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우혁 팽
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1 대한혈관외과학회지 : 제 24 권제 1 호 Vol. 24, No. 1, May, 2008 백서에서허혈 - 재관류손상후대장과소장의세균전위비교 이화여자대학교의학전문대학원외과학교실, 1 한양대학교의과대학구리병원외과학교실 박재정ㆍ남영수 1 ㆍ정구용 Differences in Bacterial Translocation Across the Large and Small Bowel Walls after Ischemia and Reperfusion Injury in Rats Jae Jeong Park, M.D., Young-Soo Nam, M.D. 1 and Ku-Yong Chung, M.D. Department of Surgery, School of Medicine, Ewha Womans University, Seoul, 1 Department of Surgery, Guri Hospital, College of Medicine, Hanyang University, Guri, Korea Purpose: Bacterial translocation is a major problem after ischemic bowel injuries such as mesenteric vessel obstruction or bowel strangulation. In this study, we investigated the differential character of bacterial translocation from the large and small bowel using Escherichia coli labeled with technetium ( Tc-E.coli). Method: Male Sprague-Dawley rats weighing g underwent laparotomy. The superior mesenteric artery and marginal arteries of the proximal jejunum and distal colon were occluded for 30 minutes and then re-perfused for 4 hours. A suspension containing Tc-E.coli was injected into the lumen of the proximal colon (group 1) and distal ileum (group 2). In the sham operation group (groups 3, 4), Tc-E.coli was also injected in the same manner without induction of ischemia and reperfusion injury. Two hours after E. coli injection, blood, mesenteric lymph nodes (MLN), liver, spleen, and lung were collected for quantitative analysis of radioactivity. Large and small bowel specimens were also harvested for microscopic examination. Student s t-test was used for statistical analysis. P 0.05 was considered statistically significant. Result: Compared with group 1, group 2 showed a significant increase in Tc-E.coli translocation from the lumen to all organs investigated, except with regard to MLN. The sham operation group (groups 3, 4) showed scanty bacterial translocation. The mucosal epithelial cell layers of both groups (groups 1, 2) were comparatively intact. Conclusion: The Tc-E.coli method was found