<5B D DB8E9BFAABAB4B8AEBCBEC5CD2DB8BBB6F3B8AEBEC6B1E2BBFDC3E6B0FA5D20BCF6C0CEBCBA20B1E2BBFDC3E620BDC7C5C2C1B6BBE720B9D720B0CBC3E2BDC3B

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1 학술연구용역사업최종결과보고서 국문과제명 수인성기생충실태조사및검출시스템구축을위한연구 영문과제명 A study on survey on infection status and establishment of detection system of water-borne protozoan parasites 주관연구기관 : 연세대학교의과대학 질병관리본부 - 1 -

2 목 차 Ⅰ. 연구개발결과요약문... 1 ( 한글 )... 1 ( 영문 )... 2 Ⅱ. 학술연구용역사업연구결과... 3 제1장최종연구개발목표... 3 제2장최종연구개발내용및방법... 9 제3장최종연구개발결과 제4장연구결과고찰및결론 제5장연구성과 제6장참고문헌 제7장첨부서류

3 편집순서 4 : 요약문 최종결과보고서 요약문 과제명 중심단어 수인성기생충실태조사및검출시스템구축을위한연구 수인성기생충, 실태조사, 작은와포자충, 람블편모충, 이질아메바, 숙주세포, calpain 주관연구기관연세대학교의과대학주관연구책임자신명헌 연구기간 본연구에서는작은와포자충및람블편모충에대한기개발된특이항체의유용성을평가하기위해환경시료내작은와포자충과람블편모충의검출여부를조사하였으며, 검출항체로서의사용이가능한수준인지를평가하였다. 강원도내조사한지역들로부터강물및하천수 10 개샘플및토양 5 개샘플을수집하여 membrane filter 를이용하여농축한결과중홍천강에서만소수의작은와포자충난포낭이검출되었다. 그러나다른지역의강물과토양에서는전혀관찰되지않았다. 한편조사한같은지역에서얻은농축시료내에서람블편모충의낭자형은전혀검출되지않았다. 또한용역연구발주기관으로부터받은기개발된작은와포자충에대한항체를이용하여면역형광염색을실시한결과환경시료내에서발견된난포낭에양성반응을보이지않았다. 또한연구팀실험실이보유하고있는작은와포자충을사용하여기개발된항체로면역형광염색을실시한결과양성반응을보이지않았다. 그러나양성대조항체로사용한작은와포자충 IFA kit (Cellabs) 항체는본실험실에서보유중인작은와포자충에대해뚜렷한양성반응을보였다. 또한람블편모충에대한단일크론항체들을이용하여람블편모충에반응시킨결과양성반응을보였다. 한편이질아메바에의한조직내병인기전을알기위해아메바에의한숙주세포사멸과관련된특이신호물질과이와관련된특이기질단백질들을탐색하고작동기전을조사하여다음과같은결과를얻었다. 이질아메바와함께배양한 Caco2 세포에서현저한 DNA 의 fragmentation 이유도되었으나, Caco2 세포외막에 PS 의노출은약간증가되었다. 이질아메바의첨가는숙주세포내 calpain 의활성을유도하였다. 세포생존과밀접한관련있는 X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP), 그리고전사인자인 NF-kB 및 STAT (The signal transducer and activator of transcription) 단백질들이 calpain 의기질단백질인지를조사하였다. Caco2 세포와이질아메바를함께배양한군에서아메바를첨가하지않은대조군에비해 NFkB p65 와 p50, XIAP 모두현저하게분해가일어나는것을확인하였다. 그러나 NFkB 의활성을억제하는 IkB 는이질아메바자극에의해서전혀절단되지않았다. 또한 STAT 단백질들도이질아메바를 Caco2 세포에자극하였을때세포내 STAT1, 2, 3, 5, 6 단백질들이빠른시간안에단백분해되었다. 이러한이질아메바에의한숙주세포내생존관련단백질들의절단은 calpain 억제제로숙주세포를미리전처치하였을때효과적으로억제되었다. 한편, Caco2 세포에 pan-caspase 억제제또는 calpain 억제제로전처치한후아메바에의한세포사멸을조사한결과, calpain 억제제로전처리한군에서만현저히감소되었다. 또한이질아메바에의한비만세포주사멸에관여하는신호전달물질은 p38 MAPK 와 caspase-9 이부분적으로관여하고있음을확인하였다. 이상의결과를요약하면, 강원도내강물, 하천, 토양에서는작은와포자충과람블편모충의오염도가극히적어기개발된항체를강원도내에서얻은환경시료에적용하여오염률을조사하기에는적절치않는것으로생각된다. 또한이질아메바자극에의한숙주세포내 calpain 의활성은세포생존과전사에필요한중요한단백질들을절단함으로써숙주세포의사멸을가속화시켜조직염증반응을조절하는것으로생각된다

4 편집순서 5 : 요약문 ( 영문 ) S u m m a r y Title of Project Key Words A study on survey on infection status and establishment of detection system of water-borne protozoan parasites water-borne parasites, C. parvum, G. lamblia, E. histolytica, host cells, calpain Institute Yonsei University Project Leader Myeong Heon Shin Project Period This study was carried out to find out degree of contamination of C. parvum and G. lamblia in environmental samples including river, stream, and soil, and to test whether Ab to C. parvum and G. lamblia can be used for detection of the parasites. Samples were obtained from 15 spots of Gangwon-do, and very little number of C. parvum oocysts were found only in one area, Hongcheon river. In addition, there was no positive reaction in the oocysts incubated with FITC-conjugated mab to C. parvum. Moreover, even if we incubated oocystes from our lab with the Ab to C. parvum, we did not found any positive reaction. In contrast, there was strong positive reaction in C. parvum in our lab after staining with control primary Ab from commercial company. In addition, mab to G. lamblia showed reaction with G. lamblia. Next, we investigated intracellular signaling mechanisms involved in host cell death by E. histolytica, which can lead to understand amebic-induced pathogenesis in infected persons. We found that amoeba strongly induced DNA fragmentation in CaCo2 cells, but week responses were shown in surface expression of PS in host cells by amoeba. Morever, amoeba degraded intracellular survival factors such as NFkB, XIAP, and STATs, and amoeba-induced degradation of those proteins were inhibted by pretreatment of host cells with calpain inhibitor (calpeptin) prior to exposure to amoeba. However, ikb, which plays role in inhibition of NFkB activation, was not degraded in host cells by amoeba. Furthermore, degraded forms of STATs proteins including 1, 2, 3, 5, and 6 were nicely shown in host cells stimulated with amoeba, and the amoeba-triggered degradation of STATs were inhibited by calpeptin. In contrast, host cell death by amoeba was inhibited by pretreatment of host cells with calpain inhibitor, but not pan-caspase inhibitor, suggesting that calpain-dependent signaling is important for host cell death by amoeba. In addition, p38 MAPK and caspase-9 is partially involved in mast cell death by amoeba. In conclusion, we found that little or no contamination of C. parvum and G. lamblia in environmental samples from river, stream, and soil, which is suspicious are for parasite contaminations around cow-rearing houses. Therefore, it is suggested that previously developed mab to the parasites from the environment was not suitable to use as detecting Ab in Gagnwon-do. In addition, this study suggest that intracellular various proteins associated with cell survival and transcription can be acted as a substrate for calpain induced by amoeba, and that many other signalling molecules are operated to be a mediator leading to cell death in human mast cells. Further studies are needed to elucidate fully tissue inflammatory responses in host by infection with E. histolytica

