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1 등록번호 안내서 화장품피부부식성동물대체시험법 ( 인체피부모델을이용한피부부식시험법) 가이드라인 ( 민원인안내서) 독성평가연구부특수독성과

2 지침서ㆍ안내서제ㆍ개정점검표 명칭 화장품피부부식성동물대체시험법 ( 인체피부모델을이용한피부부식시험법 ) 가이드라인 ( 민원인안내서 ) 아래에해당하는사항에체크하여주시기바랍니다. 이미등록된지침서ㆍ안내서중동일ㆍ유사한내용의 지침서ㆍ안내서가있습니까? 예 아니오 등록대상 여부 상기질문에 예 라고답하신경우기존의지침서ㆍ안내서의개정을우선적 으로고려하시기바랍니다. 그럼에도불구하고동지침서ㆍ안내서의제정이 필요한경우그사유를아래에기재해주시기바랍니다. ( 사유 : ) 법령( 법ㆍ시행령ㆍ시행규칙 ) 또는 행정규칙( 고시ㆍ훈령ㆍ예규 ) 의내용을단순편집또는 나열한것입니까? 단순한사실을대외적으로알리는공고의내용입니까? 1 년이내한시적적용또는일회성지시ㆍ명령에해당하는내용입니까? 외국규정을번역하거나설명하는내용입니까? 신규직원교육을위해법령또는행정규칙을알기쉽게정리한자료입니까? 예 아니오 예 아니오 예 아니오 예 아니오 예 아니오 상기사항중어느하나라도 예에 해당되는경우에지침서ㆍ안내서등록대상이아닙니다. 지침서ㆍ안내서제ㆍ개정절차를적용하실필요는없습니다. 지침서ㆍ안내서 구분 내부적으로행정사무의통일을기하기위하여반복적으로행정사무의세부기준이나절차를제시하는것입니까? ( 공무원용 ) 대내외적으로법령또는고시ㆍ훈령ㆍ예규등을알기쉽게풀어서설명하거나특정한사안에대하여식품의약품안전처의입장을기술하는것입니까? ( 민원인용 ) 예 ( 지침서 ) 아니오 예( 안내서 ) 아니오 기타확인 사항 상위법령을일탈하여새로운규제를신설ㆍ강화하거나민원인을구속하는내용이있습니까? 예 아니오 상기질문에 예 라고답하신경우상위법령일탈내용을삭제하시고지침서ㆍ 안내서제ㆍ개정절차를진행하시기바랍니다. 상기사항에대하여확인하였음. 2019년 9월 30일 담당자확인( 부서장) 방서영 윤혜성

3 이안내서는화장품피부부식성동물대체시험법 ( 인체피부모델을이용한피 부부식시험법) 가이드라인에대하여알기쉽게설명하거나식품의약품안전 처의입장을기술한것입니다. 본안내서는대외적으로법적효력을가지는것이아니므로본문의기술방식 ( 하여야한다 등) 에도불구하고민원인여러분께서반드시준수하셔야 하는 사항이아님을알려드립니다. 또한, 본안내서는 2019 년월현재의과학적ㆍ기술적사실및유효한법규를토대로작성되었으므로이후최신개정법규내용및구체적인사실관계등에따라달리적용될수있음을알려드립니다. 민원인안내서 란대내외적으로법령또는고시ㆍ훈령ㆍ예규등을알기쉽게 풀어서설명하거나특정한사안에대하여식품의약품안전처의입장을기술하는것 ( 식품의약품안전처지침서등의관리에관한규정제2 조) 본안내서에대한의견이나문의사항이있을경우식품의약품안전평가원독성평가연구부특수독성과에문의하시기바랍니다. 전화번호 : , 5162 팩스번호 :

4 제 개정이력 연번 1 제 개정번호승인일자주요내용 화장품피부부식성동물대체시험법 가이드라인( 민원인안내서) 제정

5 목 차 Ⅰ. 개요 6 Ⅱ. 시험원리 6 Ⅲ. 제한점및고려사항 7 Ⅳ. 시험방법 7 Ⅴ. 인정요건 10 Ⅵ. 시험결과및보고 11 - 별첨 1 : - 별첨 2 : 번역본 원문 - 5 -

6 화장품피부부식성동물대체시험법 ( 인체피부모델을이용한피부부식시험법) 가이드라인 Ⅰ. 개요 본시험법은인체피부의상부인표피의형태학적, 생화학적및생리학적특성과 매우유사하게 3차원으로재구성한인체피부모델 (Reconstructed human Epidermis, RhE) 을사용하여비가역적인피부손상인피부부식을평가하는생체외 (in vitro) 피부부식시험법 이다. 본시험법은인체피부모델에시험물질을국소적으로적용하여일정시간노출시킨 뒤세포생존율을측정하여피부부식성을평가하는시험법으로, 세포생존율을측정하는 MTT 를이용하여부식성및비부식성과혼합물의하위범주를분류할수있다. 본가이드라인에는 5개의 RhE 모델(EpiSkin, EpiDerm, SkinEthic RHE, epics, LabCyte EPI-MODEL24) 을사용하여검증된시험법을포함하고있다. 본시험법을사용하고자하는실험실은가이드라인에서제시된 12개의숙련도물질( 별 첨 1의표 1) 을사용하여기술적숙련도를입증해야하며, 가이드라인에서제시하고있는 인정요건모두를만족시키는결과값만이유효한것으로인정된다. Ⅱ. 시험원리 시험물질은비형질전환인체유래표피각질세포로구성된 3차원인체피부모델에 국소적으로적용된다. RhE 모델은조직화된기저층(basal layers), 가시층(spinous layers), 과립층(granular layers) 및체내에분포하는지방중주요지질층(lipid class) 인세포간판상형지질층(lamellar lipid layer) 을포함하는다층의각질층으로 구성된다. RhE 시험법은부식성물질에의해각질층을투과하여세포독성을나타낸다 는원리를기반으로한다. 세포생존율은 MTT [3-(4,5-dimethyl-triazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 가효소반응에의해 - 6 -

7 변환된청색포르마잔염(formazan salt) 을조직으로부터추출하여정량적으로측정한다. Ⅲ. 제한점및고려사항 본가이드라인은 UN GHS에따라부식성및비부식성물질과혼합물의분류를 가능하게한다. 더나아가 UN GHS에따라부식성물질및혼합물의범주를선택적하 위분류 1A와 1B/1C 로하위분류하는것을가능하게한다. 본시험법은액체, 반고체, 고체및왁스가포함된광범위한화학물질분류및 물리적성상에적용할수있다. 특정시험물질에적용할수없는경우, 본시험가이드 라인은특정시험물질에대해사용할수없다. 또한본가이드라인은혼합물에도적용 가능한것으로추정한다. 그러나혼합물은광범위한범주와조성을아우르고, 혼합물에 대한정보가매우제한적이기때문에이가이드라인이특정용도에대해적용할수없 는경우, 특정혼합물에는본가이드라인을사용해서는안된다. 가스와에어로졸은검 증연구에서아직평가가이루어지지않았기때문에본가이드라인에서는허용되지않는다. MTT 포르마잔과같은파장영역의빛을흡수하거나 MTT를 MTT 포르마잔으 로직접환원시킬수있는시험물질들은조직생존율측정을간섭할수있으므로이를 보정하기적절한대조군을사용해야한다. 본가이드라인에서는피부자극성과관련하여충분한정보를제공하지는않지만, 단회피부노출후국소적피부자극을충분히평가(full evaluation) 하기위해서는 IATA 지침서 203번을참고한다. Ⅳ. 시험방법 4.1. RHE 시험법구성요소 일반적인조건 인체피부모델은상피조직을재구성하기위해비형질전환인체각질세포를사용 한다. 각질층은세포독성기준물질(cytotoxic benchmark chemicals)( 예, Sodium Dodeoyl Sulfate, TritonX-100) 의빠른투과를견딜수있는견고한장벽을포함한 다층구조( 기저층, 가시층, 과립층) 이여야한다. 이장벽은정해진노출시간후기준물 - 7 -

8 질이조직생존율을 도로투여했을때세포생존율을 50% 감소시키는농도(IC 50 ) 또는세포독성기준물질을정해진농 50% 까지감소시키는노출시간(ET 50 ) 을측정하여해 당장벽의품질을확인해야한다. 또한 RhE 모델은박테리아, 바이러스, 마이코플라스 마또는곰팡이에오염되지않아야한다 기능적인조건 가. 생존율 조직생존율을정량화하기위해 MTT 시험법을이용한다. RhE 조직모델의살 아있는세포는 MTT를청색 MTT 포르마잔침전물로환원시키며, 이침전물은조직으 로부터이소프로판올( 또는유사한용매) 을사용해추출한다. 추출된 MTT 포르마잔은 표준흡광도(OD) 측정또는 HPLC/UPLC- 분광광도계를이용하여정량화할수있다. RhE 모델사용자는사용하는 RhE 모델의음성대조군에대해정해진기준을충족하는 지확인해야한다. 음성대조군의 OD 값에대한허용범위( 상한및하한선) 는 RhE 모델 개발자/ 공급자가설정해야한다. 본가이드라인에포함된 5개의검증된 RhE 시험법에 대한음성대조군의 OD 값허용범위는별첨 1의표 2 를참조하도록한다. 나. 장벽기능 각질층과지질조성은세포독성기준물질( 예, SDS나 Triton X-100) 의빠른투과를충분히견딜수있어야한다 형태학 기저층, 가시층, 과립층, 각질층과인체표피세포와유사한지질성분을포함하여인 체표피와유사한다층구조임을증명하기위해 RhE 모델의조직학적검사를수행한다 재현성 시험법사용자는양성및음성대조군을통해시험법의재현성을증명해야한다. 또한부식성및비부식성화학물질에대해오랜시간의경과에있어서도재현성을보여주는데이터를제공한경우에한해서시험법을사용해야한다. 하위분류를위해시험법을사용하는경우, 하위분류에대한재현성또한입증해야한다 품질관리 - 8 -