to be suitable for studies of bacterial translocation from the small and large bowels. Bacterial translocation is much more likely to occur across the small bowel wall than across the large bowel wall. Key Words: Bacterial translocation, Large bowel, Small bowel, Ischemia and reperfusion injury 중심단어 : 세균전위, 대장, 소장, 허혈 - 재관류손상 서 장내세균전위는장내세균또는세균의부산물이장점막을통하여장간막림프절및전신의기관으로이동하는 책임저자 : 정구용, 서울시양천구목 6 동 우 , 이대목동병원외과 Tel: , Fax: kuyong@ewha.ac.kr 본논문의요지는 2008 년대한혈관외과학회춘계학술대회에서포스터발표되었음. 론 현상으로 Berg와 Garlington에의해서알려졌다 (1). 이러한현상은장의허혈-재관류손상시발생할수있으며임상적으로급성상장간막동맥의폐쇄, 장의염전또는탈장으로인한교액, 또는전신의출혈, 화상, 외상등으로인하여발생한다 (2-5). 이렇게전위된세균은혈액및전신으로퍼져전신염증성반응, 패혈증의원인이될수있다 (6). 장내세균전위의연구방법으로는주로원격장기의조직에서세균배양을통하여전위여부를알아보는방법이이용되어왔다. 또한전위되는세균의근원이대장내세균인지소장내세균인지지금까지의연구에서확실히밝혀진바가없는데, 이는대장과소장에서일어나는세균전위를구분해서연구 1

2 2 대한혈관외과학회지 : 제 24 권제 1 호 2008 할방법이기존의방법으로는마땅치않았기때문이다. 대장과소장은특성이다르고존재하는세균의양이다르므로이를구분하여연구해봄으로써장내세균전위의주요원인이되는부위를확인해보는것이의미가있을것으로생각된다 (7). 이에본연구자는소장과대장에허혈-재관류손상을주고난후동위원소가부착된대장균을대장또는소장에주입하여대장과소장의세균전위의차이를알아보고자하였다 대상과방법 ATCC 대장균을 Tryptic Casein Medium을이용하여 37 o C에서증식시켰다. 이대장균용액을희석하여 10 8 CFU (colony-forming units)/ml의농도로맞추었다. 2 ml의대장균용액에 580μM 의주석염 1 ml를첨가하여 37 o C에서 10분간배양하였다. 이후 1 mci의 Tc (Technetium-) 을첨가한후다시 37 o C에서 15분간배양하였다. 이배양액을 2,000 g 로 20분간원심분리를시행한후침전물 (precipitate) 만남기고상청액 (supernatant) 을버린후생리식염수로채운후침전물과섞어서원심분리를다시시행하였다. 이때순도측정을위해버린부유물과나중에침전물과식염수를섞은용액에서 100μl 를채취하였다. 이과정을 3회더시행하여 Tc이부착된대장균만남도록하였다 (8) g의 Sprague-Dawley 종백서를 group 1 ( 대장균을대장에주입, n=7) 과 group 2 ( 대장균을소장에주입, n=7), Sham 수술군으로 group 3 ( 대장균을대장에주입, n=5), group 4 ( 대장균을소장에주입, n=5) 으로나누었다. Ketamin과 Xylazine ( 럼푼 R, 바이엘코리아 ) 으로복강내마취후개복한다음, 상장간막동맥의근위부를혈관겸자를이용하여동맥혈류를폐쇄하였다. 우회혈류를차단하기위하여대장의원위부와공장의근위부도혈관겸자를거치하였다 (9). 30분간허혈손상을준다음혈관겸자를모두풀어재관류시켰다. 재관류 4시간후 group 1에서는대장의맹장부위에 group 2에서는회장말단부에혈관을피해서 Tc이부착된대장균을주입하였다. 이과정에서대장균의누출을피하기위하여 23 Gage 바늘을이용하여서서히주입하였다. 대장균주입후 2시간후에백서의소장과대장조직, 혈액, 간, 장간막림프절, 비장, 폐의조직을얻었다. 대장과소장조직은포르말린에고정후파라핀포매후박절하여 H&E 염색을시행하였다. 나머지조직은감마카운터를이용하여 1분간 1 g의조직에서나오는감마선양을측정하였다. Sham군에서는허혈재관류과정없이 group 3에서는대장의맹장부위, group 4에서는회장말단부에 Tc이부착된대장균을같은방법으로주입하였다. 통계는 α error 0.05, β error 1.0으로정하여 Student s t-test를이용하였고 P 값이 0.05 이하이면통계학적으로유의한차이가있는것으 Fig. 1. The percentage of incorporated Tc into bacterial cells. cpm = counts per minute. 