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1 J Korean Soc Transplant 2008;22: 종 설 지방유래 중간엽줄기세포 부산대학교 의학전문대학원 생리학교실 정 진 섭 Adipose Tissue Derived Mesenchymal Stem Cells Jin Sup Jung, M.D. Department of Physiology, School of Medicine, Pusan National University, Busan, Korea Mesenchymal stem cells (MSCs) are a heterogeneous population of cells that proliferate in vitro as plastic-adherent cells, have fibroblast-like morphology, form colonies in vitro and can differentiate into bone, cartilage and fat cells. Recent studies have shown that MSCs can be differentiated into nonmesordermal lineages. Although MSCs can be isolated from every type of connective tissues, the abundance, the easy and repeatable access to subcutaneous adipose tissue and the simple isolation procedures indicate that adipose tissue can be a preferable candidate in MSC isolation for clinical application. Therefore, in this review, the isolation, characterization, preclinical and clinical application, and the mechanisms and future roles of ADSC in cell therapy are discussed. (J Korean Soc Transplant 2008;22: ) Key Words: Adipose tissue, Mesenchymal stem cells, Differentiation, Clinical application, Cell therapy 중심 단어: 지방조직, 중간엽줄기세포, 분화, 임상적 용, 세포치료 서 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC)는 생체외 에서 섬유아세포모양으로 부착해서 자라고 단일세포로부 터 세포군락을 형성할 수 있으며 골, 지방, 연골세포로 분화 책임저자:정진섭, 부산시 서구 아미동 1가 10번지 부산대학교 의학전문대학원 생리학교실, Tel: , Fax: jsjung@pusan.ac.kr 접수일:2008년 11월 4일, 게재승인일:2008년 11월 5일 론 할 수 있는 세포를 말한다. 이러한 세포의 존재는 1970년 Friedenstein에 의해 골수에서 처음 보고되었으며(1) 이후 유 사한 특성을 가진 세포가 지방조직(2)을 포함한 뇌, 비장, 간, 신장, 폐, 골수, 근육, 흉선, 췌장등 다양한 조직에 존재 함이 보고되었다.(3) 지방조직은 발생학적으로 배아의 중배엽으로부터 유래 하며 성숙한 지방세포, 지방전구세포, 섬유아세포, 혈관평 활근, 혈관내피세포, 조직 macrophage와 임파구로 구성된 복잡한 조직이다. 인체지방조직은 양이 많고, 환자에게 큰 위험없이 쉽게 분리가 가능하며 재충전이 가능하다는 장점을 가지고 있 다. 또한 골수의 MSC (Bone marrow stromal cells, BMSC)는 골수 유핵세포의 0.01%에 불과한 것으로 알려져 있으나 지 방조직에는 1 그램당 대략 100,000개의 MSC가 존재하며(4) 이를 단기간에 대량으로 증식이 가능하므로 줄기세포의 주 요 공급원으로 사용될 수 있다. 지방조직에서 세포분리는 1960년대에 Rodbell(5,6)과 Rodbell과 Jones(7)에 의해 처음 개발되었다. 이들은 백서의 지방조직에서 조혈세포를 제거하고 collagenase처리후 원심 분리하여 stromal vascular fraction (SVF)를 분리하였다. 순환 혈구세포, 섬유아세포, pericyte, 내피세포, 지방전구세포 등 다양한 세포를 포함한(5-7) SVF를 배양용기에 깔아 부착되 는 세포를 선별함으로서 세포를 분리하였다. 이 원리를 이 용하여 인체지방조직에서 세포를 분리하는 방법이 개발되 었으며, 세포분리를 위해 이용되는 지방조직은 수술기간동 안 절제된 피부조직에서 얻는 것과 성형목적으로 흡입에 의한 지방제거를 수행하는 과정에서 얻는 것이다. 지방조직에서 collagenase처리후 부착되어 자라는 세포는 연구자에 따라 ASC (adipose-derived stem/stromal cells), ADAS (adipose-derived adult stem cells), ADSCs (adipose-derived stromal cells), adipose mesenchymal stem cells (AdMSCs) 등 다양한 이름으로 불리고 있다. 이러한 문제를 정리하기 위하여 International Fat Applied Technology Society (IFATS)는 지방조 직에서 분리한 부착해서 자라는 다분화능을 가진 세포를 adipose-derived stem cells (ASCs)로 명할 것을 제안하였다. 그러나, SVF내 세포의 조성이 다양하므로 부착후 자라는 세포의 조성도 게대배양횟수나 사용배지에 따라 다를 수 183