9 했을때만 개발자/ 공급자가각 RhE 모델이정해진생산출하기준에적합하다는것을증명 RhE 조직모델을사용할수있다. 부식성분류에대한신뢰성있는예측을위 해, 품질관리(QC) 된조직에서생성된결과만이인정된다. 본가이드라인에포함된 5개의 검증된 RhE 시험법의품질관리(QC) 기준은별첨 1의표 3 을참조하도록한다 시험물질및대조물질적용 매노출시간마다각시험물질과대조물질에대해최소 2개의조직반복시료를 사용해야한다. 충분한양의시험물질로표피표면을균일하게덮을수있도록처리하 는반면무제한용량(infinite dose) 으로처리하는것은피한다. 고체시험물질의경우 시험물질과조직표면사이의접촉이용이하도록조직표면을탈이온수또는증류수로 촉촉하게적시고, 고운가루형태로만들어실험해야한다. 노출시간이끝나면시험물 질을수용성완충용액또는 0.9% 염화나트륨(NaCl) 용액으로표면을조심스럽게세척 한다. 수행되는 RhE 시험법과노출시간에따라서노출배양온도는상온과 37 사이 에서달라질수있다( 별첨 1의부록 2 참조) 세포생존율측정 세포생존율을측정하기위해 MTT 정량분석법을사용한다. 조직에 MTT 용액 을넣고 3시간동안배양한뒤침전된청색포르마잔생성물을용매를통해추출한다 음, 정해진표준흡광도(OD) 나 HPLC/UPLC- 분광광도계절차에따라측정된다. 시험물 질이 MTT를직접환원시키거나색간섭에의해 MTT 시험을방해하는경우. 이를보 정하기위해비특이적 MTT 환원(non specific MTT, NSMTT) 대조군과비특이적색 상 (non specific color, NSC) 대조군과같은추가적인대조군이사용되어야한다 결과해석및예측모델 각시험물질에서얻은흡광도(OD) 값은생존율 100% 를기준으로하는음성대 조군과비교하여생존율을계산하는데사용된다. HPLC/UPLC-분광광도계를사용하는 경우, 조직생존율은음성대조군에서동시에얻은 MTT 포르마잔피크와비교하여시 험물질에노출된살아있는조직에서얻은 MTT 포르마잔피크영역(%) 으로계산된다

10 시험결과에따라분류가명확한경우, 해당시험물질에대해최소 2개의조직 반복시료들로구성된한번의시험만으로충분하다. 하지만반복된시험결과가일치하 지않거나기준값의경계에해당되는경우두번째시험을수행해야하며, 시험결과가불일치할경우세번째시험을수행해야한다. 두번째 EpiSkin, EpiDerm SCT, SkinEthic RHE 및 epics, LabCyte EPI-MODEL24을포함한 5개의피부부식시험법에대한결과해석및예측모델은다 음과같다. 표 1. EpiSkin TM 예측모델 생존율 판정기준 3 분노출후 < 35% 부식성 : 선택적하위분류 1A 3분노출후 35% 그리고 60 분노출후 < 35% 또는 60분노출후 35% 그리고 240 분노출후 <35% 부식성 : 선택적하위분류 1B/1C의조합 240분노출후 35% 비부식성 표 2. EpiDerm TM SCT, SkinEthic TM RHE, epics, LabCyte EPI-MODEL24 SCT 예측모델 생존율 STEP 1 STEP 2 판정기준 3 분노출후 < 50% EpiDerm TM SCT 3 분노출후 < 25% 3분노출후 25% 1A 1B/C 또는 3분노출후 50% 그리고 60 분노출후 < 15% SkinEthic TM RHE epics, LabCyte EPI-MODEL24 3 분노출후 < 18% 1A 부식성 3분노출후 18% 1B/C 3 분노출후 < 15% 1A 3분노출후 15% 1B/C 3분노출후 50% 그리고 60분노출후 15% 비부식성

11 Ⅴ. 인정요건 RhE 시험은다음의인정요건을충족해야한다. 1) RhE 모델을사용하는각시험에서음성대조군을처리한조직은조직의품질 을반영하는 OD 값( 별첨 1의표 2) 을나타내야한다. 2) 양성대조군으로처리한조직은각시험법의조건에따라부식성화학물질에해 당하는조직생존율을나타내야한다. 3) 시험물질및또는대조물질에대한반복시료에서조직들간의생존율편차는 유효한 RhE 모델의필요조건( 예; 두조직시료간의생존율편차가 30% 를넘지 않아야함) 에맞는허용범위안에있어야한다. 4) 반복실험에서음성대조군또는양성대조군이허용범위를벗어난경우그시험 은부적합으로간주되어재시험을해야한다. 를벗어나면재시험을수행해야한다. 시험물질의편차가규정된범위 Ⅵ. 시험결과및보고 시험보고서는다음의사항을포함해야한다. 시험물질과대조물질 단일성분물질 : IUPAC 또는 CAS 명칭, CAS 번호, SMILES 또는 InChl 코드와 같은화학물질식별정보, 구조식, 순도, 불순물에대한적절하고실행가능한화학물질 정보등 다성분물질, 정확한화학구조와분자구조를알수없는물질(UVCB) 및혼합 물: 화학적식별에의한특성, 구성성분의비율과성분의물리화학적특성 물리적성상, 용해도, 부가적으로관련물리화학적특성 출처, 시판된경우제품번호

12 해당되는경우, 시험전시험물질/ 대조군물질의처리여부( 예, 가열, 분쇄) 시험물질의안정성, 사용기한, 또는알수있다면재분석날짜 보관조건 사용된 RhE 모델및프로토콜( 해당되는경우) 시험조건 사용된 RhE 모델( 배치번호포함) 측정기기의보정정보( 예; 분광광도계), 파장및주파수 MTT 포르마잔정량에사용한파장영역(pass)( 해당되는경우), 측정기기의 직선범위 MTT 포르마잔정량에사용된방법에대한설명 HPLC/UPLC- 분광광도계의기능에대한설명( 해당되는경우) 사용된특정 RhE 모델( 기능포함) 의상세배경정보. 최소한다음사항을포함해야 함 ⅰ) ⅱ) ⅲ) 생존율 장벽기능 형태적특징 ⅳ) RhE 모델의품질관리(QC) RhE 모델의이력참고자료. 배치모델이력에근거한품질관리데이터허용기 준을최소한포함해야함 일반적으로시험법사용전에숙련도확인물질에대한평가로시험법수행의 숙련도입증 시험절차 수행한시험절차의세부사항( 노출후세척과정포함) 수행한시험물질및대조군물질의용량 노출시간및노출온도 직접적인 MTT 환원제및또는유색시험물질에사용된대조군에대한설명( 해당 되는경우 ) 노출시간마다시험물질이나대조군물질에사용된조직시료수( 양성대조군, 음성 대조군, NSMTT, NSC living, NSC killed ) 사용된 RhE 모델에근거하여모델에적용한예측모델및판정기준에대한설명 시험절차의변경사항에대한설명( 세척과정포함)

13 반복실험및시험인정요건양성대조군과음성대조군의평균값및기존데이터를기반으로허용가능한범위양성대조군과음성대조군에서조직반복시료간의허용가능한편차시험물질의조직반복시료간의허용가능한편차 결과 각시험물질및대조군, 각노출기간, 각반복실험, 각시료의측정값(OD 또는 MTT 포르마잔피크영역, 조직생존율, 평균조직생존율, 조직반복시료간의표 준편차또는 CV) 에관한데이터의도표화( 해당되는경우) 해당되는경우, 직접적인 MTT 환원제및또는유색시험물질에사용된대조군들 의결과(OD 또는 MTT 포르마잔피크영역, %NSMTT, %NSC living, %NSC killed, 조직반복시료간의편차또는표준편차포함) 와최종적으로보정된조직생존 율 (%) 정해진시험회차및시험물질과대조군물질로부터얻어진허용기준에대한결과 관찰된기타결과에대한설명 사용된예측모델과판정기준에근거한분류 결과에대한고찰 결론

14 별첨 1. 번역본(OECD TG 431) 생체외피부부식성 : 인체피부모델을이용한피부부식시험법 In vitro Skin Corrosion : Reconstructed Human Epidermis(RhE) Test Method 개요 1. UN 의화학물질분류및표시에관한국제조화시스템(Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals, GHS) (1) 에서정의된바에따르면 피부부식이란시험물질을적용한후육안으로관찰가능한피부괴사가표피층과진피 층에걸쳐나타나는비가역적피부손상을말한다. 이번에개정된시험가이드라인 (Test Guideline, TG) 431은 UN GHS (1) 에따라비부식성 부식성물질및혼합물을 분류하는생체외 (in vitro) 시험법에대해설명한다. 이시험법은또한부분적으로부 식성하위분류를가능하게한다. 2. 일반적으로화학물질의피부부식성평가에는실험동물을사용해왔다 (OECD TG 404는 1981 년채택, 1992 년, 2002년그리고 2015 년에개정됨) (2). 본시험법외 에화학물질의부식가능성의평가는 2개의검증된생체외 (in vitro) 시험법이 OECD TG 430 (3), TG 435 (4) 로채택되었고또한피부자극평가를위해서는생체외 (in vitro) OECD TG 439 (5) 가채택되었다. 피부부식및자극에관한통합독성평가(Integrated Approaches to Testing and Assessment, IATA) 문서는정보출처와분석기법을분류 하는여러가지모듈에대해기술하며, i) 위한기존의시험과비시험데이터를통합활용하는방안과 접근법에대한지침을제공한다 (6). 화학물질의피부자극및피부부식성평가를 ii) 시험이추가로필요시