로판정하였다. 결 Tc과결합한대장균용액을 3회원심분리한결과 96% 농도에해당하는대장균을얻을수있었다 (Fig. 1). 30분간의허혈손상과, 조직을얻을때까지총 6시간의재관류기간동안실험에이용한백서는모두생존하였다. Group 1과 group 2의비교시 group 2에서혈액을비롯한간, 장간막림프절, 비장, 폐등모든조직에서감마선이월등히많이방출되었으며, 장간막림프절에서의결과를제외하고모두통계학적으로유의한차이가있음을보여주었다 (Fig. 2). Sham군에서는대장균을대장에주입한 group 1과 group 3 을비교하였고, 소장에주입한 group 2와 group 4를비교했을때허혈재관류손상으로인한세균전위가확실하게일어난것을확인하였다 (Fig. 2). Group 1, 2의대장과소장의현미경조직소견에서는이두군모두에서점막상피세포와점막하층의구조는비교적잘유지되어있었다 (Fig. 3). 고 상장간막동맥의급성폐쇄및기타질환으로대장과소장의광범위허혈손상이발생하는경우수술등의조치를통한신속한혈액의재관류가필요하다. 또한필요한경우괴사된장의절제가필요하다. 이때허혈손상을입은장에서허혈재관류손상으로인한장내세균의전신전위가따르게된다 (10). 이로인하여전신성염증반응증후군 (SIRS: Systemic Inflammatory Response Syndrome), 성인성호흡곤란증후군 (ARDS: Adult Respiratory Distress Syndrome) 등이일어날수있으며, 심한경우패혈증도올수있다 (6). 세균전위는장내의정상세균총 (normal bacterial flora) 들의생태학적균형과전신의면역기능의결함및장의점막장벽의손상등여러가지에영향을받는다 (11). 대장과소장은회맹판 (Ileocecal valve) 를경계로나누어져있다. 정상적인사람의경우위와십이지장의내용물에는 10 3 CFU/g의세균이, 공장에서회장까지의장내용물에는 CFU/g의세균이존재하며원위부로갈수록증가한다. 대장내의내용물에서는 CFU/g의세균이존재한다. 소장의근위부에서는산, 담즙, 췌장액의존재및활발한 과 찰

3 박재정외 : 백서에서허혈 - 재관류손상후대장과소장의세균전위비교 3 Fig. 2. The quantitative analysis of radioactivity from each specimen. *P 0.05 (Comparing between group 1 and group 2). Group 1: Tc-E.coli was injected into the lumen of the proximal colon after I/R (ischemia and reperfusion) injury, Group 2: Tc-E.coli was injected into the lumen of the distal ileum after I/R injury, Group 3: Tc-E.coli was injected into the lumen of the proximal colon without I/R injury, Group 4: Tc-E.coli was injected into the lumen of the distal ileum without I/R injury. cpm/g = counts per minute per gram; MLN = mesenteric lymph node. 장운동으로세균이존재하기어려우며, 대장에서는내용물의지체및발효로인하여장내의세균이증가한다 (12). 이러한사실은장내세균전위의주된근원이대장일것으로생각되게하며따라서이러한차이를고려한두장의세균전위의차이를연구해볼필요가있다. 소장의림프액은상장간막혈관을따라지나는림프절로배액되며가슴림프관팽대 (Cisterna chyli) 로배액된후흉관 (Thoracic duct) 을통하여혈액으로유입된다. 대장은소장과같이상장간막혈관및림프절을통하여혈액순환및림프 액의배액이이루어진다. 본실험에서는배액경로가유사한근위부대장과원위부소장에대장균을주입하여특성을알아보았다. 기존의세균전위의연구방법은절취된각장기의세균배양을시행하여세균이자라면전위가된것으로판정하는것이었다 (13). 이러한방법은실험과정에서오염에의한오류가있을수있으므로이를방지하기위하여모든실험조작은엄격한무균상태에서이루어져야한다. 또한조직에서세균의배양과배양된세균의양적측정에는많은시

이에 세균전위에서 세 균의 근원을 알기위한 시도로 Koh 등(15)은 쥐에게 미리 었다.