2 184 대한이식학회지:제 22 권 제 2 호 2008 있어 같은 용어로 불리는 세포의 특성도 연구자들에 따라 서로 다를 수 있다. 따라서, 본 종설에서는 지방조직에서 분리 후 3회이상 게대배양하여 비교적 균일한 MSC의 특성을 가진 세포에 대해 논의하고 자한다. 이들 세포를 본 종설에서는 adipose tissue-derived stromal cells (ADSC)로 칭할 것이다. ADSC의 특성 ADSC는 2,3일의 doubling time을 가지고(8,9) telomerase활 성의 존재여부는 연구자에 따라 서로 다른 보고가 있 다.(10-12) ADSC는 체외에서 35번 세포분열후에도 초기세 포와 유사한 염색체를 유지하여 체외배양에서 유전적 안정 성을 유지하나(13,14) 4개월 이상 장기배양한 ADSC가 형질 변환이 일어나 면역결핍생쥐에 이식시 종양을 형성함이 보 고되었고 염색체 이상의 빈도도 상당히 증가하는 것으로 알려졌다.(15) ADSC는 다른 조직에서 분리한 MSC와 유사한 모양과 분 화능을 가진다. 하지만, 조직을 얻은 환자의 나이, 성, 백색 대 갈색지방, 조직채취부위, 수술방법, 배양조건, 세포밀도, 배양액 조성에 따라 세포증식속도 및 분화능의 차이가 알 려지고 있다. 단순 지방흡입술에 의한 지방제거는 ADSC의 수나 생존에 영향을 주지 않으나(16-18) 초음파에 의한 지 방흡입술은 ADSC의 수와 증식능이 감소함이 보고되었 다.(18) 성숙한 지방세포를 제거하기 위한 원심분리시 속도 가 세포회수율에 영향을 주며 1200 g에서 세포의 회수가 가 장 좋음이 보고되었다.(19) 지방조직의 줄기세포의 수는 나 이가 어린 개체에서 더 많으나 세포자체의 분화능은 나이 에 따라 크게 변화하지 않는다.(20) 분리된 ADSC는 냉동보 관이 가능하며 줄기세포의 특성유지를 위해 low density로 배양하는 것이 중요하며 세포를 배양하는 배지에 따라 세 포의 증식능 및 분화능이 변화함이 보고되었다.(21) ADSC의 빈도는 지방채취 부위에 따라서도 서로 다른 것 으로 보고되고 있다. 갈색지방과 백색지방사이에 분화 및 증식능의 차이 가 있고(22) 피하지방과 복부지방사이에 줄 기세포의 증식능이 다르다는 보고가 있다.(23) 복부와 둔부 피하지방의 stromal cell의 빈도에 대해서는 연구자에 따라 서로 상반된 보고가 있다.(24,25) 따라서, 임상적으로 자가 줄기세포의 분리에 최적인 부위의 결정은 보다 많은 연구 가 필요하다. ADSC의 증식은 FGF-2,(26) Wnt signal,(27) CXCR4(28) 등 다양한 물질에 의해 영향을 받으며 FGF-2, wnt3a, VEGF, HGF등 다양한 성장인자를 분비하여 autocrine loop에 조절 된다.(29) 최근 microrna로 알려진 nucleotide의 noncoding RNA들이 진핵세포의 기능조절에 중요한 역할을 함 이 알려졌다. 이들 mirna들은 특정 mrna의 3 말단에 결 합하여 단백질합성을 억제하거나 mrna분해를 유도한 다.(30) 이러한 mirna의 기능이 줄기세포의 기능에도 중요 한 역할을 함이 알려졌고(31,32) mirna의 발현 및 processing과정에 TGF-β등 주요 세포신호조절물질이 관여함이 보 고되었다.(33) ADSC의 증식 및 분화에 대해서도 microrna 가 관여하는 것으로 보고되었다.(34) ADSC의 증식 및 분화 기전에 대한 이해는 세포분리와 배양기술의 개선에 기여할 수 있을 것이다. 표면항원의 특징 일반적으로 MSC는 조혈모세포의 표식자인 CD45, CD34, CD14, CD11을 발현하지 않는다. MSC는 또한 MHC class II antigen, constimulatory molecule인 CD80, CD86, CD40을 발현하지 않고 CD31(platelet/endothelial cell adhesion molecule [PECAM]-1), CD18 (leukocyte function-associated antigen-1 [LFA-1]), CD56 (neuronal cell adhesion molecule-1)을 발현하지 않는다. 반대로 CD9, CD105 (SH2), CD73 (SH3/4), CD44, CD90 (Thy-1), CD71, and Stro-1, CD106(vascular cell adhesion molecule [VCAM]-1), CD166 (activated leukocyte cell adhesion molecule [ALCAM]), intercellular adhesion molecule (ICAM)-1과 CD29을 발현한다.(35-38) 2번이상 게대배 양된 ADSC는 다른 조직의 MSC와 표면항원이 90%이상 유 사하나(39-43) ADSC와 BMSC에서 가장 현저히 다른 표면 항원은 CD34이다. BMSC는 CD34가 발현되지 않는 것으로 알려져 있으나 초기에 분리한 지방조직유래세포는 CD34를 발현하며 게대배양시 그 발현이 현저히 감소한다.