는유의하게감소하였고, TNF-α, IL-6, TIMP-1, LTB 4 는감소하였으나유의하지는않았다. 4. 조직의 H&E 염색결과염증소견이감소하였고, Safranin-O 염색결과활막주변연골의파괴정도도감소하였다. 5. 무릎관절의연골량을 micro CT-arthrography 를사용하여측정한결과, 연골량파괴가억제되었다. 참고문헌»»» 1. 한방재활의학과학회. 한방재활의학. 서울 : 군자출판사. 2011: Hogenmiller MS, Lozada CJ. An update on osteoarthritis therapeutics. Curr Opin Rheumatol. 2006;18: 김현아. 퇴행성관절염의임상연구. 대한류마티스학회지. 2000;7(3): 박동수, 정수현, 김순중, 서일복. 加減小續命湯이 Monosodium Iodoacetate 로유발된골관절염의초기변화에미치는영향. 한방재활의학과학회지. 2011;21(4): 한영규, 박영회, 금동호, 이명종. 加味蒼栢散이 Carrageenan 유발동물모델관절염의소염, 진통, 해열및면역에미치는영향. 한방재활의학과학회지. 2005;15(1): 최재영, 오민석. 甘草附子湯이 Papain 으로유도된골관절염에미치는실험적연구. 한방재활의학과학회지. 2012; 22(4): 윤상구, 박영회, 이명종. 牽牛子가관절염유발흰쥐의소염및해열작용에미치는영향. 한방재활의학과학회지. 2003;13(3): 조중현, 권오곤, 우창훈, 안희덕. Collagen 으로유발된마우스의관절염에대한薏苡仁湯추출물의억제효과. 한방 43

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