5 편집순서 6 : 총괄연구과제의연구결과 학술연구용역사업연구결과 제 1 장최종연구개발목표 1.1 목표 - 본연구의목적은작은와포자충및람블편모충에대한기개발된특이항체의유용성을평가하기위해환경시료내작은와포자충과람블편모충의감염률을조사하고, 검출항체로서의사용가능성을분석한다. 또한이질아메바성대장염과연관된병인기전을알기위해아메바에의한숙주세포사멸과관련된특이신호물질과 calpain 의존성특이기질단백질들을탐색, 작동기전을정밀히조사하여수인성기생충실태조사및검출시스템구축을위한연구를위한기초적인활용자료를얻는데있다. < 연구배경, 목적및범위 > 와포자충증은 4군전염병, 람블편모충감염증은지정전염병 ( 질병관리본부 ) 으로분류되어있으며, 물을통해서전파될수있는대표적인수인성기생충성질병이다. 와포자충증의원인체는 Cryptosporidium parvum ( 작은와포자충 ) 이잘알려져있으며, 자연환경에서장기간생존가능하고, 상수도용소독제에서도상당한저항성을가지고있다 ( 이등, 2007). 따라서수돗물에서도검출이가능한원충류이다. 작은와포자충의숙주범위는매우광범위하며, 우리나라에도이미유행지가형성되어있는것으로알려져있다. 그러나사람과동물에서정확한감염율은임상증상이발현되지않아실제로알기어려운실정이며, 와포자충의진단은일반광학현미경적방법으로는특별히훈련된전문가가아니면거의불가능한일이기때문에보다간편하고정확한진단방법의개발이필요하다. 또한람블편모충은세계적으로분포하고더운지방에많으며주로어린아이들에게많이감염된다. 람블편모충의포낭은물에서 3개월이상생존할수있으며, 이질환은인수공통감염증으로설치류, 사슴, 소, 양, 말그리고애완동물을통해서감염이이루어질수있다. 소위선진국에서도감염률이높아미국에서가장흔하게관찰되는장내기생충이다. 열대지역의후진국에서는물론감염률이매우높다. 여행자설사의가장중요한원인으로알려져있고, 미국이나영국에서는상수도가포낭에의한오염으로발생함으로수인성전염병으로지정되어있다. 우리나라에서작은와포자충및람블편모충의유행지역은일부지역만파악되어있을뿐정확한발생빈도나유행지는구체적으로보고된바없다. 즉현재까지와포자충에대한연구는가축및실험동물에서의감염여부, 병원성, 교차감염실험등에관한것이고, 일부지역주민이나병원외래환자로부터감염상황만보고되어있을뿐역학조사가거의이루어지지않았다. 특히, 작은와포자충 - 3 -

6 의주요감염원으로서는소가가장큰역할을하고있는것으로밝혀졌으며, 축산농가의폐수로인해지역의강물이나토양을오염시키고있다. 그러나이렇게주요오염원이되는가축이나강물에대한조사는일부지역에서만이루어졌다. 축산농가에서는대부분이가축분변을그냥방치하거나하수도내지도랑등으로흘려보내상수원과강이오염되고있다. 따라서많은지역이오염되어있을것으로짐작할수있지만어느정도, 어느지역에분포하고있는지파악할수있는자료가부족한실정이며, 이는국민이와포자충및람블편모충의감염에대해거의무방비상태로노출되어있는것과마찬가지인것이라고볼수있다. 따라서와포자충과람블편모충의유행지역을파악하는것은감염예방, 전파경로의차단등공중보건학적측면에서매우의미있는일이될것이다. 특히작은와포자충은효과적인치료약이나예방약이개발되어있지않으며, 오로지개인의위생관리를철저히하고모든음식물이나물을끓여먹음으로써예방하는방법밖에는없기때문에역학조사는필수적이라할것이다. 더불어와포자충및람블편모충의진단을보다손쉽고효과적으로할수있는방법을개발하는것이무엇보다중요하다. 조직침범 (tissue-invasive) 기생원충인이질아메바는전세계적으로약 5천만명의사람이감염되어있으며, 해마다약 4만명이상이이로인해사망하고있다 (Stanley et al., 2001; Espinosa-Cantellano et al., 2000; Hughes et al., 2003). 이질아메바는생활주기 (life cycle) 에있어포낭형 (cyst) 과영양형 (trophozoite) 이관찰되며, 포낭으로오염된물과음식물의섭취로인해감염이성립된다. 또한여행자설사의대표적인원인원충이다. 따라서우리나라에있어법정지정수인성전염병원체로감염시인체의대장조직을괴사시켜심한설사와복통을동반하는대장염 (colitis) 과치사율이높은간농양 (liver abscess) 등을일으킬수있어매우중요한병원체이다 (Haque et al., 2003). 미국국립보건원에서도와포자충, 람블편모충과함께생물학적테러를유도할수있는매우위험한병원체로인식되어연구해야할관리병원체로인정되고있다. 장내로도입된포낭형의아메바는회장하부에서탈낭한후영양형으로변화되어대장상피세포층을파괴하면서장점막에침입하여이분열법으로분열증식한다 (Marshall et al., 1997). 원발성궤양의호발부위는대장으로회맹부, 충수돌기및상행결장이다. 대장에이행한후아메바의표면에발현되어있는특이 lectin [D-galactose/N-acetyl-D-galactosamine (Gal/GalNAc)-specific amoebic lectin] 을통해장상피세포에부착하게되면장상피세포의사멸이유도되는데이때세포사멸은자멸사 (apoptosis) 와괴사 (necrosis) 등의두가지혼합된세포사멸의형태를보인다 (Huston et al., 2004) ( 그림참조 )

7 이질아메바에의한세포사멸은일반적인세포사멸기전과는달리일어나는것으로이해하고있는데, 그증거로세포사멸억제단백질인 Bcl-2를과발현시켰을때자외선조사에의한세포사멸은억제되었지만이질아메바에의한세포사멸은전혀억제되지않았다 (Seydel et al., 1998). 또한이질아메바는 caspase-9 억제제로처리된 caspase-8 결손세포도쉽게죽일수있었다. 더욱이이질아메바는 Fas/Fas 리간드 (ligand) 나종양괴사인자 (tumor necrosis factor [TNF]) 수용체를통한세포사멸신호전달경로가결여되어있는마우스의간장세포도죽일수있었다 (Ragland et al., 1994). 이러한결과를종합해보면이질아메바에의한숙주세포의사멸은현재가지알려진고전적인세포사멸기전과는다른경로로세포의죽음이일어나는것으로추측된다. 이질아메바가숙주세포에접촉시세포내칼슘의농도가급격히비가역적으로증가되는것으로잘알려져있다 (Ravdin et al., 1988). 이러한세포내칼슘이온농도의급격한변화는세포죽음과직접적으로연관되어있다. 예를들면이질아메바에의한중국햄스터난소 (Chinese hamster ovary [CHO]) 세포의세포용해 (cytolysis) 가칼슘킬레이터 (chelators) 인 EDTA 와 EGTA를사용하였을때억제되었다고한다 (Ravdin et al., 1985). 더욱이 CHO 세포를지연성칼슘차단제인 verapamil로처리하였을때아메바에의한세포사멸이잘억제되었다 (Ravdin et al., 1985). 따 - 5 -