(44,45) 게 대배양에 의한 CD34의 발현감소가 CD34가 발현되지 않는 세포의 선택적 증식보다 CD34의 발현감소에 의한 것은 CD34를 발현하는 단일세포에서 형성된 colony에서 CD34발 현이 관찰되지 않음이 밝혀짐으로서 생체외에서 세포분열 과정동안 CD34의 발현이 감소하는 것으로 판단된다.(45) 그러나, CD34의 발현과 생체효능과의 상관관계는 명확히 밝혀져 있지 않으나 후지허혈모델에서 혈관생성능에는 CD34발현여부가 유의한 차이를 나타내지 않는다.(45) 국제 세포치료학회의 중간엽 및 조직줄기세포 위원회는 아래와 같은 MSC의 최소요구조건을 4가지를 제시하였다 (46): 1. MSC는 세포배양용기에 표준배양조건에서 부착되어 자 라야 한다. 2. MSC는 생체외에서 골세포, 지방세포 및 연골세포로 분 화하는 능력을 가져야 한다. 3. MSC는 CD73, CD90, CD105를 발현하여야 한다. 4. MSC는 조혈모세포의 표식자인 c-kit, CD14, CD11b, CD34, CD45, CD19, CD79와 human leukocyte antigen (HLA)-DR 을 발현해서는 안된다. 다양한 조직에서 유래한 MSC가 유사한 특성과 표면항원 의 발현양상을 보임에 따라 MSC가 공통전구세포에서 유래 할 가능성이 제시되었다. 최근 지방조직을 포함한 다양한

3 정진섭:Adipose Tissue Derived Mesenchymal Stem Cells 185 조직에 존재하는 MSC가 CD146, NG2, 3G5를 발현하는 혈 관주위세포이며(47,48) 이들이 혈관의 안정화 및 면역세포 와의 상호작용에 관여한다.(49,50) 성체의 MSC는 중배엽에서 기원하나(51) 발생초기의 MSC는 주로 신경외배엽이나 neural crest에서 유래하는 Sox1 양성인 neuroepithelial cell에서 유래하는 것으로 보고 되었다.(52) 따라서, 이러한 발생학적 특성이 MSC가 신경 외배엽성 분화능을 가지는 기초가 될 수 있을 것이다. ADSC의 분화 MSC는 지방세포, 근육세포, 골세포, 연골세포등 중배엽 성세포로 분화하는 능력을 가질 뿐만 아니라 비중배엽성세 포인 신경세포, 췌장내분비세포, 간세포, 혈관내피세포 및 심근세포로도 분화함이 보고되었다. 중배엽성세포로의 분 화기작에 대해서는 분자적 기작에 대한 연구가 많이 진행 되고 있으며 MSC의 골세포로의 분화에 중요한 역할을 하 는 rux-2와 지방세포로의 분화에 주요인자인 PPAR-γ의 작 용을 조절하여 지방 및 골세포로의 분화방향을 결정하는 taz (transcriptional coactivator with PDZ-binding motif)의 역할 이 보고되었다.(53) 1) 지방세포 ADSC는 매우 용이하게 성숙한 지방세포로 분화한다. MSC를 지방분화를 유도하는 일반적인 방법은 dexamethasone, insulin, isobutyl methyl xanthine,과 indomethacin으로 처 리하는 것이며 oil red O staining을 이용한 lipid vacuole의 축적, PPAR γ, fatty acid-binding protein ap2, lipoprotein lipase의 발현등을 측정함으로써 확인한다.(54) ADSC를 이용 하여 삼차원적으로 지방조직을 재생이 가능하며 이를 이용 하여 ADSC가 성형목적의 자가 지방의 제공원으로 이용될 수 있고 외상, 종양제거수술, 화상후 생긴 연부조직결손을 대체할 생체재료생산에 응용될 수 있다. 실제로 ADSC를 이용하여 다양한 원인의 fistula를 치료하는 임상시험이 진 행되고 있다.(55,56) 2) 골/연골세포 ADSC는 생체외에서 골 및 연골세포로 분화가 가능하다. MSC를 골세포로 분화하는 대표적인 방법은 ascorbic acid, β-glycerophosphate, dexamethasone으로 2 3주 처리하는 것 이며 골세포로의 분화는 alkaline phosphatase발현, calcium축 적을 alizarin red와 von Kossa stain을 통해 확인한다.(36) 연 골세로로의 분화는 MSC를 원심분리하여 micromass로 transforming growth factor-β 존재하에서 배양함으로써 유도되 며 조직학적으로 toluidin blue 염색을 통해 glycosaminoglycan 의 축적을 통해 확인하고 type II collagen의 발현을 조사한 다.(57) ADSC는 골수유래세포보다 생체외 골 및 연골분화 능이나 생체내 골 및 연골 재생능이 떨어지는 것으로 알려 져 있다.(58-63) 그러나, BMP6(64)나 BMP7(65)이 ADSC의 연골분화를 촉진한다. 골분화의 경우 물리적 자극,(66) fluid shear stress,(67) BMP-2처리,(68) histone deacetylase억제제 (69)나 quercetin처리(70)에 의해 골분화가 증가되고 적절한 생체재료와 혼합하여 생체이식시 효율적인 골 및 연골 재 생능이 보고되었다.(71,72) 따라서, ADSC의 골 및 연골 재 생치료제로의 개발 가능성은 충분하다고 하겠다. 3) 심장근육세포 생쥐의 ADSC가 interleukin-3, IL-6 및 stem cell factor를 첨 가한 methylcellulose medium에서 심근유사세포로 분화하고 (73) 단층으로 배양한 ADSC을 섬유화가 일어난 심근에 이 식하였을 때 심근세포로의 분화가 관찰되었다.