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지선 간
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1 과제구분기관고유수행시기전반기 연구과제및세부과제 천연물을이용한기능성소재탐색및개발발효미생물을이용한기능성분효율증진기술개발 색인용어 연구분야 농식품자원 수행기간 12~ 14 농식품자원 13 천연물, 발효, 미생물, 기능성 연구실 농업기술원환경농업연구과농업기술원환경농업연구과 책임자 원선이 소호섭 ABSTRACT This study was examined to evaluate the effects of perilla leaf, green tea, and Lagerstroemia speciosa extract fermeted with various microorganisms(bacillus subtilis, Aspergillus kawachii, Monascus ruber, M. purpures, M. pilosus) of lipolysis mediators in vivo and in vitro. Antiobese, hypolipidemic and antifatty liver effect of green tea powder postfermented by M. pilosus was slightly higher than that of nonfermented green tea. In conclusion, the constituents of perilla leaf fermented by M. purpures has been proven to not only inhibit obesity but also increse the cell viability in high fat mice cell. Key words : Natural substance, Fermentation, Microorganism, Functionality 1. 연구목표 발효는유기물을배당체에서비당체로전환할뿐만아니라항산화활성을갖는페놀성화합물을비롯한다양한생리활성물질의효능을증진하는역할을하고있어최근기능성소재연구분야에서발효와관련된연구가활발히이루어지고있다 ( 목포대 11). 홍국균 (Monascus ruber, M. anka, M. purpures, M. pilosus 등 ) 은고분자인탄수화물, 지방및단백질을저분자로전환하여새로운생리활성물질을형성하는발효미생물로서발효시생성되는 Monacolin K(mevinolin, lovastatin) 는콜레스테롤생합성을방해하는고지혈증치료제및면역증진용건강기능성식품으로등록되었다. 바나바 (Lagerstroemia speciosa Pers.) 의주요성분은 corosolic acid로식이섬유함량이높고지방산화를촉진하며혈당저하, 체지방감소및비만예방효과가있는것으로밝혀졌으며, 녹차 (Camellia sinensis L.) 추출물의체지방감소유효성분은 catechin이며, 깻잎 (Perilla fruescens Britton) 은 perillaldehyde으로지방분해및비만예방효과로 Ⅲ. 환경농업연구 533

2 기능성식품원료로인정되는등발효미생물에의한생리활성성분의이용흡수율향상을위한전처리기술개발이늘어나고있는실정이다 ( 식약청. 12). 따라서본실험에서는발효미생물에의한생리활성성분및지방분해활성을향상시키는기능성식품소재화기술을개발하고자본연구를실시하였다. 2. 재료및방법가. 발효미생물배양및증식 발효미생물인 Bacillus subtilis는농업유전자원센터에서, Aspergillus kawachii는한국미생물보존센터, Monascus ruber, M. purpures, M. pilosus는미생물자원센터 (KCTC) 에서분양받았다. B. subtilis 균주는 NB(Nutrient Broth) 배지에 37, A. kawachii는 MEB(Malt Extract Broth) 배지에 28, Monascus속균주는 PDB (Potato Dextrose Broth) 배지에 28 인큐베이터에서배양하였다. 액체배양은 500ml 삼각플라스크에 150rpm으로진탕한후 260nm에서흡광도를측정하여균수를조사하였다. 고체배양은액체배양배지에 agar를추가하고일회용샤레에각각 10개씩균사체 Φ0.5cm를접종한후배양기간별길이를측정하였다. 나. 식물분말시료조제및일반성분분석깻잎은도내유기농재배단지에서, 녹차잎은전남보성산, 바나바잎추출물은한국 Wellness banaba사에서구입하여시험재료로사용하였다. 일반성분은시료일정량을 500 회화로에회화시켜얻은회분에염산용액 (HCl:H 2 O=1:1) 으로 50ml가되게정량한후발광플라즈마분석기 (Optima 8300, Perkinelmer) 를사용하여무기성분을측정하였다다. 총폴리페놀함량분석동결건조한분쇄시료 0.5g을 70% EtOH 용매 15ml를넣고 30분간진탕후 10분간원심분리하여종이여과지 (No.2) 로 3회추출한다음최종부피를 50ml로정용한다. EtOH 추출물 100ul에 2% Na 2 CO 3 2ml를가하고 vortex한후 2분간방치한다. 50% Folin-Ciocalteau s phenol reagent 100ul를첨가하고 vortex하여 30분간방치한다음 750nm에서흡광도를측정한다. 표준물질로 tannic acid 0.5g/100ml을정용하고 10배희석한용액 (0, 50, 100, 200, 300, 500mg/L) 을 standard stock으로사용하였다. 시료중총폴리페놀함량계산식은다음과같다. 검량선 Y= ax + b (X : 분광법으로측정한흡광도, Y : 분광광도계로주입된표준용액의농도 (ppm, ug/ml)) 이며, 시료중총폴리페놀함량 (ug/g) = Y V/S (Y : 표준물질로구한검량선에대립하여얻은 Y값 (ppm), V : 추출용매 (70% EtOH) 의총부피 (ml), S : 추출시료의무게 (g)) 로계산하였다 년도시험연구보고서