8 라서이질아메바에의한세포사멸과정에있어칼슘의존성시스테인단백분해효소인 calpain의활성이매우중요한역할을할수있음을추측할수있다 (Neumar et al., 2003). 또한이질아메바를 Jurkat T 세포에접촉시세포내단백질들의타이로신탈인산화 (tyrosine dephosphorylation) 가일어나며, 이때단백질타이로신인산가수분해효소 1B (protein tyrosine phosphatase 1B [PTP1B]) 의활성은 calpain의활성과직접적인관련이있다 (Frangioni et al., 1993). Calpain은거의모든포유류세포내에존재하고있는매우중요한단백분해효소이며 (Saido et al., 1994) 세포주기조절, 전사인자활성, 분화및사멸등에관여하고있다. Calpain은 μ-calpain과 m-calpain 2개의이형체 (isoforms) 로존재하며각각촉매작용 (catalytic) subunit (80-kDa) 와조절작용 (regulatory) subunit (28-kDa) 가결합된이질이량체 (heterodimer) 의형태로있다 (Perrin et al., 2002). 최근세포사멸과정에있어 calpain의활성과 caspase의활성간에는상호신호조절이있는것으로보고되고있다 (Nakagawa et al., 200). 예를들면 calpain은 caspase-3, -7, -8, -9, 및 -12의절단을유도하였다 (Carmody et al., 2000). 반대로 caspase는 calpain의세포내억제인자인 calpastatin을절단함으로써 calpain의활성을촉진하기도한다 (Wang et al., 1998). 그러나이질아메바에의한세포사멸시 calpain의해절단되는단백질들에대한연구와신호전달물질들의탐색에대한연구는아직까지부족한실정이다

9 1. 2 목표달성도 - 본연구과제에서원심부유법의검사결과홍천 ( 홍천강 ) 의시료에서만작은와포자충이검출되었으며, 나머지하천과토양에서는모두음성으로나타났다. 그러나기개발된기생충특이항체를이용하여작은와포자충을검출하기에는부적당한것으로판단된다. 강원도일부지역의역학조사결과강원도지역의환경은타지역에비해비교적깨끗하게유지되고있음을알았으며, 특별히작은와포자충에대한기개발된항체는실험실내에서보유하고있는작은와포자충에도반응하지않았던것으로미루어보아항체의유용성이떨어진다고판단된다. 또한람블편모충에대한기개발된단일크론항체들중일부는실험실내낭자형과영양형에양성반응을보였다. 따라서이들항체를이용하여환경시료내에서람블편모충을검출할수있을것으로생각되나, 환경시료에서얻은람블편모충에는적용치못하여정확한것은알수없었다. 이러한결과를토대로연구자가목표로삼은연구계획에따른연구진행은겅의 100% 가깝게달성하였다고생각한다. 또한이질아메바영양형자극에의한숙주세포사멸과관련된생존및전사단백질검색및작동기전을정확히규명하여 100% 에근접한수준으로연구목표를달성하였다고평가하였다. 대여기여도에있어서도발견한연구결과물을국외저명학술대회에서포스터로발표하여연구의성과를선전하였을뿐만아니라본연구를통해발견한이질아메바에의한새로운세포사멸의신호모델을국제적인수준의잡지에게재할수있어기여도가매우큰것으로평가된다. 최종적으로중요한수인성기생원충에대한유행지역및감염율에대한실태를파악함으로써기본적인역학정보를구축하는데, 그리고이질아메바의영양형과숙주간에상호작용하는 calpain 특이기질단백질들을검색함으로써이질아메바감염에대한조직병리기전을이해할수있는기초자료를제시하는데기여할것이다 국내 외기술개발현황 - 환경시료에서작은와포자충의감염율은서울시상수원수에서 29.2% (Lee 등, 2000), 낙동강중류수계에서 (Kim 등, 2006), 전남곡성에서 83.3%, 충북충주에서 9%(Yu 2004) 의양성반응이보고되어있다. 현재작은와포자충과람블편모충은장내기생원충류중에서비교적감염률이높은것으로알려져있지만실제환자나환축이얼마나존재하는지, 그리고자연환경하에서어느정도분포되어있는지는정확한자료가많지않은실정이다. 보통병원외래환자, 그리고지역주민을대상으로조사가이루어졌을뿐가축이나물에대한조사는매우부족한편이다. 또한, 그진단법역시전통적인대변검사에의존하고있기때문에숙달된전문가가아니면검사하기가매우어려워실제환자나환축의진단에는거의사용되지않으며, 다만연구목적으로사용되는것이일반적이다. 따라서앞으로는우리나라에서도광범위한역학조사와보다손쉬운진단방법이개발되어야할것이다. - 우리나라에있어서도대변검사를통한일반인을대상으로한전국적또는지역적인역학조사에서 1970년대에는 6.4% 의높은감염률을보였으나이후감소하여 1994년의조사에서는약 0.5-1% 수준의 - 7 -

10 감염률이관찰되었다. 그러나최근의역학적자료는거의없는실정이며특별히병원에내원한원인불명의설사증상을보이는환자중에서이질아메바감염률에대한정보는전혀없는실정이다. 특히감염된사람중약 10-20% 정도만현증증상을보이며상당수의감염자는무증상의보낭자 (cyst carrier) 로존재하다가숙주의면역상태가약화되게되면만성적인설사와간농양등의임상증상을보이므로감염자의적극적인검출이관리에매우중요하다. 또한 2007년최근발표된자료에의하면우리나라의후천성면역결핍증환자에게서치사율이높은이질아메바성간농양이보고되었다. 이러한연구결과는최근증가하고있는면역상태저하또는결핍환자와이질아메바감염과밀접한관련이있을수있음을잘보여준다. 그러나아메바성대장염과간농양과관련된질병의진행과정을체계적으로조사하는연구는부족한실정이다

11 제 2 장최종연구개발내용및방법 1 ) 연구개발내용 (1) 강원도에서얻은환경시료에서작은와포자충및람블편모충오염실태조사 (2) 기개발된특이작은와포자충및람블편모충에대한항체를이욯한환경오염실태조사를위한유용성검사 (3) 이질아메바에의한숙주세포사멸에있어세포내 calpain 의존성기질단백질탐색및신호전달물질조사 2 ) 연구방법 ( 1 ) 환경시료채취지역선정강원도일부지역중주거지역에근접해있고생활하수의유입이비교적손쉽다고생각되는하천 ( 춘천 -공지천, 춘천호, 원주-원주천 ) 3곳, 근처에축산농가가존재하여축산폐수의유입가능성이있는하천 ( 화천-화천강, 횡성-섬강천, 금계천, 홍천-홍천강, 인제-내린천, 양구-서천, 평창-평창강 ) 7곳을임의로선정하여각지역별하천수 20L 씩을채집하였다. 또한, 오염가능성이비교적높다고판단되는축사주변지역 5곳을선정하여토양 1Kg씩을채집하였다. 하천수를취수할때는될수있으면비가온다음날을선정하였지만비가내린날이적었고, 비의양또한매우적었다. ( 2 ) 하천수및토양 s a m p l e 농축각지점별로 20L를채수한하천수를 membrane filter(millipore, 1.0 um, White Plain 47mm) 를이용하여감압여과한후필터를 50ml원심관에넣어 filter paper내의잔존물이모두제거될때까지강하게 shaking 하였다. 모아진 filter paper내의잔존물은 1,050 g로 10분간원심분리하였다. 원심분리후상층액을제거하고남은농축물을분변검사및 IFA test에사용하였다. 각지점별로 1Kg씩채집한토양은물 5L를가지고 washing한후 serial mesh( 최종 pore size 30um) 를이용하여 filtering한후 500ml 원심분리병에서 1,050 g로 10분간원심분리하였다. 원심분리후상층액을제거하고남은농축물을분변검사및 IFA test에사용하였다. ( 3 ) 감압 여과에 사용된 f i l t e r p a p e r 하천수의 감압 여과 시 모든 하천수를 일정한 속도로 여과하기는 불가능하였다. 각 하천수의 수질 상태 에 따라 사용된 filter paper의 수는 아래와 같다. ( T a b l e 1 ) 각 지역별 하천수의 감압여과 시 사용 된 f i l t e r p a p e r 지역 춘천 화천 횡성 홍천 양구 인제 원주 평창 하천수 공지천 춘천호 화천강 섬강천 금계천 홍천강 서천 내린천 원주천 평창강 Filter paper 각 지역별 하천수의 상태는 취수한 날이 대부분 비가 내린 다음 날을 선택했기 때문에 비교적 오염물 이 많이 남아있었으며, 부유물이 잔존하고 있는 상태였다. 따라서 감압여과시 filter paper의 사용량이 많 이 늘어났다고 판단된다