(74) 그러나, 그 효율이 낮고 인체세포에서도 동일한 결과가 나타나는지 는 명확하지 않다. 4) 혈관내피세포 ADSC가 생체이식시 빈도는 낮으나 혈관내피세포로 분 화함이 보고되었으나(45) 생체외에서 분화유도시 vwf나 CD31의 level이 정상내피세포보다 현저히 낮아 여전히 내 피전구세포보다 낮은 분화효율을 나타낸다(IFATS 2008). 이에 비하여 지방조직에서 직접분리한 SVF내에는 CD34가 발현되는 혈관관련 세포가 포함되어 내피세포로의 분화효 율이 상대적으로 높다.(75,76) 5) 평활근세포 생체외에서 ADSC는 sphingosylphosphorylcholine 처리에 의해 평활근유사 세포로 분화하고(77) 평활근세포와 유사 하게 고농도 K +, carbachol 및 Ca통로개방제에 의한 수축이 일어나며 big conductance Ca 2+ 에 의해 활성화되는 K + 통로 (BK(Ca))를 발현된다.(78) 그러나, 생체내에서 ADSC가 혈 관평활근세포로 분화하는지 정상평활근세포와 유사한 장 력을 발생시키는지는 보다 연구가 필요하다. 6) 신경세포 ADSC의 신경세포로의 분화는 초기에 valproic acid, butylated hydroxyanisole, insulin, 및 hydrocortisone등을 이용하여 신경분화를 유도하고 신경세포의 표식자인 nestin, glial fibrillary acidic protein (GFAP), nestin, NeuN, beta-tubulin등의 발현을 관찰하였다.(79) 그러나, 이후 화학물질을 이용한 신 경분화유도방법에 많은 문제가 있다는 것이 알려졌다.(80) 이후 sphere culture와 성장인자를 조합한 보다 효율적인 신 경분화유도 방법이 제시되었으나(81) 아직 이들 세포가 전 기생리학적으로 신경세포의 특성을 보이는지는 확실치 않 다. 최근 sphere배양방법이나 platelet-derived growth factor, basic fibroblast growth factor, forskolin, GGF-2를 이용하여

4 186 대한이식학회지:제 22 권 제 2 호 2008 ADSC를 기능적으로 Schwann cell과 유사한 세포로 분화하 고 myelin을 생성할 수 있음이 보고되었다.(82,83) 7) 췌장내분비세포 인체 ADSC를 이용하여 nicotinamide, activin-a, exendin-4, hepatocyte growth factor, pentagastrin 처리에 의하여 insulin, glucagon, somatostatin을 발현하는 세포로 분화할 수 있음이 보고되었다.(84) 그러나, 이들 세포가 각 호르몬을 분비하는 지 생리학적 자극에 반응하는지는 명확히 밝혀지지 않았다. 8) 간세포 최근의 연구는 ADSC가 간세포와 유사한 세포로 분화함 이 보고되었으나(85-87) 그 분자적 기작에 대해서는 보다 상세한 연구가 필요하다. 9) ADSC와 다른 조직에서 유래한 MSC의 분화특성차 다양한 조직에서 분리한 MSC의 표면항원의 유사성에도 불구하고 서로다른 조직에서 유래한 세포의 기능적 특성의 차이가 보고되고 있다. 토끼에서 골수와 활막에서 분리한 MSC가 지방 및 근육에서 분리한 세포에 비하여 생체외 연 골분화능이 높고 연골손상의 재생능도 좋은 것으로 보고되 었다.(60) 인체BMSC가 지방유래세포보다 연골 분화능이 높다.(61) 백서의 spinal fusion model에서 bmp-2 adenovirus 로 transduction한 인체 골수와 지방에서 분리한 MSC의 효 능이 유사한 것으로 보고되었으나,(88) 백서의 골막과 골수 에서 분리한 MSC가 ADSC보다 생체외 골분화능과 생체내 골 생성능이 우수하고(62) 동일환자의 다양한 조직에서 분 리한 MSC를 비교한 실험에서 인체ADSC가 BMSC보다 지 방세포로의 분화능은 우수하고 골분화능은 BMSC가 우수 함이 보고되었다.(63) 생쥐후지허혈모델의 혈관재생능은 인체ADSC가 BMSC보다 우수한 효과를 나타내었다.(89) T cell 활성화를 억제하는 능력은 생쥐(90)와 인체(91)의 ADSC와 BMSC사이에 유사한 것으로 보고되었다. 위에서 설명한 바와 같이 다양한 조직에서 유래한 MSC 는 유사한 표면항원발현을 나타내나 분화 및 증식 등의 특 성에 있어 차이를 나타내었고. 배양배지의 조성, 배양시 세 포밀도 및 특정물질 첨가에 의해 ADSC 변화함이 보고되었 다. 이러한 결과는 임상에서 MSC의 사용시 치료대상질환 에 따라 그 목적에 가장 잘 맞는 배양조건 및 MSC의 분리 부위를 선별하는 것이 필요함을 나타낸다. ADSC의 생체효능 및 임상시험 ADSC의 특성과 분화능을 이용한 다양한 생체실험이 진 행되었다(Table 1). 두개골결손모델,(92,93) bmp-2과발현 ADSC를 이용한 장골결손모델,(94) bmp-6과발현 세포를 이 용한 척수융합(95) 등에서 ADSC이식후 생체골재생능에 유 의한 효과가 관찰되었으며 3 4 mm의 토끼연골결손재생에 도(96) 유의한 효과과 관찰되었다. BMSC를 이용한 반월판 재생을 위한 임상시험 1/2 상이 55명의 환자를 대상으로 시 행되었고( 참조) BMSC를 이용한 척추 융합 임상시험도 41명의 환자를 대상으로 성공적으로 수행 되었다.