15 3. 본시험가이드라인은인체건강평가항목인피부부식에대해설명하며, 인체 피부의상부인표피의조직학적, 형태학적, 생화학적및생리학적특성과매우유사하 게재현하여제작된인체피부모델(Reconstructed human Epidermis, RhE)( 인체유래 비형질전환표피각질세포로부터얻음) 을사용한다. 이가이드라인은 2004년에처음 채택되었으며, RhE 모델을사용하는추가시험법을포함하여 2013 년, 2016 년, 2019 년에개정되었다. 또한부식성화학물질의하위분류를가능하게하는시험법의활용 가능성과생존율의측정을위한대체방법의활용을도입하고, IATA 가이던스문서를 참조하여 2015 년에개정되었다. 4. 본시험가이드라인에는시판되는 RhE 모델들을사용하는 5개의검증된시 험법을포함하고있다. 2개의시험법인 EpiSkin 표준모델(Standard Model, SM) 과 EpiDerm 피부부식시험법(Skin Corrosivity Test, SCT)(EPI 200) 은사전검증연구 후 (7) 피부부식성평가를위한검증연구 (8)(9)(10) 가수행되었다 (11)(12) ( 검증된참고시험 법 (Validated Reference Methods, VRM), EpiSkin =VRM1, EpiDerm =VRM2로지 칭). 이연구결과는위에서언급한 2 개의검증된참고시험법(VRM) 을부식성 (Corrosive, C) 과비부식성(Non-Corrosive, NC) 으로분류하는규제목적으로사용할 수있으며, 더욱이 EpiSkin 은부식성물질의하위분류에사용할수있음을보여준다 (13)(14)(15) (16)(17)(18). 유사시험법평가기준(Performance Standards, PS) 기반검증연구에따르면, 시판되는다른 2개의생체외 (in vitro) 피부부식 RhE 시험법(SkinEthic RHE, epics ) 은 EpiDerm VRM2 와유사한결과를나타내었다. 따라서 SkinEthic RHE 와 epics ( 이전의 EST-1000) 도부식성물질과비부식성물질을분류하기위한 규제목적으로사용될수있다 (19)(20). 모델제조사들이수행한사후검증연구 (2012~2014 년) 에서는비특이적 MTT 환원의간섭을보정한프로토콜을사용하여부 식성/ 비부식성분류뿐만아니라, 부식성물질의하위분류에대한판별수준을개선하였 다 (21)(22). 하위분류에대한예측력을높일수있는대체예측모델(alternative predictions models) 을찾기위하여 EpiDerm TM SCT, SkinEthic RHE 및 epics 로수 행한사후검증데이터의추가적인통계분석을수행하였다 (23). 마지막으로 LabCyte EPI-MODEL24는시중에서구매가가능한또하나의생체외 (in vitro) 피부부식 RhE 시험법으로, VRM 과과학적으로유사하다. 따라서부식성물질과비부식성물질을분 류할수있으며, (40)(41)(42)(43). 부식성의하위분류를가능하게하는규제목적으로사용할수있다

16 5. 규제목적으로피부부식성을평가하기위해검증된참고시험법(VRM) 외에 유사또는변경된생체외 (in vitro) RhE 시험법을사용하려면우선 OECD 가이던스문 서 34 번 (25) 의원칙에의해유사시험법평가기준 (Performance Standards, PS) (24) 에서제 시된요건에따라시험을수행하여제안된시험법들의신뢰성, 상관성( 정확성) 및제 한점을파악해야한다. 새롭게제안되거나개정된시험법은유사시험법평가기준(PS) 에 따라검토된후, 이가이드라인에포함된경우에만데이터상호인정(Mutual Acceptance of Data, MAD) 이보장된다. 본시험가이드라인에포함된시험법은피부 부식에대한생체외 (in vitro) 시험법의시험결과를각국가의요구사항에맞게설명하 기위해사용할수있으며, 이는데이터상호인정의장점이있다. 6. 본가이드라인에사용된용어의정의는부록 1 에서제공된다. 초기고려사항 7. 본시험가이드라인은 UN GHS (1) 에따라부식성과비부식성물질및혼합물 의분류를가능하게한다. 더나아가본시험가이드라인은 UN GHS (1) 에따라부식성 물질및혼합물의범주를선택적하위분류(optional sub-category) 1A와 1B/1C로하 위분류하는것을가능하게한다 (21)(22)(23). 이시험가이드라인의제한점은 UN GHS (1) 에따라피부부식성하위분류 1B와 1C 를구별할수없다는것이고, 이는생체내(in vivo) 부식성하위분류 1C 의화학물질들이잘알려져있지않기때문이다. 본시험가 이드라인에따른 5개의시험법을통해하위분류 1A, 1B/1C, NC 로구별할수있다. 8. 주요한각물질들을대표하는광범위한물질들이본시험가이드라인의시험 법에검증연구에서테스트되었다. 구에서원래데이터베이스는다양한화학물질을아우르는 부식성과비부식성을확인하기위해수행된검증연 60개의화학물질이포함된 다 (8)(9)(10). 또한하위분류를위한시험의민감도, 특이도, 정확도및실험실내재현성 을입증하는시험은시험법개발자에의해광범위한화학물질을포함한 개의화학물질로수행되었으며, 그결과들은 OECD에의해검토되었다 79개내지 80 (21)(22)(23) 진전체데이터로볼때본시험가이드라인은액체, 반고체, 고체및왁스가포함된 광범위한화학물질분류및물리적성상에적용할수있다. 액체는수용성이거나비수 용성일수있고, 고체는물에용해또는비용해성일수있다. 가능한경우, 고체는시 험전에갈아서고운가루로만들어사용하고샘플에다른전처리는필요하지않다.. 알려

17 특정시험물질이본시험법가이드라인에서적용할수없음이입증되는경우, 이시험 가이드라인은특정시험물질에대해사용해서는안된다. 또한본시험가이드라인은 물질에대한적용성을확장하여혼합물에도적용가능한것으로추정한다. 합물은광범위한범주와조성을아우르고, 그러나혼 혼합물의시험에대한정보가제한적이기 때문에가이드라인의특정용도에대해적용할수없음이입증된경우( 참고문헌(26) 에서제안된전략에따른), 그시험물질분류의혼합물에는본시험가이드라인을사 용해서는안된다. 혼합물, 시험이어려운화학물질( 예; 불안정) 또는본가이드라인에 기술된적용범위내에확실히해당되지않는화학물질의시험을고려할때, 그러한 시험물질의결과가과학적으로의미있는결과를줄수있을지를미리고려해야한다. 혼합물시험에대한규제요구사항이있을때는그러한고려는필요하지않다. 가스와 에어로졸은검증연구에서아직평가되지않았다 (8)(9)(10). RhE 시험법을사용하여가스 와에어로졸을시험해볼수는있지만본시험가이드라인에서는허용하지않는다. 9. MTT 포르마잔과같은파장영역의빛을흡수하는시험물질이나 MTT를 MTT 포르마잔으로직접환원시킬수있는시험물질들은조직생존율측정을간섭할 수있어, 보정을위해적절한대조군을사용해야한다. 이때적절한대조군시험물질에 의한간섭의종류와 MTT 포르마잔( 제 25~31 항참조) 을정량하는방법에따라달라 질수있다. 10. 본시험가이드라인은피부자극에대해충분한정보를제공하고있지는않지 만, OECD TG 439 에서건강영향(health effect) 에미치는생체외(in vitro) 피부자극 을구체적으로다루며, 동일한 RhE 시험시스템을기반으로한다( 단. 프로토콜은상이 함 ) (5). 단회피부노출후국소적피부자극을충분히평가하기위해서는 IATA(Integrated Approach to Testing and Assessment) 가이던스문서 203번을참고 한다 (6). 이러한 IATA 접근법은동물시험을고려하기전에피부부식과피부자극에대 한생체외 (in vitro) 시험수행을포함하고있다. 인체피부의사용은국가및국제적 인윤리고려사항과여건에따라야한다. 시험원리 11. 시험물질은비형질전환인체유래표피각질세포로구성된 3차원인체피부모델

18 에국소적으로적용된다. RhE 모델은조직화된기저층(basal layers), 가시층(spinous layers), 과립층(granular layers) 및체내에분포하는지방중주요지질층(lipid class) 인세포간판상형지질층(lamellar lipid layer) 을포함하는다층의각질층으로 구성된다. 12. RhE 시험법은부식성화학물질이확산이나침식에의해각질층을투과할수 있으며, 그하부층세포에세포독성을나타낸다는전제를기반으로한다. 세포생존율은 MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5 - diphenyltetrazolium bromide, Thiazolyl blue tetrazolium bromide; CAS number ] 가효소반응에의해변 환된청색포르마잔염을조직으로부터추출하여정량적으로측정한다 (27). 부식성물 질은규정한기준치이하로세포생존율을감소시키는것을통해확인한다( 제 35 항, 36 항참조). RhE 기반피부부식시험법은 OECD 가이드라인 404에따라토끼를이용한 생체내 (in vivo) 피부부식성을예측하는것으로나타났다 (2). 숙련도입증 13. 본시험가이드라인을준수하는 5개의검증된 RhE 시험법을일반적으로사 용하기전에실험실은표 1에제시된 12개의숙련도물질을정확하게분류하여기술 적숙련도를입증해야한다. 하위분류가입증되어야한다. 하위분류를위한시험법으로사용하는경우에도정확한 목록에제시된물질을이용할수없거나정당한사유가 있는경우적절한생체내 (in vivo) 와생체외(in vitro) 참고데이터를가지고있는다 른물질을이용할수있다( 예, 참고화학물질의목록 한선정기준을적용해야한다. (24) ). 단표 1에기술된것과동일 14. 숙련도시험의일부과정으로서, 사용자는조직수령후 RhE 모델제조사로 부터제공된정보대로조직의장벽특성을확인해야한다. 조직이장거리/ 장시간에걸 쳐배송되는경우, 이절차는더욱중요하다. 시험법이성공적으로확립되고숙련도가 입증된경우, 이러한검증절차를일상적으로실시할필요는없다. 그러나시험을일반 적으로하는경우, 장벽특성에대한평가를주기적으로지속할것을권장한다

19 시험절차 15. 다음은본시험가이드라인에서적용되는피부부식성평가를위한 RhE 시험법의 구성요소와절차에대한일반적인설명이다. 본시험가이드라인에서과학적으로검증된 RhE 모델 (EpiSkin (SM), EpiDerm (EPI 200), SkinEthic EPI-MODEL24) 은시중에서구입가능하다 델에대한표준작업지침서 (SOPs) 는공개되어있으며 (16)(17)(19)(28)(29)(30)(31)(32)(33)(40)(41) (34)(35)(36)(37)(42) RHE 및 epics, LabCyte. 이 5개의 RhE 모, 시험법의주요구성요소는 부록 2 에요약되어있다. 이시험법을사용시, 해당 SOP 를참조할것을권장하고다음의사항 을준수해야한다. 표 1. 숙련도물질목록 1 물질 CASRN 화학물질 분류 2 In vivo 결과에 근거한 UN GHS Cat. 3 In vitro 결과에 근거로 Cat. 4 VRM 의평균세포생존율 VRM1 VRM2 3분 60분 3분 60분 물리적 성상 Bromoacetic acid Boron trifluoride dihydrate Phenol Dichloroacety l chloride Glyoxylic acid monohydrate Lactic acid Ethanolamine Hydrochloric acid (14.4%) Phenethyl bromide 4-Amino-1, 2,4-triazole 4-(methylthi o)-benzaldeh yde Lauric acid 하위분류 1A In Vivo 부식성 유기산 1A (3) 1A 고체 무기산 1A (3) 1A 액체 페놀 1A (3) 1A 고체 친전자체 1A (3) 1A 액체 유기산 유기산 하위분류 1B/1C의조합 In Vivo 부식성 1B와 1C (3) 1B와 1C 고체 1B와 1C (3) 1B와 1C 액체 유기염기 1B (3) 1B와 1C 점성 무기산 1B와 1C (3) 1B와 1C 액체 In Vivo 부식성 친전자체 NC (3) NC 141 유기염기 NC (3) NC 친전자체 NC (3) NC 유기산 NC (3) NC 액체 88.2 고체 액체 고체 약어 : CASRN(Chemical Abstracts Service Registry Number) : 화학초록서비스등록번호; UN