12 ( 4 ) 강원도각지역별강물및하천수의취수지점각지역별취수지점을그림 1에표시하였다. 춘천의공지천과원주의원주천은인구밀집지역근처에위치하고있어생활하수가유입될수있는가능성이비교적크다고생각되는지점이며, 춘천의춘천호는유료낚시터부근에서취수하였다. 그리고타지역의강물및하천은인구밀집지역과는거리가멀었지만유속이빠르지않은지점을선택하였으며, 수질상태가비교적좋지않다고판단되는지점에서취수하였다. ( 5 ) S u c r o s e f l o t a t i o n 원심부유법 ( 설탕원심부유법 ) 위에서농축한하천수및토양에서의침전물을 50ml 원심분리관에넣은후 3회원심세척하였다. 원심분리후농축액에완전히용해시킨설탕용액 ( 설탕 600g, 물 500ml) 을첨가하여혼합한후 1,050 g로 15분간원심분리한후상층액을검경하였다. ( 6 ) 수인성원충류검출을위한대조시험 Membrane filter를이용하여감압여과를실행했을때검출율이어느정도인지를알아보기위하여수돗물 1L에 C. parvum 난포낭 100개와약 20um크기의 E. acevulina 난포낭 100개씩을인위적으로집어넣은후똑같은방법으로농축, 검사를실시하였다. 또한, 본실험실에서유지하고있는 C. parvum oocyst 를가지고검사발주기관에서제공한 1차항체의민감도를면역형광염색으로실시하였다. ( 7 ) 면역형광염색농축된하천수및토양에서의침전물슬라이드에지름약 2Cm 정도로도말한후충분히건조시킨후기개발된작은와포자충에대한항체 (COWP6-1, COWP6-2) 또는람블편모충에대한항체 (2G3, 3C6, 27E6, 26D8, 30B9)) 를적하하였다. 일차항체원액또는 4배수희석액을각 20ul 씩건조된슬라이드위에도말한다. 또한기개발된기생충특이항체들을본실험실에서보유또는배양하고있는기생원충이도포되어있는슬라이드에떨어뜨렸다. 37 에서 30분간방치하였다. 이때슬라이드가건조되지않도록습윤상자에담아반응시킨후슬라이드를 PBS로 3회세척한다. FITC-conjugated anti-rabbit IgG 또는 anti-mouse IgG를 1: 1000으로희석한후 20 ul 씩슬라이드위에도말하였다. 이때슬라이드가건조되지않도록습윤상자에담아반응시킨다. 이후슬라이드를 PBS로 3회세척하고, 빛에노출되지않는환경에서형광현미경 (Zeiss, Germany) 으로검경하였다

13 ( 8 ) 이질아메바의무균배양 이질아메바 Entameba histolytica HMI:IMSS 주를 TYI-S-33 배지 (Diamond et al,. 1978) 에서무균배 양하여실험을수행하였다. ( 9 ) 인체장상피세포주및비만세포주의무균배양인체장상피세포주인 Caco2 세포주를 MEM 배지 (10% Fetal bovine serum, 25 mm HEPES, 25 mm NaHCO3, Gentamycin sulfate 50 mg/l) 에서무균배양하였다. 비만세포 [Human mast cell (HMC-1)] 의배양은 IMC-1 세포를 Iscove s Modified Dulbecco s Medium (IMDM) 에 10% FBS와 sodium bicarbonate, penicillin, streptomycin을넣어 37, 5% CO 2 incubator에넣고배양한것을사용하였다. ( 1 0 ) D N A f r a g m e n t a t i o n 이질아메바에의한장상피세포내 DNA의단편형성을측정하기위해장상피세포 (4 106/group) 와이질아메바 (4 105/group) 를 1시간동안 37 에서배양한후모았다. 모은시료를 PBS로한번세척하고 lysis buffer (1% NP-40 in 20 mm EDTA, 50 mm Tris-HCl, ph 7.5) 를사용하여두번 lysis 한후 1600g에서 5분동안 centrifugation하였다. 이후상층액을새로운 tube에옮겨 RNAse와 1% SDS를넣고 56 에 2시간동안반응시켰다. 반응후 proteinase K를넣고 37 에서 2시간반응시켰다. DNA를 EtOH를이용해침전시킨후 1% agarose 젤에전기영동하여 DNA의단편형성을확인하였다. ( 1 1 ) 장상피세포의 a p o p t o s i s 분석을위한 A n n e xi n - V 양성세포수조사장상피세포의 apoptosis를분석하기위해 apoptosis의초기과정에일어나는 phosphatidykserine (PS) 의 externalization을측정하였다. 이때 annexin V 는바깥쪽으로이동된 PS와단단히결합하게된다. Caco2 세포 (2 105/well) 와이질아메바를 1:10과 1:5의비율로 12-well tissue culture plate에서 1시간동안 37, CO2 배양기에서배양한후이질아메바를차가운 PBS를이용해두번세척하여걷어내고 trypsin-edta를이용해 plate에붙은장상피세포를떼어냈다. 떼어낸세포를 wash buffer (0.1% sodium azide 와 1% FBS을포함하는 phosphate-buffered saline [PBS]) 를이용해세척후 FITC-labeled annexin-v (2 μl ) 가함유되어있는부착용액 (binding buffer [10 mm Hepes, 140 mm NaCl, 2.5 mm CaCl2, ph 7.4]) 400 μl를첨가하여 15분간상온에서염색한후 flow cytometer를이용하여 annexin V 에염색된세포수를조사하였다. 또한비만세포를이질아메바와 5:1의비율로섞어 37, 5% CO 2 배양기에서 48 well plate에배양시킨다음, 세척후세포자멸사초기단계인 PS의세포막바깥으로의노출을측정하기위하여 FITC-conjugated annexin V를첨가하여염색한후 PI 염색을하여유세포분석기 (flowcytometer) 를통해 annexin V와 PI의형광강도를측정하였다