(97) ADSC의 생체효능중 가장 많이 연구된 것이 후지허혈모 델에서 혈관생성촉진효과이다. 생쥐의 대퇴동맥결찰에 의 하여 유도된 후지허혈모델에서 ADSC의 국소이식에 의해 혈관생성이 촉진됨이 보고되었다. Miranville 등(75)은 인체 지방조직에서 CD34(+)/CD31( ) cell이 CD34( )/CD31 ( ) cell에 비하여 효과가 좋음을 보고하였다. Planat-Benard 등은(76) 3일 배양한 세포 (대부분이 CD34+/CD31 )를 이 용하여 동일한 효과를 관찰하였다. Rehman 등(44)은 EGM- MV배지에서 1번 게대 배양한 지방유래세포에서 다양한 혈 관생성인자가 분비되고 세포이식에 의해 후지허혈 생쥐모 델에서 혈관재생능을 관찰하였다. CD34의 발현이 소실된 3회이상 게대배양한 인체 ADSC의 이식시도 혈관재생능이 관찰되고 허혈유도후 1주에 이식시도 유사한 효과가 나타 남이 관찰되었고(45) 그 치료효능 BMSC보다 우수함이 보 고되었다.(89) ADSC의 혈관생성능을 이용하여 피부절편의 접합부에 ADSC를 이식하여 피부절편의 생존능을 향상시 킬 수 있음이 보고되었다.(98) 돼지의 급성심근경색모델에서 자가 ADSC를 관상동맥으 로 주입하여 4주 이후 심장기능의 유의한 증가가 관찰되었 고(99) 단일세포의 투여보다 ADSC로 sheet형태로 배양시 더많은 혈관생성인자와 세포사멸을 억제하는 인자가 분비 되고 심근경색 유도4주후에 심근에 섬유화부위에 이식시 심근의 재생과 기능회복이 일어남이 보고되었다.(74) 현재 급성심근경색환자를 대상으로 BMSC과 지방조직에서 신선 하게 분리한 SVF를 이용한 임상시험이 진행중이다( clinicaltrials.gov/ 참조). 중뇌동맥의 폐쇄에 의해 유도된 뇌경색에서 MSC의 국소 이식에 의해 기능회복이 일어나고(100) 출혈성 뇌졸중모델 에서 인체 ADSC의 정맥투여에 의해 기능이 회복됨이 보고 되었다.(101) 백서에서 자가ADSC의 국소이식이(102)에 의 해 외상성 척수손상에 의한 장애회복에 효과를 나타내고 이러한 효과가 ADSC의 세포추출물을 matrigel에 첨가하여 이식하였을 때도 나타남이 보고되었다.(103) MSCs는 면역억제능을 가지고 있으며( ) ADSC도 BMSC와 유사한 특성을 가진다. 이와 일치하여 생쥐에서 GVHD치료효능이 관찰되었으며(107) 백서의 알레르기성 비염에서도 증상을 완화시키는 효과가 관찰되었다.(108) GVHD(109,110)와 pure red cell aplasia환자(111)에서 효과가 확인되었다. BMSC를 이용하여 GVHD, multiple sclerosis 나 Crohn s disease같은 자가면역질환의 치료에 임상시험이 진 행되고 있다. 특히, GVHD의 경우 32명환자에 대한 임상 2

5 정진섭:Adipose Tissue Derived Mesenchymal Stem Cells 187 Table 1. In vivo studies of ADSC transplantation Preclinical model Donor cells Recipient Administration route References Critical sized femoral defect Cranial bone defects Cranial bone defects Posterior spinal fusion Hemorrhagic stroke model MCAO occlusion Hindlimb ischemia Acute myocardial infaction Myocardial infarction Spinal cord injury Spinal cord injury Wound healing Wound healing Antiaging GVHD Hematopoietic stem cell engraftment Liver Injury Full-thickness cartilage defects Allergic rhinitis mouse model Complex perianal fistula including Crohn's disease Pulmonary emphysema Treatment of tracheomediastinal fistula Chronic osteoarthritis of the coxofemoral joints Improved viability of random pattern skin flaps Cancer oncolytic virus gene therapy Prodrug cancer gene therapy (BMP-2 overexpression) Dog, autologous Pig Autologous Pig Autologous Autologous Mouse Rabbit Dog Nude rat Dog Mouse Pig Mice Pig Mouse Nude mouse Hairless mouse Mouse SCID mouse Nude mouse Rabbit Dog Nude mouse Nude mouse Systemic Intracoronary Monolayer sheet Cytoplasmic extract Systemic Systemic Systemic Systemic Systemic Systemic & systemic ,45,75, , , 상시험이 효과가 입증되어 임상3상에 시험이 진행중이며 steroid로 치료가 Crohn s disease환자 10명의 환자을 대상으 로 임상 2상시험이 진행중이다. 