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1 Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society Vol. 17, No. 3 pp , ISSN / eissn 김양미 1*, 김경아 2 1 충북대학교의과대학생리학교실, 2 충북대학교의과대학의공학교실 Cell proliferation inhibition effects of epigallocatechin-3-gallate in TREK2-channel overexpressing cell line Yangmi Kim 1*, Kyung-Ah Kim 2 1 Dept. of Physiology, College of Medicine, Chungbuk National University 2 Dept. of Biomedical Engineering, College of Medicine, Chungbuk National University 요약 Two-pore 도메인포타슘채널 (two-pore domain K + channel, K2P channel) 은세포내 ph, 생리활성지질, 신경전달물질과같은생리학적자극의표적이며안정막전압 (resting membrane potential) 을설정하는것으로알려져있다. 일부유형의 K2P 채널들은세포사멸및종양형성등에서중요한역할을한다. K2P 채널중 TREK2 채널의길항제는보고되지않았다. 본연구의목적은 TREK2 채널을과발현시킨 HEK293 세포 (HEKT2) 에서플라보노이드에의해 TREK2 채널이억제되는지그리고 HEKT2 세포의증식이플라보노이드에의해영향을받는지알아보고자하였다. 전기생리학적전류는단일채널 patch clamp 방법을사용하여기록하였고세포증식은 XTT 에세이방법을이용하여측정하였다. HEKT2 세포에서전기생리학적 TREK2 채널활성도는에피갈로카테킨 -3- 갈레이트 (EGCG) 및케르세틴과같은플라보노이드에의해각각 91.5±13.1%(n=5), 82.2±13.7%(n=5) 까지억제되었다. 반면, EGCG 유사체인에피카테킨 (EC) 는 TREK2 단일채널활성도에현저한억제효과는없었다. 또한 HEKT2 세포에서세포증식이 EGCG 에의해 69.4±14.0%(n=4) 까지감소되었음을확인하였다. 결과로부터 EGCG 와케르세틴이 TREK2 채널억제제임을처음으로확인하였고, EGCG 만 HEKT2 세포의증식을감소시킨다는결론을얻었다. 본연구의결과는 EGCG 및케르세틴이 TREK2 채널을억제함으로써막전압의변화유도와세포증식에필요한세포내신호변화의시작을트리거하는데일차적으로작동할수있음을시사한다. Abstract Two-pore domain potassium (K2P) channels are the targets of physiological stimuli, such as intracellular ph, bioactive lipids, and neurotransmitters, and they set the resting membrane potential. Some types of K2P channels play a critical role in both apoptosis and tumoriogenesis. Among the K2P channels, no antagonists of the TREK2 channel have been reported. The aim of the present study was to determine if the TREK2 channel is blocked and whether cell proliferation is influenced by flavonoids in the TREK2 overexpressing HEK293 cells (HEKT2). The electrophysiological current was recorded using single channel patch clamp techniques and cell proliferation was measured using a XTT assay. The electrophysiological results showed that the TREK2 channel activity was reduced to 91.5±13.1% (n=5) and 82.2±13.7% (n=5) by flavonoids, such as epigallocatechin-3-gallate (EGCG) and quercetin in HEKT2 cells, respectively. In contrast, the EGCG analogue, epicatechin (EC), had no significant inhibitory effects on the TREK2 single channel activity. In addition, cell proliferation was reduced to 69.4±14.0% (n=4) by ECGG in the HEKT2 cells. From these results, EGCG and quercetin represent the first known TREK2 channel inhibitors and only EGCG reduced HEKT2 cell proliferation. This suggests that the flavonoids may work primarily by inhibiting the TREK2 channel, leading