3 라. 총플라보노이드함량분석동결건조한분쇄시료 0.5g을취해 70% EtOH 용매 15ml를넣고 30분간진탕후 10 분간원심분리하여종이여과지 (No.2) 로 3회추출한다음최종부피를 50ml로정용한다. 시험관에 Diethylene Glycol 2ml와시액 1ml를취해잘혼합한다. 혼합액에 1N NaOH 20ul를가하고다시잘혼합한다. 혼합액을 37 항온수조에서 1시간방치한후 420nm에서흡광도를측정하였고 standard calibration curve는 naringin의농도가 0~0.5mg% 범위가되도록제조한표준용액을사용하였으며. 계산식은총폴리페놀과같다. 마. 항산화활성분석항산화활성은 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hadrazyl) free radical 소거능으로분석하였다. EtOH 추출물 350μl에시료 75ul를처리한후 0.15mM DPPH in EtOH 용액 325μl를넣고섞는다. 반응물을호일로빛을차단하여 4 에서 30분동안반응한후 520nm에서흡광도를측정하고. blank는시료용매를사용하였다. 대조구로는 ascorbic acid를사용하여비교하였으며전자공여효과는시료첨가구와첨가하지않은경우의흡광도를백분율로나타내었다. Electron donating ability(%) = [1 (A/B)] 100 (A: Absorbance of sample, B: Absorbance of blank) 바. 동물세포배양및지방분해활성분석 American Type Culture Collection(ATCC, CL-173) 에서구입한전지방세포인 3T3-L1은 Dulbecco s modified Eagle s medium(dmem) 에 10% bovine calf serum과 1% 페니실린 / 스트렙토마이신을혼합한배지를사용하여 37, 5% CO 2 incubator에서세포가 80% 이상 confluence하게배양하였다. 2일후에 0.25% 트립신-EDTA를처리하여세포를분리하고원심분리기에서세포를모은후서스펜션용액을만들어 24-웰플레이트에배양하였다. 배양후 10% fetal bovine serum이첨가된 DMEM 배양액에 0.5mM IBMX, 1μM 덱사메타손, 5μg/ml 인슐린이첨가된분화배지와추출물 20, 40, 80ug/ml을처리하였다. Positive control로 resveratrol 20ug/ml을처리하였고 7일후에세포를 oil red O로염색하고 500nm에서흡광도를측정하여지방분해활성을측정하였다. 사. 세포독성분석식물추출물을 24시간처리한 3T3-L1 cell에 20ul(500ug/ml) MTT(tetrazolium salt) 시약을배지에넣어준다음 37, 5% CO 2 incubator에서 4시간배양하였다. Suction 및 washing후 200ul의 DMSO를첨가하여세포를용해한다음 37 CO 2 incubator에서 20분반응후 560nm에서흡광도를측정하여세포독성을계산하였다. Ⅲ. 환경농업연구 535