제1형 당뇨병에 대해서도 임상시험도 계획되고 있다( 참조). 연부조직재건과 관련하여 내장장기의 fistula (crohntrials.gov 환자의 항문주위 fistula와 기관종격간 fistula)의 치료효과가 보고되었으며(55,112) Crohn s disease의 fistula의 경우 5명의 환자를 대상으로 임상 1상을 시행하여 8개의 fistula중 6개 가 8주후 완치되는 효과를 보였다.(56) 1상시험결과는 환자 의 수가 적어 효능에 대한 명확한 결론을 내리기 어려우나 2상 시험을 진행할 충분한 근거를 제공하였고 현재 50명의 환자를 대상으로 2상시험이 완료되어 유의한 효과가 관찰 되었다. MSC는 암세포로 선택적으로 이동하는 특성이 있다. 이 러한 특성을 바탕으로 암치료에서 ADSC를 유전자전달체 로 이용하는 연구가 보고되었다. ADSC에 oncolytic adenovirus를 감염하여 정맥으로 전신투여하였을 때 adenovirus만 을 정맥투여하였을 때에 비하여 ADSC의 종양으로의 이동 없이 폐와 유방종양의 치료효과가 증가함이 보고되었다. (113) 치료에 효능이 있고 cytoskine deaminase를 과발현한 ADSC의 피하주사와 전신투여시 생쥐의 피하 인체결장암 model에서 암성장억제효과를 나타내었다.(114) 면역결핍생쥐에 BMSC를 이식한 후 이식한 세포는 조혈 모세포의 niche를 형성하는 골수기질세포, 골모세포, 골세 포 및 내피세포로 분화한다.(115) 따라서 유사한 특성을 가 진 ADSC가 조혈모세포의 골수 안착능을 증가시킬 수 있 다. 실제로 ADSC가 BMSC와 유사한게 방사선조사에 의해 골수파괴한 면역생쥐에서 조혈모세포와 공동이식시 조혈 모세포의 골수안착능을 증가시켰다.(116) 그러나, 백혈병환 자에서 고용량의 항암제투여후 골수재생을 위한 조혈모세

6 188 대한이식학회지:제 22 권 제 2 호 2008 포이식시 BMSC의 공동이식을 한 임상시험에서 MSC의 공 동이식이 조혈모세포단독이식군에 비하여 급성 및 만성 GVHD의 발생을 통계학적으로 유의하게 감소시켰으나 백 혈병의 재발을 현저히 증가시킴이 보고되었다.(117) 이러한 결과는 MSC의 면역억제능이 종양을 가진 환자에서 암의 증식을 촉진할 수 있는 있음을 나타내며 이들 환자에서 MSC의 사용에 특별한 주위가 필요함을 시사한다. BMSC가 bleomycin에 의해 폐손상을 완화시키며 이식한 세포가 일부 폐조직세포로 분화함이 보고되었다.(118) 이러 한 효과가 interleukin 1 receptor antagonist에 매개됨이 보고 되었다.(119) 이러한 MSC의 특성을 일치하여 ADSC의 전신 투여가 폐기종을 완화시킴이 보고되었다.(120) BMSC를 이 용한 만성폐쇄성 폐질환의 임상시험이 진행중이다( clinicaltrials.gov/ 참조). 창상의 회복을 ADSC가 촉진시킴은 다양한 실험모델에 서 보고되었고( ) 피부의 주름살을 감소시키는 효과 도 보고되어(124) 지방성형에 의한 피부성형효과를 뒷받침 함을 제시하였다. ADSC가 그 효율은 낮으나 간세포로 분화함이 보고되었 다.(85-87) 실제로 사염화탄소에 의해 유도된 간손상에서 인체 ADSC의 정맥내 투여가 간기능의 회복을 촉진하고 이 들 세포의 일부가 간세포로 분화함이 보고되었다.(125,126) 그러나, 세포융합의 가능성에 대한 보다 세밀한 연구가 필 요하다. 그외에 작용기전은 명확하지 않으나 개의 고관절의 만성 골관절염에서 자가 ADSC의 이식효과에 대한 다기관 임상 시험결과 유의한 증상완화가 관찰되어(127) 앞에서 언급한 bleomycin에 의한 폐손상억제작용과 함께 ADSC의 항염증 작용을 시사하고 있다 ADSC의 생체효능기전 ADSC의 다양한 생체효능을 나타내는 기전은 1) 이식한 ADSC에서 분비된 다양한 cytokine과 성장인자들 이 paracrine manner를 통하여 조직손상을 회복시킨다. 2) ADSC가 stem cell niche를 변화시켜 내재성 줄기세포의 동원과 분화를 촉진한다 3) ADSC가 항상화물질, free radical scavenger, chaperone/ heat shock protein을 제공하여 국소에 유리된 유해물질을 제거하여 손상세포의 생존 증가 4) 손상세포로 이식한 줄기세포의 mitochondria를 전달하여 세포기능을 회복한다.(128) 5) 이식한 지방세포가 다양한 손상조직세포로 분화한다. 6) 면역기능조절 MSC가 면역조절작용을 가짐은 BMSC가 T세포의 증식을 억제함을 관찰함으로써 제시되었다.(129,130) ADSC도 BMSC 와 유사하게 생체외에서 면역억제작용을 나타냄이 보고되 었으나( ) ADSC의 면역억제작용의 기전은 명확히 연구된 바가 없다. MSC의 면역조절작용은 BMSC에서 주로 연구되어 MSC에 의한 면역조절작용은 innate 및 adaptive immune system과의 상호작용을 통해 나타나며 세포간의 직 접접촉과 다양한 용해성 물질이 관여하는 것으로 알려졌 다. Nitric oxide와 indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO)는 표적 세포에서 분비된 IFNγ에 의해 MSC로 부터 분비가 유도되 고(134,135) Transforming growth factor-β1 (TGF β 1), hepatocyte growth factor (HGF), IL-10, PGE2, haem oxygenase-1 (HO1), IL-6 와 soluble HlA-G5는 MSC에서 일정하게 만들어 진다.