20 GHS(United Nations Globally Harmonized System (1) ) : 화학물질분류 표시국제조화시스템; VRM(Validated Reference Method) : 검증된참고시험법; NC(Not Corrosive) : 비부식성 1 숙련도물질은부식성과비부식성물질로구분하고, 그다음부식성물질의하위분류로분류한뒤, 화 학적분류에의해분류된숙련도물질은 EpiSkin TM 과 EpiDerm TM(8)(9)(10) 의 ECVAM 검증연구및 EpiSkin TM(22), EpiDerm TM, SkinEthic TM 및 epics 개발자가제공한데이터를기반으로한사후검증연구 에서이용된물질들가운데선정되었다 (23). 별도의표시가없는경우, 판매되는물질의순도에서평가되 었다 (8)(10). 가능한범위에서선정된물질들은 (i) VRM(Validated Reference Method) 으로측정이나예측 이가능한부식성반응의범위를나타내며 ( 예, 비부식성; 강한부식성물질); (ii) 검증연구에서사용된 화학물질의그룹을나타내고 ; ( ⅲ) 화학구조가명확하며; (iv) 검증된참고시험법(VRM) 의수행특성 을반영하며 ; (v) in vivo 참고시험법에서명확한결과를가지고있으며; (vi) 시중에서구매가능하고; (vii) 처리비용이많이들지않는다. 2 Barratt 등이지정한화학물질분류. 3 UN GHS 1A, 1B, 1C에각각상응하는 UN 포장분류등급은 I, II, III 이다. 4 이표에보고된 VRM in vitro 예측결과는시험법개발자가수행한사후검증시험중에 EpiSkin 및 EpiDerm TM 시험법(VRMs) 에서도출되었다. 5 ECVAM 피부부식검증연구에서얻은생존율은직접적인 MTT 환원에대해서는보정되지않았다( 죽은 대조군에대한검증연구는수행하지않았음). 그러나이표에제시된시험법개발자가산출한사후검 증데이터는적절한대조군 (23) 에서얻었다. RHE 시험법구성요소 일반적인조건 16. 인체피부모델은상피조직을재구성하기위해비형질전환인체각질세포를사 용한다. 살아있는상피세포의여러층( 기저층, 가시층, 과립층) 이기능을유지하고있 는각질층아래있어야한다. 각질층은황산도데실나트륨(SDS) 또는 Triton X-100 을비롯한세포독성기준물질의빠른투과를견딜수있는견고한기능적장벽을생성 하기위해필요한필수지질성분이포함된다층구조이여야한다. 이장벽기능은정해 진노출시간후기준화학물질이조직생존율을 포독성기준물질을정해진농도로투여했을때세포생존율을 50% 로감소시키는농도(IC 50 ) 또는세 50% 까지감소시키는노 출시간 (ET 50 ) 을측정하여해당장벽의품질을확인해야한다( 제 18 항참조). RhE 모 델의차단(containment) 특성은각질층주위물질이살아있는조직으로투과되는것을 막아주며그렇지않은경우, 피부노출모델로적합하지않을수있다. RhE 모델은박 테리아, 바이러스, 마이코플라스마또는곰팡이에오염되지않아야한다. 기능적인조건 생존율 (Viability) 17. 조직생존율은정량화하기위해 MTT 시험법을이용한다 (27). RhE 조직모델

21 의살아있는세포들은 MTT를청색 MTT 포르마잔침전물로환원시키며, 이침전물은 조직으로부터이소프로판올( 또는유사한용매) 을이용하여추출한다. 추출용매의흡 광도값은충분히작아야한다( 예, OD < 0.1 ). 추출된 MTT 포르마잔은표준흡광도 (OD) 측정또는 델사용자는사용하는 HPLC/UPLC-분광광도계를이용하여정량화할수있다 RhE (38). RhE 모델의배치가음성대조군의정해진기준을충족하는지확 인해야한다. 음성대조군 OD 값에대한허용범위( 상한및하한) 는 RhE 모델개발자/ 공급자가설정해야한다. 표 2에본시험가이드라인에포함된 5개의검증된 RhE 시 험법에대한음성대조군의 OD 값허용범위를제시하고있다. HPLC/UPLC-분광광도 계사용자는표 2 에서제시된음성대조군 OD 모 범위를음성대조군의허용기준으로사 용해야한다. 음성대조군처리조직은유사한측정값을측정하여노출시간동안안정적 으로배양된것을확인해야한다. 표 2. 배치품질을대조하기위한음성대조군 OD 값의허용범위 허용하한선 허용상한선 EpiSkin TM (SM) EpiDerm TM SCT (EPI-200) SkinEthic TM RHE epics LabCyte EPI-MODEL24 SCT 장벽기능 (Barrier function) 18. 각질층과지질조성은세포독성기준물질( 예 : SDS 또는 Triton X-100) 의 빠른투과를충분히견딜수있어야한다. 사용된 RhE 모델의배치별장벽기능은 조직모델개발자/ 판매자가최종사용자에게조직공급시확인해야한다( 제 21항참 조 ). RhE 형태학 (Morphology) 19. 기저층, 가시층, 과립층, 각질층과인체표피세포와유사한지질성분을포함 하는다층구조임을증명하기위해 RhE 모델의조직학적검사를수행한다. 최종사용 자에게조직공급시조직형태의적합성을확인하는데사용된 RhE 모델의결과 (histological examination) 는 RhE 모델의개발자/ 판매자에게같이제공되어야한다( 제

22 21 항참조). 재현성 (Reproducibility) 20. 시험법사용자는시간경과에따른시험법의재현성을양성및음성대조군을 통해증명해야한다. 또한 RhE 모델개발자/ 판매자가숙련도물질목록( 표 1) 의부식 성및비부식성화학물질에대해오랜시간의경과에있어서도재현성을보여주는데 이터를제공한경우에한해서시험법을사용해야한다. 용하는경우, 하위분류에대한재현성도입증되어야한다. 하위분류를위해시험법을사 품질관리 (Quality Control, QC) 21. 개발자/ 판매자가각 RhE 모델이정해진생산출하기준에적합하다는것을 증명했을때만 RhE 모델을사용할수있다. 이기준은생존율( 제 17 항), 장벽기능( 제 18 항), 재현성( 제 19 항) 과가장관련된다. 이러한데이터들은시험법사용자에게제공 되어야하며, 이데이터를시험보고서에포함시킬수있다. 부식성분류에대한신뢰 성있는예측을위해, 품질관리(QC) 된조직에서생성된결과만이인정된다. IC 50 또는 ET 50 의허용범위( 상한및하한선) 는 RhE 모델개발자/ 판매자에의해설정된다. 검증 된 5개의시험법에대한허용범위는표 3 에서제시하고있다. 표 3. 품질관리(QC) 기준 허용하한선 허용상한선 EpiSkin TM (SM) (18시간동안 SDS 처리) (33) IC 50 = 1.0 mg/ml IC 50 = 3.0 mg/ml EpiDerm TM SCT (EPI-200) (1% Triton X-100) (34) ET 50 = 4.0 hours ET 50 = 8.7 hours SkinEthic TM RHE (1% Triton X-100) (35) ET 50 = 4.0 hours ET 50 = 10.0 hours epics (1% Triton X-100) (36) ET 50 = 2.0 hours ET 50 = 7.0 hours LabCyte EPI-MODEL24 SCT IC (18시간동안 SDS 처리) (42) 50 = 1.4 mg/ml IC 50 = 4.0 mg/ml 시험물질및대조물질의적용

23 22. 매노출시간마다각시험물질과대조물질에대해최소 2개의조직반복시료 를사용해야한다. 액체및고체시험물질의경우, 충분한양의시험물질로표피표면 을균일하게덮을수있도록처리해야하는반면무제한용량(infinite dose) 으로처리 하는것을피한다( 최소 70 µl/cm 2 또는 30 mg/cm 2 ). 시험법에따라고체시험물질을 도포하기전에시험물질과조직표면사이의접촉이용이하도록조직표면을탈이온수 또는증류수로촉촉하게적신다 (34)(35)(36)(37)(42). 가능한경우, 고체시험물질은갈아서 고운가루로만들어실험해야한다. 적용방법은시험물질에적합해야한다( 제 34~37 항참조). 노출시간이끝나면시험물질을수용성완충용액또는 0.9% 염화나트륨 (NaCl) 용액으로조직표면을조심스럽게세척한다. 검증된 5개의 RhE 시험법중어 떤시험법을사용하는지에따라시험물질당두번또는세번의노출시간이적용된다 ( 유효한 RhE 모델 5개모두: 3분에서 1 시간; EpiSkin TM 의경우 4 시간추가노출시간). 사용되는 라질수있다. RhE 시험법과노출시간에따라서노출배양온도는상온과 37 사이에서달 23. 매실험마다조직의생존율( 음성대조군), 장벽기능, 조직민감도( 양성대조 군) 가기존에정해진허용범위내에있는것을입증하기위해음성대조군과양성대조 군을동시에사용해야한다. 제안하는양성대조군물질은 RhE 모델에따라빙초산또 는 8N 수산화칼륨(KOH) 이다. 8N 수산화칼륨(KOH) 은직접적인 MTT 환원제로서제 25항과 26항에기술된바와같이적합한대조군을필요로할수있다는것에유의해 야한다. 제안된음성대조군은 0.9%(w/v) 염화나트륨(NaCl) 또는물이다. 세포생존율측정 24. 본시험가이드라인에서세포생존율을위해 MTT 시험법( 정량분석) 을이용 해야한다 (27). 모델조직을적절한농도( 또는 1 mg/ml, 상세내용은부록 2 와관련 SOP 참조) 의 MTT 용액에 3 시간동안처리한다. 그러고나서침전된청색 포르마잔생성물은적절한용매( 예; 이소프로판올, 산성이소프로판올) 를이용하여 조직으로부터추출되며, 이포르마잔의농도는최대 570 nm ± 30 nm의밴드패스 (band pass) 를가지는필터파장에서표준흡광도(OD) 나 HPLC/UPLC-분광광도계절 차에따라측정된다( 제 30 항, 31 항참조) (38). 25. 시험물질이 MTT 를청색포르마잔으로직접환원시키거나, 자연적또는물질 처리과정에의해 MTT 포르마잔과동일한 OD 범위(570±30 nm 주로청색과자색