14 ( 1 2 ) W e s t e r n b l o t Caco2 세포 (1 106/group) 와이질아메바를 1:10, 1:20, 1:50의비율로첨가하고시간별로배양하였다. 정해진시간동안살아있는아메바와함께배양한장상피세포를원심분리기를이용하여모은후차가운 PBS를넣어세척하였다. 세척후차가운 lysis buffer (60 mm β-glycerophosphate, 10 mm EDTA, 10 mm MgCl, 10 mm NaF, 2 mm DTT, 1 mm NaVO, 1 mm APMSF, 1% NP-40, 5 μg/ml leupeptin) 에 lysis한후 30분동안차가운얼음에박아두었다. 30분이지난후 sample을 sample buffer와혼합한뒤 100 에서 5분동안열처리하고 10% 와 15% Tris-glycin SDS-PAGE상에서전기영동하였다. 전기영동후 gel을 PVDF 막으로옮긴후 5% 탈지분유 (non-fat dry milk) 를함유하고있는Tris-buffered saline (TBS [0.1% Tween-20]) 에넣고상온에서 1시간동안반응시켰다. 반응이끝나고TBST로한번세척한후측정하고자하는물질에대한일차항체 (m-calpain, calpain small subunit, caspase-3, b-actin, NF-kB p65, NFkB p50, XIAP, STAT1,2,3,5,6, IkB-a를각각반응시켰다. 반응시킨막을 TBST로세번세척후이차항체를반응시킨뒤 chemiluminesence reagent (LumiGLo) 를사용하여항원-항체반응을확인하였다. 또한 50만개의비만세포를이질아메바와 5:1의비율로배양시킨후 lysis buffer로처리한후, 원심분리를통해상청액을모아 loading buffer와혼합후 100 에서 5분간열처리하여 SDS-PAGE를시행하였다. 전기영동후 PVDF membrane에옮긴다음 caspase-9, phospho-p38 등의항체로반응시켰다. 이차항체로다시반응시킨후 detection 시약을이용하여활성화되었는지를확인하였다. ( 1 3 ) 장상피세포또는비만세포에다양한억제제전처치숙주세포를 30분동안 37 에서 caspase 억제제인, calpain 억제제인 calpeptin을 15분동안전처치하였다. 억제제로전처치한세포는이질아메바와반응전 PBS로한번세척하였다. 억제제로전처치한장상피세포를실험에이용하였다. 또한비만세포를 37 에서 60분동안 caspase-9 억제제, DPI, MEK 억제제, p38 MAPK 억제제, PI 3-kinase 억제제등으로전처치후이질아메바와배양한후, 비만세포의세포사를유세포분석기를통해분석하였고 Western blot을통해각종신호전달물질이활성화가되었는지를측정하였다. ( 1 4 ) 통계처리 Student's t-test 를이용하여대조군과의 P 값이 0.05 이하이면유의한차이가있는것으로간주하였다

15 제 3 장최종연구개발결과 ( 1 ) 환경시료에서의역학조사결과각지역별환경시료의채집및결과는 Table 2와같다. 이중춘천과원주지역은하천이인구가밀집해있는지역과매우가까운거리에있으며, 주변에음식점및상가가위치하고있어생활하수가유입되기쉬운환경에있는것으로판단되는곳에서채수하였다. 화천, 횡성, 홍천, 양구, 인제, 평창지역의하천은주변에축산농가가위치하고있으며, 특히비가온후에비교적냄새가많이발생한다는지역에서중점적으로채수하였다. 토양시료의선정은주변에축사가인접해있는지역을임의로선정하였다. ( T a b l e 2 ) 각 지역별 환경시료 채집 현황 및 검출결과 지역 춘천 화천 횡성 홍천 양구 인제 원주 평창 하천수 공지천 춘천호 화천강 섬강천 금계천 홍천강 서천 내린천 원주천 평창강 * 토양 * C. parvum 강물및하천수에서수인성원충류의검사결과각지역별강물및하천수 20L 씩을 membrane filter를이용하여여과농축하였다. 여과농축한농축물은 filter paper가가장많이사용되었던홍천강의 sample에서도 5ml을넘지않았으며, 이농축물을설탕원심부유법에사용하였다. 이농축물에서 Sheather's Soln. 원심부유법을실시한결과홍천의홍천강에서만작은와포자충이발견되었을뿐그외지역에서는모두검출되지않았다. 또한, 작은와포자충의숫자가너무적어계수에는적절하지않았다. 람블편모충은채집한모든환경시료에서음성결과를나타내었다. A B F i g. 2. 설탕원심부유법으로검출된작은와포자충. A: 홍천강에서발견된작은와포자충 B: 실험실에서보유하고있던작은와포자충 ( 1,080)

16 - 14 -

17 F i g. 3. 공지천 F i g. 4. 홍천강 토양에서수인성원충류검사결과축산농가가인접해있는지역에서토양을무작위로 1Kg 씩채집하여검사하였다. 그러나채집한모든토양에서어떤종류의원충류도발견되지않았다. 특히, 토양을채집한지역의축사에서채집한한우와젖소의분변에서도수인성원충류인작은와포자충및람블편모충이발견되지않았다. 이연구에서축산농가가키우고있는한우 20마리와젖소 10마리에서검사를실시했는데, 여러종류의 Eimeria spp (E. bovis, E. zuernii, E. aubernensis, E. bukidonensis, E. subspherica) 와 3종류의선충류 (C. bovis, S. papillosus, T discolar), 베네덴조충은발견되었으나, 와포자충류는전혀검출되지않았다. ( 2 ) 기개발된기생충특이항체를이용한면역형광대조시험결과 작은와포자충난포낭검출을위한시험 membrane filter를이용하여환경시료를감압여과하였을때검출률을알아보고자수돗물 1L에 C. parvum 난포낭 100개와약 20 um크기의 E. acevulina 난포낭 100개씩을인위적으로집어넣은후똑같은방법으로농축, 검사를실시하였다. 그결과 C. parvum은 14.1±2.66 (14%), E. acevulina 71.7±5.33 (71%) 개의난포낭이검출되어 C. parvum은검출률이매우낮다고판단되며, 특히환경시료 ( 강물및하천수 ) 의취수량을생각해볼때검출율은 1% 미만이라고생각된다. 한편, E. acevulina의검출률이 70% 가넘은것과비교해보면원충체의크기에따라서검출률에많은차이가있을것으로판단된다. 기개발된항체의면역형광염색검사사용유용성을알기위한대조시험연구실에서보유하고있는 C. parvum oocyst 에검사발주기관으로부터제공된 2 종류의 1차항체 (COWP 6-1, COWP 6-2) 를가지고면역형광염색을실시했으나모두음성반응을나타내었다. 특히제공된 1차항체원액으로도 IFA를실시했지만모두음성반응을나타내었다. 따라서본실험에제공된 1차항체를가지고작은와포자충을검출하기에는적절하지않다고판단된다. Fig. 5는 IFA kit (Cellabs) 의 Positive control slide의형광염색소견으로람블편모충과작은와포자충이잘나타나보인다. Fig. 6은본실험실에서보유중인작은와포자충을 IFA kit (Cellabs) 내양성항체를이용하여형광염색한소견이며강한양성반응을잘나타내고있다. 그러나 Fig. 7에서보이는것처럼, 본실험실에서보유중인와포자충을이용하여발주기관에서제공한항체를가지고형광염색을실시한결과특이한양성반응이관찰되지않았다

18 실험실내에서얻은람블편모충낭자형과영양형을모은후, trypan blue 로염색하여 counting한다. 람블편모충 10 4 개를유리슬아이드에올려놓고, 건조한뒤, 미리 -20 에서차갑게유지된 methanol로 10 분간 -20 에서반응시켜충체를고정시켰다. 고정된충체를 0.5% triton X-100으로상온에서 10분간반응시켰다. 2. 5% goat serum, 3% BSA in PBS 로 37도에서 1시간 blocking 시킨다. 1차항체인 CCC2G4, CCC4C6, CCC26D8, CCC27E6,CCC30B9를 (1X, 4X, 10X, 또는 25X 희석하여반응시킴 ) 반응시킨후 4 C에서 overnight 한후 PBS 완충액으로 3분-5분간격으로 2번세척한후, 2차항체인 anti-mouse IgG-FITC-conjugated (green) 혹은 anti-mouse IgGi-Rhodamine conjugated (red) 로실온에서 2시간반응시켰다. 1X PBS 로 2번세척한후, DAPI (1:500)(trophozoite만) 로 10분간실온에서반응시켜핵을염색한뒤세척한후, Vectashield mounting medium으로 mounting 하여형광현미경으로관찰하였다

19 F i g. 5. IFA Kit (Cellabs), 작은와포자충및람블편모충형과염색사진양성대조슬라이드 ( 200) F i g. 6. 본실험실에서작은와포자충을가지고하여작은와포자충을 IFA kit (Cellabs) 내항체를이용한면역형광염색 ( 200) F i g. 7. 본실험실에서보유중인작은와포자충을발주기관에서제공한 1차항체를이용한면역형광염색 (x200)