to a change in the resting membrane potential, and triggering the initiation of a change in intracellular signaling for cell proliferation. TREK2 channel may, at least in part, contribute to cell proliferation. Keywords : Epigallocatechin-3-gallate(EGCG), Flavonoid, Quercetin, TREK2, Two-pore domain potassium(k2p) channels 본논문은 2013년도충북대학교학술연구지원사업에의하여연구되었으며, 2015년도정부 ( 미래창조과학부 ) 의재원으로한국연구재단의지원을받아수행된연구임 (NRF-2015R1A2A2A ). * Corresponding Author : Yangmi Kim (Chungbuk National Univ.) Tel: yangmik@chungbuk.ac.kr Received February 12, 2016 Accepted March 3, 2016 Revised (1st February 22, 2016, 2nd February 23, 2016, 3rd February 28, 2016, 4th February 29, 2016, 5th March 2, 2016) Published March 31,

2 한국산학기술학회논문지제 17 권제 3 호, 서론포타슘채널은세포막전압을안정화시키는역할을하는채널로서 78개유전자형의이온채널패밀리를가지고있다 [1]. 그채널중 K2P 채널 (two-pore domain K + channel) 은 15개 ( 기능하지않은것을포함하면 18개 ) 로알려져있으며막전압의존성포타슘채널 (voltagedependent K + channel, K V) 이나칼슘에의해활성화포타슘채널 (Ca 2+ -activated K + channel, K Ca) 들과는달리안정막전압 (resting membrane potential) 상태에서항상열려있어 leak 채널또는 background 채널이라고불리기도한다 [1]. 그종류로는제일먼저클로닝된 Two P-domain in a Weakly Inward rectifying K + channel인 TWIK, 세포밖산성 ph에의해억제되는 TASK(TWIKrelated Acid-Sensitive K + channel), 세포밖알카리 ph 에의해활성화되는 TALK(TWIK-related ALkalinesensitive K + channel), 불포화지방산및세포막신전 (stretch) 에의해활성화되는 TREK(TWIK -RElated K + channel), 휘발성마취제인할로탄에의해억제되는 THIK(Tandem pore domain Halotane-Inhibited K + channel), 척수에서많이발견되는 TRESK(TWIK-RElated Spinal cord K + channel) 등이있다 [1]. 이채널은신경, 심장, 근육과내분비기관에서막전압을조절하고, 신경전달물질에의해신경활성도를조절하는것으로알려져있다 [1]. 플라보노이드중폴리페놀화합물인케르세틴 (quercetin, 3, 3, 4, 5, 7-pentahydroxyflavone) 과 epigallocatechin-3 gallate(egcg) 는항암, 항염증, 항산화제로알려져있다 [2]. 그중 EGCG는녹차에서유래된것으로많은사람들에게음용되는차성분이다. 이러한폴리페놀이이온채널에대한효과가있다면약으로서의효용가치는높아많은연구가이루어지고있다 [3]. K2P 채널에대한플라보노이드의효과는보고된바있고최근우리도 TREK2(Genbank accession No: NM_023096) 와전기생리학적으로유사한 TREK1 채널이 μm 수준의플라보노이드에의해억제됨을확인하였다 [4, 5]. 하지만 TREK2에대한플라보노이드에대한효과는보고된바없다. TREK1과 TREK2가아미노산서열에서 65% 유사성을가지고있지만 TREK2는 C-terminus가 TREK1 보다길고 TREK2는 C-terminus 부위에 ph 반응기와세포막신전에대한반응기가있는것으로알려져있다 [6]. 그러므로 TREK1과반응이다르게나타날수있다 [7]. 또한 TREK1과 TREK2는전기생리학적으로단일채널전도도나전류전압곡선의차이가나므로 TREK2 에대한연구는필수불가결하다. TREK2 또한세포가허혈에빠졌을때활성화되는채널이어서이채널을조절하는천연물이규명되어진다면신약개발에중요한단서가될것이다. 몇몇칼슘채널을포함한이온채널조절제는항고혈압약으로사용되고뇌의혈관경련을방지하고심장박동수를변화시켜협심증시흉통을감소시켜주는역할을한다 [8]. 이처럼이온채널단백질을표적으로하는약들이개발되면서이온채널단백질표적약물연구는매우중요하고세계적으로도확장추세에있다 [9]. 단일이온채널단백질을표적으로하는약물을발견하거나시험하기위해서는이온채널이지속적이고안정적으로과발현된세포주의확립이필요하고단일채널에대한약물효과의검증이필요하다. 즉, 단일이온채널을과발현한세포주의개발로합성약물또는천연추출물의효과를쉽게연구할수있게되었다 [4, 10]. 그러므로본연구에서는 TREK2 채널이지속적이고안정적으로과발현된 HEK 세포 (HEKT2) 에서플라보노이드의효과를전기생리학적관점에서조사하고 TREK2를조절하는플라보노이드가세포증식에어떤영향을주는지조사하였다. 또한 TREK2가과발현되지않는 HEK293 세포 (HEK) 에서플라보노이드에대한세포증식의영향도비교관찰하였다. 2. 재료및방법 2.1 세포배양 HEKT2는 C 대학교에서분양받아사용하였다. 세포는 10% fetal bovine serum(fbs) 이첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium(dmem) 에 penicillin 200 units/ml와 streptomycin 200 μg/ml를넣어, 5% CO 2 가포함된 37 의가습인큐베이터에배양하였다. 2.2 전기생리학적기록전기생리학적기록은선행연구에서기록된방법으로기록하였고 [4, 11], patch clamp 증폭기 (Axopatch 200B, Axon Instruments, Inc., Foster city, CA) 를사용 128