4 4 대한혈관외과학회지 : 제 24 권 제 1 호 2008 Fig. 3. Microscopic finding of the bowel mucosa of rats after 30 minute ischemia and 6 hour reperfusion injury. The mucosal epithelial cell layers of the large (A) and small (B) bowel were comparatively intact (H&E stain, 100). 간과 노력이 필요하다(14). 그리고 일반적으로 전위된 세균 의 근원이 어디인지 알기가 어렵다. 이에 세균전위에서 세 균의 근원을 알기위한 시도로 Koh 등(15)은 쥐에게 미리 었다. Urao 등(16)은 신생 토끼(neonatal rabbit)를 이용한 실 험에서 대장에만 세균 집락(Bacterial colonization)이 형성되 어 있고 소장에는 세균 집락이 형성되지 않은 신생 토끼에 Tetracycline으로 처리한 물만 이틀간 먹인 후 Tetracycline에 저항성을 가진 대장균을 대장 또는 소장에 주입한 후에 장 간막 림프절과 문맥혈을 배양하는 방법으로 전위된 대장균 서는 전신의 세균전위가 일어나지 않았고, 시간이 지나서 소장에 세균 집락이 형성되었을 때 비로서 세균전위가 발 견된다는 연구 결과를 보여주었다. 이것은 세균전위는 대장 의 근원을 알아보고자 시도하였다. 이들의 실험은 생태학적 장내 균주의 균형이 깨어지는 단점을 초래한다. 이들은 같 은 농도의 대장균을 주입하였을 경우 대장보다 소장에 주 에서의 세균 집락 형성시 영향을 받지 않고 소장에서의 세 균 집락 형성시에 영향을 받는다는 연구 결과로, 세균전위 에 있어서 소장 내의 세균의 존재가 더 중요한 역할을 하 입한 경우에 림프절과 문맥혈로 대장균의 전위가 더 많이 일어난 결과를 보여주었다. Tc 동위원소를 부착하여 장내에 투여한 다음 대장균에 고 있음을 강조하고 있다. Schimpl 등(17)은 쥐를 이용한 단장 증후군(short bowel syndrome)에서 회맹판을 포함하지 않고 회장을 절제한 경우 적출된 장기에서 배출되는 감마선의 양을 측정함으로써 세 균의 전위를 알아보는 방법은 조직에서 나오는 감마선의 양으로 장내에 주입했던 대장균의 전위 여부를 알 수 있으 와 포함하여 절제한 경우를 각각 비교하였다. 이 연구에서 는 소장의 과다 절제로 인하여 소장내 세균의 과증식으로 세균전위가 일어나지만 회맹판이 절제된 경우에서 절제하 며, 양적 비교가 용이하고 다른 세균으로부터의 오염에 영 향을 받지 않아 철저한 무균환경을 요구하지 않는다. 또한 Tc을 부착하는 과정은 대장균의 생활력에 영향을 주지 지 않은 경우에 비하여 세균전위가 감소함을 보여준다. 이 는 회맹판이 있을 경우 소장 내용물의 이동이 지체되어 소 장내 세균의 과증식이 일어난 결과로 생각된다. 않는 것으로 알려져 있다(8). 본 연구에서는 소장과 대장 모 두 동일한 30분간의 허혈 재관류 손상을 준 후 group 1에서 Tc이 부착 는 맹장에, group 2에서는 말단부 회장에 각각 장내에는 대장균 외에도 여러 종류의 세균이 있으며 각 세균 마다 세균전위의 특성이 대장균과 동일하지 않은 것 으로 알려져 있다(18). 따라서 본 연구의 결과 즉 대장균의 된 같은 양의 대장균을 주입하였다. 그 결과 소장에 주입한 경우가 대장에 대장균을 주입한 경우보다 본 실험에서 채 취한 모든 장기에서 전위가 많이 일어났다. 이러한 연구 결 허혈-재관류 손상시에 대장보다는 소장에서 대장균의 전위 가 더욱 많이 일어난다는 사실이 임상적으로 장내 세균총 모두에 적용될 수는 없지만, 적어도 대장과 소장의 면역적 과는 세균전위에 있어서 소장 내의 세균의 존재가 대장 내 의 세균의 존재보다 더 중요한 역할을 하고 있음을 보여주 장벽에 차이가 있으며 소장만의 허혈 재관류 손상이 발생 한 경우에도 이러한 장내 세균전위에 의한 전신성 반응에

5 박재정외 : 백서에서허혈 - 재관류손상후대장과소장의세균전위비교 5 대하여대비하는것이필요하다는것을알수있다. 결 장의허혈-재관류손상시동반되는세균전위의연구에서동위원소인 Tc을대장균에부착하여직접장내에주입하여전위를알아보는방법은대장과소장을구분하여세균전위를연구하는데유용하다. 허혈-재관류손상후같은양의대장균주입시소장은대장에비하여대장균의전위를더잘일으키는특성을지니고있다. 이는대장과소장이면역학적장벽에차이가있음을의미하며소장의허혈재관류손상시장내세균전위에대한예방이임상적으로중요한의미가있음을확인하였다. 론 감사의글 이논문에관련된실험을도와주신이은주, 최성훈연구원에게감사드립니다. REFERENCES 1) Berg RD, Garlington AW. Translocation of certain indigenous bacteria from the gastrointestinal tract to the mesenteric lymph nodes and other organs in a gnotobiotic mouse model. Infect Immun 1979;23(2): ) Rush BF Jr, Sori AJ, Murphy TF, Smith S, Flanagan JJ Jr, Machiedo GW. Endotoxemia and bacteremia during hemorrhagic shock. The link between trauma and sepsis? Ann Surg 1988;207(5): ) Maejima K, Deitch EA, Berg