(104,129, ) IDO는 국소환경에서 임파구증식에 필요한 tryptophan을 고갈시켜 작용한다. IDO는 IFNγ를 생 산하는 TH1 세포의 증식을 억제하고(134) MSC에서 유리되 는 prostaglandin E2와 함께 NK세포의 활성을 억제한 다.(106,134) MSC는 NO생성을 통하여 T세포 활성화를 억 제한다.(141) MSC에 의해 생산된 용존성 HlA-G5는 T 세포 의 증식, NK세포와 T 세포의 세포독성을 억제하고 조절 T 세포의 생성을 증가시킨다.(136,142) PGE2는 수지상세포의 분화와 NK세포 및 T세포에 대한 작용을 억제한다. 임상에서 자가세포를 사용하는 것은 거부반응 및 감염의 위험성을 피할 수 있어 최선의 선택이다. 하지만 환자의 상 태에 따라 자기조직의 양이 충분하지 않거나 병적상태에서 자가줄기세포의 기능저하가 나타날 경우가 있고 분리한 자 가세포의 치료효능에 대한 개인적인 차이에 의해 치료효능 저하등의 문제가 생길 수 있다. 병적상태에서 줄기세포의 기능저하는 순환기질환환자에서 내피전구세포에서 보고되 었고,(143,144) 백서의 당뇨병모델에서 분리한 ADSC의 기 능이 감소됨이 보고되어(145) 당뇨병환자에서도 유사한 현 상이 나타날 가능성이 있다. 또한, 급성상황에서 사용해야 할 경우 치료가 필요한 시점에 충분한 수의 세포를 확보하 지 못하는 경우가 생길 수 있다. 이런 경우는 타인에서 분리 한 ADSC의 동종이식을 고려해야 한다. ADSC는 MHC class I을 발현하나 게대배양에 따라 MHC class II antigen의 발현이 감소하고 costimulatory molecule인 CD80과 CD86(133)을 발현하지 않으므로 거부반응을 유도 하지 않는 것으로 간주되고 있다.(43,91) 실제로 면역억제제 투여없이 실험동물에 투여한 인체 MSC를 이식한 경우나 (100) 동종 MSC를 이식한 경우,(146) 임상시험에서 투여한 동종세포들이 장시간 생체내 존재함이 보고되고 있어 이러 한 가정을 뒷받침한다. 미분화상태의 ADSC가 낮은 면역성 을 나타내나 분화과정동안 조직거부반응관련 유전자의 발 현이 변화할 가능성이 있다. 다른 세포로의 분화에 대하여 는 연구된 바가 없으나 골분화과정동안의 면역학적 특성은 변화하지 않는 것으로 알려졌다.(147) 그러나, 일부보고에 서 MSC의 조직거부반응이 보고되었고(148,149) 현재까지 시행된 동종세포를 이용한 임상시험의 개수가 많지 않으므 로 이를 광범위하게 적용하기 전에 보다 정밀한 연구가 필

7 정진섭:Adipose Tissue Derived Mesenchymal Stem Cells 189 요하다. 그러나, 앞에서 언급한 바와 같이 ADSC의 치료목 적이 손상조직의 대체를 위한 장기간의 이식세포생존이 아 니고 이식세포에서 유리되는 물질이나 자가재생능 복원의 단기간의 효과가 목적이라면 동종세포의 임상적 사용을 보 다 광범위하게 고려할 필요가 있다. 타인에서 분리한 ADSC 를 사용하게되면 치료제의 대량생산에 의한 치료비용의 감 소, 응급상황에서 준비된 세포의 사용, 사전에 효능이 검정 된 세포의 사용등이 가능하게 되는 장점이 있다. MSC의 종양에 대한 작용은 복합적이다. 실제로 MSC가 종양으로 이동함을 이용하여 항암유전자나 oncolytic virus 를 이용한 유전자치료에 운반체로 이용될 수 있음이 보고 되었다.(113,114) 그러나, 그 빈도는 낮으나 4 5개월 체외 배양한 ADSC자체로부터 종양이 형성될 수 있다는 보고가 있다.(15) 또한, MSC가 종양으로 이동하여 종양관련 기질 을 형성하고(150,151) 기질과 종양세포의 상호작용이나 혈 관생성(152)에 의하여 흑색종등 일부 종양의 증식, 유방암 의 전이(147,148)를 촉진함이 보고되었다. 종양의 기질로 이 동한 MSC자체는 악성은 아니나 종양세포와 상호작용하여 그 특성이 바뀌고 종양의 증식을 지지할 수 있다. 난소암에 서 분비된 lysophosphatidic acid가 MSC를 myofibroblast로 분 화하고 SDF-1의 생성을 증가시켜 암의 진행을 촉진할 수 있고,(155) ADSC와 폐종양 및 신경교종세포주를 공동이식 하였을 때 종양증식이 증가함이 보고되었다.(156) 또한 MSC가 면역억제기능을 가지므로 종양을 가진 환자에게 MSC의 투여가 종양성장을 촉진할 가능성이 있다. 실제로 MSC를 투여한 백혈병환자의 임상시험에서 백혈병의 재발 이 현저히 증가함이 보고되었다.(117) 따라서, MSC의 임상 적용에 있어 보다 세심한 주의가 필요할 것이며 이를 극복 하는 연구가 세포치료제의 개발에 중요하다. 조직손상의 치료에 줄기세포를 사용하는 경우 표적장기 에 쉽게 도달할 수 있게 국소투여하는 것이 바람직하다. 그 러나, 중추신경계와 같이 손상부위의 해부학적위치가 직접 투여가 어렵거나 손상이 전신적으로 진행되는 경우 세포의 전신투여가 불가피한 경우가 있다. MSC는 다른 줄기세포 와 같이 손상조직으로 선택적으로 이동하고 engraftment도 손상조직에서 보다 잘 일어나는 특성을 가지고 있다. 