3 하여단일채널기록을수행하였다 [12]. 모든기록은실온 (22-24 ) 에서수행하였다. student's test 를사용하였고모든통계량의유의수준은 P<0.05 로하였다. 2.3 실험용액세포밖용액을구성하는유리전극 (pipette) 용액과세포내용액을구성하는 bath 용액은 150 mm KCl, 1 mm MgCl 2, 10 mm HEPES, 5 mm EGTA로동일하게구성하고, HCl을이용하여 ph 7.2로적정하였다. 플라보노이드는물또는 DMSO를이용하여 1000배까지희석하여사용하였다. 2.4 세포증식분석 HEKT2 및 HEK 세포의증식과정에서플라보노이드의효과를평가하기위하여, 세포증식분석 XTT kit를사용하였다 (Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd. Kibbutz Beit-Haemek, Israel). 방법을요약하면아래와같다. 1x10 4 개의세포를 96 well에 100 μl/well 씩넣어배양하고플라보노이드및포타슘채널차단제 (TEA) 를넣어 3일간배양하였다. 3일후 XTT 라벨링액 50 μl를추가하여 4시간동안배양하였다. 분광광도계 (SpectraMax M5e, Sunnyvale, CA) 로 nm에서흡광도를측정하였고, 비특이적인반응을배제하기위해 nm의파장을측정하여분석에사용하였다. 2.5 전기생리학적데이터분석전기생리학적데이터는 pclamp 프로그램 (version 9.02, Axon instrument, Union City, CA) 을이용하여이온채널활성도 (NP o, N은이온통로의수, P o 는활성을가진채널의열릴확률 ) 로분석하였다. 단일채널전류 trace는 2 khz에서필터하여사용하였다. TREK2 전류에대한플라보노이드의농도-반응그래프를그리기위해 Origin software (OriginLab, Corp, Northampton, MA, USA) 에서 Hill 공식 (y=1/(1+(ic 50/[F]) n )) 을사용하였다. y는채널활성도를나타낸다. IC 50 은플라보노이드에의해 TREK2 채널이 50% 억제되는값이며 n은 Hill 상관계수, F는플라보노이드의농도이다. 상대적채널활성도 (relative channel activity) 는 N TestP otest/n ControlP ocontrol 로, 상대적전류 (relative current) 는 I Test/I Control 로계산하였다. 모든수치는평균 ±S.E. 로나타내었다. 플라보노이드처리전의평균값과플라보노이드처리후평균값의차이는 unpaired(independent) 3. 결과 3.1 TREK2 대한 EGCG 및케르세틴효과 단일채널기록법을사용하여 TREK2 에대한 EGCG 및케르세틴과의효과를조사하였다. Patch clamp 방법중에서세포안이세포밖으로드러나는방법인 inside-out patch 모드에서 TREK2 채널에대한 EGCG 효과를관찰했다 (Table 1과 Fig. 1). 유지전압 (holding potential) 은 -60 mv로고정한채기록된 TREK2 채널상대적활성도는 50 μm의 EGCG에의해 91.5±13.1%(n=5) 까지감소하였다 (Table 1, Fig. 1a, Fig. 1b). Table 1은플라보노이드에의해 TREK2 채널이활성도가얼마나억제되는지보여주고있다. EGCG 처리전 TREK2 채널의상대적활성도의감소효과를 0% 로볼때 EGCG를처리하였을경우약 92% 까지억제됨을보여주고있다 (Table 1). Table 1. The relative TREK2 channel activity by flavonoids Flavonoids (50µM) 전압 (mv) 상대적채널활성도감소효과 (%) ( 평균 ± S.E.) EGCG ±13.14* Quercetin ±13.69* Apigenin ±1.20 EC ±1.20 ** 상대적채널활성도 :N TestP otest/n ControlP ocontrol *: p < 0.05 에서유의성있음, n=5 EGCG에의해억제된 TREK2 채널은 EGCG가없는용액으로관류하여도회복되지않았다 (Fig. 1a). 다른종류의플라보노이드인케르세틴의 TREK2 채널활성도에대한효과도조사하였다 (Table 1, Fig. 1c, Fig. 1d). 케르세틴처리전의 TREK2 채널활성도의감소효과를 0% 로볼때세포내에 50 μm의케르세틴적용시 TREK2 채널상대적활성도를 82.2±13.7% 까지감소시켰다 (Table 1과 Fig. 1c와 1d, n=5). 케르세틴에의해억제된전류는케르세틴을없앤용액에서거의회복되지않았다 (Fig.1c). 129

