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1 완 결 과 제 최 종 보 고 서 일반과제( ), 보안과제( ) (과제번호 : PJ007449) 셀룰로오스계 농업부산물 이용 바이오에탄올 생산기술 개발 (Development of Bioethanol Production Technique Using Lignocellulosic Agricultural By-prodcuts ) 국립식량과학원 농촌진흥청

2 제 출 문 농촌진흥청 장 귀하 본 보고서를 셀룰로오스계 농업부산물 이용 바이오에탄올 생산기술 개발 과제의 보고서로 제출합니다. 제1세부연구과제 : 부산물 당화효소 생산체계 구축 제2세부연구과제 : 부산물의 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스 당화균주 개발 제3세부연구과제 : 농업부산물 바이오매스의 전처리 방법 및 당화 발효 최적조건 확립 제1협동연구과제 : 농업부산물 대량 확보 및 수거 시스템 구축 제2협동연구과제 : 농업부산물로부터 분해균주(곰팡이)이용 당전환 기술개발 제3협동연구과제 : 섬유소의 당화 및 에탄올 발효 통합공정을 위한 균주 개발 주관연구기관명 : 국립식량과학원 바이오에너지작물센터 주관연구책임자 : 구 본 철 연 구 원 : 구 본 철, 김 중 곤 : 윤 영 미 : 차 영 록 제1협동연구기관명 : 순천대학교 제1협동연구책임자 : 박 금 주 제2협동연구기관명 : 김 훈 제2협동연구책임자 : 김 정 호 주관연구책임자 : 구 본 철 주관연구기관장 : 국립식량과학원장 직인

3 요 약 문 Ⅰ. 제 목 셀룰로오스계 농업부산물 이용 바이오에탄올 생산기술 개발연구 Ⅱ. 연구개발의 목적 및 필요성 섬유질 바이오매스는 가용 에너지 자원의 96%에 달하며, 주로 섬유소, 헤미셀룰로스, 리그닌을 가수분해하여 다양한 단당류가 생산됨. 섬유질 바이오매스로부터 확보된 다당류를 원재료로 하여 환경 친화적인 물리 생물학적 방법으로 xylose, arabinose, glucose 등을 얻는 공정을 확립하고, 이를 원료로 바이오알코올을 생산하면 환경 친화적으로 바이오매스를 활 용할 수 있으며, 고부가가치 창출 및 폐기물 처리비용 절감을 통해 농가소득 증대 및 관련 산업체의 이익창출에 기여할 수 있음 Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위 농업부산물이용 바이오에탄올 생산 기술 개발 셀룰로오스계 농업부산물 종류별 특성분석 셀룰로오스계 농업부산물의 고효율 에탄올 전환 미생물 이용기술 개발 우수 셀룰로오스 당화효소 최적생산조건 확립 셀룰로스계 농업부산물 대량확보 방안 및 수거시스템 구축 곰팡이 유래 셀룰로스계 농업부산물 분해 및 당화용효소 고농도 생산 농업부산물로부터 Z. mobilis와 혐기성 섬유소 분해효소 생산 미생물 혼합/단계적배양을 통한 효율적인 에탄올 생산 공정 개발 효모유전공학을 이용한 통합공정발효균주 개발 Ⅳ. 연구개발결과 초식동물 배설물로부터 cellulose 분해활성이 있는 Bacillus sp. H9-1의 분리 및 효소 생산 최적화 초식동물 배설물로부터 xylan 분해활성이 있는 Bacillus pumilus H10-1 균주의 분리 및 효 소 생산 최적화 발효당 추출용 고온 폭쇄 전처리 장치 및 CO 2 혼합 알카리 전처리 방법 개발 부산물 발생량 분석과 biorefinery의 규모에 따른 시기별 농업부산물 소요량 및 확보 방안 바이오에탄올 생산을 위한 부산물 수거체계 분석 바이오에탄올 원료 수거 체계의 경제성 분석 GIS를 이용한 수거 체계 최적화

4 Ⅴ. 연구개발결과의 활용계획 섬유소 분해효소 생산 및 우수 생산 균주 개발 분야의 기초자료 활용 셀룰로오스계 바이오매스를 이용한 바이오에탄올 생산공정 규모화연구의 기초자료 전처리 조건 확립을 위한 변수 최적화연구에 활용 정책제안 활용 - 농업 자원(볏짚, 보리짚, 조사료) 수거시스템 구축을 위한 정책제안으로 활용 분자모델링을 통하여 바이오매스 분해효소의 활성을 개량할 수 있음. 고발현된 신규 Y. lipolytica 라카아제 및 메타게놈 유래 xylanase Xyn10J를 이용하여 당 화효율을 개선할 수 있음. 환경 친화적, 물리적 및 생물학적 방법으로 농업부산물 바이오매스의 산업적 용도를 창 출하고, 다른 기능성 유용물질의 생산에 적용할 수 있음. 본 연구과정에서 얻어진 효소의 yeast surface display 기술을 활용하여 타 세부과제의 연구 결과 얻어진 고활성 섬유소 분해효소를 surface display한 효모 형질전환체를 개 발하고자 함

5 S U M M A R Y Title : Development of Bioethanol Production Technique Using Lignocellulosic Agricultural By-products The importance of bioenergy production has increased because of deficit of fossil energy and for the preparation of climate change. Collection system of raw materials for bioenergy production is required. As the agricultural byproducts is dispersed widely, reasonable collection system is required considering geographical dispersion, road network, transporting facility and collection cost. We analyzed the generation and utilization of cellulose agricultural byproducts according to season and region, the collection cost of agricultural byproducts, and how to decide the biorefinery place and optimize the collection system using GIS. Forty one microorganisms, expected to be cellulolytic or xylanolytic microorganisms were isolated from various environmental samples, such as soil, miscanthus residue, horse manure, compost, humus, etc. These strains were screened at 35 by using plate count atgar containing 1% (w/v) carboxymethyl cellulose (CMC) or xylan (from the beech wood) instead of glucose. All of them were rod form and gram positive strains. Among the strains, both D1 and E2 microbial strains, which have high cellulase and xylanase activities, were characterized and identified as Bacillus subtilis by analysis of 16S rdna sequence and biochemical studies, and named as B. subtilis D1 and E2, respectively. The maximum cellulase activities of D1 and E2 were 38.5 and 30.9 IU. Optimum temperature and ph of D1 and E2 for the cellulase activity were 50, ph 6 and 7, respectively. The cellulase activity was strongly inhibited by Al +++ and Zn ++. The maximum xylanase activities of D1 and E2 were and IU. Optimum temperature and ph of D1 and E2 for the cellulase activity were 60, ph 10 and 11, respectively. The cellulase gene was cloned from each B. subtilis D1 and E2 genomic DNA by polymerase chain reaction (PCR). The amplified PCR products were ligated with the T&A cloning vector system and the constructed plasmids were transformed into E. coli DH5α. The sequence analysis of the insert DNAs revealed the identification of a 1,499-bp region containing cellulase open reading frame. According to cellulase gene sequence analysis, B. subtilis D1 had gene sequence similarity of 98% with B. subtilis strain AH18 cellulase gene (EF ) and B. subtilis I15-endo-1,4-beta-glucanase (FJ ). In case of B. subtilis E2, it had gene sequence similarity of 99% with B. subtilis strain AH18 cellulase gene (EF ) and B. subtilis CMCase gene (D ). The recombinant plasmid (including B. subtilis D1 cellulase gene) which was ligated with pet-28a(+) vector was expressed in E. coli BL21 and the expressed fusion protein was analyzed by SDS-PAGE. A new specific band with molecular weight of about 50 kda was obtained from cellular extract of E. coli BL21

6 harboring cellulase gene. IPTG concentration and induction time were optimized for expression of cellulase gene. Optimal IPTG concentration and induction time 0.1 mm and 1 hr, respectively. SS8 and SS10 microbial strains were isolated from soil of sweet sorghum field. These strains which have high xylanase activities, were characterized and identified as Staphylococcus sp. by analysis of 16S rdna sequence and biochemical studies, and named as Staphylococcus sp. SS8 and SS10, respectively. The optimum temperature and ph for xylanase activity of Staphylococcus sp. SS8 and SS10 were 50 and 9.0, respectively. The xylanase activity was strongly inhibited by Al +++. The xylanase gene was cloned from SS8 and SS10 genomic DNA by polymerase chain reaction (PCR). The amplified PCR products were ligated with the T&A cloning vector system and the constructed plasmids were transformed into E. coli DH5α. The sequence analysis of the insert DNAs revealed the identification of a 640-bp region containing xylanase open reading frame. According to xylanase gene sequence analysis, both strains had gene sequence similarity of 99% with Bacillus subtilis Xyl gene for xylanase (AB ). This study was performed to find cellulolytic/xylanolytic strain of enzymatic saccharification for bioethanol production. Cellulolytic/xylanolytic strains were isolated from 59 different feces of herbivores from Seoul Grand Park located in Gwacheon Gyeonggi-Do. And cellulolytic/xylanolytic bacteria in Korea for exploring, soil, rice straw, leaves were sampled at 139 points, from which 326 strains were isolated. The celluloytic/xylanolytic strains were selected by congo red staining and DNS method. Among the isolated strains, H9-1 strain isolated from the feces of rabbit has the highest CMCase activity. H9-1 strain was identified as Bacillus sp. based on 16S rdna gene sequencing. The optimal conditions for CMCase activity by Bacillus sp. H9-1 were at 40 and at initial ph 8. And among the isolated strains, H10-1 strain isolated from the feces of ceratotherium simum has the highest xylanase activity. H10-1 strain was identified as Bacillus pumilus based on 16S rdna gene sequencing. The optimum culture time for xylanase activity of Bacillus pumilus H10-1 were 8 days. Saccharification of pretreated rice straw by crude enzyme extract from Bacillus pumilus H10-1 resulted in release xylose, respectively The effective pretreatment technology for lignocellulosic biomass is presented. We newly developed temperature and pressure-controlled expansion reaction system and CO 2 -mixed physicochemical pretreatment method. This system consists of a reactor with high temperature and pressure in upper side, and a separator with low temperature and pressure in bottom. To hydrolyze biomass, 3MPa of CO 2 was loaded into the reactor. After reaction, the sample spouted into the separator with 6MPa N 2 pressure. Rice straw material, milled into 0.3mm and drying at 50 for one day was used for pretreatment. At that time, the water content of the sample was under 5%. Compositional analysis of rice straw was performed by NREL protocol, and it consisted of 36.6% cellulose, 24% hemicellulose, 20% lignin, and 11% ash. The sample was pretreated with 4.48% NaOH solution at for 29.4minutes using our new developed pretreatment system. Especially NaOH and CO 2

7 mixed solution were used for the pretreatment of rice straw. As a result of the pretreatment, the sample was changed to 70.7% cellulose and 23.2% hemicellulose with 35.8% solid remaining. In conclusion, the yield of ethanol is 97% For saccharification, novel enzymes degrading cellulosic materials should be screened, isolated, and improved from microbial sources including metagenomes, especially from fungal systems. In this study, the enzymes were screened from various domestic fungal sources and the enzymatic properties were improved based on QM/MM methods. Novel strains were screened; Fomitopsis rosea for xylanase, Agaricus arvensis, Trametes hirsuta, and Penicillium pinophilum for cellulase, Stereum hirsutum for β-glucosidase (ShBGL), and Pholiota adiposa for lignocellulase. Genes coding Chaetomium globosum xylanase (Chxyn), Penicillium pinophilum β-glucosidase (Ppibgl), cellulase (Ppieg12), endoglucanase (eg), Neosartoya fischeri β-glucosidase (NfBGL) were cloned. Chxyn and NfBGL were successfully improved in their enzymatic properties by the QM/MM modeling. Novel laccase was isolated from Yarrowia lipolytica and expressed in Pichia pastoris. Saccharification degree of cellulosic substrates was increased with the laccase by removing phenolic compound, the hydrolysis inhibitors. The saccharification degree was also increased by addition of culture filtrates produced with consortium culture, Stereum hirsutum (BGL) and Schizophilum commune (EG and CBH). The fungi were cultured in 70 L fermenters with optimized conditions. The hydrolytic enzyme, lignocellulase from Pholiota adiposa was immobilized on SiO 2 particles and the enzymes were stable up to 90% after 25 cycles of the column. The efficiency of the saccharification was improved by the addition of bacterial xylanase and lichenase. The findings in this study will be useful in the degradation of various cellulosic materials including agricultural by-products in case of bioethanol production. Bioethanol production process from agricultural products includes pretreatment of the cellulosic material to improve the digestibility, digestion of the cellulosic material by physical, chemical, and/or enzymatic treatment, ethanol fermentation from the produced fermentable sugars using ethanol producing microorganism, and distillation and dehydration of biothanol. Up to now, digestion of cellulosic material and fermentation of fermentable sugars are carried out by separate process. It would be economical and time-saving if the digestion and fermentation could be performed through a integrated process. Theoretically, integration of the process could be accomplished by co-culture of the cellulose-degrading and ethanol fermenting microorganisms or using ethanol fermenting microorganism into which cellulose degrading capability has been artificially introduced. This study was performed to surface display cellullose degrading enzymes required for complete digestion of cellulose, endoglucanse, β-glucosidase, and cellobiohydrolase, on a yeast host strain to develop a yeast strain that can be used for the integrated saccharification and fermentation process for the bioethanol production from agricultural by products. A tri-functional cellulase gene, cel44, was isolated and amplified from Paenibacillus polymyxa by PCR and was introduced into pct, a yeast surface display vector system.

8 The construct pct/cel44 was then introduced into a yeast strain, Saccharomyces cerevisiae EBY100, to display the enzyme on the host. The transformant was found to show endoglucanse activity. A β-glucosidase gene, bgl, was isolated and amplified from Neosartory fischeri Nf1595 and was surface-displayed on the yeast strain as cel44. A cellobiohydrolase gene, cbh, was isolated and amplified from Fusicoccum sp. BCC124 and was surface-displayed on the yeast strain. A fused gene, containing endoglucanse, β-glucosidase, cellobiohydrolase, and cellulose binding domain genes was constructed by site-directed mutagenesis, restriction enzyme digestion, and overlapping PCR. After ligation with pct, the construct was then introduced into a yeast strain for the surface display of the fused enzyme. The transformant was found to be able to digest cellulosic material and to produce ethanol from the digested fermentable sugars. The bioethanol production through the co-culture of cellulose-degrading and ethanol fermenting microorganisms was found not to be feasible due to the delayed production of cellulose-degrading enzymes, the requirements for additional nutrients for the growth of microorganisms, the low concentration of substrate that can be added to the medium, and the low concentration of fermentable sugars in the growth medium. The effect of NaOH pretreatment on structural features of agricultural by products, rice straw, wheat straw, barley straw, and M iscanthus sinensis was also investigated by scanning electron microscopy, atomic force microscopy, Fourier transmittance infrared spectroscopy and X-ray diffraction. The results of this study could be used for the construction of industrial yeast strain that can simultaneously carry out saccharification and fermentation.

9 목 차 제 1 장 서 론 1 제 2 장 국내외 기술개발 현황 10 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 17 제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 239 1절 목표대비 대외 달성도 239 2절 정량적 성과 241 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 249 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 250 제 7 장 기타 중요 변동사항 251 제 8 장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비 현황 252 제 9 장 참고문헌 253

10 제1장 서 론 제1절 부산물 당화효소 생산체계 구축 산업발전과 인구증가는 화석연료 사용량의 증가를 초래하였고, 이로 인해 지구환경 파괴와 함께 자원고갈 문제의 우려를 낳고 있다. 석유자원이 최대로 많이 생산되는 시기를 오일피 크(oil peak)라고 하며, Hubbert나 Camphell의 분석결과에 의하면 현재 세계의 석유생산량은 벌써 오일피크에 도달했다고 한다[1]. 오일피크를 지나면서 해마다 석유 생산량이 감소되는 반 면 석유자원의 가격이 상승됨으로 인해 국가 에너지 안보차원에서 석유대체에너지에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 또한 식량작물의 바이오에너지로의 이용은 국제 곡물가 상승과 그에 따른 후진국의 식량 파동으로 국제적인 식량 윤리문제를 야기하고 있다. 이와 더불어 국내 에너지소비는 1970 년에 43,911천toe인 반면 2008년의 경우 238,135천toe로 급격히 증가하고 있으며, 에너지 수 입 의존도 또한 1970년 47.5%에서 2008년에는 96.4%로 두배이상 증가하여 막대한 에너지 사용 요구로 대체에너지 생산 공정의 개발 및 원천기술 개발을 통한 에너지 자립 기술 확 보고 시급하다. 최근에 섬유소계 바이오매스를 이용한 바이오에너지에 대한 관심이 전세계적으로 증가됨 에 따라 비식량작물인 섬유소계 바이오매스의 cellulose와 hemicellulose의 효율적인 당화를 위해 cellulase와 더불어 xylanse에 대한 연구가 활발해지고 있다. 섬유소계 바이오매스의 경우 발생양이 많고 값이 싸며, 포도당으로 가수분해될 경우 많은 미생물에 의해 발효 및 생물전환이 가능한 기질이기 때문에 바이오에탄올 생산을 위한 적합한 원료이다. 특히 고 효율의 바이오에탄올을 생산하기 위해 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스로부터 발효가 가능한 단당으로 경제적으로 많은 양을 전환시킬 수 있는 우수한 섬유소 당화 효소가 확보 되어야 한다. 게다가 셀룰로오스계 바이오매스 바이오에탄올 생산 공정의 생산 비용 중 바이오매 스 당화과정에 필요한 셀룰로오스 당화효소가 차지하는 비율은 약 20%이며, 우수한 효소 대량생산은 바이오에탄올 산업화에 반드시 필요하다. 본 연구에서는 우수한 섬유소 당화효소를 발굴하여 효소의 특성을 조사하고 대량생산을 위한 기초 자료로써 생산조건을 탐색하고자 하였다. 제2절 부산물의 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스 당화균주 개발 최근 환경오염과 화석연료의 고갈문제로 대체 에너지에 대한 관심이 많아지고 대체에너지의 하나로 재생 가능한 바이오에탄올에 대한 연구가 활발히 수행되고 있다. 초기 바이오에탄올 원 료로는 사탕수수와 같은 당질계와 옥수수와 같은 전분질계 바이오매스가 주로 연구되었고, 실 제 이를 원료로 바이오에탄올을 생산하여 수송용 바이오연료로 이용되고 있다. 현재 바이오연 료는 전 세계적으로 전체 수송연료의 1% 정도를 차지하고 있으나 2030년에는 최대 5%까지 늘어날 것으로 예상된다 그러나 이러한 당질계와 전분질계 바이오매스는 식량자원이어서 바이 오에탄올 생산에 따른 개도국의 식량수급 불균형으로 설탕, 식량 등의 가격 폭등을 초래한 애 그플레이션의 원인으로도 지탄받았다. 이와는 달리 섬유질계 바이오매스의 경우, 식량자원으로 바이오연료를 생산한다는 논쟁에서 자유로워 이를 이용하여 바이오에탄올을 생산하려는 연구 - 1 -