24 시험물질) 에서빛을흡수할경우색간섭을일으켜 MTT 측정을간섭할수있다. 시 험물질로부터잠재적간섭을감지하고보정하기위해비특이적 MTT 환원 (non-specific MTT reduction, NSMTT) 대조군과비특이적색상(non-specific colour, NSC) 대조군( 제 26~30 항참조) 과같은추가적인대조군이사용되어야한다. 이는시험물질이세척과정에서완전히제거되지않거나, 표피를투과한경우 MTT 생존율시험수행시조직내에남아있을때특히중요하다. MTT 환원및색간섭을보정하는방법에 (34)(35)(36)(37)(42) 의표준작업지침서(SOP) 에기술되어있다. 착색제에의한직접적인 대한자세한설명은해당시험법 26. 시험물질이직접적인 MTT 환원제인지확인하기위해새로준비한 MTT 용 액에각시험물질을넣어야한다 (34)(35)(36)(37)(42). 시험물질을넣은 MTT 혼합물이청색 / 자색으로변하는경우시험물질이직접적으로 MTT 를환원시키는것으로추정하고, 더나아가표준흡광도(OD) 측정또는 HPLC/UPLC-분광광도계를이용하여비생존표 피 (non-viable epidermis) 에대한기능적확인이이루어져야한다. 이추가기능적확 인은죽은조직을사용하며, 이조직은매우낮은대사활성도를가지고있지만살아 있는조직과비슷한양의시험물질을흡수한다. 각 MTT 환원시험물질은죽은조직 으로매노출시간마다최소 2개의반복시료에적용하고전체피부부식시험과정을거 친다. 순수조직생존율(true tissue viability) 은 MTT 환원제에노출된살아있는조직 으로부터얻은조직생존율에서, 죽은조직에동일한 MTT 환원제에노출시킨후얻은 비특이적 다. MTT 환원율을뺀값으로계산되며동시에음성대조군과비교하여계산하였 ( 즉, 순수조직생존율 = %Viability - %NSMTT) 27. 물또는이소프로판올과접촉했을때착색되는시험물질또는유색시험물질 에의한잠재적간섭을확인하고추가적인대조군의필요성을결정하기위해, 물( 노출 환경) 및/ 또는이소프로판올( 추출용매) 에서시험물질의스펙트럼분석을실시해야한 다. 물및/ 또는이소프로판올애서시험물질이 570±30 nm 범위의빛을흡수하면착색 제대조군(colorant control) 을추가적으로사용해야하고, 이러한대조군을필요로하 지않는경우 HPLC/UPLC- 분광광도계측정법을사용해야한다( 제 30항과 31항참 조). 표준흡광도(OD) 를측정하는데있어서간섭을일으키는시험물질은매노출시간 마다최소 2 개의살아있는반복시료에적용하고, 비특이적색상대조군(NSC living ) 을만 들기위해 MTT 배양단계에서조직에 MTT 용액대신배지로처리하고전체피부부 식시험과정을거친다. 살아있는조직의내재적생물학적변이성때문에유색시험물 질에서매번노출시간( 각실험) 마다 NSC living 대조군을사용하여동시에실험하는것이

25 필요하다. 순수조직생존율은간섭을일으키는시험물질에노출시킨조직을 MTT 용 액으로배양하여얻은조직생존율에서, 동일한시험물질을조직에노출시킨후 MTT 용액대신배지로배양하여얻은비특이적색상대조군의조직생존율 (%NSC living ) 을빼 서계산한다. ( 즉, 순수조직생존율 = %Viability - %NSC living ) 28. 직접적인 MTT 환원과색간섭( 제 27 항참조) 을동시에유발하는것으로확 인된시험물질은이전에서술된 NSMTT 및 NSC living 대조군과별도로표준흡광도 (OD) 측정시세번째대조군을필요로한다. 이는 MTT 시험을간섭하는어두운색 ( 예, 청색, 자색, 흑색) 의시험물질을사용한경우로, 26항에서기술한바와같이시험 물질의본연의색이 문이다. NSMTT MTT를직접적으로환원시키는능력에대한평가를방해하기때 이시험물질은살아있는조직과죽은조직모두에결합할수있으므로 대조군은시험물질에의한직접적인 MTT 환원성뿐만아니라죽은조직에 남아있는시험물질에서발생하는색간섭도보정해준다. 이로인해 NSC living 대조군이 시험물질이살아있는조직과결합하여발생하는색간섭을이미보정하기때문에색 간섭에대한이중보정이발생할수있다. 색간섭에대한이중보정을피하기위해 죽은조직의비특이적색상 (NSC killed ) 에대한세번째대조군이필요하다. 이추가대 조군에는시험물질을노출마다최소한 2개의죽은조직에적용하고 MTT 배양단계에 서 MTT 용액대신배지로배양되는것외에동일한시험절차를거친다. 수행되는각 시험횟수와는상관없이시험물질당하나로 NSC killed 대조군은충분하지만가능하면 동일한조직(the same batch) 을사용하여 NSMTT 대조군과동시에수행하여야한다. 그러고나서, 순수조직생존율은시험물질에노출된살아있는조직에서얻은조직생존 율(%Viability) 에서 %NSMTT 와 %NSC living 값을빼주고, 죽은조직에간섭을일으키 는시험물질을노출시킨후배지로배양하여얻은 %NSC killed 값을더하여계산한다. ( 즉, 순수조직생존율 = %Viability - %NSMTT - %NSC living + %NSC killed ) 29. 비특이적 MTT 환원과비특이적색간섭은조직추출물의판독값을분광광 도계의직선범위이상으로증가시킬수있다는점에유의해야한다. 따라서규제목적 으로시험물질에대한시험을수행하기전, 실험실에서는시중에서구입가능한 MTT 포르마잔(CAS # ) 을사용하여분광광도계의직선범위를정해야한다. 특히분광광도계를사용하는표준흡광도(OD) 측정은직접적인 MTT 환원제및또는 색간섭물질에대한보정없이시험물질로부터얻은조직추출물의 OD 값이분광광도 계의직선범위내에있거나, 시험물질로얻은보정되지않은생존율(%) 이이미부식 성으로정의된경우에는직접적인 MTT 환원제및색간섭시험물질을평가하는데적

26 합하다( 제 35항과 36 항참조). 그럼에도불구하고 NSMTT 및또는 NSC living 을생성하 는시험물질에대한결과는신중하게검토해야한다. 30. MTT 시험에서매우강한색간섭으로인해표준흡광도(OD) 측정에적합 하지않는유색(coloured) 시험물질의경우, MTT 포르마잔을측정하는 HPLC/UPLC- 분광광도계를대신사용할수있다( 제 31 항참조) (37). HPLC/UPLC-분광광도계시스 템은정량적측정전에 로시험물질과상관없이 MTT 포르마잔을시험물질로부터분리해준다 (38). 이러한이유 HPLC/UPLC-분광광도계사용시에는 NSC living 또는 NSC killed 의대조군이전혀필요하지않다. 그러나시험물질이 MTT를직접환원시키는 것으로판단되거나 MTT를직접환원시키는능력의평가를방해하는색상을띠는경 우( 제 26 항참조), NSMTT 대조군을사용해야한다. MTT 포르마잔을측정하는 HPLC/UPLC- 분광광도계를사용하는경우, 조직생존율은음성대조군의 MTT 포르마 잔피크와비교하여시험물질에노출된살아있는조직 MTT 포르마잔피크영역(%) 으 로계산된다. MTT 를직접환원시킬수있는시험물질의경우, 순수조직생존율은시 험물질에노출된살아있는조직생존율에서 % NSMTT 를뺀값으로계산된다. 마지막 으로색간섭을일으킬수있는직접적인 MTT 환원제는처리후조직에남아있는 MTT를너무강하게환원시켜 OD( 표준 OD 측정법사용시) 또는피크영역 (HPLC/UPLC- 분광광도계사용시) 이직선범위를벗어나게하므로이러한조직추출 물은평가할수없으며, 이경우는매우드물게발생한다. 31. HPLC/UPLC- 분광광도계는모든종류의시험물질( 유색, 무색, MTT 환원제, MTT 비환원제) 에대한 MTT 포르마잔측정에사용될수있다 광도계시스템이다양하기때문에 (38). HPLC/UPLC- 분광 HPLC/UPLC-분광광도계시스템은사용하기전에 조직추출물에서 MTT 포르마잔을정량화하기위한검증이이루어져야하며, 생체분 석방법검증을위한미국식약처(FDA) 가이던스에기술된내용을근거로한표준규 격파라미터의허용기준에부합하고있음을입증해야한다 (38)(39). 주요파라미터와허 용기준은부록 4 에제시되어있다. 부록 4 에제시된허용기준을충족한다면, HPLC/UPLC- 분광광도계시스템은사용하기에적합하다고간주하며, 기술된시험조건으로 MTT 포르마잔을측정할수있다. 본시험지침서에 인정요건