4 한국산학기술학회논문지제 17 권제 3 호, 2016 성의감소효과는거의 0% 에가깝다. 즉이러한결과는아피제닌이나 EC는 TREK2 채널차단에거의영향을주지못한다는것을제시한다. Fig. 1. The effects of EGCG and quercetin on TREK2 channel activity in HEKT2 cells. (a and c) EGCG (50 μm) and quercetin (50 μm) inhibited TREK2 channel activity. A representative channel trace for EGCG and quercetin inhibited TREK2 current was voltage-clamped under inside out patch configuration at -60 mv. Expanded single channel current trace were showed before (control), after the response to EGCG (50 μm) and quercetin (50 μm) reached a stable level and after washing with EGCG-free and quercetin-free solution. (b and d) Relative channel activity showed in (b) and (d) before and after treatment of EGCG or quercetin. Pipette and bath solutions for electorophysiological recording contained 150 mm KCl, 1 mm MgCl 2, 10 mm HEPES and 5 mm EGTA. Asterisks indicate values which are different from the respective control (t-test, P<0.05). 3.2 TREK2 에대한아피제닌 (apigenin) 및에피카테킨 (epicatechin) 의전기생리학적효과파슬리에서유래된아피제닌 (apigenin, 5, 7- Dihydroxy -2-(4-hydroxyphenyl)-4h-1-benzopyran-4-one) 과 EGCG 의유사체인에피카테킨 (epicatechin, EC) 의 TREK2 채널에대한효과를테스트하였다. 녹차에서유래된카테킨 종류는 EGCG, (-)-epigallocatechin(egc), (-)-epicatechin gallate(ecg) 및 (-)-epicatechin(ec) 가있다 [14]. 이들중본연구에서는 EC와 EGCG에대한 TREK2 채널에대한효과를조사하였다. Inside-out patch 모드에서유지전압 -60 mv에서실험을수행하였다. EGCG 또는케르세틴과는달리 50 μm 아피제닌및 EC는 TREK2 채널활성도에영향을주지않았다 (Table 1, Fig. 2a, 2b). 아피제닌이나 EC 는 table 1 에서보듯이 TREK2 채널활 Fig. 2. The effects of epicatechin (EC) and apigenin on HEKT2 cells. (a and b) EC (50 μm) and apigenin (50 μm) did not affect TREK2 channel activity. A representative channel trace for EC and apigenin inhibited current was voltage-clamped under inside out patch configuration at -60 mv. Expanded single channel current trace were showed before (control) and after the response to EC (50 μm) and apigenin. Pipette and bath solutions contained 150 mm KCl, 1 mm MgCl 2, 10 mm HEPES and 5 mm EGTA 3.3 TREK2에대한 EGCG 과케르세틴농도의존성 TREK2 채널의전류전압 (current-voltage relationship, I-V) 곡선은 TREK1이외향정류 (outward rectification) 전류를보이는것과달리내향정류 (inward rectifying) 전류를보인다 [13]. EGCG와케르세틴의 TREK2에대한농도반응을조사하기위해 inside-out macro patch 모드에서유지전압을 0 mv 고정하고 -100 mv 에서 100 mv 램프펄스를 200 ms 동안가하여전류를기록하였다. TREK2 채널활성도에대한 EGCG와케르세틴농도를점진적으로증가시키면서전류를기록하고분석하였다 (Fig.3). EGCG(0, 0.01, 0.1, 1, 10, 100 μm) 와케르세틴 (0, 0.5, 5, 30, 50, 100 μm) 의농도가증가함에따라 TREK2 전류의크기를감소시켰다. Table 2는 EGCG 를농도에따라처리하였을경우 TREK2 의전류 130