11 에 박차를 가하고 있다 특히 볏짚 등의 섬유질계 바이오매스는 지구상에 아주 풍부하게 존재 하고 있어 이용 가능성이 높다. 그러나 이들을 이용한 바이오에탄올 생산을 위해서는 미생물 발효가 가능하도록 섬유소의 당전환이 필요하며 이를 위해 섬유소 분해효소를 이용한다. 본 연 구는 자연계에 널리 분포하는 섬유소의 이용 효율 증대를 위한 섬유소 분해효소 생산 균주를 탐색, 분리, 동정하는데 그 목적이 있다. Cellulase는 복합효소로서 endoglucanase(ec ), exoglucanase(ec ) 및 β -glucosidase(ec ) 등의 3가지 유형의 효소들로 구성되어 있으며, 이들 효소는 기질의 활성도 특성에 따라 각각 CMCase, avicelase 및 PNPGase로 구분하기도 한다. 섬유소 분해효소는 곰팡이, 세균, 방선균 등 여러 미생물들에 의해 생산된다. 특히 Tricodema reseei, Aspergillus niger 등의 곰팡이가 생산하는 cellulase는 활성이 우수하여 Genencor, Novozyme 등에서 이들이 생산하는 효소를 생산 판매하고 있다. 곰팡이가 분비하는 cellulase는 일반적으로 약산성 영역에서 높은 활성을 보이는 반면, 세균이 생산하는 효소는 중 성 또는 알칼리성에서 최대 활성을 주로 나타내는 것으로 보고되고 있다. 볏짚 등의 초본계 바 이오매스의 전처리에는 황산 등의 산을 이용한 전처리보다 암모니아, NaOH 등 염기 처리가 더 효율적이며, 처리 후 섬유소의 효율적인 당전환을 위해서는 중성이나 염기조건에서 효과적 으로 cellulase를 생산하는 미생물이 유용하다. 현재 섬유소 분해효소를 생산하는 세균에 대한 연구가 많이 진행되고는 있지만 산업화되어 이용되고 있지는 않은 실정이다. 따라서 본 연구에 서는 초본계 식물을 먹이로 하는 초식동물의 배설물 및 국내자연환경으로부터 섬유소 분해효 소를 생산하는 균주를 분리 동정하고자 하였다. 또한 섬유질 분해효소를 생산하는 분리 균주 의 최적 효소생산조건을 구명함으로써 국내 바이오에탄올 생산관련 분야의 발전에 기여하고자 한다. 제3절 농업부산물 바이오매스의 전처리 방법 및 당화, 발효 최적조건 확립 화석연료 고갈 예상으로 인한 국제유가의 불안정, 지구온난화 및 환경오염 우려로 인한 온실가 스 절감 요구 등 대체에너지 개발의 필요성이 급증하고 있다. 대체에너지 중에서 식물 바이오 매스 이용한 바이오에너지 개발에 대한 관심이 고조되고 있다. 전분계 및 당질계인 1세대 바이 오알코올은 미국 및 브라질에서 이미 산업화되었지만 곡물 가격의 급등에 따른 새로운 문제가 야기되고 있다. 이를 해결하기 위해서는 지구상에 가장 풍부하며 재생산이 가능한 섬유질계 바 이오매스를 이용하는 기술 개발이 절실히 필요하다[1]. 섬유질계 바이오매스는 종류에 따라 조 금씩 다르나 섬유소(Cellulose)가 38-50%, 헤미셀룰로스(Hemicellulose)가 23-32%, 리그닌 (Lignin)이 15-25%로 되어 있으며, 이 3종류의 섬유질 성분이 효율적으로 분해되어야 한다. 섬 유질계 바이오에탄올을 생산하려면 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스와 같은 다당류를 전처리, 당 화, 발효하는 과정이 필요하다. 이중에서 첫 번째 단계인 전처리 공정은 아직 해결되어야 할 문제점이 많다. 화학적 전처리는 에너지 소모, 고가의 생산 장비, 폐기물의 처리비용 등으로 인 하여 생산단가가 높아질 뿐만 아니라 정제의 어려움이 있다. 바이오에탄올 생산을 위한 목질계 바이오매스의 생물공학적 전환을 위해서는 효율적인 전처리 기술, 특히 물리 및 생물학적 방법 이 융합된 새로운 전처리 방법이 필요하다.[2] 현재는 물리적 전처리인 폭쇄법이 가장 효과적 인 방법으로 평가되고 있으나 불순물 및 고가의 생산 장비 등의 단점이 있다[3-4]. 이 문제를 해결하기 위하여 고효율전처리와 효소처리를 연계한 당화 공정 개발이 요구된다. 섬유질계 바 - 2 -

12 이오매스를 전처리하여 셀룰로오소와 헤미셀룰로오스를 추출한 후에는 발효에 필요한 글루코 스와 같은 단당으로 분해하기 위한 효소당화 공정이 필요하며, 이때 가장 중요한 부분이 효소 이다. 섬유질 분해 효소는 현재 Novozymes 사와 같은 글로벌 기업에서 연구개발 및 시제품 생산이 진행되고 있지만, 아직 효소가격이 고가이므로 경쟁력있는 효소생산이 필수적이다. 또 한 발효공정에서는 동시당화발효에 적합한 고온내성 균주 및 5탄당 발효균주등 에탄올 생산성 을 향상시킬 수 있는 발효균주 개발이 필수적이다. 본 연구에서는 섬유질계 바이오에탄올 생산기술 개발 중에서 농업부산물를 이용한 전처리기술 개발를 위한 연구개발에 중점을 두며, 전처리 조건 검정을 위한 당화 및 발효공정 최적화 연구 를 수행하였다. 제4절 농업부산물 대량 확보 및 수거 시스템 구축 화석연료의 사용에 따른 이산화탄소 배출량의 증대 및 연료가격의 폭등에 대비하여 바이오 매스를 활용한 바이오연료에 대한 관심이 고조되고 있다. 바이오연료는 옥수수 및 사탕수수로 부터 생산되는 바이오에탄올과 두류식물이나 유채의 열매로부터 생산되는 바이오디젤로 구분 하고 있다. 옥수수 및 사탕수수로부터 바이오에탄올을 생산하는 기술은 이미 상용화되어 있으 며 미국에서는 주로 옥수수, 브라질에서는 주로 사탕수수로부터 바이오에탄올을 생산하여 판매 하고 있다. 그러나 옥수수 및 사탕수수는 식용 또는 사료용으로 이용할 수 있으므로 식량이 부 족한 현실에서 에너지로 이용하는 것은 바람직스럽지 못하다. 제5절 농업부산물로부터 분해균주(곰팡이)이용 당 전환기술 개발 메타게놈/곰팡이 유래 섬유질 분해/당화효소의 규명 및 대량 생산기술이 필요한데 토착 메타게놈/곰팡이 라이브러리로부터 섬유소 분해/당화효소 유전자를 확보하고 이를 개량하고 대 량 발현시키기 위한 기술 개발이 필요하다. 국내 토착 메타게놈 유래 바이오매스 분해/당화효 소 개발을 통한 생물자원 확보 및 원천기술 확보가 필요하다. 곰팡이 유래 섬유질 분해미생물 및 효소에 대한 연구는 미미한 실정이다. 국내 자생 곰팡이 유 래 분해효소의 탐색 연구 및 대량생산 기술 확보 필요하다. 그림 1. 바이오에너지의 선진국 및 국내 정책 - 3 -

13 그림 2. 바이오에탄올 과정의 개요와 현 기술 문제점 및 해결방안 그림 3. 문제해결을 위한 본 과제의 연구분야 전분계 및 당질계인 1세대 바이오알코올은 미국 및 브라질에서 이미 산업화되었지만 곡물 가격의 급등에 따른 새로운 문제가 야기된다. 이를 해결하기 위해서는 지구상에 가장 풍부하며 재생산이 가능한 섬유질계 바이오매스를 이용하는 기술 개발이 절실히 필요하다. 섬유질계 바 이오매스는 종류에 따라 조금씩 다르나 섬유소(Cellulose)가 38-50%, 헤미셀룰로스 (Hemicellulose)가 23-32%, 리그닌(Lignin)이 15-25%로 되어 있으며 (그림 4), 이 3종류의 섬 유질 성분이 효율적으로 분해되어야 한다

14 그림 4. 섬유질계 바이오매스의 구성성분: cellulose (38-50%), hemicellulose (23-32%) 및 lignin (15-25%). 섬유소에탄올은 생산단가, 혼합비율 증대 (현재 10% -> 25%), 인프라 구축 등의 개선 요 인으로 2012년부터 사용되기 시작하여 2022년에는 전분에탄올의 사용량을 추월할 것으로 예측 하고 있다 (BCurtis Energies & Resource Group, 2008). 실제 미국의 2007년 전분에탄올 생산 단가는 $1.69/gallon이며, 2007년 섬유소에탄올 생산단가 $2.6/galon을 2012년 $1.33/gallon으로 줄이는 것을 목표로 하고 있다 (BCurtis Energies & Resource Group, 2008). 화학적 전처리는 에너지 소모, 고가의 생산 장비, 폐기물의 처리비용 등으로 인하여 생산단 가가 높아질 뿐만 아니라 정제의 어려움이 있다. 바이오에탄올 생산을 위한 목질계 바이오매스 의 생물공학적 전환을 위해서는 효율적인 전처리 기술, 특히 물리 및 생물학적 방법이 융합된 새로운 전처리 방법이 필요하다. 현재는 물리적 전처리인 폭쇄법이 가장 효과적인 방법으로 평 가되고 있으나 불순물 및 고가의 생산 장비 등의 단점이 있다. 이 문제를 해결하기 위하여 고 충격전처리와 효소처리를 연계한 당화 공정 개발이 요구된다. 물리적 및 생물학적 당화방법은 화학적 당화법에 비하여 많은 장점을 지니고 있으나, 현 수준의 기술은 반응속도가 늦고 분해 율이 낮을 뿐 아니라, 효소 생산비용이 높아 산업화에 저해요인이 된다. 본 연구팀은 높은 분 해력을 가진 섬유소, 헤미셀룰로스 및 리그닌 분해효소 생산 미생물을 확보하고 있다. 산업화 를 위해서는 재조합 균주를 이용한 분해효소 대량 생산 조건 확립 및 물리적 전처리와 연계한 친환경적 당화공정 기술 개발이 필요하다. 현재의 기술로 배양할 수 있는 원핵미생물은 전체의 1% 이내에 불과하며, 배양불가 원핵미생물(uncultured prokaryotes)의 다양성은 배양된 것에 비해 엄청나게 크다. 퇴비, 반추위, 갯벌, 갈대숲, 늪지 등 유기자원이 풍부한 환경으로부터 메 타게놈 라이브러리를 구축하면 다양한 유전자원을 확보 이용할 수 있을 것이므로 이에 대한 연구가 필요하다. 국내 토착 메타게놈/곰팡이 라이브러리로부터 섬유소 분해/당화효소 유전자를 확보하고 이 를 개량하고 대량 발현시키기 위한 기술이 개발된다면 바이오매스로부터 당류 생산 공정의 개 선 및 생산원가 절감이 가능할 뿐만 아니라 바이오산업에서 다양한 기능성 소재 개발에도 응 용이 가능하다. 국내 토착 메타게놈 유래 바이오매스 분해/당화효소 개발을 통한 생물자원 확 보 및 상업적 판매가 전무한 상태이므로 원천기술 확보가 절실히 필요하다. 최근 일본과 유럽을 중심으로 곰팡이 유래 단백질에 관련된 기능성 연구가 활발히 진행되고 있으며, 이를 통해 우 수한 섬유질 분해미생물이 밝혀지고 있으나 국내에서는 곰팡이 유래 섬유질 분해 효소에 대한 - 5 -

15 연구는 미미한 실정이다. 따라서 국내 자생 곰팡이 유래 분해효소의 탐색, 기능성 연구 및 대 량 생산 기술의 확보가 절실히 필요하다. 물리적+생물학적 방법을 이용한 당화는 화학적 방법과 비교하여 많은 장점을 지니고 있으 나, 현 수준의 기술은 반응속도가 늦고 분해율이 낮을 뿐 아니라, 효소 생산비용이 높아 산업 화에 저해요인이 된다. 다양한 효소 유전자를 확보하고, 단백질공학 기술을 이용한 효소 단백 질의 개량이 이루어지면 고역가의 변이체를 얻을 수 있을 것임. 이를 위해서는 효과적인 탐색 방법 및 효소 구조에 기초한 활성 개량 기술이 필요하다. 현재 동시당화 및 발효를 위한 coculture를 실행할 경우 발효효율 증대, 열 충격유전자 및 stress 반응유전자를 효모의 염색체에 삽입시킬 경우에 약 52 의 온도에서도 생존가능, calcium을 발효배지에 mm로 첨가 시 ethanol tolerance의 증가, 효모 균주를 acid-pretreated softwood prehydrolysate 등의 특정 기질에 대한 적응기간 증가 시 에탄올발효 효율증진 등이 보고되어 있다. 한편 당화과정을 거쳐 고분자 탄수화물인 섬유소와 헤미셀룰로 스는 포도당과 xylose와 같은 단당의 형태로 분해되게 된다. 그러나 야생 미생물에서는 섬유질 바이오매스의 주요 당인 xylose를 에탄올까지 전환하는 미생물이 현재까지는 존재하지 않기 때문에 유전자조작을 통하여 이를 이루는 연구가 시도되어 일부 성과를 거두고 있다. 하지만 경우에 따라 유전자 조합균들이 에탄올에 대한 내성이 낮다든지, 전처리과정에서 생산되는 초 산, 리그닌분해산물(phenolic compound)과 같은 발효저해물질에 약하거나 또는 발효에 걸리는 시간이 긴 것과 같은 아직도 개선해야 할 점들이 많아 이에 대한 연구가 필요한 실정이다. 섬유질 바이오매스는 가용 에너지 자원의 96%에 달하며, 주로 섬유소, 헤미셀룰로스, 리그 닌으로 이루어져 있어 이들을 가수분해하면 다양한 단당류가 생산된다. 섬유질 바이오매스로부 터 확보된 다당류를 원재료로 하여 환경 친화적인 물리 생물학적 방법으로 xylose, arabinose, glucose 등을 얻는 공정을 확립하고, 이를 원료로 바이오알코올을 생산하면 환경 친화적으로 바이오매스를 활용할 수 있으며, 고부가가치 창출 및 폐기물 처리비용 절감을 통해 농가소득 증대 및 관련 산업체의 이익창출에 기여할 수 있다. 섬유소계 바이오매스는 임목, 각종 농산물 의 부산물 및 폐기물이 포함되며 국내에서도 농 임산업 폐기물 발생량이 증가하고 있어 이에 대한 처리 및 활용문제가 대두되고 있다. 섬유소계 바이오매스로부터 바이오 알코올의 생산을 위한 공정은 1. 당화 저해 물질을 제거 하고 셀룰로스의 접근 가능성을 증가시키기 위한 전처리 공정 (Pretreatment), 2. 셀룰로스의 가수분해를 통해 발효 가능한 당류로 변환하는 당화 공정 (Saccharification), 3. 생성된 당을 효모 및 박테리아 (S용하여 알코올로 전환 시키는 발효 공정(Fermentation)으로 구성된다. 섬 유소계 바이오매스로부터 효과적인 바이오알코올 생산을 위해서는 전처리 공정을 통한 바이오 매스의 분별 및 당화공정을 거쳐 발효성 당으로 전환하여야 하며, 후속 생물전환공정에서 최종 제품을 얻는 과정까지 연계되어야 함. 이 과정에서 전처리, 당화효소생산, 동시발효 과정에 상 당한 비용이 들어간다 (그림 5 & 6)

16 그림 5. 섬유소계에탄올의 생산비용 (NREL, 2000) 그림 6. 섬유소계에탄올 생산공정단가 목표 (BCurtis Energies & Resource Group, 2008) 전 세계의 바이오매스는 매년 30억 톤 이상 생산되며, 아시아에서만 8억 톤 이상이 생산됨. 농업부산물은 주로 CHL로 이루어져 있어 이들을 가수분해하면 단당류(D-glucose, D-galactose, D-mannose, L-arabinose, D-ribose, D-xylose) 및 phenolic 화합물이 된다. 섬유 질 바이오매스로부터 발생된 단당류를 원재료로 한 생물전환을 통해 고가의 바이오에너지를 생산하면 환경 보호 및 폐기물 처리비용 절감은 물론 농가소득 증대 및 관련 산업체 이윤 창 출에 기여할 수 있다. 한편 우리나라에 가장 풍부한 바이오매스 자원은 농 임산 바이오매스이 다. 특히 국내 산림에서 임목의 생장에 의해 생산 가능한 바이오매스량은 연간 약 2천만톤으로 이를 발열량으로 환산하여 보면 94,290 Gcal 이다. 국내 바이오에너지 생산에 가장 적합한 바 이오매스는 목질계 바이오매스이며, 이 목질계 바이오매스 이용을 위한 당화효소 및 당화공정 의 과학적 기초자료, 인력양성 및 산업체 기술이전 등이 필요하다. 국내 토착 메타게놈 유래 바이오매스 분해효소 확보 및 개량을 통한 고활성 효소의 개발을 통해 바이오매스로부터 당류 생산 공정의 개선 및 생산원가 절감 가능하다. 현재 급증하고 있 는 바이오에너지 시장에서 국산 고활성 분해 효소의 발굴로 외화절감 및 소재의 다양화를 통 한 관련시장의 활성화가 기대되며 바이오산업에서 다양한 기능성 소재 개발에도 응용 가능하 다. 또한 바이오에너지 생산의 핵심 요소인 고활성 효소의 개발은 기존 에너지 대비 바이오에 너지의 가격 경쟁력확보와 시장에서의 비교우위를 점할 수 있도록 할 것이다. 국내 자생 토착 담자균 자원의 체계적 발굴을 통해 다량의 지적소유권 확보 및 산업화가 - 7 -