이러 한 효과가 손상초기에 이식시 더 현저하게 나타나며 손상 이 일어난 후 시간이 지남에 따라 그 효과는 감소한다. 이는 손상조직이 MSC를 손상부위로의 이동을 용이하게 하는 특 정수용체나 ligand를 발현과 관련있는 것으로 생각된다. MSC가 손상부위로 이동하는 기작은 완전히 밝혀져 있지 는 않다. 조혈모세포의 동원과 허혈조직으로의 내피전구세 포의 동원에 CXCL12 (SDF-1)과 이의 수용체인 CXCR4가 중요한 역할을 한다.( ) MSC도 CXCR4를 포함하여 다양한 chemokine의 수용체를 발현하며, MSC는 종양으로 선택적으로도 이동하는 것으로 알려져 있다. 유방암의 경 우 이 과정에 monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1)이 관 여하나,(160) 다른 연구결과 전립섭암, 대장암 및 유방암세 포주에서 얻어진 SDF-1에 MSC가 반응한다는 보고도 있 다.(161) 만성신경교종의 경우 MSC의 동원에 IL-8, TGF-β 와 VEGF가 관여하는 것으로 알려졌다.(162) 결론 및 향후 전망 줄기세포를 이용한 난치성질환의 치료가능성은 새로운 의학기술의 가능성을 제시하고 있다. 이중 양이 많고 반복 적으로 채취가 가능한 피하지방은 MSC의 이상적인 공급원 으로 사용될 수 있다. ADSC는 기본적으로 BMSC와 유사한 분화와 증식특성을 가지고 있고 중배엽성 세포이외에 신 경, 혈관 및 간세포등으로의 분화가능성이 제시되어 세포 치료와 조직공학을 이용한 임상적용을 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. MSC를 이용한 전신적으로 투여한 MSC가 transdifferentiation의 증거가 명확하지 않음에도 다양한 질 병의 급성기에 효과를 나타냄은 MSC가 처음 기대한 손상 세포대체보다 세포증식억제, 혈관생성 촉진, 항염증작용 및 면역조절작용 등 손상조직의 미세환경조절을 통해 생체작 용을 나타냄을 시사한다. 이러한 작용은 손상조직의 보호 와 재생기능을 촉진하는 다양한 항염증 cytokine, 세포사억 제물질이나 세포생존촉진물질의 유리를 통하여 일어난다. 이는 이식한 MSC와 면역세포등 손상부위주위세포나 내재 성 줄기세포와의 상호작용 및 손상조직 미세환경의 변화를 이해하는 것이 MSC의 치료효능의 예측과 항진기술개발에 중요함을 나타낸다. 또한, 이식한 MSC가 생체조직에서 얼마나 오래 남아있을 수 있는 지, 증식이 가능한지를 밝히는 것도 장기적인 부작 용의 예측과 동종이식의 허용범위설정에서도 중요하다. 세포치료제로의 본격적인 임상적용을 위해서는 MSC의 면역거부반응이 낮다는 연구결과에도 불구하고 동종이식 후 생체 면역거부반응에 대한 보다 명확한 이해가 필요하 나 MSC의 치료대상질환이 이식한 세포의 장기적인 생착을 필요로 하지 않는 경우라면 보다 광범위한 동종이식을 검 토해볼 필요가 있다. MSC는 장기체외 배양시 나타날 수 있는 세포유전학적인 변화와 설치류에서 관찰된 종양형성등의 위험성이 제기될 수 있으나 MSC는 항암치료나 GVHD치료에서 이미 대량으 로 인체투여되어 종양형성보고가 되지 않는 등 다른 줄기 세포에 비하여 비교적 안전성이 검증된 상태이다. 그러나, 제한된 환자수로 아직 명확한 결론에 도달하기는 어려우며 골수이식과 대량의 항암제를 투여하는 환자의 특성에 의해 부작용이 묻힐 가능성도 배재할 수 없다. 다른 위험성은 이 미 보고된바와 같이 MSC에의한 종양성장촉진, 종양재발과 전이촉진이다. ADSC를 포함한 MSC는 다양한 질병의 치료에 이용될 가 능성을 가지고 있고 실제로 일부 질환에 대해서는 임상시

8 190 대한이식학회지:제 22 권 제 2 호 2008 험단계에 진입해 있다. 하지만 MSC의 세포치료제로의 광 범위한 적용을 위해서는 이들의 생체내외에서의 특성에 대 한 보다 깊은 이해와 부작용을 최소화하는 연구가 병행되 어야 한다. REFERENCES 1) Friedenstein AJ, Chailakhjan RK, Lalykina KS. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells. Cell Tissue Kinet 1970; 3: ) Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Hedrick MH, et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng 2001;7: ) da Silva Meirelles L, Chagastelles PC, Nardi NB. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci 2006;119(Pt 11): ) Sen A, Lea-Currie YR, Sujkowska D, Franklin DM, Wilkison WO, Gimble JM, et al. Adipogenic potential of human adipose derived stromal cells from multiple donors is heterogeneous. J Cell Biochem 2001;81: ) Rodbell M. Metabolism of isolated fat cells. II. 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