5 의감소효과를나타낸것이다. EGCG가없는용액을흘렸을경우나타나는전류의크기를 1로볼때농도가 0, 0.01, 0.1, 1, 10, 100 μm까지증가될수록전류의크기가점점감소됨을보여주고있다. 이러한효과를플롯팅하여 Hill 공식을이용하여핏팅하였을경우 EGCG가 TREK2 전류를 50% 억제하는농도 (IC 50) 는 18.9±1.42 μ M(n=5) 로나타났고 Hill 기울기계수가 2.08이었다 (Fig. 3a). Table 2에서보듯이 10 μm에서도 TREK2 전류가 control 전류 1과비교하였을경우 0.78로거의억제되지않았고 100 μm이되면전류의크기가현저히줄어들고있어이것은적어도수십 μm이되어야 TREK2 채널이차단될수있음을시사한다. Fig. 3c 및 3d는대표적인농도의존 I-V 곡선을나타낸것으로외향전류보다는내향전류가더커지는전형적인 TREK2 전류모양을보이고있다. Table 2. The dose dependency of ECGC on relative TREK2 current EGCG (μm) 전압 (mv) EGCG 상대적전류 ( 평균 ± S.E.) ± ± ± ± ± 0.10 ** 상대적채널전류 :I Test/I Control (n=5) Table 3 또한케르세틴을농도에따라처리하였을경우 TREK2 전류감소효과를나타낸것이다. 케르세틴이없는용액에서전류의크기를 1로볼때케르세틴농도가 0, 0.5, 5, 30, 50, 100 μm까지증가될수록점점전류의크기가점점감소됨을보여주고있다. 이러한효과를플롯팅하여 Hill 공식을이용하여핏팅하였을경우케르세틴의 IC 50 은 3.9±1.8 μm (n=5) 이었고 Hill 기울기 계수가 0.99 이었다 (Fig. 3b). 케르세틴의경우 EGCG와는달리 5 μm에서이미전류의크기가 0.44로현저히줄어있음을보여주고있다 (Table 3). Table 3. The dose dependency of quercetin on relative TREK2 current Quercetin (μm) 전압 (mv) EGCG 상대적전류 ( 평균 ± S.E.) ± ± ± ± ± ± 0.01 ** 상대적채널전류 :I Test/I Control, n=5 Fig. 3. EGCG and quercetin concentration-response curve for TREK2 channel in HEKT2 cells. HEKT2 cells were voltage-clamped under inside-out macropatch configuration at 0 mv. The bath solution contained 0 μm ~100 μm EGCG and quercetin. (a and b) Dose-dependent effects of EGCG and quercetin on TREK2 at -60 mv were plotted. Each point represents the mean ±S.E. (n= 5 cells per concentration). (c and d) Current-voltage relationship with dose dependency. EGCG and quercetin inhibited TREK2 current continually recorded by 150-ms ramp from -100 to 100 mv (as shown in the inset) at holding potential of 0 mv. The inward rectifying current was inhibited by EGCG and quercetin dose dependently. Percent inhibition by EGCG and quercetin of TREK2 channel current was calculated from -60 mv after application of EGCG and quercetin. 3.4 EGCG의존재시 TREK2 에대한세포막신전에대한민감도 TREK2는 TREK1처럼세포막의신전에의해활성화되는것으로알려져있다 [15]. EGCG와케르세틴이 TREK2 전류를억제하였으므로억제된전류가세포막신전에도영향을주는지확인하기위해 25 μm EGCG를세포내에적용하여 TREK2에대한세포막신전에대한반응을조사하였다 (Fig. 4). Fig. 4는 EGCG 유무와음압 (negative pressure, P) 유무에따라 TREK2의세포막신전에대한기계적민감도 (mechanosensitivity) 를보여주 131

6 한국산학기술학회논문지제 17 권제 3 호, 2016 고있다. EGCG 가없을경우에는유지전압 -60 mv 에서 -10 mmhg -30 mmhg 의기계적음압에의해 TREK2 채널활성이증가되고음압이사라졌을경우는처음수준으로회복되었다. EGCG 처리후에도채널활성은남아있었으나음압에반응하는민감도는매우떨어져있었다 (Fig. 4). 이러한결과는플라보노이드가 TREK2 채널의세포막신전에대한민감도를감소시킬수있음을제시한다. Fig. 4. Mechanosensitivity of TREK2 channels by EGCG. The negative pressure (denoted as P) was applied from -10 mmhg to -30 mmhg. The addition of EGCG (25 μm) alone decreased the sensitivity of membrane stretch. Pipette and bath solutions contained 150 mm KCl, 1 mm MgCl 2, 10 mm HEPES and 5 mm EGTA 틴처리시에는 HEKT2 세포증식감소효과가 HEK 세포에서보다더적게나타났다 (Table 4, HEK vs HEKT2, 24% vs 15%). 