17 가능하며, 미개발 생물자원의 활용에 의한 부가가치 창출 및 농가소득 향상에 기여할 수 있다. 개발된 단백질은 고가 산업용 효소 및 식 의약품 소재로서 광범위한 제품에 응용 가능할 뿐 아니라, 신규 기능성 효소 자원의 개발로 인한 시장 규모 확대 및 신규 시장 창출이 가능하다. 나아가서는 관련 기반기술의 선점을 통해 담자균 유래 기능성 단백질 분야에서 비교우위를 점 할 수 있을 것이다. 최근 분자생물학과 생명정보학의 발전으로 바이오매스 분해 관련 효소의 분자진화와 구조 적 변환이 가능하게 되었으며, 이러한 분자진화 및 구조변형 기술이 소규모 및 장기간 연속 생 산이 가능한 미생물반응기 기술과 접목된다면 원료의 경제적 생산이 가능하여 바이오에탄올 관 련 산업의 큰 전환기가 마련될 것이며, 효모유전공학을 통한 yeast cell surface display 기술을 통하여 효율적인 바이오알코올 발효 공정 기술 개발로 관련 산업체 기술이전을 통한 바이오에탄 올 생산 선진국으로 도약할 수 있을 것이다. 1987년 대체에너지개발촉진법 이 제정 공포된 이래 2006년 바이오알코올 등 바이오연료 보 급 계획 발표 및 바이오알코올 실증 평가가 시작되어 현재 2008년 정부의 적극적인 지원으로 대처에너지 개발 사업이 본격적으로 추진되고 있다. 현재 정부에서는 신재생에너지 보급을 통 한 기업의 경쟁력 강화 도모 및 개인이 법에서 정한 신재생에너지 시설에 투자한 경우, 조세특 례제한법 규정에 따라 투자금액의 일정비율을 세액에서 공제하는 한편 수입되는 신재생에너지 생산용 기자재 및 이용 기자재 물품의 관세 경감 (세특례제한법 제 118조 규정 의한 관세 경 감에 관한 규칙 발표 제 3호)혜택을 부여하는 등 바이오알코올 사업에 적극적으로 지원하고 실정이다. 국가에너지의 97% 이상을 해외에 의존하고 있으며 유사시 에너지 공급라인을 보장하기 어 려운 우리나라의 입장에서는 향후 에너지 안정 확보 및 자립 달성, 더 나아가 첨단생명공학기 술을 확보한 학문적 자료 및 연구 인력을 기반으로 하는 원천기술획득을 통해 대외수출도 가 능함으로 바이오매스와 같은 천연자원으로부터의 재생에너지 생산기술개발은 반드시 필요하다. 국내의 경우 환경 친화적 바이오매스 분해 공정 관련 연구가 미비하고 상업화가 이루어지 지 않고 있었으나, 최근 바이오에너지의 필요성 및 가격 경쟁력 문제의 대두로 인하여 전 세계 적으로 바이오매스 분해 관련 연구가 활성화 된다. 본격적인 연구를 통해 신규 물리적 분해 공 정 및 생물학적 분해 효소를 이용한 산물 생산이 가능하며, 신규 고활성 효소의 확보를 통해 국제경쟁력 제고 및 기술적 우위의 확보가 가능하다. 2005년 교토의정서 발효 및 전 세계적으로 화석연료의 과다 사용에 따른 자원 고갈 및 환 경오염에 대한 관심고조로 선진국을 중심으로 환경오염 및 지구온난화를 해결하기 위해 친환 경적 바이오에너지 기술의 개발이 절실히 요구되나 화석연료 대비 가격 경쟁력의 문제가 있으 며, 전분질 및 당질계 원료의 안정적인 확보 문제가 대두된다. 이런 문제점을 해결하기 위하여 지구상에 가장 많이 존재하는 목질계 바이오매스로부터 바이오에너지 생산을 시도하고 있다. 제6절 섬유소의 당화 및 에탄올발효 통합공정을 위한 균주 개발 화석 연료의 사용이 계속됨에 따라 사용 가능한 화석 연료가 계속 감소하면서 고유가가 지속되고 있을 뿐 아니라 막대한 양의 이산화탄소가 방출되면서 지구 온난화가 가속되고 있는 실정이다. 이에 대처하기 위하여 선진국에서는 석유 의존도를 낮추기 위한 대체에너 지 개발에 박차를 가하고 있으며, 특히 다양한 바이오매스를 이용한 신재생에너지를 개발 - 8 -

18 하여 화석 연료를 대체하고 바이오매스의 이산화탄소 흡수를 통해 온실가스를 저감하여 지 구온난화 문제를 완화하려는 노력이 지속되고 있다. 바이오매스를 이용한 에너지 중에서 바이오에탄올은 휘발유와 혼합하거나 단독으로 수송 용 연료로 사용될 수 있어 바이오디젤과 더불어 대표적인 신재생에너지로 각광을 받았다. 이에 따라 당질계와 전분질계 원료를 사용한 바이오에탄올 생산이 많은 나라에서 이루어지 고 있으나, 식용 또는 사료용으로 사용이 가능한 당질계와 전분질계 원료를 사용한 바이오 에탄올 생산량이 급격하게 늘어나면서 전 세계적인 곡물 가격 상승을 가져와 원료 수급 안 정성에 대한 우려가 증가하고 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 최근에는 각국에서 농 업폐기물이나 폐목재 등 비식용 바이오매스를 활용하여 바이오에탄올을 생산하기 위한 지 속적인 연구가 이루어져왔다. 농업부산물과 같은 섬유질계 원료는 지구상에 양적으로 가장 풍부하게 존재하는 바이오 매스로 cellulose, hemicellulose, lignin으로 구성되어 있으며, 그 중에서 cellulose는 양적으 로 가장 풍부할 뿐 아니라, 분해에 의해 에탄올 발효의 원료가 되는 포도당이 생성되므로 가장 이용성이 높은 물질이다. 섬유질계 바이오매스로부터 바이오에탄올을 생산하는 과정 은 크게 lignin 등의 물질을 제거하여 당화 및 발효공정이 원활하게 이루어지도록 하기 위 한 전처리(pretreatment), 화학적 또는 효소적 처리에 의해 cellulose로부터 발효성 당을 생 성시키는 당화(saccharification), 미생물을 사용하여 발효성 당으로부터 에탄올을 생성시키 는 발효공정(ethanol fermentation), 발효액으로부터 에탄올을 증류시키고 물을 제거하는 정 제공정(purification) 공정으로 이루어지며, 효율적인 전처리 및 당화기술의 개발, hemicellulose 유래 pentose 류를 효율적으로 에탄올로 변환시킬 수 있는 균주의 개발 등이 극복해야 할 과제라 할 수 있다. 섬유질계 원료의 전처리 및 당화공정을 통해 얻어지는 포도당 등의 발효성 당은 Saccharomyces 또는 Z ymomonas 등의 미생물을 사용하여 에탄올로 변환되는데, 이들 미 생물은 포도당 등의 발효성 당으로부터 에탄올을 생성할 수는 있느나 전분 또는 섬유소 등 의 원료로부터 직접 에탄올을 생성하지는 못하기 때문에 전분질 또는 섬유질계 원료로부터 에탄올을 생산하기 위해서는 화학적 또는 효소적 방법으로 이들을 발효성 당으로 변환시킨 후 에탄올 생산균에 의한 발효공정을 수행해야 하는 문제점이 있다. 본 연구에서는 이러한 문제점을 해결하여 섬유질계 원료로부터 효율적으로 bioethanol을 생산하기 위한 기초 연구로 당화와 발효 공정을 통합하여 수행할 수 있는 균주를 개발하고 자 하였다. 즉 효소적 방법으로 섬유소로부터 포도당을 얻는데 필수적으로 요구되는 endoglucanase, cellobiohydrolase 및 β-glucosidase를 에탄올 생산균인 Saccharomyces cerevisiae 세포표면에 발현시킨 형질전환체를 제작하여 당화와 발효를 동시에 수행할 수 있는 가능성을 타진하고자 하였다. 한편 효소적 방법으로 섬유질계 원료를 당화시키는 방 법에서는 높은 효소 가격이 제한사항이 되고 있는 점에 착안하여 섬유질 분해효소을 생산 하는 미생물과 발효균주를 혼합배양하여 에탄올을 생산하는 방법의 적용 가능성에 대해서 도 확인하고자 하였다. 또한 NaOH 전처리가 볏짚, 보릿짚, 밀짚 및 억새풀의 구조적 특성 에 미치는 영향을 조사하여 농업부산물의 전처리 방법을 개발하는데 기초자료로 활용하고자 하였다

19 제2장 국내외 기술개발 현황 제1절 부산물 당화효소 생산체계 구축 유용 효소의 탐색을위한 미생물 연구 분야, 재조합 단백질의 발현 조절 기술 분야, 미생물 배양기술 분야에서 상당한 수준의 경쟁력을 확보하고 있다. 최근 극한 환경 미생물, 메타게놈 유전자를 확보하여 신기능성 효소를 개발하기 위한 연구 가 활발하다. 신기능 바이오촉매 개량을 위한 단백질 설계 분자진화 등 단백질 공학 분야가 경쟁력을 가지고 있다. 그러나 효소의 대량생산기술 등 산업적인 측면에서는 Novozyme(덴마크), Genencor(미국), DSM(네덜란드), Amano(일본) 등 선진 기업에 비하여 영세한 실정이다. 미국은 신기능 효소 및 단백질 공학기술을 주도하고 있으며, 유럽은 생물전환 공정 기술 개발에 강점이 있고, 일분은 고정화 촉매기술 분야에 강하다. 효소 분자 진화기술의 경우 1990년대 후반 이후 Applied Molecular Evolution, Biomethodes, Codexis, Danisco, DSM, Novozymes, Verenium 등이 상업적 적용을 주도하 고 있으며, 현재 Codexis와 Verenium이 거대 다국적 기업과의 제휴를 통하여 산업 적용 분야를 선도하고 있다. 유럽은 EuropaBio 프로그램의 바이오산업 촉진책을 통하여 재생 가능한 생물자원 무공해 바이오에너지 친환경 바이오합성기술의 개발에 박차를 가하고 있다. 제2절 부산물의 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스 당화균주 개발 국내에서는 박테리아 곰팡이 등 섬유소 분해 효소 생산 균주 분리 및 효소 생산을 위한 배양 온도, 배양 ph, 배양 시간 등 배양 조건 최적화가 이루어지고 있으며 Bacillus, E. coli 등의 세 균에 섬유소 분해 효소 유전자를 도입하는 재조합 DNA기술 개발 및 효소의 발현 및 고효율 섬유소 분해효소 유전자를 메타게놈 연구 기법을 통해 대량 발굴하는 연구에 주력하고 있다. 국외에서는 Trichoderma와 Aspergiillus 등 곰팡이로부터 섬유소 분해 효소 생산 및 효소 활 성 최적화하고 Trichoderma 등 섬유소 분해 활성 균주로부터 섬유소 분해효소 유전자의 분리 및 발현에 대한 보고가 많으며 볏짚, 콩껍질 등 부산물을 초기 기질로 이용한 SSF(solid-state fermentation) system에 의한 섬유소 분해 효소 생산에도 노력하고 있고 에너지 확보를 위하 여 Novozymes, Genecor사 등 여러 기업에서 대체에너지 개발을 위한 효소 개발에 박차를 가 하고 있다. 당화 효소의 탐색을 위한 미생물 연구분야, 재조합 단백질의 발현조절 기술분야, 배 양 기술분야에서 국내 기술이 상당한 수준의 경쟁력을 확보하고 있으나 산업용 효소의 대량 생산기술 등 산업적인 실용성에서는 Novo사(덴마크), Genenco사(미국) 등에 비하여 경쟁이 난 망하며, 이에 활성이 우수한 균주의 확보가 필요하다. 제3절 농업부산물 바이오매스의 전처리 방법 및 당화, 발효 최적조건 확립 최근 국내 바이오에너지 연구개발은 주로 셀룰로오스계 바이오매스로부터 당을 추출하여 발효시 킬 수 있는 2세대 바이오에탄올 연구에 주력하고 있다. 산, 알카리 등 화학적 및 고온, 고압의 물리적 전처리 공정 개발과 당화가능 효소생산 균주 및 고효율 발효균주 개발 연구는 아직 시 작 단계이다. 최근에 서울대 등에서 고농도 에탄올 생산 효모의 개량, 한국에너지기술연구원에

20 서 목질계 바이오연료 생산 기술 개발, 고려대에서 목질바이오매스의 물리 화학적 전처리와 연계한 생물학적 처리를 통한 당화공정 기술 개발, 순천대에서 목질바이오매스 분해 및 발효용 미생물 메타게놈 유래 효소개량에 대한 기초연구를 하고 있으나, 상용화를 목적으로 한 실증 기술 개발 연구는 추진된 바 없는 상태이다. 세계에서 바이오에탄올 상용화율이 가장 높은 브라질은 사탕수수를 주원료로 바이오에탄올을 생산하며 미국에 이어 세계 제2위를 차지하고 있다. 1980년대부터 브라질내 절반 이상의 차량이 95% 에탄올(E95)로 운행되며, 현재 브라질내 가변연료차량(FFV)이 전체 차량의 50%이상이고, 정책적으로 25% 이상의 무수에탄올 배합을 의무화하고 있다. 덴마크 Dong Energy사는 바이오 에너지 전문회사인 Inbicon을 설립하여, 2009년 11월부터 세계 최대 규모의 바이오에탄올 생산 공장을 가동하고 있다. 이 공장은 농업부산물인 밀짚 원료를 연간 3만톤 이용하여 바이오에탄 올을 연간 540만L 생산하고 있다. 원료처리능력은 시간당 4톤이며, 덴마크 Novozymes와 Danisco Genecor가 당화공정에 필요한 효소를 공급하고 있다. 미국과 EU에서도 섬유질계 기 반 바이오연료 기술 개발을 위해 집중적인 연구비를 투입하고 있다. 제4절 농업부산물 대량 확보 및 수거 시스템 구축 홍성구(2004)는 배, 포도, 사과, 복숭아, 고추, 깨의 재배 단위면적당 부산물 생산량을 측정 하여 바이오매스의 가스자원화를 위한 부산물의 발생량, 발생열량 등을 분석하였으나 그러나 바이오에탄올 생산에 적합한 작물인 보리, 밀, 옥수수, 콩, 고추, 유체의 부산물 발생에 대한 자 료는 미흡한 실정이다. 국내에서는 아직 바이오에탄올 생산을 위한 수거체계확립에 대한 연구 가 수행된 바 없으며, 바이오매스 가스 자원화를 위한 발열량 분석을 수행한 반면 국외에서는 바이오에탄올 생산을 위한 부산물 수거체계에 대한 연구를 수행한 바 있다. 수거장비 및 집하 장 위치를 포함한 수거방법에 따른 수거비용을 분석하여 바이오에탄올 생산을 위한 효율적 수 거체계의 확립이 필요하다. Rentizelas 등(2009)은 바이오 에너지 생산을 위한 농업 부산물의 저장 위치를 포장 내, 중간 집하장 및 바이오에탄올 생산공장으로 구분하여 각각의 장단점을 분석하였으며, 복수의 작물(면화 부산물 및 알몬드 잔가지)을 원료로 사용하는 경우의 경제적 인 효과를 분석하였다. Petrolia(2008)는 미국 미네소타와 아이오와의 옥수수 생산지역을 대상 으로 바이오에탄올 생산을 위한 옥수수 부산물의 수거 체계에 대하여 연구하였으며, 연간 9만 5천 m 3 의 에탄올 생산규모에 요구되는 옥수수 부산물의 양은 32만5천 톤이며, 톤당 62 달러가 경제성을 확보하기 위한 최저 부산물 비용인 것으로 보고하였다. 제5절 농업부산물로부터 분해균주(곰팡이)이용 당 전환기술 개발 비식용 원료로부터 바이오연료 기술 개발은 목질계 바이오에탄올 생산 기술이 1990년대 일 부 연구된 바 있다. 이후 섬유질계 전처리에 대해 제한적으로 요소기술 개발 연구가 수행 중이 며, 최근 한국생산기술연구원에서 해조류를 이용한 바이오에탄올 제조 방법에 관한 연구를 수 행하고 있다. 최근에 서울대 등에서 고농도 에탄올 생산 효모의 개량, 한국에너지기술연구원에 서 목질계 바이오연료 생산 기술 개발, 고려대에서 목질바이오매스의 물리 화학적 전처리와 연계한 생물학적 처리를 통한 당화공정 기술 개발, 순천대에서 목질바이오매스 분해 및 발효용 미생물 메타게놈 유래 효소개량에 대한 기초연구를 하고 있으나, 상용화를 목적으로 한 실증 기술 개발 연구는 추진된 바 없는 상태이다 (표 1)

21 표 1. 목질계 바이오에탄올 생산기술 관련 최근 연구주제 수행기관 서울대 전남대 서울대 서울대 고려대 고려대 전북대 목질바이오에너지 연구사업단 오믹스기반 바이오에너지 융합연구단 생명공학연구소 서울시립대 에너지관리공단 에너지기술연구원 순천대 연구개발 주제 대사공학을 이용한 셀룰로스계 바이오에탄올 생산용 균주 개발 및 공정 최적화 Cellulose, hemicellulose 분해를 통한 원료당 생산기술 고리그닌 함유 목질자원의 복합적 전처리 공정 개발 미생물 유전체 재설계를 통한 에탄올 고생산성 Saccharomyces cerevisiae의 개발 바이오매스로부터 수송용 바이오연료 생산을 위한 기술 바이오에탄올 생산용 농임산 바이오매스의 새로운 통합형 전처리 방법의 개발 저비용/친환경 농업생산물과 연계한 수송용 바이오알코올 생산 통 합공정 기술 산림 바이오에너지 생산의 원천기술 개발 무공해청정에너지를 생산하는 초우량 미생물 균주 개발 목질계 바이오매스 전처리 기술의 scale-up 공정 기술 개발 혐기성 미생물 유래 셀룰라아제 복합체 '셀룰로좀'의 오믹스 및 고 효율 농업부산물의 바이오에탄올 생산 化 홍조류 유래 바이오에탄올 생산기술개발 목질계 수송용 알콜 제조 공정 실용화 연구 목질바이오매스로부터 발효성당과 바이오에탄올 생산을 위한 미생 물 메타게놈 유래 효소개량 섬유질계 바이오에탄올의 생산단가 중 가장 줄일 수 있는 부분이 당화와 발효를 동시에 진 행시키는 방법이 가장 유력한 것으로 예비결과들이 나오고 있으며, 이를 위하여 효모 개량 시 도를 하려는 초기 단계에 있다. 미국과 EU에서는 섬유질계 기반 바이오연료 기술 개발을 위해 집중적인 연구비를 투입하 고 있다 (표 2). 섬유질계 에탄올 생산에서 가장 비용이 많이 드는 전처리 과정에서 섬유소의 견고한 구조를 느슨하게 풀어주는 역할을 하는 Expansin에 대한 연구들이 최근 보고되고 있 음. 본 과제에서 이 단백질을 이용하는 기술을 개발할 필요가 있다. 당화와 발효를 동시에 진 행시키는 방법 중 섬유질을 분해할 수 있는 기본적인 효소를 효모 표면에 발현시키는 방법이 시도되어 일부 성공하고 있으나 다중단백질의 세포표면 발현은 초기 단계에 있으며, 특히 리그 닌 등을 분해하는 효소의 추가 동시 발현은 아직 보고되고 있지 않다. 최근에 이루어진 Z. mobilis 관련된 해외 연구로는 유전자 조작을 통한 섬유소 및 오탄당 이용 가능 균주 개발, Pichia tripitis, Pachysolen tannophilus 등의 효모와 Z. mobilis의 혼합배양을 통한 gluclose/xylose 혼합물로부터 에탄올 생산, 고정화 Z. mobilis를 이용한 에탄올 생산 효율 향 상, 당질 및 전분질계 농업부산물로부터 Z. mobilis를 이용한 에탄올 생산, 내산성 Z. mobilis 를 이용한 에탄올 생산 등에 관한 연구가 이루어지고 있다. 해외에서도 섬유질계 농업부산물로 부터 Z. mobilis를 이용하여 에탄올 생산하기 위한 연구는 활발히 이루지고 있지 않으며, 섬유 소분해효소 생산 미생물과 Z. mobilis의 혼합배양을 통해 에탄올을 생산하기 위한 연구는 보고 된 바가 없다