20 또한연구기관에서보유하고있는발주기관으로부터제공된 5 종류의람블편모충에대한단일크론항체를가지고면역형광염색을실시한결과람블편모충낭자형에양성반응을보였다 ( 그림 8 및표 3). F i g. 8. 람블편모충낭자형에대한단일크론항체 ( 2 G 4, 4 C 6, 2 7 E 6, 2 6 D 8, 3 0 B 9 ) 의면역형광염색사진 Table 3. 람블편모충낭자형에대한단일크론항체 ( 2 G 4, 4 C 6, 2 7 E 6, 2 6 D 8, 3 0 B 9 ) 의면역형광강도

21 5개의단일크론항체모두영양형에잘반응하는것을확인하였다 (Fig. 9). 그러나 4배수희석된항체를가지고실험한결과, 2G4 및 4C6 항체만이양성반응을보여주었다. F i g. 9. 람블편모충영양형에대한단일크론항체 ( 2 G 4, 4 C 6, 2 7 E 6, 2 6 D 8, 3 0 B 9 ) 의면역형광염색사진

22 ( 3 ) 이질아메바에의한 C a c o 2 세포사멸 Caco2 세포를이질아메바와배양하였을때유도되는세포사멸현상에대하여알아보았다. Caco2 세포를이질아메바와함께배양한후 DNA fragmentation이유도되는지알아보았을때, 대조군에비해이질아메바와함께배양한 Caco2 세포에서현저한 DNA의 fragmentation이유도되었다 (Fig. 1A). 또한이질아메바와 Caco2 세포를배양한후, 세포외막에 phosphatidylserine (PS) 의노출을 annexin-v 염색을통해확인하였다. 이질아메바를첨가한후 Annexin-V 양성세포율이이질아메바를첨가하지않은대조군과비교할때증가하였다 (Fig. 1B)

23 ( 4 ) 이질아메바에의한 C a c o 2 세포내 C a d e p e n d e n t c ys t e i n p r o t e a s e c a l p a i n 과 c a s p a s e 의활성이질아메바는세포사멸을유도할때세포내칼슘이온의농도를증가시키다. 따라서이질아메바를 Caco2 세포에첨가한후 Ca2+-dependent cystein protease calpain의활성을알아보았다. 이질아메바를첨가한후 1분에서부터 m-calpain과 calpain small subunit이활성화되는것을확인하였다. 다음으로 western blot을이용하여 caspase-3의활성을분석하였다. 이질아메바를첨가후 Caco2 세포내의 caspase-3이배양시간및첨가한아메바의수에비례하여잘라진것을볼수있으며이러한결과들은반응초기인 1분내에서도관찰할수있었다. 특히이질아메바의첨가에의해 Caco2 세포내 caspase-3 이절단되어활성형 19 kda과 17 kda이잘관찰되었다

24 ( 5 ) 이질아메바에의한 C a c o 2 세포내 N F k B 와 X I A P 의분해 NFkB는 transcription factor로서 cell survival과세포사멸은물론면역과염증반응에관여하는유전자들을조절한다. 또한 X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) 와같은 anti-apoptotic gene의발현을유도하여 cell survival을조절한다. 따라서 Fig. 3A 에서는이질아메바가 transcription factor인 NFkB와 anti-apoptotic gene XIAP의 degradation을유도하는지알아보았다. Caco2 세포와이질아메바를함께배양한군에서이질아메바를첨가하지않은대조군에비해 NFkB p65와 p50, XIAP 모두현저하게분해가일어나는것을확인하였다. 다음으로 cytoplasm에서 NFkB와결합하여 NFkB를비활성형태로유지하는 IkB-a의변화를알아보았다. 이질아메바를첨가한군과첨가하지않은대조군모두이질아메바의자극에의해서 IkB-a에어떠한영향도주지않았다 (Fig. 3B)

25 ( 6 ) 이질아메바에의한 C a c o 2 세포내 S T A T s 의분해 STAT (The signal transducer and activator of transcription) 단백질들은세포의증식과사멸, 분화와같은생물학적기능을매개하는 transcription factor이다. Fig. 4에서는이질아메바가 STAT들의분해를유도하는지알아보았다. 이질아메바와 Caco2 세포를함께배양하였을때 Caco2 세포내 STAT1, 2, 3, 5, 6은빠른시간안에분해되었다

26 ( 7 ) 이질아메바에의해유도된 C a c o 2 세포에서의 N F k B 와 X I A P, S T A T s 의분해에 c a l p a i n 억제제가미치는영향이질아메바에의해유도된 Caco2 세포의 NFkB와 XIAP의분해에 calpain 활성이필요한지를확인하기위해 Caco2 세포를이질아메바첨가전 calpain 억제제로전처치하였다. Calpeptin을 Caco2 세포에전처치하였을때이질아메바에의해유도되었던 NFkB와 XIAP의분해가대조군과비교하였을때효과적으로억제되었다. 특히 calpeptin 1 mm에서억제효과가가장극적으로보였다 (Fig. 5A). 또한 STATs 의경우에도 Caco2 세포에 calpeptin을전처치하였을때이질아메바에의해유도되었던 STATs분해가억제되는것을확인하였다 (Fig. 5B)

27 ( 8 ) 이질아메바에의해유도된 C a c o 2 세포에서의 D N A f r a g m e n t a t i o n 에 p a n - c a s p a s e 억제제와 c a l p a i n 억제제가미치는영향이질아메바에의해유도된 Caco2 세포의 DNA fragmentation에 calpain과 caspase 활성이필요한지를확인하기위해 Caco2 세포를이질아메바첨가전 pan-caspase 억제제또는 calpain 억제제로전처치하였다. 먼저 calpain 억제제인 calpeptin을 Caco2 세포에전처치했을때에는아메바에의해유도된 DNA fragmentation이현저히감소된것을볼수있었지만 (Fig. 6A), Pan-caspase 억제제를처리하였을때에는전혀억제되지않았다 (Fig. 6B)

28 ( 9 ) 이질아메바에의한비만세포주사멸에관여하는신호전달물질 HMC-1세포를이질아메바없이배지에만배양시켰을경우 6시간경과시 Annexin V (+) 세포 5.5%, PI (+) 세포 8.1% 인데비해이질아메바와함께배양시켰을경우 2시간, 4시간, 6시간경과시시간에비례하여 Annexin V (+) 세포의경우각각 10.7%, 35.4%, 45.9% 로증가하였으며, PI (+) 세포의경우각각 15.7%, 55.5%, 62.6% 로증가하였고이는이질아메바가 HMC-1과 2시간이상배양시 HMC-1의세포사를급속히진행시킴을보여주고있다 (Fig. 7). HMC-1을이질아메바와 1시간동안배양후 p38 MAPK의인산화정도를살펴보면이질아메바의비율을늘릴수록 HMC-1세포의 p38의인산화가더욱진행되었다 (Fig. 8). 이질아메바경우 HMC-1세포의 caspase-9을활성화시켰고이질아메바의비율을늘릴수록 caspase-9이더욱활성화되었다 (Fig. 9). Control vehicle로사용한 1%DMSO와 p38 MAPK 억제제인 10 μm SB202190, caspase-9 억제제인 50 μm AC-LEHD-CMK, NADPH oxidase 억제제인 10 μm DPI, 100 μm PD98059로각각 HMC-1세포를 1시간전처치한후이질아메바와 6시간배양시 HMC-1의 Annexin V (+) 세포는각각 51.3%, 40.1%, 44.0%, 53.3%, 48.4% 를나타내었고 PI (+) 세포경우각각 64.4%, 54.2%, 55.2%, 65.4%, 62.1% 를나타내어 SB202190과 AC-LEHD-CMK로전처치한그룹에서만이질아메바에의한 HMC-1의세포사를부분적으로감소시킨것을관찰할수있었다 (Fig. 10). F i g. 8. 이질아메바에의해유도되는 HMC-1 의세포사