그리고포타슘채널억제제인 TEA 처리시에 HEKT2 세포에서증식이약간증가 ( 증식억제효과가 -로표시됨 ) 되어있음을알수있다 (Table 4). Table 4. The comparison of relative cell proliferation rate between HEK and HEKT2 cells after treatment with flavonoids Agents HEK cells (inhibitory effect of proliferation, %) HEKT2 cells (inhibitory effect of proliferation, %) Control 0.00± ±6.03 TEA (10 mm) 0.56±0.86 (-)6.38±0.39 Quercetin (50 μm) 24.32± ±6.28 EGCG (50 μm) 10.68± ±14.00* DMSO (0.1%) 0.35±3.82 (-)3.26±6.28 *: p < 0.05 에서유의성있음, n=4, (-): 증식을의미 Table 4의결과를 Fig. 5에나타내었다 (Fig. 5). Fig. 5에서도 HEKT2 세포에서 EGCG에의해세포의증식이현저히억제됨을보여주고있다. 3.5 HEKT2 와 HEK 세포에서세포증식과플라보노이드효과와의연관성플라보노이드는세포증식및세포사멸에영향을주는것으로알려져있다 [16]. EGCG가 TREK2 채널을억제하므로 HEKT2 세포에서 EGCG 처리전후세포의증식에어떤영향을주는지조사하였다. HEK 세포와 HEKT2 세포에플라보노이드처리시세포증식효과를 XTT 분석법을이용하여분석하였다 (Table 4와 Fig. 5, n=4). Table 4는 TREK2가발현되지않은 HEK 세포와 TREK2가과발현된 HEKT2 세포에서플라보노이드의효과를비교하였다. HEK 세포와 HEKT2 세포에서플라보노이드를처리하지않았을경우 (control) 세포증식억제효과를 0% 으로볼때 HEK 세포에서 EGCG 및케르세틴의효과는미미하였다 (EGCG:24% 감소, 케르세틴 : 11% 감소 ). 하지만 TREK2가발현된 HEKT2에서는 EGCG 처리시플라보노이드가처리되지않은 control 세포와비교할때거의 69.4±14.0%(n=4) 까지세포증식이감소하였음을볼수있다 (Table 4와 Fig. 5). 케르세 Fig. 5. The relevance of cell proliferation on HEK and HEKT2 by flavonoids (a) Percent proliferation of non-transfected HEK293 (HEK) cell in the presence of flavonoid and TEA. DMSO was used as a control. EGCG induced cytotoxicity in TREK2 transfected HEK 293 (HEKT2) cells. Cells were treated for 3 days with flavonoid such as EGCG (50 μm), quercetin (50 μm) and TEA. Cell survival was determined by the XTT assay. Error bars represent standard error from the mean (SEM) for 4 separate experiments. Asterisks indicate values which are different from the respective control (t-test, P<0.05). 132

7 4. 고찰본연구에서는 TREK2 과발현 HEK293 (HEKT2) 세포에서 TREK2 채널이 EGCG와케르세틴에의해차단됨을확인하였고, 이두플라보노이드중 EGCG만이 HEKT2 세포증식억제를유도하였음을확인하였다. HEKT2 세포에서는 EGCG에의한증식억제효과가있고 TREK2가발현되지않은 HEK 세포에서는 EGCG 에의한증식억제효과가거의없는것으로볼때 EGCG에의한 HETK2 증식억제효과는 TREK2 채널의차단효과때문인것으로판단된다. 그러나케르세틴의경우는 TREK2 채널을 EGCG 보다낮은농도에서차단함에도불구하고 (Fig. 3과 Table 3) HEKT2 증식억제효과는미미하였다 (Fig. 5와 Table 4). 이러한현상은케르세틴이다른유형의포타슘채널활성을유도하여 TREK2 채널의억제효과를상쇄하기때문일것으로추측된다. 몇몇연구에서케르세틴이채널활성효과가있다는보고가이러한추측을뒷받침한다. 즉 CFTR Cl - 채널 [17], Ca 2+ 채널 [18], K Ca[19], K V1.5[20] 채널에서케르세틴에의한채널활성이보고되어있고본연구팀에서도방광암세포에서케르세틴에의한 K Ca 활성및세포성장과의연관성을보고한바있다 [21]. HEKT2 세포에서는케르세틴이 TREK2 채널을열리게하는것이아니라닫히게하는효과가있다. 그렇기때문에 HEKT2 세포에서케르세틴에의한세포증식억제효과의감소는케르세틴-유발세포내칼슘증가또는케르세틴-유발 K Ca 의활성 (quercetin-induced K Ca activation) 이케르세틴에의한 TREK2 전류의억제효과를상쇄하기때문인것으로추측된다. 이러한추측은방광암에서케르세틴- 유발 K Ca 채널활성이세포의증식을억제하다는보고로설명될수있다 [21]. 케르세틴은여러종류의이온채널을활성화시킨다고알려져있지만 [17-20], TREK2 채널은차단하였다 (IC 50; 4 μm, Fig. 3). TREK2 채널을차단하는효과를나타내는농도는 TREK1 채널을차단하는 IC μm[4] 에비하면 4배정도높은농도수준이지만 IC 50 가 65 μm인 5-HT-유발내향전류 (I 5HT)[22] 보다는농도가 16배나낮은농도이고, IC 50 가 15 μm인 acetylcholine 감수체매개이온전류 (acetylcholine receptor mediated ion current, I Ach)[23] 에비하면 4배, IC 50 가 11 μm 신경세포의글라이신-유발전류 (glycine-induced current, I Gly)[24] 보다는 3배정도낮은농도이다. 