22 표 2. 해외 주요 목질계 수송용 알코올 R&D 프로그램 사업명 원료 및 사업 내용 지원 기관 EBI 목질계 에탄올 생산 기술 개발 (주) BP JBEI Biorefinery Demonstratio n Small scale Biorefinery 목질계 바이오알코올 생산 원 천 기술 개발 대규모 목질계 에탄올 생산 실 증 연구 중소형 목질계 에탄올 생산 실 증 DOE DOE DOE Ethanolgen 에탄올 발효 균주 개발 DOE Enzymes 셀룰라제 생산 기술 개발 DOE Energy Crop 목질계 연료 생산용 에너지작 물 육종 연구 USDA NILE 목질계 에탄올 생산 기술 개발 EU 주관기관 미국 버클리 대학 미국 LBNL 외 2개 대학 Abengoa 외 5개 기업 ICM외 3개 기업 Cargill 외 4개 기업 Genencor 외 3개 기업 미국 10개 대학 IFP, VTT 외 12개 기관 사업규모 (억 달러) 기간 (10년) (5년) (3년) (3년) (3년) (4년) 국내의 Z. mobilis를 이용한 에탄올 생산에 관한 연구는 기초 수준에 머무르고 있는 실정 이다. 국내에서 활용 가능한 다양한 바이오매스로부터 에탄올을 생산할 수 있는 Z. mobilis 균 주 개발과 아울러 섬유소 분해효소생산 미생물과 혼합배양을 통한 에탄올 생산 공정의 개발이 필요하다. 2008년 바이오에탄올의 세계시장 규모는 27,500 백만달러이었으며, 2015년에는 46,600 백만달러에 이를 것으로 전망된다 (표3). 표 3. 세계시장 규모 전망 구분 연평균증가율 (2008~2030) 바이오에탄올 27,500 35,000 46,600 68, , ,000 10% 당화효소 ,200 1,800 20% * 관련 자료 근거 (단위: 백만달러, %) 세계시장규모 : world`s ethanol production forecast , M arketresearch- Analyst.com 국내시장 : 주류공업협회, 통계청, 삼성경제연구소 - 세계시장규모 : Ethanol price = $0.5/L, CAGR : 4.6% - 국내시장 : 2009년 수입규모 : 2008년 대비 3% 증가 Novozymes(덴마크), Genencor International(미국), Iogen(캐나다), Arkenol(미국), JGC(일 본) 등이 바이오에탄올 생산 업체이다. 강산 및 폭쇄 공정을 이용한 당화액 생산과 효소 당화

23 공정 기술을 보유한 회사이다. 섬유질 바이오에탄올 상업화 단계의 기술을 보유한 회사는 아직 없다 (표 4). 관련 기술/제품의 국내 지식재산권(특허 등) 현황 번호 특허명 보유기관명 출원(등록)일 암모니아를 이용한 섬유소계(목질계) 바이오매스의 전처리 방법 및 그 장치 한국에너지기술연구원 2002/2/7 섬유소계(목질계) 바이오매스의 약산 추출 후 증기 폭쇄방법 및 그 장치 한국에너지기술연구원 2002/2/12 셀룰로오스, 자이란, 린첸안 및 만난을 동시에 분해하는 페니발실러스 폴리믹사 GS01 균주의 다기능성 단일 효소 cel44c 경상대학교 산학협력단 2007/06/13 유전자 신균주 페니실륨 피노필럼 KMJ601 유래 엔도글루카네이즈의 생산 최적화 및 유전자 클로닝 건국대학교 산학협력단 2008/11/12 셀룰라아제를 생산하는 트라메테스 허수타 및 그 이용 (주)SK 케미칼 2008/10/

24 표 4. 바이오에탄올 관련 주요 선도 기업/기관의 현황 미국 Genencor 社 스페인 Abengoa Bioenergy 社 영 BP 社, 미 Verenium 社 덴마크 Novozyme 社, DONG Energy 社 덴마크 Novozyme 社 미 Range Fuels 社 미 에너지성(DOE) 미 POET 社 미 DOE, 미 Range Fuel 社 미 KL Process Design Group 社 카나다 Iogen 社 차세대 바이오에탄올 생산 Bioethanol pilot plant Genencor 社 는 시험공장에 효소를 공급. 09년까지 조업개시예정, 시간당 4톤의 보리 처리하여 연간 4,500톤의 bioethanol 생산 예정 미 Nebraska주에 Biomass를 변환하는 최신의 시설을 개설. Lignocellulose Biomass에서 바이오연료를 생산하기위한 프로세스 연구개발 전용 시험공장 보유. 영 BP 社 는 Verenium 社 의 cellulosic ethanol을 제조하기 Cellulosic ethanol 개발 상업화 위한 기술을 platform으로 이용하여 ethanol 생산 제2세대 DONG Energy 社 는 Novozyme의 효소를 사용하여 bioethanol 짚을 원료로 bioethanol 생산. Novozyme은 제2세대 시범제조용 bioethanol 대규모 생산에 필요한 효소기술을 2010년에 plant 확립예정 Cellulase 제조공장 Cellulose, 에탄올 당화효소상품화 지원 Bioethanol 제조공장 Bioethanol 정제소 폐목재로부터 에탄올 생산 셀룰로스 에탄올 Bioethanol 생산에 필요한 cellulase 생산 신규설비를 약 1억달러로 건설. 2010년 후반 조업 개시예정 미국 최초 상업베이스 섬유소유래 에탄올 생산 공장허가를 미국 조지아주에서 취득 목질계 Biomass, 농업폐기물 등 섬유소계 Biomass에서 당을 분해하는데 필요한 효소의 상품화를 위해 3,380만 달러를 지원. 광범위한 화공품을 cellulose계 Biomass로부터 제조. Indiana주에 bioethanol 공장을 건설, 건설비용 1억 500만 달러, 21번째 공장, 연간 6,500만 갤런(약 25만 kl) 생산능력 Cellulose계열 Biomass에서 에탄올 상업적 수준 생산연구 KL 社 의 공장은 폐목재를 재생가능 연료인 cellulase유래 에탄올로 변환. Cellulose 유래 에탄올 생산에 독자기술과 효소 사용 Iogen의 cellulosic ethanol은 카나다 오타와에 있는 데모용 설비에서 생산. 연간 10만L의 에탄올 생산 pilot plant 관련 기술/제품의 국외 지식재산권(특허 등) 현황 번호 특허명 보유기관명 출원일 US Pretreatment process for conversion Iogen Corporation 1998/12/8 of cellulose to fuel ethanol The Texas A&M Methods of biomass pretreatment University System 1993/7/27 Calcium hydroxide pretreatment of The Texas A&M /9/6 biomass University System Method for treating cellulosic biomass Tokyo University of 2003/8/8 and system for treating the same Agriculture Genetically modified cyanobacteria for US 6,699,696 the production of ethanol, the Enol Energy Inc. 2004/3/2 (Toronto, CA) constructs and method thereof US 6,849,434 Ethanol production in recombinant University of Florida 2005/2/1 hosts Research Foundation, Inc. Ethanol production in gram-positive University of Florida microbes Research Foundation, Inc. 2005/7/

25 본 연구관련 국내외 기술수준 비교 개발기술명 관련기술 현재 기술수준 기술개발 선진국 최고보유국 우리나라 연구신청팀 목표수준 대비 물리적 전처리 공정 및 바이오전처리 공정의 미국 80% 80% 바이오전처리 공정 선진국화 90% 곰팡이 셀룰라제 미국 90% 90% 고효율 셀룰라제의 분리 100% 셀룰로좀 복합효소 (또는 셀룰로좀 복합효소 분리 미국 90% 90% 효모 표면발현) (또는 효모 표면발현) 100% 당화 효소 개발 미국 80% 80% 고효율/고안정성 당화공정 개발 90% 당화공정 개발 미국 80% 80% 당화공정의 선진국화 90% Zymomonas mobilis 이용 에탄올 생산 공정의 미국 90% 90% 에탄올 생산 선진국화 100% 1) 개발기술명은 본 연구과제 최종 연구개발 목표기술을 의미 2) 현재 기술수준은 선진국 100% 대비 우리나라 및 신청한 연구팀의 기술수준 표시 3) 기술개발 목표수준 및 선진국대비는 당해과제완료 후 선진국 100% 대비 목표수준 제시 제6절 섬유소의 당화 및 에탄올발효 통합공정을 위한 균주 개발 국내에서 섬유질계 바이오매스로부터 바이오에탄올을 생산하기 위한 기술 개발에 관한 연구는 비교적 활발히 이루어지고 있다. 그러나 당화와 발효 통합공정 개발에 관한 연구는 거의 이루어지고 있지 않은 형편으로, 전분질계 원료로부터 당화균주와 발효균주의 혼합배양에 의한 에탄올 생산에 관한 연구가 일 부 이루어졌을 뿐이다. 섬유소 분해효소 생산균주의 선발, 유전공학기법을 이용한 섬유소 분해효소 생산 균주 및 에탄올 발효균주의 개량에 관한 연구는 비교적 활발히 이루어졌다. 그러나 섬유질 분해효소를 효모 세포 표면에 발현시키기 위한 연구가 이제 시작 단계에 있을 뿐 당화/통합공정용 균주개발에 관한 연구는 이루어진 바가 없으며, 당화균주와 발효균주의 혼합배양에 의한 섬유질계 원료로부터 에탄올 생 산에 관한 연구도 이루어지지 않고 있다. 미국과 EU 등에서는 섬유질계 기반 바이오에탄올 생산 기술 개발이 활발히 이루어져 실제 섬유질계 원료를 이용한 바이오에탄올 생산이 일부 국가에서 실용화되고 있다. 유전공학 기법을 이용한 발효균주 개발 중 최근에 이루어진 것으로는 오탄당 이용 가능한 Zymomonas mobilis 균주의 개발 등이 있으며, 당화와 발효를 동시에 진행시키는 방법 중 섬유소를 분 해할 수 있는 기본적인 효소를 효모 세포 표면에 발현시키는 방법이 시도되어 일부 성공하고 있다. 그 러나 다중 단백질의 효모 세포 표면 발현에 관한 연구는 초기 단계에 있으며, 특히 리그닌 등을 분해하 는 효소의 추가 동시 발현은 보고된 바가 없다. 당화균주와 발효균주의 혼합배양에 의한 바이오에탄올 생산에 관한 연구도 부분적으로 이루어져 Pichia tripitis, Pachysolen tannophilus 등의 효모와 에탄올 생 산균주의 혼합배양에 의한 glucose/xylose 혼합물로부터 에탄올 생산에 관한 연구가 보고된 바 있다

26 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 제1절 부산물 당화효소 생산체계 구축 1. 재료 및 방법 가. 부산물 당화효소 생산을 위한 효소 생산 균주 탐색 부산물 당화효소 대량 생산을 위한 균주를 탐색하기 위하여 부엽토, 억새시료, 수로내 물, 말똥 및 퇴비시료를 사용하여 부산물 당화효소 생산 균주를 분리하였다. 또한 본 실험에 사용된 부산물 당화효소 생산 균주 분리용 배지로는 plate count agar (PCA)를 실험에 사용하였으며, 부산물 당화효소 생산 균주의 탐색과 분리 방법은 다양한 시료를 0.85% NaCl용액에 현탁하여 연속희석한 후 각각의 농도에서 100 μl를 취하여 PCA배지 에 도말한 뒤 35 에서 24 48시간 동안 호기성 배양한 뒤, 이후 고체배지내에 나타 난 성상이 다른 각각의 colony를 순수 분리하였다. 나. 분리된 부산물 당화효소 생산 균주의 특성 조사 분리된 균주의 colony 모양, 표면, 색깔, 크기를 관찰하여 형태학적 특성을 조사하였으 며, API Kit (biomerieux, France)를 이용하여 생화학적 성상을 확인하였고, 16S rdna sequence를 분석하여 일부 균주를 동정하였다. 다. 분리된 부산물 당화효소 생산 균주로부터 생산된 효소의 활성 측정 분리된 부산물 당화효소 생산균주로부터 생산되는 cellulase와 xylanase의 효소활성을 측정하기 위하여 carboxymethylcellulose (CMC)와 xylan을 기질로 하여 DNS법을 사용 하였으며[9], 조효소 생산을 위하여 PCA배지내 glucose 성분 대신 cellulase 활성측정의 경우 1% CMC를 xylanase 활성측정의 경우 1% xylan이 포함된 PCA 배지에 분리균주 를 각각 접종하여 배양함과 동시에 배양하는 동안 일정시간마다 시료를 채취하였다. 채 취한 시료는 10,000 g에서 원심분리하여 상등액을 균체외 조효소로 사용하였다. cellulase 및 xylanase 조효소 활성측정은 조효소액 500 μl와 1% CMC용액 또는 1% xylan용액 500 μl를 완전 혼합하여 50 에서 30분간 반응시킨 후, 반응시킨 시료에 DNS 용액 1 ml를 첨가한 뒤 끓는 물속에 시험관을 담궈 중탕시키면서 5분간 발색시킨 후 증류수 10 ml를 첨가하고 540 nm에서 흡광도를 측정하여 cellulase 및 xylanase 조 효소의 활성을 측정하였으며 대조군은 조효소액 500 μl와 증류수 500 μl를 혼합하여 시 료와 동일하게 수행하였다. 효소 활성 1 unit는 조효소액 1ml로부터 1분간 1 μmol의 환 원당을 CMC 또는 xylan으로부터 방출시키는 효소의 양으로 정의하였다. 라. 분리된 부산물 당화효소 생산 균주로부터 생산된 cellulase 및 xylanase의 온도에 대한 효소의 활성 영향 조효소 생산을 위하여 PCA배지내 glucose 성분 대신 cellulase 활성측정의 경우 1% CMC를 xylanase 활성측정의 경우 1% xylan이 포함된 PCA 배지에 분리균주를 각각 접종하여 배양함과 동시에 배양하는 동안 일정시간마다 시료를 채취하였다. 채취한 시 료는 10,000 g에서 원심분리하여 상등액을 균체외 조효소로 사용하였다. 생산된 조효 소의 온도에 대한 효소 활성 영향을 조사하기 위하여 Britton-Robinson buffer용액 (ph

27 7.0)에 5% CMC용액 또는 5% xylan 용액을 혼합하여 2% 기질용액을 제조하였다. 기 질이 혼합된 buffer와 조효소액을 각각 500 μl씩 완전 혼합하여 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 에서 각각 30분간 반응시킨 뒤, 반응시킨 각각의 시료에 DNS 용액 1 ml를 첨가한 뒤 끓는 물속에 시험관을 담궈 중탕시키면서 5분간 발색시킨 후 증류수 10 ml를 첨가 하고 540 nm에서 흡광도를 측정하여 cellulase 및 xylanase 조효소의 활성을 측정하였 다. 대조군은 조효소액 500 μl와 증류수 500 μl를 혼합하여 시료와 동일하게 수행하였으 며, 각 온도에 따른 상대효소활성을 측정하여 효소활성의 최적 온도를 확인하였다. 마. 분리된 부산물 당화효소 생산 균주로부터 생산된 cellulase 및 xylanase의 ph에 대한 효소의 활성 영향 조효소 생산을 위하여 PCA배지내 glucose 성분 대신 cellulase 활성측정의 경우 1% CMC를 xylanase 활성측정의 경우 1% xylan이 포함된 PCA 배지에 분리균주를 각각 접종하여 배양함과 동시에 배양하는 동안 일정시간마다 시료를 채취하였다. 채취한 시 료는 10,000 g에서 원심분리하여 상등액을 균체외 조효소로 사용하였다. 생산된 조효 소의 ph에 대한 효소 활성 영향을 조사하기 위하여 ph가 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12로 조절된 Britton-Robinson buffer용액에 5% CMC용액 또는 5% xylan 용액을 혼합 하여 2% 기질용액을 사용하였다. 기질이 혼합된 각 ph 범위의 buffer와 조효소액을 각 각 500 μl씩 완전 혼합하여 50 에서 각각 30분간 반응시킨 각각의 시료에 DNS 용액 1 ml를 첨가한 뒤 끓는 물속에 시험관을 담궈 중탕시키면서 5분간 발색시킨 후 증류수 10 ml를 첨가하고 540 nm에서 흡광도를 측정하여 cellulase 및 xylanase 조효소의 활성 을 측정하였다. 대조군은 조효소액 500 μl와 증류수 500 μl를 혼합하여 시료와 동일하게 수행하였으며, 각 ph에 따른 상대효소활성을 측정하여 효소활성의 최적 ph를 확인하였다. 바. 분리된 부산물 당화효소 생산 균주로부터 생산된 cellulase 및 xylanase의 금속이온에 대한 효소의 활성 영향 분리균주로부터 생산된 cellulase의 금속이온에 대한 특성 조사를 위해 사용된 분리균주 로는 Bacillus sp. D1과 E2 균주를 사용하였으며, xylanase의 의 금속이온에 대한 특성 조사를 위해 사용된 분리균주로는 Staphylococcus sp. SS8과 SS10을 사용하였다. Cellulase의 특성 조사를 위한 조효소 생산을 위해 Bacillus sp. D1과 E2 균주를 각각 1% CMC가 포함된 PCA배지에서 1일간 배양 후 원심분리하여 얻은 상등액을 조효소로 사용하였으며, Xylanase의 경우 Staphylococcus sp. SS8과 SS10 균주를 각각 1% xylan이 포함된 PCA배지에서 1일간 배양 후 원심분리하여 얻은 상등액을 조효소로 사 용하였다. 효소의 특성 조사를 위해 사용된 buffer는 Britton-Robinson buffer를 사용하 였으며, 효소의 금속이온의 영향조사를 위해 ph 7.0으로 조절된 buffer를 사용하여 효 소활성을 확인하였다. 또한 효소의 금속이온의 영향을 조사하기 위해 AlCl 3, BaCl 2, CaCl 2, CoCl 2, CuCl 2, FeCl 3, MgCl 2, MnCl 2, ZnCl 2 이 각각 포함된 금속이온용액을 이용 하여 효소와 반응시킨후 활성을 측정하여 금속이온의 영향을 조사하였다. 사. Cellulase 유전자 및 xylanase 유전자 cloning 본 연구에 사용된 cellulase 유전자 및 xylanase cloning을 위한 primer는 문헌조사를 통해 제작되었으며, primer 염기서열은 표 1에 나타낸 바와 같다