4 3. 결과및고찰 발효미생물에의한생리활성성분및지방분해활성을향상시키는기능성식품소재화기술을개발하고자발효미생물증식정도를조사한결과 B. subtilis는녹차 3일배양시 13.4x10 6 CFU/ml로가장많이증가하였으나배양기간이길수록감소하였다. A. kawachi는바나바 12일배양시 251.2mg, M. pilosus는바나바 3일배양시 264.2mg, M. purpures는바나바 9일배양에 324.0mg, M. ruber는깻잎 3일배양에 352.6mg으로많이증가하였다 ( 표 1). 따라서발효미생물은식물재료및액체배양기간에따라증식정도에차이가있음을알수있다. 표 1. 미생물종류별균체량 ( 단위 : mg) 미생물종류 식물재료 배양기간 3일 6일 9일 12일 B. subtillis 무첨가 깻잎 녹차 바나바 A. kawachii 무첨가 깻잎 녹차 바나바 M. pilosus 무첨가 깻잎 녹차 바나바 M. purpures 무첨가 깻잎 녹차 바나바 M. ruber 무첨가 깻잎 녹차 바나바 B. subtilis : x10 6 cfu/ml 고체배양시배양기간이길수록모든발효미생물이증가하였고, A. kawachi와 M. pilosus는바나바 13일배양에서무첨가보다균사생장이각각 0.3cm, 1.4cm 증가하였으나, M. purpures와 M. ruber는각각 1.0~1.8cm 감소하였다 ( 표 2) 년도시험연구보고서

5 표 2. 고체배양시발효미생물의균사생장량 ( 단위 : cm) 미생물종류 식물재료 배양기간 ( 일 ) A. kawachii 무첨가 깻잎 녹차 바나바 M. pilosus 무첨가 깻잎 녹차 바나바 M. purpures 무첨가 깻잎 녹차 바나바 M. ruber 무첨가 깻잎 녹차 바나바 표 3. 미생물첨가후일반성분변화 ( 배양 10 일차 ) 미생물종류식물재료 (g/kg) N P (g/kg) K Ca (g/kg) (g/kg) Mg (g/kg) Na Fe (g/kg) (mg/kg) Zn (mg/kg) Mn (mg/kg) Cu (mg/kg) B. subtillis 깻잎 녹차 바나바 A. kawachii 깻잎 녹차 바나바 M. pilosus 깻잎 녹차 바나바 M. purpures 깻잎 녹차 바나바 M. ruber 깻잎 녹차 바나바 Ⅲ. 환경농업연구 537