29 F i g. 9. 이질아메바에의한 HMC-1 세포의 p38 MAPK 인산화유도 F i g. 9. 이질아메바에의한 HMC-1 세포의 caspase-9 활성화유도 F i g 이질아메바에의해유도되는 HMC-1 세포사에있어여러억제제의효과

30 제 4 장연구결과고찰및결론 강원도내일부지역의하천및강물과토양에서수인성원충류인작은와포자충과람블편모충에대한역학조사를실시하였다. 조사결과홍천강에서만작은와포자충이검출된반면다른지역의강물과토양에서는전혀관찰되지않았다. 또한, 람블편모충은모두관찰되지않았다. 낙동강이나서울시상수원수등에서검사한결과 20% 이상의양성결과를보고한결과가있지만본조사에서는홍천강에서만극히적은수의작은와포자충난포낭을관찰하였을뿐다른어느지역에서도검출되지않았다. 또한검출된작은와포자충의수역시극히적어서계수는거의불가능한상태였다. 한편, 또한기개발된작은와포자충에대한단일크론항체를이용하여기생충체에면역형광염색 (IFA) 검사를실시한결과음성반응을나타내었다. 기개발된항체의검출항체로서사용가능성을확인하기위해본실험실에서보유중인작은와포자충을가지고면역형광염색을실시한결과역시음성반응을보였다. 그러나시판중인대조군의작은와포자충에대한항체 [(IFA kit (Cellabs)] 를이용하여형광염색을실시해보면뚜렷한발색반응을나타낸다. 이러한결과로미루어보아발주기관으로부터제공받은기개발된작은와포자충에대한항체는검출항체로서의사용이적절치못한것으로판단된다. 그러나실험실에서키우고있는람플편모충에기개발된람블편모충에대한단일크론항체를이용하여 면역형광염색을실시한결과 5 개의항체모두가낭자형과영양형에양성반을을이끌어냈다. 그러나희 석한항체를이용하였을때는양성반응의정도가감소되는경향을보여주였다. 따라서기생원충에대한특이항체를이용하여환경내오염실태를역학조사하는것은어려움이있을것으로판단된다. 환경시료에서발견되는적은수의원충의수, 환경에서얻은충체는실험실내에서보유하거나배양하고있는전형적인난포낭또는낭자형과는달리손상된형태일가능성이높아기생충특이항체의유용성이매우낮을것이라고생각한다. 특별히이실험에서사용된람블편모충의낭자형은실험실내에서얻은것이어서, 실제로환경에서발견되는낭자형에기개발된단일크론항체들이어떠한반응을보일수있는지에대해서는정확히알수없다고생각한다. - 한편, 본연구에서얻은아메바에의한숙주세포사멸과관련된특이신호물질과이와관련된특이기질단백질들을탐색하고작동기전에관한것은국내외를포함하여처음으로발견한현상이다. 특히이질아메바에의한세포죽음에있어세포생존과밀접한관련있는 X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP), 그리고전사인자인 NF-kB 및 STAT (The signal transducer and activator of transcription) 단백질들이 calpain의기질단백질임을처음으로발견한것이매우우수하다고생각한다. 또한이질아메바에의한세포내 calpain의활성은 NF-KB 활성억제단백질인 IkB의절단이유도되지않았는데, 이러한점이이질아메바에의한세포사멸이정교한과정에의해조절되고있음을알수있다. 또한숙주세

31 포의종류에따라아메바에의한세포사멸신호전달물질및신호기전이달라질수있음을비만세포를 이용한실험을통해알수있었다. 이러한연구결과를통해이질아메바와관련된병인기전을더자세 히분석할필요가있다고생각한다

32 제 5 장 연구성과 5. 1 활용성과 과제명수인성기생충실태조사및검출시스템구축을위한연구 과제책임자 신명헌 / 연세의대 / 기생충학 가. 연구논문 번호 논문제목 저자명 저널명 집 ( 권 ) 페이지 Impact factor 1 2 국내 / 국외 SCI여부 나. 학술발표 번호발표제목발표형태발표자학회명연월일발표지 1 2 Calpain-dependent degradation of transcription factors and Xlinked inhibitor of apoptosis (XIAP) in colon epithelial cells during cell death induced by Entamoeba histolytica 포스터 신명헌 Annual Meeting of the American -12 Association 미국, 시애틀 of Im m unologists 국내 / 국제 국제 다. 지적재산권 번호출원등록 / 1 2 특허명출원 ( 등록 ) 인출원 ( 등록 ) 국출원 ( 등록 ) 번호 IPC 분류 라. 정책활용 기타관련정책에활용예를구체적으로기술함. 마. 타연구 / 차기연구에활용 타연구및차기연구에활용된예를구체적으로기술함. 바. 언론홍보및대국민교육

33 언론홍보및대국민교육내용, 일자등을간략히기술함. 사. 기타 임상시험, 관련 DB 구축, 워크샾또는심포지움개최등의경우구체적으로기술함 활용계획 수인성으로매개되는원충성질병에대한오염지역을파악할수있으며, 이로인하여와포자충, 람블편모충, 이질아메바감염에대한지속적인관리및예방에활용될수있을것이다. 숙주-기생충상호관계를보다더정확히이해함으로써기생생물체에대한새로운진단방법을개발할수있어경제적. 산업적측면에서유용하게사용될수있을것이다. 숙주-기생충간의상호관계의특이한조절기전을연구하는연구인력을육성할수있으며, 또한오랜시간동안숙주에잘적응되어진기생생물체와숙주와의상호관계성의새로운비밀을밝힘으로써국제적으로저명한학술지에게재할것이다

34 제 6 장 참고문헌 Chai JY, Lee SH, Guk SM, Lee SH. An epidemiological survey of Cryptosporidium parvum infection in randomly selected inhabitants of Seoul and Chollanam-do. Korean J Parasitol 34(2): , Fayer R Effect of sodium hypochlorite exposure on infectivity of Cryptosporidium parvum oocysts for neonatal BALB/c mice. App Env Microbiol 61: Kang YK, Lee HK, Kim SW, Chi JG. Cryptosporidiosis in a leukemia child with severe diarrhea. Seoul J Med 36(1):29-34, Lisle JT, Rose JB. Cryptosporidium contamination of water in the USA and UK: a mini-review. J Water SRT-Aua 44: , 1995 MacKenzie W, Hoxie N, Proctor M, Gradus M, Blair K, Peterson D, Kazmierczak J, Addiss D, Fox K, Rose J, Davis J. A massive outbreak in Milwaukee of Cryptosporidium infection trasmitted through the public water supply. New Eng J Med 331: , 1994 Marshall MM, Naumovitz D, Ortega Y, Sterling CR. Waterborne protozoan pathogens. Clin Microbiol Rev 10(1):67-85, 1997 Nime FA, Burek JD, Page DL, et al. Acute enterocolitis in human being infected with the protozoan Cryptosporidium. Gastroenterology 70: , 1976 O'donoghue PJ. Cryptosporidium and cryptosporidiosis in man and animals. International J Parasitol. 25(2): , 1995 USDA. Cryptosporidium is common in dairy calves. Fort Collins, CO: National Dairy Helfer Evaluation Project, National Animal Health Monitoring System, Yu JR, Seo M, Huh S. An epidemiological survey on Cryptosporidium parvum infection of inhabitants in Chorwon-gun, Kangwon-do. Submitted at Korean J Parasitol 39(2), 2001 김윤희, 이순화, 이철희. 낙동강중류수계에서 Cryptosporidium과 Giardia의분포특성. 대한환경공학회지 28(8): , 2006 김행옥, 위성환, 주후돈, 이정길, 강영배, 최상호, 이원창. 마우스, 랫트, 기니픽에대한 Cryptosporidium parvum의실험적감염. 한국수의공중보건학회지 17(4): , 김혜선, 윤제용, 염철민. 국내상수원수및하수에서 Cryptosporidium과 Giardia 포낭검출. 한국물환경학회지 16(5): , 2000 위성환, 이정길, 주후돈, 강영배. 국내마우스에서분리된 Cryptosporidium parvum의송아지로의감염시험. 기생충학잡지 30(4): , 1992 이목영, 김도연, 조은주, 이의광, 오세종, 이채근, 하영칠. 1623방법에의한서울시상수도계통의지아디아및크립토스포리디움검출. 한국물환경학회지 16(5): , 2000 이재구, 김현철, 유명조. 최신수의기생충학. 도서출판나눔의집 pp: , 2007 이재구, 서영석, 박배근. 한국산동물로부터크립토스포리디움의분리및동정. I. 각종동물의크립토스