28 Table 1. Primers for cellulase or xylanase cloning in this study. Cellulase Primer Sequence Product size 5' - ATG AAA CGG TCA ATT TCT ATT YJ-1 TT -3' 1,500 bp YJ-2 5' - CTA ATT GGG TTC TGT TCC CAA AT -3' JK-L15F 5' - ATG AAA CGG TCA ATC T -3' 1,500 bp JK-L15R 5' - CTA ATT TGG TTC TGT T -3' JK-L73F 5' - ATG CCT TAT CTG AAA C -3' 730 bp JK-L73R 5' - TTA TTT TTT TGT ATA -3' Xylanase Primer Sequence Product size 5' - ATG TTT AAG TTT AA AAG AAT JK-xynF TTC TTA GTT -3' 640 bp JK-xynR 5' - TTA CCA CAC TGT TAC GTT AGA ACT TCC ACT -3' 상기 제작된 primer와 본 세부과제 및 제 2세부과제로부터 분리된 섬유소 당화효소 생 산균주와 PCR를 이용하여 cellulase 및 xylanase 유전자를 증폭하였으며, 증폭된 유전자 를 T&A cloning vector에 cloning하여 E. coli DH5α에 형질전환 후 PCR product를 고속 으로 염기서열을 결정하였다. 밝혀진 유전정보를 분석하기 위해 BLAST search를 통해 cellulase 또는 xylanase 유전자를 확인하였다. 아. 섬유수 유전자 발현조건 탐색 및 발현 조건 최적화 본 연구에 사용된 cellulase 유전자의 발현 및 발현 조건 최적화를 위해 발현 벡터의 종 류와 발현유도체의 농도 및 시간에 대한 조사를 수행하였다. 발현벡터의 종류에 따른 cellulase 유전자의 발현 유무를 알아보기 위한 실험에 사용된 발현 벡터의 종류로는 pexp5-ct/topo, pet-32a(+), pet-28a(+), pbad24, pgfpuv를 사용하였다. pexp5-ct/topo 벡터의 경우 pexp5-ct/topo 벡터에서 cloning 된 cellulase 유전자 가 포함되어 있는 plasmid를 발현을 위해 사용하였으며, 나머지 벡터의 경우 T&A cloning 벡터에서 cloning 된 cellulase 유전자가 포함되어 있는 plasmid를 사용하였다. 발현균주로는 사용된 모든 벡터에 E. coli BL21을 이용하였으며, 발현유도체로는 pbad24를 제외한 나머지 벡터의 발현유도체로 0.5 mm의 IPTG를 사용하였으며, pbad24는 0.02%의 L-arabinose를 발현유도체로 사용하였고 발현유도체를 첨가한 후 4 시간동안 배양하여 발현유무를 확인하였다. 발현유도 시간에 따른 cellulase 유전자 발현 양상을 확인하기위해 발현유도체 첨가 후 배양시간에 따른 (0, 1, 2, 4, 8 h) 세포내 단백질 발현양상을 SDS-PAGE 분석을 통해 확인하였으며, 발현유도체 농도에 따른 cellulase 유전자 발현 양상을 확인하기 위해 발 현유도체 IPTG의 농도에 따른 (0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 mm) 세포내 단백질발현양상을 SDS-PAGE 분석을 통해 확인하였다. 2. 연구결과

29 가. 부산물 당화효소 생산을 위한 효소 생산 균주 탐색 부엽토, 억새시료, 수로내 물, 말똥 및 퇴비 등으로부터 총 41개 균주를 분리하였 으며, 분리된 균주들의 형태학적 특징을 표 1-1에 나타내었다. 또한 이 가운데 21 개 균주에서 cellulase 및 xylanase 활성 확인하였다 (표 1-2). 표 1-1. 다양한 시료로부터 분리된 균주들 집락의 형태학적 특징 No Strain Form Surface Texture Elevation Margin Color Opacity 1 A-1 circular glistening mucoid raised entire beige opaque 2 A-2 circular glistening mucoid crateriform entire yellow translucent 3 A-3 circular glistening mucoid raised entire yellow translucent 4 A-4 circular smooth moist raised entire beige opaque 5 A-5 irregular smooth moist raised curled white yellow translucent 6 A-6 irregular smooth moist raised undulate yellow opaque 7 A-7 circular smooth moist convex entire pink opaque 8 A-8 irregular dull butyrous crateriform undulate beige opaque 9 B-1 circular glistening mucoid raised entire beige opaque No Strain Form Surface Texture Elevation Margin Color Opacity 10 B-2 circular dull moist raised entire beige opaque 11 B-3 circular smooth moist convex entire yellow opaque 12 B-4 irregular dull moist flat undulate beige opaque 13 B-5 circular smooth moist raised entire white yellow translucent 14 B-6 circular smooth mucoid raised entire beige opaque 15 C-1 circular dull butyrous crateriform entire beige opaque 16 C-2 irregular dull butyrous flat undulate beige opaque 17 C-4 irregular glistening mucoid raised entire beige opaque 18 D-1 circular smooth mucoid raised entire beige opaque 19 D-2 irregular wrinkled dry convex entire white yellow translucent 20 D-4 irregular dull butyrous flat undulate beige opaque 21 E-1 irregular dull mucoid raised curled white yellow translucent 22 E-2 circular smooth butyrous flat entire beige opaque 23 E-3 circular glistening mucoid convex entire beige opaque 24 E-4 circular glistening moist convex entire yellow opaque 25 E-5 circular dull butyrous convex entire yellow opaque 26 E-6 irregular dull butyrous flat curled beige opaque 27 F-1 circular dull butyrous flat undulate beige opaque 28 F-2 irregular dull butyrous flat undulate beige opaque

30 29 F-3 circular dull butyrous crateriform entire beige opaque 30 F-4 irregular glistening mucoid convex entire beige opaque 31 F-5 circular smooth mucoid raised entire beige opaque 32 F-6 irregular dull butyrous raised undulate beige opaque 33 F-7 filamentous dull dry flat filiform beige opaque 34 F-8 circular dull butyrous raised entire beige opaque 35 G-1 irregular dull butyrous flat undulate beige opaque 36 G-2 irregular smooth butyrous raised entire beige opaque 37 G-3 circular glistening mucoid convex entire beige opaque 38 G-4 circular glistening mucoid convex entire beige opaque 39 G-5 circular glistening mucoid crateriform entire beige opaque 40 G-6 irregular dull butyrous flat lobate beige opaque 41 G-7 irregular dull butyrous flat entire white yellow translucent

31 표 1-2. 다양한 시료로부터 분리된 균주들의 cellulase 및 xylanase의 활성 측정 결과 Strain Cellulase activity Xylanase activity Strain Cellulase activity Xylanase activity Strain Cellulase activity Xylanase activity A C F A C F A C F A D F A D F A D F A E G A E G B E G B E G B E G B E G B F G B F : excellent, ++: good, +: weak, -: negative 나. Cellulase 유전자 cloning Y J-1/Y J-2 primer와의 PCR을 통하여 분리균주 D1, E2 균주로부터 약 1500 bp 크기의 cellulase 유전자를 확인하여 cloning을 완료하였다(그림 1-1). 그림 1-1. Y J-1/Y J-2 primer와 분리균주 D1과 E2의 cdna 의 PCR을 통한 cellulase 유전 자 증폭. Cloning된 PCR 결과물의 염기서열을 분석한 결과 D1, E2 균주 모두 Bacillus subtilis AH18의 cellulase gene과 가장 유사하여 B. subtilis 유래 cellulase gene (endo-1,4-beta glucanase)으로 확인되었다(그림 1-2, 3, 4, 5)

32 그림 1-2. Y J-1/Y J-2 primer와 분리균주 D1 cdna 의 PCR을 통해 얻어진 cellulase 유전 자의 NCBI blast search 결과. 그림 1-3. Y J-1/Y J-2 primer와 분리균주 D1 cdna 의 PCR을 통해 얻어진 cellulase 유전 자의 염기서열. 그림 1-4. Y J-1/Y J-2 primer와 분리균주 E2 cdna 의 PCR을 통해 얻어진 cellulase 유전 자의 NCBI blast search 결과. 그림 1-5. Y J-1/Y J-2 primer와 분리균주 E2 cdna 의 PCR을 통해 얻어진 cellulase 유전 자의 염기서열. 또한 JK-L15 F/R primer와의 PCR을 통하여 분리균주 D1 균주로부터 약 1500 bp 크기의 cellulase 유전자를 확인하여 cloning을 완료하였다(그림 1-6)

33 그림 1-6. JK-L15 F/R primer와 분리균주 D1의 cdna의 PCR을 통한 cellulase 유전자 증폭. Cloning된 PCR 결과물의 염기서열을 분석한 결과 cloning된 유전자는 Bacillus subtilis AH18의 cellulase gene과 가장 유사하여 B. subtilis 유래 cellulase gene (endo-1,4-beta glucanase)으로 확인되었다(그림1-7, 8). 그림 1-7. JK-L15 F/R primer와 분리균주 D1 cdna 의 PCR을 통해 얻어진 cellulase 유 전자의 NCBI blast search 결과. 그림 1-8. JK-L15 F/R primer와 분리균주 D1 cdna 의 PCR을 통해 얻어진 cellulase 유 전자의 염기서열. 그림 1-9는 JK-L73 F/R primer와 분리균주 D1, E2 균주의 cdna 를 이용한 PCR 을 통하여 약 730 bp 크기의 cellulase 유전자를 확인하였으며 cloning을 완료하였 다

34 그림1-9. JK-L73 F/R primer와 분리균주 D1과 E2의 cdna 의 PCR을 통한 cellulase 유 전자 증폭 증폭된 유전자의 염기서열 분석결과 D1 균주로부터 cloning된 유전자는 Bacillus subtilis strain LN의 cellulase gene (cell 73)과 가장 유사하여 B. subtilis 유래 cellulase gene (cell 73)으로 확인되었으며(그림 1-10, 11), E2 균주로부터 cloning 된 유전자는 Bacillus subtilis beta-1,3-1,4 glucanase gene과 가장 유사하여 B. subtilis 유래 cellulase gene 으로 확인되었다(그림 1-12, 13). 그림 JK-L73 F/R primer와 분리균주 D1 cdna 의 PCR을 통해 얻어진 cellulase 유 전자의 NCBI blast search 결과. 그림 JK-L73 F/R primer와 분리균주 D1 cdna 의 PCR을 통해 얻어진 cellulase 유 전자의 염기서열. 그림 JK-L73 F/R primer와 분리균주 E2 cdna 의 PCR을 통해 얻어진 cellulase 유 전자의 NCBI blast search 결과

35 그림 JK-L73 F/R primer와 분리균주 E2 cdna 의 PCR을 통해 얻어진 cellulase 유 전자의 염기서열. 다. Xylanase 유전자 cloning 그림 1-14는 JK-Xyn F/R primer와의 PCR을 통하여 분리균주 D1, D2, D4, E2, F8, G3, G5 로 부터 약 640 bp 크기의 xylanase 유전자 확인 및 cloning을 완료하였다. 그림1-14. JK-Xyn F/R primer와 분리균주 D1, D2, D4, E2, F8, G3, G5의 cdna의 PCR을 통한 xylanase 유전자 증폭. Cloning된 유전자의 염기서열 분석결과 D1 균주로부터 cloning된 유전자는 Bacillus subtilis strain M W 10의 endo-1,4-beta-xylanase (xylb)와 유사하여 B. subtilis 유 래 xylanase gene (endo-1, 4-beta xylanase (xylb)) 으로 확인되었으며(그림 1-15, 16), D2, D4 균주의 경우 Bacillus sp. NBL420의 endo-xylanase (xyls)와 유사하여 B. subtilis 유래 xylanase gene (endo-xylanase (xyls)) 으로 확인되었고(그림 1-17, 18), E2, F8, G3, G5 균주의 경우 Bacillus subtilis의 xylanase (xyl) gene과 유사하여 B. subtilis 유래 xylanase gene (xylanase (xyl)) 으로 확인되었다(그림 1-19, 20). 그림 JK-Xyn F/R primer와 분리균주 D1 cdna의 PCR을 통해 얻어진 xylanase 유전자의 NCBI blast search 결과

36 그림 JK-Xyn F/R primer와 분리균주 D1 cdna의 PCR을 통해 얻어진 xylanase 유전자의 염기서열. 그림 JK-Xyn F/R primer와 분리균주 D2와 D4 cdna의 PCR을 통해 얻어진 xylanase 유전자의 NCBI blast search 결과. 그림 JK-Xyn F/R primer와 분리균주 D2와 D4 cdna의 PCR을 통해 얻어진 xylanase 유전자의 염기서열. 그림 JK-X yn F/R primer와 분리균주 E2, F8, G3, G5 cdna 의 PCR을 통해 얻어 진 xylanase 유전자의 NCBI blast search 결과. 그림 JK-X yn F/R primer와 분리균주 E2, F8, G3, G5 cdna 의 PCR을 통해 얻어 진 xylanase 유전자의 염기서열

37 제2세부과제의 결과로부터 얻어진 섬유소 분해능이 있는 분리균주 SS5, SS8, SS10, DS1, DW2, *C2의 cdna와 JK-Xyn F/R primer를 이용하여 PCR을 통해 약 640 bp 크기의 xylanase 유전자를 확인하여 cloning을 완료하였다. 그림1-21. JK-Xyn F/R primer와 분리균주 SS5, SS8, SS10, DS1, DW2, *C2의 cdna의 PCR을 통한 xylanase 유전자 증폭. 증폭된 유전자의 염기서열 분석 결과 SS5 (99%), SS8 (99%), SS10 (99%), *C2 (99%) 균주의 경우 Bacillus subtilis 의 xylanase (xyl) gene과 유사하였고(그림 1-21, 22), DS1 (97%)과 DW2 (97%) 균주의 경우 Bacillus sp. Y16의 xylanase gene과 유사하여 모두 Bacillus sp. 유래 xylanase gene 으로 확인되었다(그림 1-23, 24). 그림 JK-Xyn F/R primer와 분리균주SS5, SS8, SS10, *C2. cdna의 PCR을 통해 얻어진 xylanase 유전자의 염기서열. 그림 JK-Xyn F/R primer와 분리균주 SS5, SS8, SS10, *C2 cdna의 PCR을 통해 얻어진 xylanase 유전자의 NCBI blast search 결과

38 그림 JK-Xyn F/R primer와 분리균주DS1과 DW2 cdna의 PCR을 통해 얻어진 xylanase 유전자의 염기서열. 그림 JK-Xyn F/R primer와 분리균주 DS1과 DW2 cdna의 PCR을 통해 얻어진 xylanase 유전자의 NCBI blast search 결과. 라. 선별된 분리균주 동정 선별된 분리균주 D1, E2 균주의 생화학적 시험을 위하여 A PI kit을 이용하여 시 험을 수행하였으며(표 1-3, 4), 16s rdna 염기서열 분석 결과 B. subtilis 16s rdna와 99%의 상동성을 나타내어 B. subtilis로 동정하고 각각 B. subtilis D1과 E2로 명명하였다(그림 1-25, 26)

39 5 L-arabinose Xylitol - 6 D-ribose N-acetylglucosamine Gentiobiose + 7 D-xylose Amygdalin + 41 D-Turanose + 8 L-xylose - 25 Arbutin + 42 D-lyxose - 9 D-adonitol - 26 Esculin ferric citrate D-Tagatose - 10 표 1-3. 부엽토로부터 분리된 D1 균주의 생화학적 특성 No. Component Utiliza Utilizatiotion Utiliza- No. Component No. Component - tion 1 Control - 18 Inositol + 35 D-Melezitose - 2 Glycelrol + 19 D-mannitol D-Raffinose + 3 Erythritol - 20 D-sorbitol Amidon (starch) D-arabinose - 21 Methyl-αDmannopyranoside - 38 Glycogen +++ Methyl-αDglucopyranoside Methyl-βDxylopyranoside - 27 Salicin D-Fucose - 11 D-galactose - 28 D-cellobiose L-Fucose - 12 D-glucose D-maltose D-arabitol - 13 D-fructose D-lactose (bovine origin) - 47 L-arabitol - 14 D-mannose D-melibiose - 48 Potassium gluconate + 15 L-sorbose - 32 D-saccharose (sucrose) Potassium 2- ketogluconate - 16 L-rhamnose + 33 D-trehalose Dulcitol - 34 Inulin +++ Potassium 5- ketogluconate - +++: excellent, ++: good, +: weak, -: negative

40 표 1-4. 말똥으로부터 분리된 E2 균주의 생화학적 특성 No. Component Utiliza Utilizatiotion Utiliza- No. Component No. Component - tion 1 Control - 18 Inositol + 35 D-Melezitose - 2 Glycelrol + 19 D-mannitol D-Raffinose + 3 Erythritol - 20 D-sorbitol Amidon (starch) D-arabinose - 21 Methyl-αDmannopyranoside - 38 Glycogen L-arabinose Methyl-αDglucopyranoside Xylitol - 6 D-ribose N-acetylglucosamine Gentiobiose D-xylose Amygdalin D-Turanose ++ 8 L-xylose - 25 Arbutin D-lyxose - 9 D-adonitol - 26 Esculin ferric citrate D-Tagatose - 10 Methyl-βDxylopyranoside - 27 Salicin D-Fucose - 11 D-galactose - 28 D-cellobiose L-Fucose - 12 D-glucose D-maltose D-arabitol - 13 D-fructose D-lactose (bovine origin) - 47 L-arabitol - 14 D-mannose D-melibiose - 48 Potassium gluconate + 15 L-sorbose - 32 D-saccharose Potassium (sucrose) ketogluconate - 16 L-rhamnose + 33 D-trehalose Potassium 5- ketogluconate - 17 Dulcitol - 34 Inulin : excellent, ++: good, +: weak, -: negative 그림 분리균주 D1의 16s rdna 염기서열의 NCBI blast search 결과