그러므로 TREK2에대한억제제로케르세틴의역할효용성이높을것으로생각된다. 하지만케르세틴이세포내칼슘을증가시키는작용이있어칼슘에의존적인이온채널활성도고려하여사용하여할것으로생각된다. EGCG가 TREK2 채널의 IC 50 는 19 μm 정도로 K V11.1 채널인 herg 채널 (human Ether-à-go-go-Related Gene) 을억제하는 EGCG의 IC 50 는 6 μm에비하면높지만 [3] 뇌에서클로닝된 K V1.5 의 IC μm[25] 에비하면 5분의 1 정도의수준이고, 전기생리학적으로성질이유사한 TREK1에대한 EGCG의 IC 50 는 14 μm과는유사한농도였다 [4]. 이러한결과는 TREK2 채널에대한 EGCG의효과가 μm 수준에서작용하므로 TREK 채널차단제로서는유효할수있고채널종류에따라채널에작용하는농도는차이가있음을시사한다. 또한 EGCG 와케르세틴의경우 TREK2 채널에대해비가역적으로작용하기때문에 (Table 1과 Fig. 1) TREK2 채널에대한플라보노이드적용시주의가요구된다. 포타슘채널은안정막전압을유지하여세포항상성유지에기여한다 [26]. 포타슘채널차단은세포막의탈분극을유도하고세포내용질을증가시켜세포안으로의물유입을증가시켜세포의증식을감소시키는결과를유도할수있다 [27-29]. 즉, 포타슘채널차단에의한막전압의변화는세포의증식단계조절 ( 성장촉진인자의분비, 활동전압제어, 세포안으로의칼슘유입, 세포용량을조절 ) 함으로써세포증식과세포사멸기전에기여하기때문이다 [30]. 그러므로플라보노이드에의한채널의차단은세포생존또는증식기전과관련이있음이자명하고 [31, 32], HEKT2 에서의 EGCG에의한세포증식능력의감소는플라보노이드에의한 TREK2 채널억제에의해생길수있음을제시하고있다. 본연구에서이온채널약물스크리닝의일환으로 TREK2 과발현세포주를이용하였다. TREK2 과발현세포주는암치료제, 신경보호제및심장보호약물을발견할수있는실마리를제공할수있는기초적인도구이며기술의산물이다. 그러므로앞으로단일 K2P 채널을포함한더많은종류의이온채널과발현세포주의형성이필요할것으로생각된다. 133

8 한국산학기술학회논문지제 17 권제 3 호, 결론 TREK2 채널은 EGCG 와케르세틴에의해차단되고 TREK2 과발현 HEK293 세포에서 TREK2 채널을억제하는 EGCG만이세포의증식을억제할수있었다. 이러한세포증식억제는 EGCG의 TREK2 채널차단에의한것임을확인하였다. References [1] S. Feliciangeli, F. C. Chatelain, D. Bichet, F. Lesage, The family of K2P channels: salient structural and functional properties", J Physiol, Vol.593, No.12, pp , Jun, DOI: [2] G. Di Carlo, N. Mascolo, A. A. Izzo, F. Capasso, Flavonoids: old and new aspects of a class of natural therapeutic drugs", Life Sci, Vol.65, No.4, pp , Jun, DOI: [3] K. Kelemen, C. Kiesecker, E. Zitron, A. Bauer, E. Scholz, R. Bloehs, D. Thomas, J. Greten, A. Remppis, W. Schoels, H. A. Katus, C. A. Karle, Green tea flavonoid epigallocatechin-3-gallate (EGCG) inhibits cardiac herg potassium channels", Biochem Biophys Res Commun, Vol.364, No.3, pp , Dec, DOI: [4] K. A. Kim, Y. Kim, The effect of flavonoids on the TREK-1 channel", Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society, Vol.12, No.6, pp , Jun, DOI: [5] E. J. Kim, D. Kang, J. Han, Baicalein and wogonin are activators of rat TREK-2 two-pore domain K + channel", Acta Physiol(Oxf), Vol.202, No.2, pp , Jun, DOI: [6] Y. Kim, C. Gnatenco, H. Bang, D. Kim, Localization of TREK-2 K + channel domains that regulate channel kinetics and sensitivity to pressure, fatty acids and phi", Pflugers Arch, Vol.442, No.6, pp , Sep, DOI: [7] G. Sandoz, D. Douguet, F. Chatelain, M. Lazdunski, F. Lesage, Extracellular acidification exerts opposite actions on TREK1 and TREK2 potassium channels via a single conserved histidine residue", Proc Natl Acad Sci U S