35 포리디움감염상황. 기생충학잡지, 29(2): , 1991a 이재구, 서영석, 박배근. 한국산동물로부터크립토스포리디움의분리및동정. II. 마우스로부터 Cryptosporidium muris의분리기생충학잡지, 29(2): , 1991b 이재구, 서영석, 박배근. 한국산동물로부터크립토스포리디움의분리및동정. III. 닭으로부터 Cryptosporidium baileyi의분리. 기생충학잡지, 29(4): , 1991c 채종일, 신손문, 윤종구, 유재란, 이순형. 면역억제에의한마우스의 Cryptosporidium 발현실험. 기생충학잡지, 28(1):31-37, 1990 Stanley SL JR, Reed SL. Microbes and microbial toxin: paradigms for microbial-mucosal interactions. VI. Entamoeba histolytica: parasite-host interactions. Sm J physiol Gastrointest Liver Physiol 280:G , 2001 Espinosa-Cantellano M, Martinex-Palomo A. Pathogenesis of intestinal amebiasis: from molecules to desease. Microbial Rev 13: , 2000 Hughes MA, Lee CW, Holm CF, Ghosh S, Mills A, Lockhart LA, et al. Identification of Entamoeba hostolytica thiol-specific antioxidant as a GalNAc lectin-associated protein. Mol Biochim Parasitol 127: , 2003 Marshall MM, Naumovitz D, Ortega Y, Sterling CR. Waterborne protozoan pathogens. Clin Microbiol Rev 10(1):67-85, 1997 Huston CD. Parasite and host contributions to the pathogenesis of amebic colitis. Trends Parasitol 20:23-26, 2004 Seydel KB, Stanley SL Jr. Entamoeba histolytica induces host cell death in amebic liver abscess by a non-fas-dependent, non-tumor necrosis factor α-dependent pathway of apoptosis. Infect Immun 66: , 1998 Ragland BD, Ashley LS, Vaux DL, Petri WA. Entamoeba histolytica: target cells killed by trophozoites undergo apoptosis which is not blocked by bcl-2. Exp Parasitol 79: , 1994 Ravdin JI, Moreau F, Sullivan JA, Petri WA Jr, Mandell GL. Relationship of free intracellular calcium to the cytolytic activity of Entamoeba histolytica. Infect Immun 56: , 1998 Ravdin JI, Murphy CF, Guerran RL, Long-Krug SA. Effect of antagonists of calcium and phospholipase A on the cytopathogenicity of Entamoeba histolytica. J Infect Dis 52: , 1985 Ravdin JI, Sperelakis N, Guerrant R L. Effect of ion channel inhibitors on the cytopathogenicity of Entamoeba histolytica. J Infect Dis 146: , 1982 Neumar RW, Xu YA, Gada H, Guttmann RP, Siman R. Cross-talk between calpain and caspase proteolytic systems during neuronal apoptosis. J Biol Chem 278(16): , 2003 Frangioni JV, Oda A, Smith M, Salzman EW, Neel BG. Calpain-catalyzed cleavage and subcellular relocation of protein phosphotyrosine phosphatase 1B (PTP-1B) in human platelets. EMBO J 12: , 1993 Saido TC, Sorimachi H, Suzuki K. Calpain: new perspectives in molecular diversity and

36 physiological-pathological involvement. FASEB J 8(11): , 1994 Perrin BJ, Huttenlocher A. Calpain. Int J Biochem Cell Biol 34: , 2002 Neumar RW, Xu YA, Gada H, Guttmann RP, Siman R. Cross-talk between calpain and caspase proteolytic systems during neuronal apoptosis. J Biol Chem 278(16): , 2003 Squier MK, Miller AC, Malkinson AM, Cohen JJ. Calpain activation in apoptosis. J Cell Physiol 159(2): , 1994 Witkowski JM, Zmuda-Trzebiatowska E, Swiercz JM, Cichorek M, Ciepluch H, Lewandowski K et al. Modulation of the activity of calcium-activated neutral proteases (calpains) in chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) cells. Blood 100(5): , 2002 Nakagawa T, Yuan J. Cross-talk between two cysteine protease families. Activation of caspase-12 by calpain in apoptosis. J Cell Biol 50(4): , 2000 Waterhouse NJ, Finucane DM, Green DR, Elce JS, Kumar S, Alnemri ES, et al. Calpain activation is upstream of caspases in radiation-induced apoptosis. Cell Death Differ 5(12): , 1998 Porn-Ares MI, Samali A, Orrenius S. Cleavage of the calpain inhibitor, calpastatin, during apoptosis. Cell Death Differ 5(12): , 1998 Carmody RJ, Cotter TG. Oxidative stress induces caspase-independent retinal apoptosis in vitro. Cell Death Differ 7(3): , 2000 Donovan M, Carmody RJ, Cotter TG. Light-induced photoreceptor apoptosis in vivo requires neuronal nitric-oxide synthase and guanylate cyclase activity and is caspase-3-independent. J Biol Chem 276(25): , 2001 Doonan F, Donovan M, Cotter TG. Caspase-independent photoreceptor apoptosis in mouse models of retinal degeneration. J Neurosci 23(13): , 2003 Wang KK, Posmantur R, Nadimpalli R, Nath R, Mohan P, Nixon RA, et al. Caspase-mediated fragmentation of calpain inhibitor protein calpastatin during apoptosis. Arch Biochem Biophys 356(2): , 1998 Shi Y, Melnikov VY, Schrier RW, Edelstein CL. Downregulation of the calpain inhibitor protein calpastatin by caspases during renal ischemia-reperfusion. Am J Physiol Renal Physiol 279(3):F ,

37 제 7 장첨부서류 - 해당사항없음 본학술연구용역사업의성과로기술된게재된학술지논문전체사본 ( 게재허가를받은경우게재증명서 ) 과산업재산권등록증 ( 또는출원서 ) 사본을반드시첨부할것

38 주의 ( 1. 이보고서는질병관리본부에서시행한학술연구용역사업의최종결과보고서입니다. 2. 이보고서내용을발표할때에는반드시질병관리본부에서시행 한학술연구용역사업의연구결과임을밝혀야합니다. 3. 국가과학기술기밀유지에필요한내용은대외적으로발표또는공개 하여서는아니됩니다. ( 글 14 point 고딕체 )