27 32. 검증된 RhE 모델을사용한시험법에대해음성대조군을처리한조직은표 2 에서설명한바와같이조직의품질을반영하는 OD 를나타내야하며, 기존의확립된 시험결과의범위아래로내려가서는안된다. 양성대조군( 빙초산또는 8N 수산화칼륨 (KOH)) 으로처리된조직은시험조건하에부식성화학물질에반응하는조직생존율을 나타내야한다( 부록 2 참조). 시험물질및또는대조물질에대한반복시료에서조직들 간의생존율편차는유효한 RhE 모델의필요조건( 부록 2 참조)( 예; 두조직반복시료 간의생존율차이가 30% 를넘지않아야함) 에맞게허용범위안에있어야한다. 반복 실험에서음성대조군또는양성대조군이허용범위를벗어난경우그시험은부적합으 로간주되어재시험을해야한다. 시험물질의편차가규정된범위를벗어나면재시험을 수행해야한다. 결과해석및예측모델 33. 각시험물질에서얻은흡광도(OD) 값은생존율 100% 로하는음성대조군과 비교하여생존율을계산하는데사용된다. HPLC/UPLC- 분광광도계를사용하는경우, 조직생존율은음성대조군에서얻은 MTT 포르마잔피크와비교하여시험물질에노출 된살아있는조직에서얻은 MTT 포르마잔피크영역(%) 으로계산된다. 부식성물질과 비부식성물질을구분하는( 또는부식성하위분류를분류하는) 기준이되는세포생존율 은본시험가이드라인제 35항과 36 항에정의되어있으며, 결과해석에이용되어야한 다. 34. 시험결과에따라분류가명확한경우, 해당시험물질에대해최소 2개의조 직반복시료들로구성된한번의시험만으로충분하다. 하지만반복된시험결과가일 치하지않거나기준값의경계에해당되는경우두번째시험을수행해야하며, 두번 째시험결과가불일치할경우세번째시험을수행해야한다. 35. UN GHS (1) 분류체계와관련된 EpiSkin TM 피부부식시험법 (9)(22)(34) 에대한 예측모델은표 4 에서제시하고있다

28 표 4. EpiSkin TM 예측모델 3 분노출후 < 35% 노출시간이후측정된생존율 (t=3, 60분과 240 분) 3분노출후 35% 그리고 60 분노출후 < 35% 또는 60분노출후 35% 그리고 240분노출후 <35% 부식성 : 판정기준 선택적하위분류 1A* 부식성 : 선택적하위분류 1B/1C의조합 240분노출후 35% 비부식성 * 하위분류를용이하게하기위한 RhE 시험법의유효성을평가하기위해생성된데이터에따르면, EpiSkin TM 시험법의하위분류 1A의결과중약 22% 는하위분류 1B/1C 에해당하는것으로나타났다 ( 과분류) ( 부록 3 참조). 36. UN GHS (1) 분류체계와관련된 EpiDerm SCT (10)(23)(35), SkinEthic TM RHE (17)(18)(23)(36) 및 epics (16)(23)(37), LabCyte EPI-MODEL24 (41)(42) 피부부식시험법에 대한예측모델은표 5 에서제시하고있다. 표 5. EpiDerm TM SCT, SkinEthic TM RHE, epics, LabCyte EPI-MODEL 24 SCT 예측 모델 노출시간이후측정된생존율 (t=3, 60 분) 판정기준 STEP 1 EpiDerm TM SCT, SkinEthic TM RHE, epics, LabCyte EPI-MODEL24 SCT 3 분노출후 < 50% 부식성 3분노출후 50% 그리고 60 분노출후 < 15% 3분노출후 50% 그리고 60분노출후 15% STEP 2 EpiDerm TM 부식성 비부식성 SCT- step 1 에서부식성으로식별된물질/ 혼합물 3 분노출후 < 25% 선택적하위분류 1A * 3분노출후 25% 선택적하위분류 1B/1C의조합 STEP 2 SkinEthic TM RHE- step 1 에서부식성으로식별된물질/ 혼합물 3 분노출후 < 18% 선택적하위분류 1A * 3분노출후 18% 선택적하위분류 1B/1C의조합 STEP 2 epics - step 1 에서부식성으로식별된물질/ 혼합물

29 3 분노출후 < 15% 선택적하위분류 1A * 3분노출후 15% 선택적하위분류 1B/1C의조합 STEP 2 LabCyte EPI-MODEL24 SCT- step 1 에서부식성으로식별된물질/ 혼합물 3 분노출후 < 15% 선택적하위분류 1A * 3분노출후 15% 선택적하위분류 1B/1C의조합 * 하위분류를용이하게하기위한시험법의유효성을평가하기위해생성된데이터에따르면, EpiDerm TM SCT, SkinEthic TM RHE, epics, LabCyte EPI-MODEL24 SCT의하위분류 1A 결과약 29 %, 31%, 33%, 30% 는실제로각각하위분류 1B 또는 1C 물질/ 혼합물에해당하는것으로나타났다( 과 분류)( 부록 3 참조). 시험결과및보고 시험결과 37. 매시험마다조직반복시료에서얻은데이터를포함하여각반복실험에서얻 은데이터( 예; 분류결과를포함하는각시험물질과흡광도값과세포생존율) 는표형 식으로보고해야한다. 또한각각의수행시험에대한조직반복시료사이의생존율, CV 평균과범위가보고되어야한다. 각시험물질에있어서직접적인 MTT 환원제또 는유색시험물질에의한 MTT 시약과의상호작용(interaction) 에대해보고되어야한 다. 시험보고서 38. 시험보고서는다음사항을포함해야한다. 시험물질과대조물질 단일성분물질 : IUPAC 또는 CAS 명칭, CAS 번호, SMILES 또는 InChl 코드와 같은화학물질식별정보, 구조식, 순도, 불순물에대한적절하고실행가능한화학물질 정보등 다성분물질, 정확한화학구조와분자구조를알수없는물질(UVCB) 및혼합 물: 화학적식별에의한특성, 구성성분의비율과성분의물리화학적특성 물리적성상, 용해도, 부가적으로관련물리화학적특성 출처, 시판된경우제품번호

30 해당될경우, 시험전시험물질/ 대조군물질의처리여부( 예, 가열, 분쇄) 시험물질의안정성, 사용기한, 또는알수있다면재분석날짜 보관조건 사용된 RhE 모델및프로토콜( 해당되는경우) 시험조건 사용된 RhE 모델( 배치번호포함) 측정기기의보정정보( 예; 분광광도계), 파장및주파수 MTT 포르마잔정량에사용한파장영역(pass)( 해당되는경우), 측정기기의 직선범위 MTT 포르마잔정량에사용된방법에대한설명 HPLC/UPLC- 분광광도계의기능에대한설명( 해당되는경우) 사용된특정 RhE 모델( 기능포함) 의상세배경정보. 최소한다음사항을포함해야 함 ⅰ) ⅱ) ⅲ) 생존율 장벽기능 형태적특징 ⅳ) RhE 모델의품질관리(QC) RhE 모델의이력참고자료. 배치모델이력에근거한품질관리데이터허용기 준을최소한포함해야함 일반적으로시험법사용전에숙련도확인물질에대한평가로시험법수행의 숙련도입증 시험절차 수행한시험절차의세부사항( 노출후세척과정포함) 수행한시험물질및대조군물질의용량 노출시간및노출온도 직접적인 MTT 환원제및또는유색시험물질에사용된대조군에대한설명( 해당 되는경우 ) 노출시간마다시험물질이나대조군물질에사용된조직반복시료수( 양성대조군, 음성대조군, NSMTT, NSC living, NSC killed ) 사용된 RhE 모델에근거하여모델에적용한예측모델및판정기준에대한설명 시험절차의변경사항에대한설명( 세척과정포함)

31 반복실험및시험인정요건양성대조군과음성대조군의평균값및기존데이터를기반으로허용가능한범위양성대조군과음성대조군에서조직반복시료간의허용가능한편차시험물질의조직반복시료간의허용가능한편차 결과 각시험물질및대조군, 각노출기간, 각반복실험, 각시료의측정값(OD 또는 MTT 포르마잔피크영역, 조직생존율, 평균조직생존율, 조직반복시료간의표 준편차또는 CV) 에관한데이터의도표화( 해당되는경우) 해당되는경우, 직접적인 MTT 환원제및또는유색시험물질에사용된대조군들 의결과(OD 또는 MTT 포르마잔피크영역, %NSMTT, %NSC living, %NSC killed, 반복조직반복시료간의편차또는표준편차포함) 와최종적으로보정된조직 생존율 (%) 정해진시험회차및시험물질과대조군물질로부터얻어진허용기준에대한결과 관찰된기타결과에대한설명 사용된예측모델과판정기준에근거한분류 결과에대한고찰 결론 부록 1. 용어정의 정확도 (Accuracy) : 시험결과와허용된참고치의일치정도로, 시험법성과를측정하 는기준이자상관성(relevance) 의요소에해당됨. 시험결과의정확도를의미하는 일 치성(concordance) 과같은의미로혼용되어사용된다 (25). 세포생존율 (Cell viability) : 세포에서세포군집 ( cell population) 의총활성도를측정하 는지표( 예, 생염료인 MTT 를환원시키는세포의미토콘드리아탈수소효소능력) 로서 살아있는세포의활성도및총숫자와관련있으며, 측정된평가항목과사용된시험방 법에따라다를수있음 화학물질 (Chemical) : 물질또는혼합물을의미함

32 일치도 (Concordance) : 상관성의한측면을보여주고시험법이시험물질을자극성, 비자극성등의카테고리로나누는수행에대한평가척도. 이용어는정확성과같은의미로사용되며시험에사용한모든시험물질이양성또는음성으로정확하게분류되는비율로정의된다. 시험법의특이성또는민감도를우선시하는척도에따라 시험에사용될양성물질비율이조절되는데, 일치성또한이에따라달라짐 (25). ET 50 : 기준물질을정해진특정농도로적용했을때조직생존율을 데필요한시험물질노출시간 (IC 50 참조 ) 50% 까지감소시키는 UN 의화학물질분류및표시에관한국제조화시스템 (United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals, UN GHS) 적, 보건적, 환경적위험성의수준및표준화된유형에따른화학물질( 물질또는혼합 물) 의분류체계로, pictogram, 표시방법, 위험사항, 사전주의사항, 안전정보지등의 소통방식을통해화학물질의유해정보를전달하여, 사람( 고용주, 근로자, 운송자, 소 비자, 응급처치자등) 과환경을보호하고자제시된체계 (1) : 물리 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) : 고성능액체크로마토그래피 통합독성평가 (IATA, Integrated Approach to Testing and Assessment) : 통합적인독성 평가접근법 IC 50 : 고정된노출시간후에기준물질이조직생존율을 50%(IC 50 ) 측정하여평가할수있다 (ET 50 참조 ). 감소시키는농도를 무제한용량 (Infinite dose) : 상피표면을완전히균일하게덮는데필요한양을초과 하는시험물질의용량을말함 혼합물 (Mixture) : 서로반응하지않는두개이상의물질로구성된혼합물또는용액 단일성분물질 (Mono-constituent substance) : 정량적구성정의에의하면, 요성분이적어도 80%(w/w) 이상인물질 하나의주 MTT : 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Thiazolyl blue tetrazolium bromide 다성분물질 (Multi-constituent substance) : 두가지이상의주요성분의양이 10%