41 그림 분리균주 E2의 16s rdna 염기서열의 NCBI blast search 결과. 표 1-5는 선별된 제2세부과제의 결과로부터 얻어진 섬유소 분해능이 있는 분리균주들 의 형태학적 특성을 나타낸 표이며, 형태학적 특성 및 16 rdna 염기서열을 분석한 결 과 분리균주 SS5, SS8, SS10, DS1, DW2, *C2는 각각 Brevibacillus brevis (99%)(그림 1-26, 27), Staphylococcus sp. (99%)(그림 1-28, 29), Staphylococcus sp. (99%)(그림 1-30, 31), Bacillus subtilis (100%)(그림 1-32, 33), Bacillus pumilis (99%)(그림 1-34, 35), Bacillus megaterium (99%)(그림 1-36, 37) 로 각각 동정되었다. 표 1-5. 다양한 시료들로부터 분리된 xlanase 활성 균주집락의 형태학적 특징 No Strain Form Surface Texture Elevation Margin Opacity 1 SS5 Circular Dull Brittle Flat Entire Opaque 2 SS8 Circular Smooth Moist Convex Entire Opaque 3 SS10 Circular Smooth Moist Convex Entire Opaque 4 DS1 Circular Smooth Moist Convex Undulate Opaque 5 DW2 Circular Rough Dry Convex Entire Opaque 6 *C2 Circular Dull Mucoid Raised Undulate Opaque 그림 분리균주 SS5의 16s rdna 염기서열

42 그림 분리균주 SS5의 16s rdna 염기서열의 NCBI blast search 결과. 그림 분리균주 SS8의 16s rdna 염기서열. 그림 분리균주 SS8의 16s rdna 염기서열의 NCBI blast search 결과. 그림 분리균주 SS10의 16s rdna 염기서열. 그림 분리균주 SS10의 16s rdna 염기서열의 NCBI blast search 결과

43 그림 분리균주 DS1의 16s rdna 염기서열. 그림 분리균주 DS1의 16s rdna 염기서열의 NCBI blast search 결과. 그림 분리균주 DW 2의 16s rdna 염기서열. 그림 분리균주 DW 2의 16s rdna 염기서열의 NCBI blast search 결과

44 그림 분리균주 *C2의 16s rdna 염기서열. 그림 분리균주 *C2의 16s rdna 염기서열의 NCBI blast search 결과. 마. 분리균주로부터 생성된 cellulase 및 xylanase 특성조사 그림 1-38은 cllulase 생산 시간에 따른 효소의 활성을 측정한 결과이다. D1 균주 의 경우 배양 1일째, E2 균주의 경우 배양 3일째 생산된 cellulase의 활성이 가장 높은 것으로 조사되었다. 그림 B. subtilis D1과 E2로부터 생산된 cellulase의 생산 시간에 따른 효소활성의 영향. Cellulase는 Britton-Robinson buffer (ph 7.0)내에서 1%(w/v) CMC를 기질로 하여 50 에서 30 분 동안 반응시켰다. 효소활성은 unit으로 나타내었으며, 1 unit은 1분 동안 1 ml의 조효소로부터

45 1 umol의 환원당을 생산하는 것으로 정의하였다. 그림 1-39는 생산된 cellulase의 온도에 따른 효소활성영향을 나타낸 결과이며, 생 산된 cellulase의 최적 반응온도의 경우 D1, E2 균주 모두 50 에서 가장 효소반응 이 높은 것으로 조사되었다. Fig B. subtilis D1과 E2로부터 생산된 cellulase의 반응온도에 따른 효소활성의 영 향. Cellulase는 Britton-Robinson buffer (ph 7.0)내에서 1%(w/v) CM C를 기질로 하여 50 에서 30분 동안 반응시켰다. 그림 1-40은 생산된 cellulase의 ph에 따른 효소활성영향을 나타낸 결과이고, 생산 된 cellulase의 최적 반응pH의 경우 D1, E2 균주 유래 cellulase 모두 중성영역에서 높은 활성을 보였으며, 각각 ph 6 과 7에서 가장 효소반응이 높았다. Fig B. subtilis D1과 E2로부터 생산된 cellulase의 반응pH에 따른 효소활성의 영향. Cellulase는 ph 범위별로 조절된 Britton-Robinson buffer (ph )내에서 1%(w/v) CMC를 기질로 하여 50 에서 30분 동안 반응시켰다. 그림 1-41은 분리균주 Bacillus sp. D1으로 부터 생산된 cellulase의 금속이온에 대한 영향을 나타낸 결과이다

46 그림 분리균주 Bacillus sp. D1으로 부터 생산된 cellulase의 금속이온에 대한 영향. 시험에 사용된 금속이온으로는 AlCl 3, BaCl 2, CaCl 2, CoCl 2, CuCl 2, FeCl 3, MgCl 2, MnCl 2, ZnCl 2 이 사용되었으며, 시험에 사용된 금속이온가운데 Co 또는 Mn 이온의 경 우 cellulase 활성에 크게 영향을 미치지 않았으나, Al 또는 Zn 이온의 경우 상대활성이 약 40%로 감소하여 저해영향이 큰 것으로 조사되었다. 또한 Bacillus sp. E2 유래 cellulase의 경우도 마찬가지로 시험에 사용된 금속이온 모두에서 Bacillus sp. D1 유래 cellulase의 금속이온의 영향과 유사하였다(그림 1-42). 그림 분리균주 Bacillus sp. E2로 부터 생산된 cellulase의 금속이온에 대한 영향. Xylanase 생산 시간에 따른 효소의 활성 측정결과를 그림 1-43에 나타내었다. xylanase 생산 시간에 따른 효소의 활성을 측정한 결과D1, E2 균주 모두 배양 1일 째 생산된 xylanase의 활성이 가장 높았다. 그리고 그림 1-44에 나타낸 바와 같이 생산된 xylanase의 온도에 따른 효소활성영 향을 조사한 결과 생산된 xylanse의 최적 반응온도의 경우 D1, E2 균주 모두 60 에서 가장 효소반응이 높은 것으로 조사되었다. 그림 1-45는 생산된 xylanase의 ph에 따른 효소활성영향을 나타낸 결과이고, 생산 된 xylanase의 최적 반응pH의 경우 D1, E2 균주 유래 xylanase 모두 알카리영역에 서 높은 활성을 보였으며, 각각 ph 10 과 11에서 가장 효소반응이 높은 것을 알 수 있 었다

47 그림 B. subtilis D1과 E2로부터 생산된 xylanase의 생산 시간에 따른 효소활성의 영향. xylanase는 Britton-Robinson buffer (ph 7.0)내에서 1%(w/v) beech wood xylan을 기질로 하여 50 에서 30분 동안 반응시켰다. 효소활성은 unit으로 나타내었으며, 1 unit은 1분 동안 1 ml의 조효소로부터 1 umol의 환원당을 생산하는 것으로 정의하였다. Fig B. subtilis D1과 E2로부터 생산된 xylanase의 반응온도에 따른 효소활성의 영 향. xylanase는 Britton-Robinson buffer (ph 7.0)내에서 1%(w/v) beech wood xylan을 기질로 하여 50 에서 30분 동안 반응시켰다. Fig B. subtilis D1과 E2로부터 생산된 xylanase의 반응pH에 따른 효소활성의 영향. xylanase는 ph 범위별로 조절된 Britton-Robinson buffer (ph )내에서 1% (w/v) beech wood xylan을 기질로 하여 50 에서 30분 동안 반응시켰다. 그림 1-46은 분리균주 Staphylococcus sp. SS8과 Staphylococcus sp. SS10으로 부터

48 생산된 xylanase의 온도에 따른 효소활성영향을 조사한 결과이며, 생산된 xylanse 의 최적 반응온도의 경우 SS8, SS10 균주 모두 50 에서 가장 효소반응이 높은 것 으로 조사되었다. Fig Staphylococcus sp. SS8과 Staphylococcus sp. SS10으로부터 생산된 xylanase의 반응온 도에 따른 효소활성의 영향. xylanase는 Britton-Robinson buffer (ph 7.0)내에서 1%(w/v) beech wood xylan을 기질로 하여 50 에서 30분 동안 반응시켰다. 그림 1-47은 분리균주 Staphylococcus sp. SS8과 Staphylococcus sp. SS10으로부터 생 산된 xylanase의 ph에 따른 효소활성영향을 나타낸 결과이고, 생산된 xylanase의 최적 반응pH의 경우 D1, E2 균주 유래 xylanase의 활성과 유사하게 모두 알카리영역 에서 높은 활성을 보였으며, 각각 ph 9와 10에서 가장 효소반응이 높은 것을 알 수 있 었다. Fig Staphylococcus sp. SS8과 SS10으로부터 생산된 xylanase의 반응pH에 따른 효소 활성의 영향. xylanase는 ph 범위별로 조절된 Britton-Robinson buffer (ph )내에 서 1% (w/v) beech wood xylan을 기질로 하여 50 에서 30분 동안 반응시켰다. 그림 1-48은 분리균주 Staphylococcus sp. SS8로 부터 생산된 xylanase의 금속이온에 대한 영향을 나타낸 결과이다. cellulase의 경우와 같이 시험에 사용된 금속이온으로는 AlCl 3, BaCl 2, CaCl 2, CoCl 2, CuCl 2, FeCl 3, MgCl 2, MnCl 2, ZnCl 2 이 사용되었으며, 시험에 사용된 금속이온 모두에서 cellulase에 비해 저해효과가 더 큰 것으로 조사되었다. 특히 Al 이온의 경우 상대활성이 약 20%로 감소하여 가장 큰 저해효과를 나타내었으며, cellulase와 마찬가지로 Co 이온의 경우 다른 금속이온에 비해 상대적으로 저해효과가 낮은 것으로 조사되었다. 또한 Staphylococcus sp. SS10 유래 xylanase의 경우도 마찬

49 가지로 시험에 사용된 금속이온 모두에서 Staphylococcus sp. SS8 유래 xylanase의 금 속이온의 영향과 유사하게 Al 이온의 경우 가장 큰 저해효과를 나타내었다(그림 1-49). 그림 분리균주 Staphylococcus sp. SS8로 부터 생산된 xylanase의 금속이온에 대한 영향. 그림 분리균주 Staphylococcus sp. SS10으로 부터 생산된 xylanase의 금속이온에 대한 영향. 바. 분리균주 Bacillus sp. D1으로 부터 cellulase 유전자의 cloning 및 발현 pexp5-ct/topo 벡터를 이용하여 Bacillus sp. D1의 cellulase 유전자를 발현하기위 해 E. coli TOP10에서 Bacillus sp. D1의 cellulase 유전자를 cloning하였으며, pet-32a(+), pet-28a(+), pgfpuv, PBAD24 벡터를 이용하여 Bacillus sp. D1의 cellulase 유전자를 발현하기위해 E. coli DH5α에서 Bacillus sp. D1의 cellulase 유전자 (1500bp)를 cloning 하여 확인하였다. 그리고 분리균주 Bacillus sp. D1으로 부터 cloning된 약 1500bp의 cellulase 유전자의 발현유무를 확인하기위해 E. coli BL21에 pexp5-ct/topo, pet-32a(+), pet-28a(+), pgfpuv, pbad24 벡터를 각각 발현 벡 터로 사용하였다. 발현유도를 위한 발현 유도체의 경우 pbad24를 제외한 나머지 벡터 의 발현유도체로 0.5 mm의 IPTG를 사용하였으며, pbad24는 0.02%의 L-arabinose를 발현유도체로 사용하였고 발현유도체를 첨가한 후 4시간동안 배양하여 발현유무를 확 인하였다. 그림 1-46에 나타난 결과와 같이 각각의 벡터에서 발현유무를 확인한 결과 pet-28a(+)와 pgfpuv 벡터를 이용하여 발현할 경우 cellulase로 추정된 약 50 kda의 단백질이 발현되는 것을 확인하였으며, pexp5-ct/topo, pet-32(+), pbad24 벡터로

50 발현하였을 때는 cellulase로 추정된 단백질의 발현양상을 확인할 수 없었다. Fig 발현벡터의 종류에 따른 E. coli BL21에서의 cellulase 유전자의 발현(1, 2: pexp5-ct/topo; 3, 4: pet-32a(+); 5, 6: pet-28a(+); 7, 8: pgfpuv; 9, 10: pbad24). 발현유 도체로써 IPTG (1번부터 8번)와 L-arabinose (9번, 10번)을 사용하였으며 농도는 각각 0.5 mm과 0.02%로 최종 조절하였다.. M : molecular size marker. pet-28a(+)와 pgfpuv 벡터를 이용하여 발현유도체인 IPTG의 농도를 0.5 mm로 처 리한 후 발현유도시간에 따른 발현양상에 대한 결과를 그림 1-47과 48에 각각 나타내 었다. pet-28a(+) 벡터의 경우 발현유도 1시간 후 부터는 발현양의 증가가 이루어지지 않았으며, pgfpuv 벡터의 경우 발현유도 4시간까지 단백질의 발현양이 증가하고 이 후에는 발현양의 증가가 이루어지지 않았다. 그림 1-49와 50은 발현유도체의 농도를 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 mm로 조절하여 pet-28a(+) 벡터의 경우 발현유도시간을 1시간으로 하고, pgfpuv 벡터의 경우 발현유 도시간을 4시간으로 하였을 경우 발현유도체 농도에 따른 발현양상을 살펴본 결과이다. 그림 1-49와 50결과에 나타난 바와 같이 두벡터에서의 cellulase의 발현은 발현유도체의 농도에 많은 영향을 받지 않은 것을 알 수 있었다. 따라서 pet-28a(+)와 pgfpuv 벡터 를 이용하여 분리균주 Bacillus sp. D1으로 부터 cloning된 약 1500bp의 cellulase 유전 자를 발현할 경우 발현유도체의 농도는 0.1 mm로 첨가하여 pet-28a(+)의 경우 1시간, pgfpuv vector의 경우 4시간의 발현 유도시간이 cellulase 유전자 발현을 위한 최적조 건임을 확인하였다

51 Fig pet-28a(+) 벡터를 포함하는 E. coli BL21에서의 발현시간에 따른 cellulase 유전자의 발현 양상. 0.5 mm의 IPTG가 발현유도체로써 첨가되었으며, 이후 0, 1, 2, 4, 8시간 후 세포를 회수하였다(1번부터 5번). M : molecular size marker. Fig pgfpuv 벡터를 포함하는 E. coli BL21에서의 발현시간에 따른 cellulase 유전자의 발현 양상. 0.5 mm의 IPTG가 발현유도체로써 첨가되었으며, 이후 0, 1, 2, 4, 8시간 후 세포를 회수하였다(1번부터 5번). M : molecular size marker

52 Fig pet-28a(+) 벡터를 포함하는 E. coli BL21에서 발현유도체 농도(0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 mm)에 따른 cellulase 유전자의 발현 양상(1번부터 5번). 발현유도체 첨가 후 발현시간은 4 시간으로 통일 하였다. M : molecular size marker. Fig pgfpuv 벡터를 포함하는 E. coli BL21에서 발현유도체 농도(0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 mm)에 따른 cellulase 유전자의 발현 양상(1번부터 5번). 발현유도체 첨가 후 발현시간은 4시간 으로 통일 하였다. M : molecular size marker

53 제2절 부산물의 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스 당화균주 개발 Ⅰ. 재료 및 방법 1. 섬유소 분해활성 균주 시료의 채취 가. 바이오에너지작물센터 내 농업환경 섬유소 분해활성 균주가 서식할만한 단수수 재배지 토양, 퇴비, 썩은 단수수, 썩은 나무 등의 바이오에너지작물센터 내 농업환경의 시료를 멸균된 샘플병에 담아 냉장보관하면서 섬유소 분 해활성 균주를 분리하는 데 사용하였다. 나. 초식동물 배설물 서울대공원으로부터 초식동물 11과 59종으로부터 배설물을 분양받아 섬유소 분해활성 균주를 분리하긴 위한 시료로 사용하였다. 다. 국내 자연 환경 광주/전남/전북지역에서 식물체(양배추, 보리, 억새, 단수수 등)과 토양 등 139점의 시료를 채취하여 섬유소 분해활성 균주를 분리하는데 이용하였다. 2. 섬유소 분해활성 균주의 분리 및 선정 가. 평판희석배양에 의한 균주의 분리 각각의 시료들 1g을 멸균수 9 ml에 희석하고 다시 이를 10배수로 희석하여 1% CMC/xylan 고체배지에 100μl 도말하여 37 에서 1-2 day 배양하였다. 1% CMC/Xylan 고체 배지의 조성 은 표 1과 같다. 표 1. Growth media composition Component CMC/xylan Bacto pepton Yeast extract Agar formula per liter 10.0 g 5.0 g 2.5 g 15.0 g 나. Congo red 염색에 의한 섬유소 분해활성 균주의 선별 평판희석배양으로 분리된 single colony들을 CMC/xylan 고체배지에 접종 배양(37, 1 day) 한 후 congo red로 30분간 염색, NaCl로 30분간 탈색하고 증류수로 세척하여 clear zone의 생 성유무를 확인하였다. clear zone이 크고 선명한 균주만을 1차 선발하고 액체배양한 후 균주들 을 20% glycerol과 함께 70 에 냉동 보관하며 섬유소 분해활성을 측정하였다. 다. DNS법에 의한 섬유소 분해활성 우수 균주의 선정 Congo red 염색으로 선발된 균주들을 CMC/xylan 액체배지(Table 2)에 접종 배양한 후 시 간별로 2 ml 추출한 후 15,000 rpm, 4, 10 min 원심분리한 후 상등액을 효소 활성 분석을 위한 조효소로 이용하였다. 효소의 활성은 DNS 분석법을 이용하여 효소-기질 반응에 의해 생 성된 환원당을 UV/Visible spectroscopy로 분석하였다. 실험은 조효소 0.5 ml 과 기질 (2%CMC/xylan) 0.5 ml을 50 에서 30분간 반응 시킨 후 DNS 3 ml을 가하고 100 에서 5 분간 반응 시켰다. 반응이 끝난 후 얼음물에 냉각시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 당분석의 정량을 위해 glucose/xylose를 100 ml D.W에 2.0 mg을 완전히 용해한 후 저장 용액 으로 사용하고 이를 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.0 mg/0.5 ml로 희석하여 흡광도를 측정하여 정량곡선