6 발효 10일후일반성분을분석한결과는표 3과같다. B. subtilis에서깻잎은 N 12.1g, 녹차는 Na 5.1g과 Cu 5.5g, 바나바는 Na 5.1g으로함량이높았고, A. kawachi는깻잎에서 P 7.2g, Ca 12.7g, Zn 36.3g, Mn 263.8mg으로높았으며, M. pilosus는깻잎이 K 36.3g으로높은함량이었고, M. purpures는깻잎이 P 7.2g, Mg 7.1g, 바나바는 Fe 177.7mg으로우수한함량을보였다 ( 표 3). 미생물종류및액체배양기간에따른총폴리페놀함량은깻잎이 5일까지는 B. subtilis가 6.3mg/ml, 10일에는 M. purpures가 5.9mg/ml으로높았고, 녹차는 5일배양시 A. kawachi가 11.5mg/ml로가장높았고, 바나바에 M. ruber 5일배양시 11.3mg/ml으로높았다 ( 표 4). 표 4. 총폴리페놀함량변화 (mg/ml) 미생물종류 깻잎녹차바나바 1일 5일 10일 1일 5일 10일 1일 5일 10일 무 첨 가 4.6 d 4.6 c 4.6 c 8.4 b 8.4 d 8.4 c 5.9 b 5.9 b 5.9 ab B. subtillis 6.0 a 6.3 a 5.1 b 8.9 b 8.5 d 8.0 c 5.6 bc 5.2 c 5.6 b A. kawachii 5.0 cd 5.0 bc 4.2 c 10.1 a 11.5 a 10.9 a 5.6 bc 4.4 c 3.7 c M. pilosus 5.3 bc 5.1 bc 4.5 c 8.5 b 10.9 b 10.3 a 5.3 c 5.8 b 5.9 ab M. purpures 5.4 bc 5.4 b 5.9 a 8.4 b 9.2 c 9.4 b 5.3 c 5.7 b 5.9 ab M. ruber 5.5 b 4.9 bc 4.4 c 5.3 c 5.5 e 10.6 a 8.8 a 11.3 a 6.2 a 총플라보노이드는깻잎에 B. subtilis를 10일배양한처리가 48.3mg/ml, 녹차에 M. ruber 5일배양한처리가 50.7mg/ml 높은함량을보였으며, 특히바나바에 M. purpures 10일배양한처리가 53.7mg/ml로가장우수한함량으로나타났다 ( 표 5). 표 5. 총플라보노이드함량변화 (mg/ml) 미생물종류 깻잎녹차바나바 1일 5일 10일 1일 5일 10일 1일 5일 10일 무첨가 19.7 c 19.7 cd 19.7 c 34.9 bc 34.9 c 34.9 c 32.1 bc 32.1 c 32.1 c B. subtillis 37.8 a 42.7 a 48.3 a 31.1 cd 29.9 e 28.7 d 28.8 c 28.4 d 28.7 d A. kawachii 18.2 cd 12.4 e 8.0 d 35.8 b 42.4 b 43.8 b 33.8 b 27.5 d 26.4 d M. pilosus 13.3 e 21.5 c 31.2 b 28.4 d 34.0 cd 46.8 ab 31.5 bc 35.1 b 37.2 b M. purpures 13.7 de 15.8 de 22.8 c 29.2 d 30.5 de 32.2 cd 48.9 a 51.8 a 53.7 a M. ruber 32.8 b 34.3 b 34.7 b 43.7 a 50.7 a 48.0 a 33.9 b 36.8 b 40.2 b 액체배양기간별항산화활성은깻잎과녹차에서 A. kawachi 5일배양한처리가각각 89.3% 와 93.0% 로높았고, 바나바에 A. kawachii, M. pilosus, M. purpures, M. ruber 1일배양한처리가무첨가 89.9% 보다다소높았다 ( 표 6) 년도시험연구보고서

7 표 6. 항산화활성변화 (%) 깻잎녹차바나바미생물종류 1일 5일 10일 1일 5일 10일 1일 5일 10일무첨가 79.7 e 79.7 c 79.7 b 90.8 d 90.8 d 90.8 b 89.9 c 89.9 b 89.9 a B. subtillis 81.9 d 58.5 f 35.3 e 91.2 bc 92.0 c 91.1 ab 90.2 b 89.8 b 89.9 a A. kawachii 87.7 b 89.3 a 88.1 a 91.9 a 93.0 a 91.3 a 90.4 ab 88.9 c 88.4 b M. pilosus 87.1 c 67.5 d 74.5 d 90.9 cd 92.5 b 90.7 b 90.6 a 90.5 a 89.7 a M. purpures 88.6 a 84.6 b 87.4 a 91.9 a 92.3 bc 91.1 ab 90.6 a 89.9 b 90.0 a M. ruber 86.7 c 66.2 e 76.7 c 91.4 b 92.4 bc 91.1 ab 90.8 a 90.4 a 90.2 a DPPH 라디칼소거능으로 BHA 측정치에대한상대값 발효미생물별동물세포의지방분해능을분석한결과는표 7과같다. M. pilosus 균주에녹차 80ug/ml 처리에서동물세포에대한지방분해능이 23.8% 이었고, M. purpures 균주에서깻잎 40ug/ml 처리가지방분해능 29.0% 로가장우수하였다. 표 7. 동물지방세포에대한지방분해능 (%) 처리내용 깻잎 (μg/ml) 녹차 (μg/ml) 바나바 (μg/ml) Resveratrol 무처리 B. subtillis A. kawachii M. pilosus M. purpures M. ruber 동물세포배양시 M. purpures 균주에바나바추출물 400ug/ml 처리에서 65.4% 의낮은생존율을보였으나녹차와깻잎은모든처리구에서세포독성이없었다 ( 표 8). 표 8. 추출물농도별세포독성검정 (%) 처리내용 깻잎 (μg/ml) 녹차 (μg/ml) 바나바 (μg/ml) 무처리 B. subtillis A. kawachii M. pilosus M. purpures M. ruber Ⅲ. 환경농업연구 539