33 (w/w) 및 < 80% (w/w) 인물질. 다성분물질은생산과정의산물이며, 혼합물과다성분 물질의차이는혼합물은두가지이상의물질을화학반응없이섞어서얻고, 물질은화학반응의산물임 다성분 NC(Non corrosive) : 비부식성 NSC killed : 죽은조직에서의비특이적색상 (Non-Specific Colour in killed tissues) NSC living : tissues) 살아있는조직에서의비특이적색상 (Non-Specific Colour in living NSMTT : 비특이적 MTT 환원 (Non-Specific MTT reduction) OD(Optical density) : 흡광도 PC(Positive control) : 시험계의모든구성요소를포함하고양성반응을유도한다고알려진물질로처리한군. 시간에따른양성대조군반응의변동성을평가할수있다는확신을갖기위하여양성반응의범위가초과해서는안됨 유사시험법평가기준 (Performance standards) : 검증된시험법을기반으로기전적, 기 능적으로유사한시험방법의비교가능성을평가하는기준으로다음사항을포함함. (1) 필수적시험방법구성요소; (2) 검증된시험방법의허용가능한수행검증을위해사용된화학물질들중에서 선택된최소한의기준물질리스트 ; (3) 검증된시험방법에서얻은내용을기반으로정확성과신뢰도의비교수준. 이는제시된시험방법이기준화학물질의최소한의리스트를이용해평가했 을때증명되어야함 (25) 상관성 (Relevance) : 시험과관심효과의관련성및시험이특정목적에의미있고유용한지에대한설명. 상관성은시험이얼마나관심생물학적효과를정확하게측정하 고예측하는지나타내며, 상관성은시험법의정확도( 일치성) 를내포함 (25) 신뢰도 (Reliability) : 동일한시험방법에따라반복시행하였을때동일실험실과다른 실험실에서시험결과를재현할수있는정도. 신뢰도는실험실내, 실험실간재현성 (reproducibility) 과실험실내반복성(repeatability) 으로평가됨 (25)

34 반복실험 (Run) : 음성대조군과양성대조군과같이시험되는하나이상의시험물질로 구성됨 민감도 (Sensitivity) : 시험법으로모든양성/ 활성화학물질이정확하게분류되는비율. 민감도는시험법의범주결정에대한정확도의척도이며시험법의상관성을평가하는 중요고려사항 (25) 생체내피부부식 (Skin corrosion in vivo) : 비가역적인피부손상으로, 후최대 시험물질도포 4시간경과한후육안으로관찰가능한괴사가표피층에서진피층에이르기까 지나타난다. 부식반응은궤양, 출혈, 피딱지, 14일째되는관찰마지막시점에발생 하는피부열로인한변색, 완전탈모부분발생, 흉터를특징으로한다. 의심스러운병 변을평가하기위한조직병리검사의시행을고려해야한다. 특이도 (Specificity) : 시험법으로모든음성/ 비활성화학물질이정확하게분류되는비 율. 특이도는시험법의범주결정에대한정확도의척도이며시험법의상관성을평가 하는중요고려사항이다 (25). 물질 (Substance) : 생산과정을통해얻어지거나또는자연상태로얻어진화학원소들 (elements) 과이들로이루어진혼합물(compounds). 생산품의안정성을유지시키는데필요한첨가제와생산과정에서유래하는불순물을포함하지만해당물질의안정성이나조성의변화에영향을주지않고분리될수있는용매는제외함 시험물질 (Test chemical) : " 시험물질" 은시험대상이되는물질을의미 UPLC(Ultra-High Performance Liquid Chromatography) : 초고성능액체크로마토그 래피 정확한화학구조와분자구조를알수없는물질 (UVCB, Substances of unknown or variable composition, complex reaction products or biological materials) : 조성이알려져있지않거나다양한조성으로이루어진화합물, 복잡한반응산물또는생물학적물질

35 부록 2. 피부부식시험을위해검증된 RhE 시험법의주요시험법및구성요소 Nr LabCyte EPI-MODEL24 시험법구성 EpiSkin TM EpiDerm TM SCT SkinEthic TM RHE epics SCT 모델표면 0.38 cm cm cm cm cm 2 조직반복시료수 노출시간당최소 2개노출시간당최소 2-3 개노출시간당최소 2개노출시간당최소 2개노출시간당최소 2개 처리용량및적용직접적인 MTT 환원에대한사전확인 액체및점성 : 50±3 µl (131.6 µl/cm 2 )) 고체 : 20 ±2 mg (52.6 mg/cm 2 ) µl ± 5 µl NaCl 용액 (9 g/l) 왁스/ 점성: 50±2 mg (131.6 mg/cm 2 ) 나일론메 쉬사용 액체인경우 경우 50 µl, 고체인 20 mg을 2 ml MTT 용액(0.3 mg/ml) 과혼합하 여 37, 5% CO2, 95% RH에서 180±5분동안배 양 용액이청색/ 자색으로변 액체: 나일론메쉬유무에 관계없이 50 µl (79.4 µl/cm 2 )) 시험화학물질과나일론메쉬의 사전호환성시험 반고체 : 50 µl(79.4 µl/cm 2 ) 고체 : 25 µl H 2 O( 또는필요 한경우 )+25 mg (39.7 mg/cm 2 ) 왁스 (Waxes): 8 mm 직경 의평평한 ' 원반모양' 의조 각을 15 μl의 H2O로적신 조직위에놓음액체인경우 50 µl, 고체인 경우 25 mg을 1 ml MTT 용액(1 mg/ml) 과혼합하 여37, 5% CO2, 95% RH 에서 60분동안배양 용액이청색/ 자색으로변 하면, 죽은(freeze-killed) 해 액체및점성 : 나일론메쉬를 사용하여 40±3 µl (80 µl/cm 2 ) 시험화학물질과나일론메쉬의 사전호환성시험성 고체 : 20±2 µl H 2 O + 20±3 mg (40 mg/cm 2 ) 왁스 / 점성: 나일론메쉬 를사용하여 20±3 mg (40 mg/cm 2 ) 액체인경우 경우 40 µl, 고체인 20 mg을 1 ml MTT 용액(1 mg/ml) 과혼합하 여37, 5% CO2, 95% RH 에서 180±15분동안배양 용액이청색/ 자색으로변 하면, 죽은(freeze-killed) 해 액체및점성 : 나일론메쉬를 사용하여 50 µl (83.3 µl/cm 2 ) 시험화학물질과나일론메쉬의 사전호환성시험 반고체 : 50 µl (83.3 µl/cm 2 ) 고체 : 25 mg (41.7 mg/cm 2 ) + 25 µl H 2 O ( 또 는더필요한경우 ) 왁스 : 납작한 ' 쿠키같은 '8 mm H 2 직경의조각을 15 μl O로적신조직위에놓 음액체인경우 경우 50 µl, 고체인 25 mg을 1 ml MTT 용액(1 mg/ml) 과혼합하 여37, 5% CO2, 95% RH 에서 60분동안배양 용액이청색/ 자색으로변 하면, 죽은(freeze-killed) 해 액체및점성 : 나일론메쉬를 사용하여 50 µl (166.7 µl/cm 2 ) 고체 : 50±2 mg(166.7 mg/cm 2 ) + 50 µl H 2 O 왁스 : 고점도용마이크로피 펫과팁을이용해액체와 점성물질에사용한다. 액체인경우 경우 MTT 50 µl, 고체인 50 mg을 500 µl 용액(0.5 mg/ml) 과 혼합하여 37, 5% CO2, 95% RH에서 60분동안 배양 용액이청색/ 자색으로변

36 하면, 죽은 (water-killed) 대 조군이수행되어야한다. 당대조군이수행되어야한 다. 당대조군이수행되어야한 다. 당대조군이수행되어야한 다. 하면, 죽은(freeze-killed) 해당대조군이수행되어야한다. Nr 시험법구성 EpiSkin TM EpiDerm TM SCT SkinEthic TM RHE epics LabCyte EPI-MODEL24 색간섭사전확인 10 µl( 액체) 또는 10 mg( 고체) 을 90 µl의 H 2 O 와 RT에서 15분간혼화 용액이착색되면살아있는 해당대조군이수행되어야 한다. 50 µl ( 액체) 또는 25 mg ( 고체) 을 300 µl의 H 2 O와 37, 5% CO2, 95% RH에 서 60분동안혼화 용액이착색되면살아있는 해당대조군이수행되어야 한다. 40 µl ( 액체) 또는 20 mg ( 고체) 을 300 µl의 H 2 O와 RT에서 60분동안혼화 용액이착색되면살아있는 해당대조군이수행되어야 한다. 50 µl ( 액체) 또는 25 mg ( 고체) 을 300 µl의 H 2 O와 37, 5% CO2, 95% RH에 서 60분동안혼화 용액이착색되면살아있는 해당대조군이수행되어야 한다. SCT 50 µl ( 액체) 또는 50 mg ( 고체) 을 300 µl의 H 2 O와 37, 5% CO2, 95% RH에 서 60분동안혼화 용액이착색되면살아있는 해당대조군이수행되어야 한다. 3 분, 60 분(±5 분) 및 240 노출시간및온도 분(±10 분) 환기가능한실내온도 (RT, ) RT에서 3 분, 37, 5% CO 2, 95% RH에서 60분 RT에서 3 분, 37, 5% CO 2, 95% RH에서 60분 RT에서 3 분, 37, 5% CO 2, 95% RH에서 60분 RT에서 3 분, 37, 5% CO 2, 95% RH에서 60분 세척 25 ml 1X PBS (2 ml 씩) 1x PBS로부드럽게 20회정도 1x PBS로부드럽게 20회정도 1x PBS로부드럽게 20회정도 1x PBS로부드럽게 10회이상 음성대조군 50 µl NaCl 용액 (9 g/l) 모든노출시간마다시험 50 µl H 2 O 모든노출시간마다시험 40 µl H 2 O 모든노출시간마다시험 50 µl H 2 O 모든노출시간마다시험 50 µl H 2 O 모든노출시간마다시험 양성대조군 50 µl 빙초산 4 시간만시험 50 µl 8N KOH 모든노출시간마다시험 40 µl 8N KOH 1시간만시험 50 µl 8N KOH 모든노출시간마다시험 50 µl 8N KOH 1시간만시험 MTT 용액 2 ml 0.3 mg/ml 300 µl 1 mg/ml 300 µl 1 mg/ml 300 µl 1 mg/ml 500 µl 0.5 mg/ml