54 을 작성하였다. 3. 섬유소 분해활성 균주의 동정 가. 형태학적 특성 분석 섬유소 분해활성 우수 균주를 PCA(plate count agar) 배지에 균을 접종 37, 24 시간 배양 하고 형태학적 특성을 관찰하였다. 나. 생화학적 특성 분석 생화학적 특성은 API kit(biomerieux. Vitek, France)를 이용하여 확인하였다. 먼저 균주를 그램염색 하여 광학현미경을 통해 균의 그램음성/양성과 균의 모양을 관찰하였으며, 그램음성의 경 우 API 20CH kit, 그램양성은 API 50CH kit를 이용하여 분석하였다. 다. 16S rdna 염기서열 분석 선발된 균주의 염기서열 분석을 위해 균을 액체 배양한 후 genomic DNA extraction kit(dynebio, Korea)로 genomic DNA를 추출하고, 16S rdna universal primer를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR product를 T-easy vector에 ligation 후 형질전환 재조합 균주를 선발 하고 plasmid 추출 후 HindⅢ, BglⅡ로 DNA 크기를 확인하고 마크로젠(Daejeon, Korea)에 sequence 분석을 의뢰하였다. 분석된 염기서열은 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에서 상동성을 분석하고 Clustal X software version 1.81을 통해 phylogenetic tree를 작성하였다. 4. 섬유소 분해활성 우수 균주의 배양조건 최적화 가. 온도 조건 최적화 선발 균주의 배양 온도 조건에 따른 균주의 효소 생산과 효소 활성정도를 알아보기 위해 CMC/xylan 액체배지에 고체배지에서 배양된 single colony를 접종 배양하여 종균으로 사용하 였다. 배양된 종균 2 ml을 본 배양을 위해 CMC/xylan 100 ml 액체 배지에 접종하고, 배양 온도를 25, 30, 35, 40, 45, 50 로 달리하면서 150 rpm으로 24 시간 배양하였다. 배 양액은 원심분리(15,000 rpm, 10 min, 4 ) 한 후 상등액만을 조효소로 사용하여 DNS법으로 효소의 활성을 측정하였다. 나. 배지의 초기 ph 조건 최적화 배지의 초기 ph 변화에 따른 선발 균주의 효소 생산과 효소 활성은 1N HCl과 1N NaOH 시약을 이용하여 ph를 4에서 10으로 배지를 조정한 후 멸균하여 종균을 2 ml 접종하여 배양 하고 효소의 활성을 DNS 분석법으로 측정하였다. 다. 배양시간 최적화 배양시간에 따른 선발 균주의 효소 생산과 효소 활성은 100 ml CMC 액체 배지에 균을 접 종하여 37, 150 rpm으로 배양하면서, 배양시간별로 배양액을 취한 후 원심분리(15,000 rpm, 10 min, 4 ) 하고 상등액만을 조효소로 사용하여 DNS 방법으로 측정하였다. 5. 섬유소 분해활성 우수 균주가 생산한 효소를 이용한 전처리 볏짚의 당화 생산효소를 이용한 볏짚의 당화 실험은 미국 에너지부 산하의 재생에너지연구소(NREL) 분 석법에 따라 수행하였다. 50 ml의 뚜껑이 있는 삼각플라스크에 알칼리로 전처리한 볏짚을

55 xylan이 0.1g 함유하도록 정량하여 넣은 후 조효소를 첨가하여 최종부피가 10 ml이 되도록 하였다. 기질과 효소의 반응을 위해 반응액을 50 에서 5일간 180 rpm으로 교반 반응시켰다. 반응이 완료된 시료를 0.2 μm membrane filter로 여과한 후 HPLC(Waters 2414, Aminex HPX-87H column, 5mM H 2 SO 4 mobile phase, 65 column temperature, 40 detector temperature.)를 이용하여 생성된 xylose를 분석하였다. Ⅱ. 연구 결과 및 고찰 1. 섬유소 분해활성 균주 시료의 채취 가. 바이오에너지작물센터 내 농업환경 바이오에너지작물센터 내 단수수 재배지 토양, 퇴비, 썩든 단수수, 썩은 나무로부터 총 38개 균주를 평판 희석 배양을 통해 분리 할 수 있었다. 38개의 분리된 균주 중에 15개 균주에서 congo red 염색을 통해 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스 분해능이 확인 되었으며(표 2) 균주들 에 대한 형태학적 특성을 조사하였다(표 3). Congo red 염색에서 활성을 보인 균주들을 액체 배양하여 DNS 분석법으로 효소의 활성을 측정하였다(그림 1). 섬유소 분해활성이 우수한 SS8, SS9, SS10, SS13, *C7, DW2 6개 균주를 선발하고 균주의 동정을 위해 API kit를 이용하여 생화학적 특성 분석을 수행하였다(표 4~9). 생화학적 특성 분석과 16S rdna 염기 서열 분석 결과 SS8, SS9, SS10, SS13, *C7, DW2은 각각 Geobacillus stearothermophillus (95.8%), Bacillus mycoides (46.3%), Geobacillus stearothermophillus (95.8%), Bacillus cereus (98.2%), Bacillus cereus (96.4%), Bacillus cereus (57.6%)과 유연관계가 있는 것으로 조사되었다

56 표 2. 바이오에너지 작물센터 내 농업환경 유래 분리균주의 congo red 염색을 통한 섬유소 분 해활성 분리 시료 균주 CMC 배지 투명환 지름(cm) Xylan 배지 투명환 지름(cm) SS4 1.1(+) 2.7(++) SS5 0.8(-) 2.2(++) 단수수 재배지 토양 SS8 1.8(++) 2.9(++) SS9 1.8(++) 2.7(++) SS10 1.9(++) 3.1(++) SS13 1.8(++) 0(-) *C2 1.8(++) 0(-) 퇴비 *C5 1.7(+) 0.6(-) *C7 2.4(++) 1.7(+) DS1 2.7(++) 0(-) 썩은 단수수 DS3 1.2(+) 1.1(+) DS4 0.9(-) 1.0(+) DS5 1.2(+) 1.2(+) 썩은 나무 DW1 1.8(++) 0(-) DW2 2.6(++) 0.6(-) 표 3. 바이오에너지 작물센터 내 농업환경 유래 섬유소 분해활성 분리 균주의 형태학적 특성 No Strain Form Surface Texture Elevation Margin Opacity 1 SS4 Circular Dull Brittle Flat Entire Opaque 2 SS5 Circular Dull Brittle Flat Entire Opaque 3 SS8 Circular Smooth Moist Convex Entire Opaque 4 SS9 Irregular Dull Brittle Flat Undulate Opaque 5 SS10 Circular Smooth Moist Convex Entire Opaque 6 SS13 Irregular Dull Brittle Flat Undulate Opaque 7 *C2 Circular Dull Mucoid Raised Undulate Opaque 8 *C5 Circular Glistening Mucoid Flat Entire Opaque 9 *C7 Irregular Dull Brittle Flat Entire Opaque 10 DS1 Circular Smooth Moist Convex Undulate Opaque 11 DS3 Circular Glistening Mucoid Convex Entire Opaque 12 DS4 Circular Smooth Brittle Crateriform Undulate Opaque 13 DS5 Circular Glistening Mucoid Umbonate Entire Opaque 14 DW1 Circular Glistening Moist Convex Entire Opaque 15 DW2 Circular Rough Dry Convex Entire Opaque

57 그림 1. 바이오에너지작물센터 내 분리된 섬유소 분해활성 우수균주의 배양시간에 따른 섬유소 분해활성 측정(DNS 방법). 표 4. 단수수 토양에서 분리한 SS8의 생화학적 특성 No. Component Utilizatiotiotion Utiliza- Utiliza- No. Component No. Component 1 Control - 18 Inositol - 35 D-Melezitose + 2 Glycelrol D-mannitol + 36 D-Raffinose - 3 Erythritol - 20 D-sorbitol - 37 Amidon (starch) - 4 D-arabinose - 21 Methyl-αDmannopyranoside - 38 Glycogen - 5 L-arabinose - 22 Methyl-αDglucopyranoside - 39 Xylitol - 6 D-ribose + 23 N-acetylglucosamine + 40 Gentiobiose D-xylose L-xylose Amygdalin Arbutin D-Turanose D-lyxose D-adonitol - 26 Esculin ferric citrate - 43 D-Tagatose - Methyl-βDxylopyranoside Salicin - 44 D-Fucose D-galactose D-glucose D-cellobiose D-maltose L-Fucose D-arabitol D-fructose D-lactose (bovine origin) + 47 L-arabitol - 14 D-mannose D-melibiose - 48 Potassium gluconate - 15 L-sorbose - 32 D-saccharose Potassium 2- (sucrose) ketogluconate - 16 L-rhamnose - 33 D-trehalose Potassium 5- ketogluconate - 17 Dulcitol - 34 Inulin - +++: excellent, ++: good, +: weak, -: negative

58 표 5. 단수수 토양에서 분리한 SS9의 생화학적 특성 No. Component Utilization No. Component Utilization No. Component Utilization 1 Control - 18 Inositol - 35 D-Melezitose - 2 Glycelrol + 19 D-mannitol - 36 D-Raffinose - Amidon 3 Erythritol - 20 D-sorbitol - 37 (starch) D-arabinose - 21 Methyl-αDmannopyranoside - 38 Glycogen +++ Methyl-αDglucopyranoside 5 L-arabinose Xylitol D-ribose D-xylose N-acetylglucosamine Amygdalin Gentiobiose D-Turanose L-xylose D-adonitol Arbutin Esculin ferric citrate D-lyxose D-Tagatose - - Methyl-βDxylopyranoside Salicin D-Fucose - 11 D-galactose - 28 D-cellobiose + 45 L-Fucose - 12 D-glucose D-maltose D-arabitol - 13 D-fructose D-lactose - 47 L-arabitol - (bovine origin) Potassium 14 D-mannose - 31 D-melibiose gluconate 15 L-sorbose - 32 D-saccharose Potassium 2- (sucrose) ketogluconate - 16 L-rhamnose - 33 D-trehalose Potassium 5- ketogluconate - 17 Dulcitol - 34 Inulin - +++: excellent, ++: good, +: weak, -: negative 표 6. 단수수 토양에서 분리한 SS10의 생화학적 특성 No. Component Utilizatiotiotion No. Component Utiliza- No. Component Utiliza- 1 Control - 18 Inositol - 35 D-Melezitose ++ 2 Glycelrol D-mannitol - 36 D-Raffinose - 3 Erythritol - 20 D-sorbitol - 37 Amidon (starch) - Methyl-αDmannopyranoside 4 D-arabinose Glycogen - 5 L-arabinose + 22 Methyl-αDglucopyranoside + 39 Xylitol - 6 D-ribose + 23 N-acetylglucosamine Gentiobiose - 7 D-xylose - 24 Amygdalin - 41 D-Turanose + 8 L-xylose - 25 Arbutin - 42 D-lyxose - 9 D-adonitol - 26 Esculin ferric citrate - 43 D-Tagatose - 10 Methyl-βDxylopyranoside - 27 Salicin - 44 D-Fucose - 11 D-galactose D-cellobiose - 45 L-Fucose - 12 D-glucose D-maltose D-arabitol - D-lactose 13 D-fructose (bovine origin) - 47 L-arabitol - 14 D-mannose D-melibiose - 48 Potassium - 15 L-sorbose - 32 D-saccharose (sucrose) L-rhamnose - 33 D-trehalose Dulcitol - 34 Inulin - +++: excellent, ++: goo-d, +: weak, -: negative gluconate Potassium 2- ketogluconate Potassium 5- ketogluconate

59 표 7. 단수수 토양에서 분리한 SS13의 생화학적 특성 No. Component Utilization No. Component Utilization No. Component Utilization 1 Control - 18 Inositol - 35 D-Melezitose - 2 Glycelrol D-mannitol - 36 D-Raffinose - Amidon 3 Erythritol - 20 D-sorbitol - 37 (starch) D-arabinose - 21 Methyl-αDmannopyranoside - 38 Glycogen +++ Methyl-αDglucopyranoside 5 L-arabinose Xylitol D-ribose D-xylose N-acetylglucosamine Amygdalin Gentiobiose D-Turanose L-xylose D-adonitol Arbutin Esculin ferric citrate D-lyxose D-Tagatose - - M-ethyl-βDxylopyranoside Salicin D-Fucose - 11 D-galactose - 28 D-cellobiose L-Fucose - 12 D-glucose D-maltose D-arabitol - 13 D-fructose D-lactose - 47 L-arabitol - (bovine origin) Potassium 14 D-mannose D-melibiose gluconate 15 L-sorbose - 32 D-saccharose Potassium 2- (sucrose) - 49 ketogluconate - 16 L-rhamnose - 33 D-trehalose Potassium 5- ketogluconate + 17 Dulcitol - 34 Inulin - +++: excellent, ++: good, +: weak, -: negative 표 8. 퇴비에서 분리한 *C7의 생화학적 특성 No. Component Utilizatiotiotion No. Component Utiliza- No. Component Utiliza- 1 Control - 18 Inositol - 35 D-Melezitose - 2 Glycelrol D-mannitol - 36 D-Raffinose - 3 Erythritol - 20 D-sorbitol - 37 Amidon (starch) D-arabinose - 21 Methyl-αDmannopyranoside - 38 Glycogen L-arabinose - 22 Methyl-αDglucopyranoside - 39 Xylitol - 6 D-ribose N-acetylglucosamine Gentiobiose + 7 D-xylose - 24 Amygdalin D-Turanose - 8 L-xylose - 25 Arbutin D-lyxose - 9 D-adonitol - 26 Esculin ferric citrate D-Tagatose - Methyl-βDxylopyranoside Salicin D-Fucose D-galactose D-glucose D-cellobiose D-maltose L-Fucose D-arabitol D-fructose D-lactose (bovine origin) - 47 L-arabitol - 14 D-mannose - 31 D-melibiose - 48 Potassium gluconate - 15 L-sorbose - 32 D-saccharose Potassium 2- (sucrose) ketogluconate - 16 L-rhamnose - 33 D-trehalose Potassium 5- ketogluconate - 17 Dulcitol - 34 Inulin - +++: excellent, ++: good, +: weak, -: negative

60 표 9. 썩은 나무에서 분리한 DW 2의 생화학적 특성 No. Component Utilization No. Component Utilization No. Component Utilization 1 Control - 18 Inositol - 35 D-Melezitose - 2 Glycelrol D-mannitol - 36 D-Raffinose - Amidon 3 Erythritol - 20 D-sorbitol - 37 (starch) D-arabinose - 21 Methyl-αDmannopyranoside - 38 Glycogen +++ Methyl-αDglucopyranoside 5 L-arabinose Xylitol D-ribose D-xylose N-acetylglucosamine Amygdalin Gentiobiose D-Turanose L-xylose D-adonitol Arbutin Esculin ferric citrate D-lyxose D-Tagatose - - Methyl-βDxylopyranoside Salicin D-Fucose - 11 D-galactose - 28 D-cellobiose L-Fucose - 12 D-glucose D-maltose D-arabitol - 13 D-fructose D-lactose - 47 L-arabitol - (bovine origin) Potassium 14 D-mannose - 31 D-melibiose gluconate 15 L-sorbose - 32 D-saccharose Potassium 2- (sucrose) ketogluconate - 16 L-rhamnose - 33 D-trehalose Potassium 5- ketogluconate - 17 Dulcitol - 34 Inulin - +++: excellent, ++: good, +: weak, -: negative 나. 초식동물 배설물 섬유소 분해활성 균주 탐색을 위해 서울대공원으로부터 초식동물 11과 59종의 배설물을 분 양받았다(표 10). 배설물로부터 평판희석 배양으로 103개의 균주를 분리하였으며 65개 균주에 서 섬유소 분해활성을 확인하였다. Congo red 염색으로 섬유소 분해활성 우수 균주 28개를 1 차 선발하였다(표 11). 1차 선발된 균주를 액체 배양한 후 DNS 분석법을 통한 환원당 정량을 통해 CMC 및 xylan 분해능이 우수한 7개의 균주를 선발하고 효소활성이 가장 우수한 H9-1, H10-1균주를 최종적으로 선정하여 균주를 동정하였다(그림 2, 3). H9-1 균주의 동정을 위해 PCA 배지에 균을 배양한 후 형태학적 특성과 생화학적 특성을 알아보았다(표 12, 13). 분리균 주는 glycerol, L-arabinose, D-ribose, D-xylose, D-glucose, D-fructose, D-mannose, inositol, D-mannitol, D-sorbitol, methyl-αd-glucopyranoside, amygdalin, esculin ferric citrate, salicin, D-cellobiose, D-maltose, D-lactose, D-saccharose, D-trehalose, D-raffinose, amidon, glycogen, gentiobiose 등의 탄수화물을 이용하여 생육하였으며 이외의 탄수화물은 이용하지 못함을 확인하였다. 그림 4는 H9-1 균주의 congo red 염색을 통한 효소 활성과 그램염색의 결 과이다. H9-1균주는 섬유소 분해능이 있으며 colony의 모양이 불균일하고 불투명한 그램양성 의 간균임을 확인할 수 있었다. 분리균의 계통학적 유연관계를 조사하기 위하여 16S rdna 염 기서열을 분석하였다. 그림 5은 H9-1 선발균의 분석된 16S rdna 염기서열과 GeneBank에 등 록된 균주들의 염기서열을 비교 작성한 계통도이다. 염기서열 분석에서 H9-1균주의 염기서열 은 Bacillus subtillis와 99% 상동성을 나타내어 본 균주를 Bacillus sp. H9-1로 명명하였고, 이 를 농촌진흥청 유전자원센터에 기탁하였다(KACC 17125)

61 표 10. 섬유소 분해활성 균주 탐색을 위한 초식동물 목록 과 명 종 명 과 명 종 명 검은꼬리누 H43 돼지사슴 H29 겜스복 H38 물사슴 H30 니알라 H39 바라싱가 H13 돌산양 H37 붉은사슴 H31 사슴과(14종, 마콜 H40 사불상 H32 반추동물) 무플런 H41 야쿠사슴 H33 바바리양 H11 엑시스사슴 H34 블레스복 H42 와피티(엘크) H35 세이블앤틸롭 H44 일본사슴 H36 스프링복 H46 과나코 H14 시타퉁가 H47 단봉낙타 H16 낙타과(4종, 반추동물) 아메리카들소 H48 라마 H17 솟과(25종, 반추동물) 아시아물소 H49 쌍봉낙타 H3 아이벡스 H50 기린과(1종, 반추동물) 그물무늬기린 H4 아프리카물소 H1 코끼릿과(1종) 아시아코끼리 H5 자넨 H51 그랜트얼룩말 H6 워터벅 H52 그레비얼룩말 H18 유럽들소 H53 꽃말 H15 말과(6종) 일런드 H54 몽고야생말 H19 코리데일 H55 미니나귀 H20 큰뿔소 H56 셋틀랜드포니 H21 큰뿔양 H57 붉은캥거루 H7 흑염소 H58 왈라루 H25 캥거루과(4종) 흰오릭스 H59 왈라비 H26 히말라야타알 H12 회색캥거루 H27 순록 H45 꼬마하마 H28 하마과(2종) 고라니 H22 하마 H8 사슴과(14종, 꽃사슴 H2 토낏과(1종) 토끼 H9 반추동물) 노루 H23 코뿔솟과(1종) 흰코뿔소 H10 다마사슴 H