RD. Bacterial translocation from the gastrointestinal tracts of rats receiving thermal injury. Infect Immun 1984;43(1): ) Efstathopoulos N, Tsaganos T, Giamarellos-Bourboulis EJ, Kaldis P, Nicolaou V, Papalois A, et al. Early apoptosis of monocytes contributes to the pathogenesis of systemic inflammatory response and of bacterial translocation in an experimental model of multiple trauma. Clin Exp Immunol 2006; 145(1): ) Hebra A, Hong J, McGowan KL, Smith C, McKernan ML, Ross AJ 3rd. Bacterial translocation in mesenteric ischemiareperfusion injury: is dysfunctional motility the link? J Pediatr Surg 1994;29(2): ) Steinberg SM. Bacterial translocation: what it is and what it is not. Am J Surg 2003;186(3): ) Savage DC. Gastrointestinal microflora in mammalian nutrition. Annu Rev Nutr 1986;6: ) Diniz SO, Resende BM, Nunan EA, Simal CJ, Cardoso VN. Technetium labelled Escherichia coli. Appl Radiat Isot 1999;51(1): ) Megison SM, Horton JW, Chao H, Walker PB. A new model for intestinal ischemia in the rat. J Surg Res 1990;49(2): ) Seiler C, Ris HB, Stirnemann P, Czerniak A. A case of acute mesenteric ischemia that responded to a combined treatment concept. Swiss Surg 1996(3): ) Deitch EA. The role of intestinal barrier failure and bacterial translocation in the development of systemic infection and multiple organ failure. Arch Surg 1990;125(3): ) Guarner F. Enteric flora in health and disease. Digestion 2006;73 Suppl 1: ) Bark T, Katouli M, Ljungqvist O, Mollby R, Svenberg T. Bacterial translocation after non-lethal hemorrhage in the rat. Circ Shock 1993;41(1): ) de Oliveira MA, Lemos DS, Diniz SO, Coelho JV, Cardoso VN. Prevention of bacterial translocation using glutamine: a new strategy of investigation. Nutrition 2006;22(4): )Koh IH, Guatelli R, Montero EF, Keller R, Silva MH, Goldenberg S, et al. Where is the site of bacterial translocation--small or large bowel? Transplant Proc 1996;28(5): ) Urao M, Moy J, Van Camp J, Drongowski R, Altabba M, Coran AG. Determinant of bacterial translocation in the newborn: small bowel versus large bowel colonization. J Pediatr Surg 1995;30(6): ) Schimpl G, Feierl G, Linni K, Uitz C, Ozbey H, Hollwarth ME. Bacterial translocation in short-bowel syndrome in rats. Eur J Pediatr Surg 1999;9(4): ) Eaves-Pyles T, Alexander JW. Comparison of translocation of different types of microorganisms from the intestinal tract of burned mice. Shock 2001;16(2):

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Jksvs019(8-15).hwp Grade I Grade II Grade III 12 대한혈관외과학회지 : 제 20 권 제 1 호 2004 Control Group A Group B Fig. 4. Microscopic findings of vein wall in control, group A and group B on the day of 7 after venous occlusion. The