37 MTT 배양시간및 온도 37, 5% CO2, 95% RH에 서 180 분(±15 분) 37, 5% CO2, 95% RH에 서 180분 37, 5% CO2, 95% RH에 서 180 분(±15 분) 37, 5% CO2, 95% RH에 서 180분 37, 5% CO2, 95% RH에 서 180 분(±5 분) Nr 시험법구성 EpiSkin TM EpiDerm TM SCT SkinEthic TM RHE epics LabCyte EPI-MODEL24 추출용매 산성화된 이소프로판올 500 µl( 이소프로판올중 0.04 N HCl) ( 완전히격리 된조직 ) 추출시간및온도차광하여 RT에서하룻밤 OD 값 조직품질관리 기준필터없이 570 nm (545 ~ 595 nm) SDS 18시간처리 1 mg/ml IC mg/ml 1. 음성대조군 (NaCl) 으로처 리한조직반복시료의평균 OD 는모든노출시간에대해 0.6 이상 1.5 이하이어야한 다. 2 ml 이소프로판올 ( 인서트 의상부및하부로부터추 출 ) RT 에서흔들지않고하룻 밤또는 RT에서 120분동 안흔들어주면서 (~120 rpm) 기준필터없이 570 nm ( 또는 540 nm) 1 % Triton X-100 처리 4.08시간 ET 시간 1. 음성대조군 (H 2 O) 으로처 리된조직반복시료의평균 OD 는모든노출시간에대해 0.8 이상 2.8 이하이어야한 다. 1.5 ml 이소프로판올 ( 인서 트의상부및하부로부터추 출 ) RT 에서흔들지않고하룻 밤또는 RT에서 120분동 안흔들어주면서 (~120 rpm) 기준필터없이 570 nm (540 ~ 600 nm) 1 % Triton X-100 처리 4시간 ET 50 10시간 1. 음성대조군 (H 2 O) 으로처 리한조직반복시료의평균 OD 는모든노출시간에대해 0.8 이상 3.0 이하이어야한 다. 2 ml 이소프로판올 ( 인서트 의상부및하부로부터추 출 ) RT 에서흔들지않고하룻 밤또는 RT에서 120분동 안흔들어주면서 (~120 rpm) 기준필터없이 540 ~ 570 nm 1 % Triton X-100 처리 2시간 ET 50 7시간 1. 음성대조군 (H 2 O) 으로처 리된조직반복시료의평균 OD 는모든노출시간에대해 0.8이상 2.8 다. 이하이어야한 SCT 300 µl 이소프로판올 ( 완전히격리된조직) 차광하여 기준필터 RT에서하룻밤 650 nm 570 nm SDS 18시간처리 포함 1.4 mg/ml IC mg/ml 1. 음성대조군 (H 2 O) 으로처 리한조직반복시료의평균 OD 는모든노출시간에대해 0.7 이상 2.5 이하이어야한 다. 허용기준 2. 4 시간동안양성대조군 ( 빙초산) 에노출된조직반 복시료의평균생존율은음 성대조군의 % 로표시되며, 20 % 가되어야한다 ~100% 생존율을가 2. 음성대조군의 % 로표시 된양성대조군 (8N KOH) 으로 1시간동안노출된조 직반복시료의평균생존율 은 15% 미만이어야한다 ~100% 의생존율범 2. 음성대조군의 % 로표시 된양성대조군(8N KOH) 으 로 1 시간( 해당되는경우 4 시간) 동안노출된조직반 복시료의평균생존율은 15% 미만이어야한다. 2. 음성대조군의 % 로표시 되는양성대조군 (8N KOH) 으로 1시간노출된조직반 복시료의평균생존율은 20% 가되어야한다 ~100% 생존율의범위 2. 1 시간동안양성대조군 (8N KOH) 에노출된조직 반복시료의평균생존율은 음성대조군의 % 로표시되 며, 15% 가되어야한다 ~100% 생존율의범위

38 지며 OD가 0.3 이상인경 우, 두조직반복시료사이 의생존율차이는 초과하면안된다. 30% 를 위에서조직반복시료간의 변동계수(CV) 는 30% 이 어야한다 ~100% 생존율의범위 및 OD가 0.3 이상인경우, 2 개의조직반복시료사이의 생존율차이는 하면안된다. 30% 를초과 및 OD가 0.3 이상인경우, 2 개의조직반복시료사이 의생존율차이는 초과하면안된다. 30% 를 및 OD가 0.3 이상인경우, 2 개의조직반복시료사이 의생존율차이는 초과하면안된다. 30% 를

39 부록 3. 하위분류를위한시험법의수행 아래표는 5 개의시험법개발자가수행한 80 개또는 79 개의화학물질세트를기초로 계산한 5 개시험법의성능을제공한다. 4 개의시험법에대한계산(EpiSkin TM, EpiDerm TM SCT, SkinEthic TM RHE 및 epics ) 은 OECD 사무국이수행하고, 전문가하위그룹이동의하 고검토하였다 (21)(23). LabCyte EPI-MODEL24 SCT 에대한계산은개발자가수행하였고, 전 문가평가위원단(peer review panel) 과검증관리그룹이동의하고검토하였다 (41)(43). 과분류 전체화학물질에대한예측통계 (n=80 개의화학물질, epics 2번의독립적인시험또는 EpiSkin TM, EpiDerm TM SCT, SkinEthic TM 3 번의독립적인시험, 즉각각 159* 또는 240 분류. n=79** 개의화학물질, LabCyte EPI-MODEL24 SCT 3 번의독립적인시험, 즉 237 분류. * 1개의화학물질은사용불가능하여 epics 에서한번만시험되었다 (23). ** 1개의화학물질은사용불가능하여 LabCyte EPI-MODEL24 SCT에서시험되지않았다. EpiSkin TM EpiDerm TM SkinEthic TM epics EPI-MODEL LabCyte 1B와 1C로과분류된 1A 21.5% 29% 31.2% 32.8% 30% NC로과분류된 1B와 1C 20.7% 23.4% 27% 28.4% 18.9% NC로과분류된 1A 0% 2.7% 0% 0% 2.7% 부식성으로과분류 20.7% 26.1% 27% 28.4% 21.6% 전체과분류율( 모든카테고 리 ) 하위분류 17.9% 23.3% 24.5% 25.8% 21.5% 1A로하위분류된 1B와 1C 16.7% 16.7% 16.7% 12.5% 13.9% 1A로하위분류된 NC 0% 0% 0% 0% 0% 1B와 1C로하위분류된 NC 2.2% 0% 7.5% 6.6% 0% 전체하위분류비율( 모든 카테고리 ) 정확한분류 3.3% 2.5% 5.4% 4.4% 2.1% 1A로정확히분류 83.3% 83.3% 83.3% 87.5% 86.1% 1B와 1C로정확히분류 76.3% 71% 61.3% 60.7% 70% NC로정확히분류 79.3% 73.9% 73% 71.62% 78.4% 24 전체정확도 78.8% 74.2% 70% 69.8% 76.4%

40 부록 4. RhE 조직에서추출된 MTT 포르마잔정량을위한 HPLC/UPLC- 분광광도계시스템의검증을위한주요측정인자및허용기준 매개변수 (37)(38) FDA가이드라인에서유래된프로토콜 허용기준 1 2 선택성 정밀성 장기안정성 LLOQ : 하한정량한계, 1-2% 조직생존율에해당됨. 즉, 0.8 μg/ ml ULOQ : 상한정량한계, 살아있는 blank( 아무처리없이살아있는 RhE 조직의이 소프로판올추출물), 죽은 blank( 아무처리없이죽은 RhE 조직의이소프로판올추출물) 의이소프로판올의분 석이소프로판올 (n=5) 의품질관리(1.6 μg/ ml, 16 μg/ ml, 160μg /ml 의 MTT 포르마잔) 정확성이소프로판올(n=5) 의품질관리 매트릭스효과살아있는 blank(n=5) 의품질관리 결과 ULOQ 2 표준이후이소프로판올분석 재현성( 하루내) 재현성( 일간) RhE 조직 추출물에서 MTT 포르마잔의단기 안정성필요한경우, RhE 조직추출물에서 MTT 포르마잔의 3 번의독립적인보정곡선(ULOQ 2 에서시작하여, 이소프 로판올내 MTT 포르마잔의 6번연속 1/3 희석, 즉 200 μg/ ml 기준); 이소프로판올 (n=5) 의품질관리 1 일째 : 1 검량선및이소프로판올 (n=3) 의품질관리 2 일째 : 1 검량선및이소프로판올 (n=3) 의품질관리 3 일째 : 1 검량선및이소프로판올 (n=3) 의품질관리 살아있는 blank(n=3) 품질관리는샘플이준비된날, 상 온에서 24시간보관후분석 살아있는 blank(n=3) 품질관리는준비된날에, 지정된온 도(4, -20, -80 ) 에서며칠간보관후분석 음성대조군이소프로판올추출물들의농도중가장높을것으로기대되는 MTT 포르마잔농도보다적어도 2 배가높은것으로정의됨, 즉, 200 μg/ml. Area i n t e r f e r e n c e 20% Area LLOQ 1 CV 15% 20% LLOQ %Dev 15% 또는 또는 20% LLOQ 85% 매트릭스효 과 % 115% Area i n t e r f e r e n c e 1 20% Area LLOQ 검량선 : %Dev 15% 또는 20% LLOQ 품질관리 : %Dev 15% 와 CV 15% %Dev 15% %Dev 15%

41 별첨 2. 원문(OECD TG 431)

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69 화장품피부감작성동물대체시험법 ( 인체피부모델을이용한피부부식시험법 ) 가이드라인 ( 민원인안내서) 발행일 2019 년 9 월 발행인식품의약품안전평가원장 편집위원장 독성평가연구부장정자영 편집위원 도움주신분 김규봉, 김배환, 김보라, 배옥남, 안수선, 정미숙, 양성준, 권경진 문의처식품의약품안전평가원, 특수독성과 Tel : , 5155 Fax : 주소충청북도청주시흥덕구오송읍오송생명 2로 187, 오송보건의료행정타운식품의약품안전처식품의약품안전평가원