A, Vol,106, No.34, pp , Aug, DOI: [8] P. Lory, J. Chemin, Towards the discovery of novel T-type calcium channel blockers", Expert Opin Ther Targets, Vol.11, No.5, pp , May, DOI: [9] N. Villalonga, J. C. Ferreres, J. M. Argiles, E. Condom, A. Felipe, Potassium channels are a new target field in anticancer drug design", Recent Pat Anticancer Drug Discov, Vol.2, No.3, pp , Nov, DOI: [10] H. Moha ou Maati, R. Peyronnet, C. Devader, J. Veyssiere, F. Labbal, C. Gandin, J. Mazella, C. Heurteaux, M. Borsotto, A human TREK-1/HEK cell line: a highly efficient screening tool for drug development in neurological diseases", PLoS One, Vol.6, No.10, pp. e25602, Oct, DOI: [11] J. Kwak, Y. Kim, The effect of antipsychotics and antidepressants on the TREK2 channel", Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society, Vol.13, No.5, pp , May, DOI: [12] O. P. Hamill, A. Marty, E. Neher, B. Sakmann, F. J. Sigworth, Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches", Pflugers Arch, Vol.391, No.2, pp , Aug, DOI: [13] H. Bang, Y. Kim, D. Kim, TREK-2, a new member of the mechanosensitive tandem-pore K + channel family". J Biol Chem, Vol.275, No.23, pp , Jun, DOI: [14] M. D. Brown, Green tea (Camellia sinensis) extract and its possible role in the prevention of cancer", Altern Med Rev, Vol.4, No.5, pp , Oct, [15] S. G. Brohawn, How ion channels sense mechanical force: insights from mechanosensitive K2P channels TRAAK, TREK1, and TREK2", Ann N Y Acad Sci, Vol.1352, pp , Sep, DOI: [16] D. Maggioni, L. Biffi, G. Nicolini, W. Garavello, Flavonoids in oral cancer prevention and therapy", Eur J Cancer Prev, Vol.24, No.6, pp , Nov, DOI: [17] L. C. Pyle, J. C. Fulton, P. A. Sloane, K. Backer, M. Mazur, J. Prasain, S. Barnes, J. P. Clancy, S. M. Rowe, Activation of CFTR by the Flavonoid Quercetin: Potential Use as a Biomarker of F508 CFTR Rescue", Am J Respir Cell Mol Biol, Vol.43, No.5, pp , Nov, DOI: [18] S. Saponara, G. Sgaragli, F. Fusi, "Quercetin as a novel activator of L-type Ca 2+ channels in rat tail artery smooth muscle cells", Br J Pharmacol, Vol.135, No.7, pp , Apr, DOI: [19] A. Cogolludo, G. Frazziano, A. M. Briones, L. Cobeno, L. Moreno, F. Lodi, M. Salaices, J. Tamargo, F. Perez-Vizcaino, "The dietary flavonoid quercetin activates BK Ca currents in coronary arteries via production of H 2O 2. Role in vasodilatation", Cardiovasc Res, Vol.73, No.2, pp , Jan, DOI: [20] L. Yang, J. H. Ma, P. H. Zhang, A. R. Zou, D. N. Tu, "Quercetin activates human KV1.5 channels by a residue I502 in the S6 segment", Clin Exp Pharmacol Physiol, Vol.36, No.2, pp , Feb, DOI: 134

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