8 따라서발효미생물에의한생리활성은 A. kawachi 균주에녹차를 5일동안배양할때총폴리페놀이 l1.5mg/ml으로가장높았고항산화활성도 93.0% 로가장우수하였다. 총플라보노이드는 M. purpures 균주에바나바 10일배양한처리가 53.7mg/ml로함량이가장높았으나 400ug/ml 처리시 65.4% 의낮은생존율로세포독성을보였다. 발효미생물별동물세포의지방분해능은 M. purpures 균주에서깻잎 40ug/ml 처리가세포독성이없고지방분해능 29.0% 로가장우수하였다. 4. 적요 발효미생물에의한생리활성성분및지방분해활성을향상시키는기능성식품소재화기술을개발하고자시험한결과는다음과같다. 가. 액체배양시 B. subtilis는녹차 3일배양시가장많이증가하였으나배양기간이길수록감소하는경향이었다. A. kawachi는바나바 12일, M. pilosus는바나바 3일, M. purpures는바나바 9일, M. ruber는깻잎 3일배양에서많이증가하였다. 나. 고체배양시배양기간이길수록모든발효미생물이증가하였고, A. kawachi와 M. pilosus는바나바 13일배양에서무첨가보다증가하였으나, M. purpures와 M. ruber는모든처리에서무첨가보다감소하는경향이었다. 다. 발효 10일후일반성분은 B. subtilis에서깻잎이 N, 녹차는 Na, Cu, 바나바는 Na가높았고, A. kawachi는깻잎에서 P, Ca, Zn, Mn이높았으며, M. pilosus는깻잎이 K가높았고, M. purpures는깻잎이 P, Mg, 바나바는 Fe가우수한함량을보였다. 라. 액체배양기간별총폴리페놀함량은녹차에 A. kawachi 5일배양에서높았고, 총플라보노이드는바나바에 M. purpures 10일배양한처리가높은함량을보였으며, 항산화활성은녹차에서 A. kawachi 5일배양한처리가가장우수하였다. 마. M. purpures 균주에서깻잎 40ug/ml 처리가지방분해능 29.0% 로가장우수하였다. 바. 동물세포배양시 M. purpures 균주에바나바추출물 400ug/ml 처리에서 65.4% 의낮은생존율을보였으나녹차와깻잎은모든처리구에서세포독성이없었다. 사. 따라서발효미생물에의한생리활성은 A. kawachi 균주에녹차를 5일배양한처리가총폴리페놀과항산화활성이, 총플라보노이드는 M. purpures 균주에바나바 10일배양한처리가가장우수하였다. 발효미생물별동물세포의지방분해능은 M. purpures 균주에서깻잎 40ug/ml 처리가 29.0% 로가장우수하였으며세포독성도없었다 년도시험연구보고서

9 5. 인용문헌 김신재 홍국을이용한혈액순환및고지혈증개선기능성식품개발. 보건복지부보건의료기술진흥사업연구보고서. 김상인, 김지은, 소재현, 이인구, 정신교, 이경복, 유영춘, 송경식 Aspergillus kawakii 유래조효소액처리에의한감초추추출물중 Liquiritigenin의함량변화. 생약학회지. 35(4): 윤동훈, 이문원 바나바발효추출물을유효성분으로함유하는항산화제조성물. 출원번호 임광현, 정주호, 김혜경, 김미자, 김종우, 오동재 페릴알데하이드를포함하는지방축적억제또는비만예방및치료용조성물고이를포함하는약학적제제및식품. 출원번호 전건욱 고추잎과씨메탄올추출물의항산화, 항암및항비만활성. 충북대학교대학원. 농학석사학위논문. 6. 연구원편성 세부과제구분소속직급성명수행업무참여년도 13 발효미생물을이용한책임자환경농업농업연구사소호섭세부과제 연구과총괄기능성분효율증진농업기술원농업연구사김대균분석조사 기술개발 김정한자료조사 공동연구자 농업연구관원선이방향설정 주영철연구자문 Ⅲ. 환경농업연구 541

Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No μ μ

Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,