62 표 11. 초식동물 배설물에서 분리된 섬유소 분해활성 균주 No. Strain Family of herbivore Cellulase activity Xylanase activity Family of No. Strain herbivore Cellulase activity Xylanase activity 1 H1-1 Cattle H13-4 Deer H1-4 Cattle H16-1 Camel H4-3 Gifaffe H17-2 Camel H8-1 Hippopotamus H17-3 Camel H9-1 Rabbit H18-1 Horse H9-2 Rabbit H18-2 Horse H10-1 Rhinoceros H24-2 Deer H10-2 Rhinoceros H24-3 Deer H11-1 Cattle H25-1 Kangaroo H11-3 Cattle H25-2 Kangaroo H12-2 Cattle H25-4 Kangaroo H13-1 Deer H41-1 Cattle H13-2 Deer H55-1 Cattle H13-3 Deer H59-2 Cattle : excellent, ++: good, +: weak, -: negative 그림 2. 초식동물 배설물에서 분리한 섬유소 분해 우수균주의 CMCase 효소 활성

63 그림 3. 초식동물 배설물에서 분리한 섬유소 분해 우수균주의 xylanase 효소 활성 표 12. Morphological characteristics of Bacillus sp. H9-1 colony Family of Herbivore Strain Morphology of H9-1 [PCA] Form Surface Texture Elevation Margin Opacity Color Gram Stain Rabbit H9-1 Irregular Dull Brittle Flat Undulate Opaque White G(+)

64 표 13. Biochemical characteristics of Bacillus sp. H9-1 isolated from feces of rabbit Characteristics Result Characteristics Result Control - Esculin ferric citrate + Glycerol + Salicin + Erythritol - D-cellobiose + D-arabinose - D-maltose + L-arabinose + D-lactose (bovine origin) + D-ribose + D-melibiose - D-xylose + D-saccharose (sucrose) + L-xylose - D-trehalose + D-adonitol - Inulin - Methyl-βD-xylopyranoside - D-Melezitose - D-galactose - D-Raffinose W D-glucose + Amidon (starch) + D-fructose + Glycogen + D-mannose + Xylitol - L-sorbose - Gentiobiose + L-rhamnose - D-Turanose - Dulcitol - D-lyxose - Inositol + D-Tagatose - D-mannitol + D-Fucose - D-sorbitol + L-Fucose - Methyl-αD-mannopyranoside - D-arabitol - Methyl-αD-glucopyranoside + L-arabitol - N-acetylglucosamine - Potassium gluconate - Amygdalin W Potassium 2-ketogluconate - Arbutin + Potassium 5-ketogluconate - + Represents good utilization; W weak; - negative. (a) (b) 그림 4. Congo red (a) and Gram staining (b) of Bacillus sp H

65 그림 5. Phylogenetic relationship of isolated H9-1 strain with other Bacillus species based on partial 16S rdna gene sequences. 자일라네이즈 분해 활성으로 선별한 흰코뿔소 배설물 유래 H10-1 균주의 형태학적 특성과 생화학적 특성은 표 14, 15에 나타내었다. H10-1 균주는 불규칙한 모양의 축축하고 표면이 매 끈한 형태를 가지는 colony를 형성하였으며, L-arabinose, D-ribose, D-glucose, Arbutin, Esculin ferric citrate, Salicin등의 탄수화물을 이용하여 생육하였으며 glycerol, D-xylose, D-fructose, D-mannose, Inositol, D-mannitol, D-saccharose (sucrose),d-trehalose 등의 탄수 화물은 약하게 이용하여 생육함을 확인하였다.H10-1 균주의 congo red 염색을 통한 섬유소 분 해활성과 그램염색 결과는 그림 6에 나타내었다. H10-1 균주는 섬유소 분해활성이 우수함을 확인하였으며, 그램 양성의 간균임을 확인하였다. 그림 7은 16S rdna 염기서열 분석을 통한 H10-1 균주의 계통학적 유연관계를 나타낸 것으로 H10-1 균주가 Bacillus pumilus와 유연관 계가 가까움을 확인하였고 본 균주를 Bacillus pumilus H10-1로 명명하고, 농촌진흥청 유전자 원센터에 기탁하였다(KACC 91761P) 표 14. Morphological characteristics of Bacillus pumilus H10-1 colony Family of herbivore Strain Morphology of H10-1 [PCA] Form Surface Texture Elevation Margin Opacity Color Gram Stain Rhinoceros H10-1 irregular smooth moist crateriform undulate opaque white G(+)

66 표 15. Biochemical characteristics of Bacillus pumilus10-1 isolated from feces of Ceratotherium simum. Characteristics Result Characteristics Result Control - Esculin ferric citrate + Glycerol W Salicin + Erythritol - D-cellobiose W D-arabinose - D-maltose - L-arabinose + D-lactose (bovine origin) - D-ribose + D-melibiose - D-xylose W D-saccharose (sucrose) W L-xylose - D-trehalose W D-adonitol - Inulin - Methyl-βD-xylopyranoside - D-Melezitose - D-galactose - D-Raffinose - D-glucose + Amidon (starch) - D-fructose W Glycogen - D-mannose W Xylitol - L-sorbose - Gentiobiose - L-rhamnose - D-Turanose - Dulcitol - D-lyxose - Inositol W D-Tagatose - D-mannitol W D-Fucose - D-sorbitol - L-Fucose - Methyl-αD-mannopyranoside - D-arabitol - Methyl-αD-glucopyranoside - L-arabitol - N-acetylglucosamine - Potassium gluconate - Amygdalin - Potassium 2-ketogluconate - Arbutin + Potassium 5-ketogluconate - + Represents good utilization; W weak; - negative. 그림 6. Congo red (a) and Gram staining (b) of Bacillus pumilus H

67 그림 7. Phylogenetic relationship of isolated H10-1 strain with other Bacillus species based on partial 16S rdna gene sequences. 다. 국내 자연 환경으로부터 셀룰로오스 및 헤미 셀룰로오스 분해 균주 분리 식물체(양배추, 배추, 보리, 억새, 단수수 등)과 그들의 토양 등 139점의 국내 자연 환경 시료 로부터 326개의 섬유소 분해 활성 균주를 분리하였다(표 16, 17, 18). Congo red 염색을 통한 섬유소 분해활성이 있는 100개의 균주를 1차로 선정하고, DNS 분석법에 의한 환원당 정량으 로 섬유소 분해활성이 우수한 7개의 균주를 선정하여 재실험을 수행하였다(그림 8, 9). MAHJCA-1, HPHPS-1 균주의 경우 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스 분해능이 모두 우수함을 확인하였으며 이에 2균주를 최종적으로 선발하여 16S rdna 염기서열 분석을 통해 균주를 동 정하였다(그림 10) 표 16. The collected various samples for bacteria isolation from Jeonnam and Jeonbuk area. Area Soil of forest Soil of paddy Soil of miscantus culture land Soil of reed culture land General Soil Biomass Compost Total Jeonnam Jeonbuk Total

68 표 17. The detection results of cellulase and xylanase activities of isolated strains from Jeonnam area. No. Strain Source Cellulase activity Xylanase activity 1 MAHJTS1 Soil of tidal field MAHJTS2 Soil of tidal field MAHJCA1 Cabbage MAHGRH1 Rice husks MAHGRH2 Rice husks MAHGRH3 Rice husks MAHGRB1 Rice bran MAHGRB2 Rice bran MAMSD1 Sawdust MAMSD2 Sawdust MAMW1 Wood MACO1 Sediments of onion juice HPHPS1 Paddy soil HPHC1 Compost HPHC2 Compost HPHMCS1 Miscanthus soil HPHMCS2 Miscanthus soil HPHMCS3 Miscanthus soil HPHMC3 Miscanthus HPHRS1 Rice straw HPHRS2 Rice straw HPHRS3 Rice straw HPHCS1 Corn stover GJMMF2 Fallen leaves GJEMS1 Soil GJEMRE1 Reed GJEMRE2 Reed GJEMRE3 Reed DYCMS1 Soil DYYPS2 Paddy soil DYYPS4-1 Paddy soil DYYPS4-2 Paddy soil DYSWR1 Reed

69 No. Strain Source Cellulase activity Xylanase activity 34 DYSWR2-2 Reed DYSWR2-2 Reed DYSWR3-1 Reed DYSWR3-2 Reed DYSWC2 Compost DYSWW1 Swamp water JSCMS1 Soil JSCMS2-1 Soil JSCMW1 Wood JSSPS1 Paddy soil JSSC1 Compost JSSC3 Compost JSSRS2 Rice straw JSSRS3 Rice straw HSHMF2 Fallen leaves HSHMF3 Fallen leaves HSHMF4 Fallen leaves HSHMM1 Moss HSHMM3 Moss HSHMM4 Moss HSHMS2 Soil HSAMS1 Soil HSIMC1 Miscanthus HSIMC2 Miscanthus HSIMC3 Miscanthus HSIMCS1 Miscanthus soil HSIRS1 Rice straw HSIRS2 Rice straw HSIRS4 Rice straw HSIRS5 Rice straw HSIPS1 Paddy soil NJNC1 Compost NJNC2 Compost NJNC3 Compost NJNC5 Compost

70 No. Strain Source Cellulase activity Xylanase activity 68 HNDMMC1 Miscanthus HNDMMC2 Miscanthus HNDMS2 Soil HNBRS1 Rice straw HNBRS2 Rice straw HNBRS3 Rice straw HNBRS4 Rice straw GAJSMC1-1 Miscanthus GAJSMC1-2 Miscanthus GAJSMC2 Miscanthus GAJSMC3 Miscanthus GAJSMCS1 Miscanthus soil GAJSMCS2 Miscanthus soil GAJSMCS4 Miscanthus soil GAJSRS2 Rice straw GAJSRS5 Rice straw GAJSPS1 Paddy soil GAJSPS2 Paddy soil GAJSPS3 Paddy soil GAJSPS4 Paddy soil GAJSPS5 Paddy soil GAJJMS1 Soil GAJJMS2 Soil GAJJMF1 Fallen leaves GAJJMF2 Fallen leaves GAJJMF3 Fallen leaves JDJCC2 Chinese cabbage JDJSO1 Spring onion JDJSO2 Spring onion JDJSO3 Spring onion JDJSO4 Spring onion JDJSO5 Spring onion JDJRS1 Rice straw JDJRS2 Rice straw JDJRS4 Rice straw

71 No. Strain Source Cellulase activity Xylanase activity 103 JDJRS5 Rice straw JDJPS1 Paddy soil JDJPS2 Paddy soil JDJPS4 Paddy soil JDJSC1 Compost JDJSC2 Compost JDJSC3 Compost JDCMF3 Fallen leaves JDCMS1 Soil JDCMS2 Soil BSJMS2 Soil BSJMS3 Soil BSJMF1 Fallen leaves BSNPS2 Paddy soil BSNPS3 Paddy soil BSNPS5 Paddy soil BSNRS1 Rice straw BSNRS2 Rice straw BSNRS3 Rice straw BSNRS4 Rice straw BSNRS5 Rice straw BSNRS6 Rice straw BSNRS7 Rice straw JHCMS1 Soil JHCMS2 Soil JHCMMC1 Miscanthus JHCMMC2 Miscanthus JHCMMC3 Miscanthus JHCMMCS1 Miscanthus soil JHCMMCS2 Miscanthus soil JHCMMCS3 Miscanthus soil JHCMMCS4 Miscanthus soil JHCMMCS5 Miscanthus soil JHCMF1 Fallen leaves JHCMF2 Fallen leaves

72 No. Strain Source Cellulase activity Xylanase activity 138 JHCMF3 Fallen leaves JHCMF4 Fallen leaves JHGPS1 Paddy soil JHGRS1 Rice straw JHGRS2 Rice straw JHGRS3 Rice straw JHGRS4 Rice straw JHGRS5 Rice straw YAYPS1 Paddy soil YAYPS2 Paddy soil YAYPS3 Paddy soil YAYPS4 Paddy soil YAYRS1 Rice straw YAYRS2 Rice straw YAYRS3 Rice straw YAYRS4 Rice straw YAYRS5 Rice straw YAYRS6 Rice straw YAWMS2 Soil YAWMS4 Soil YAWMF1 Fallen leaves YAWMF2 Fallen leaves 파란색 : cellulase 활성이 높은 균주 (67개), 녹색 : xylanase 활성이 높은 균주 (32개), 노란색 : cellulase 및 xylanase 활성이 높은 균주 (38개) 표 18. The detection results of cellulase and xylanase activities of isolated strains from Jeonbuk area. No. Strain Source Cellulase activity Xylanase activity 1 GSOMF1 Fallen leaves GSOMF3 Fallen leaves GSOMS1 Soil GSOMS2 Soil GSOMS3 Soil GSOMS4 Soil GSSMC1 Miscanthus

73 No. Strain Source Cellulase activity Xylanase activity 8 GSSMC2 Miscanthus GSSMC3 Miscanthus GSSMCS1 Miscanthus soil GSSMCS2 Miscanthus soil GSSMCS3 Miscanthus soil GSSRS1 Rice straw GSSRS2 Rice straw GSSRS3 Rice straw GSSRS4 Rice straw GSSPS1 Paddy soil GSSPS2 Paddy soil GSSPS3 Paddy soil ISGRS1 Rice straw ISGRS2 Rice straw ISGRS3 Rice straw ISGRS4 Rice straw ISGRS5 Rice straw ISGPS1 Paddy soil ISGPS2 Paddy soil ISMMF1 Fallen leaves ISMMF2 Fallen leaves ISMMF3 Fallen leaves ISMMS1 Soil ISMMS2 Soil ISMMS3 Soil WJGRS3 Rice straw WJGRS4 Rice straw WJGPS2 Paddy soil WJGPS4 Paddy soil WJDMF1 Fallen leaves WJDMF2 Fallen leaves WJDMF3 Fallen leaves WJDMS1 Soil WJDMS3 Soil WJMMF2 Fallen leaves WJMMS2 Soil BANMS1 Soil BANMS2 Soil

74 No. Strain Source Cellulase activity Xylanase activity 46 BANMS3 Soil BANMF2 Fallen leaves BANMF4 Fallen leaves BANMW1 Wood BASPS2 Paddy soil BASPS3 Paddy soil BASPS4 Paddy soil BASRS1 Rice straw BARSS2 Sweet sorghum soil BARSS3 Sweet sorghum soil BARSS4 Sweet sorghum soil BARSS5 Sweet sorghum soil JEDC1 Compost JENMS1 Soil JENMS2 Soil JENMS3 Soil JENMW2 Wood JENMW3 Wood JENMW4 Wood JENMF1 Fallen leaves JENMF3 Fallen leaves JENMF4 Fallen leaves JENMF5 Fallen leaves JENBS1 Barley soil JENBS2 Barley soil JENBS3 Barley soil JENBS4 Barley soil JENBST2 Barley straw GCBPS1 Paddy soil GCBPS2 Paddy soil GCBPS4 Paddy soil GCBRS1 Rice straw GCBRS2 Rice straw GCBRS3 Rice straw GCBRS4 Rice straw GCSMS1 Soil GCSMS2 Soil GCSMS3 Soil

75 No. Strain Source Cellulase activity Xylanase activity 84 GCSMRES1 Reed soil GCSMRES2 Reed soil GCSMRES3 Reed soil GCSMRES4 Reed soil GCSMRE2 Reed GCSMF1 Fallen leaves GCSMF2 Fallen leaves GCSMF3 Fallen leaves SCGMF2 Fallen leaves SCGMF4 Fallen leaves SCGMS1 Soil SCGMS3 Soil SCGMS4 Soil SCHMBF2 Bird feathers SCHMBF3 Bird feathers SCHMF2 Fallen leaves SCHMS1 Soil SCHMS3 Soil SCHMS4 Soil SCHMS5 Soil SCGWE1 Weed SCGWE2 Weed SCGWES1 Weed soil SCGWES2 Weed soil SCGWES4 Weed soil SCSRS1 Rice straw SCSRS3 Rice straw SCSPS1 Paddy soil SCSPS2 Paddy soil SCSPS3 Paddy soil ISSRS1 Rice straw ISSRS2 Rice straw ISSPS1 Paddy soil ISSPS3 Paddy soil ISSMF1 Fallen leaves ISSMF2 Fallen leaves ISSMF3 Fallen leaves ISSMF4 Fallen leaves

76 No. Strain Source Cellulase activity Xylanase activity 122 ISSMS1 Soil NWBMF1 Fallen leaves NWBMF2 Fallen leaves NWBMF3 Fallen leaves NWBMS2 Soil NWBMS3 Soil JSUBW1 Wood JSUBW3 Wood JSUBRS1 Rice straw JSUBRS2 Rice straw JSUBPS1 Paddy soil JSUBPS3-2 Paddy soil JSUBC1 Compost JSUBC2 Compost JSUBC4 Compost JSUJMWE1 Weed JSUJMWE2 Weed JSUJMWE4 Weed JSUJMF1 Fallen leaves JSUJMF4 Fallen leaves JSUJMF5 Fallen leaves JSUJMF6 Fallen leaves JSUJMS2 Soil JSUJMS5 Soil JAGMWE1 Weed JAGMWE2 Weed JAGMWE3 Weed JAGMWE4 Weed JAGMBST1 Barley straw JAGMBS1 Barley soil JAGMBS4 Barley soil JAGMBS5 Barley soil JAGMF5 Fallen leaves JAGMS1 Soil JAGMS4 Soil JAGMS5 Soil JAMMWE2 Weed JAMMWE3 Weed

77 No. Strain Source Cellulase activity Xylanase activity 160 JAMMF2 Fallen leaves JAMMF3 Fallen leaves JAMMS4 Soil MJJMWE2 Weed MJJMWE3 Weed MJJMF1 Fallen leaves MJJMS1 Soil MJJMS3 Soil 파란색 : cellulase 활성이 높은 균주 (75개), 녹색 : xylanase 활성이 높은 균주 (31개), 노란색 : cellulase 및 xylanase 활성이 높은 균주 (18개) 그림 8. 국내자연환경으로부터 분리한 셀룰로오스 분해활성 우수 균주의 활성 측정. 그림 9. 국내자연환경으로부터 분리한 헤미셀룰로오스 분해활성 우수 균주의 활성 측정

78 그림 S rdna 분석법에 의한 섬유소 분해활성 우수균주의 동정. 3. 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스 분해능 우수 균주 최종 선정 및 효소 생산 최적화 가. 셀룰레이즈 활성 우수 균주의 최종 선정 및 효소 생산 최적화 국내 자연환경과 초식동물배설물로부터 분리된 MAHJCA-1, HPHPS-1, H4-3, H9-1 균주의 조효소의 활성은 각각 0.11, 0.07, 0.171, IU(30, 150 rpm, 1 day 배양)였으며, H9-1균주 의 효소활성이 가장우수하게 나타나 이를 최종균주로 선정하고 본규주의 효소 생산 최적화를 위한 배양 온도, 배지의 초기 ph, 배양시간에 따른 효소 활성 정도를 실험하였다. Bacillus sp. H9-1 균은 배양 4 시간부터 지수성장기에 들어가 10시간부터 정지기 임. 선정된 균의 효소 활 성 최적화를 위한 배양조건은 배양온도 40, 배지의 초기 ph 8, 배양 시간 48 hr 였으며, 이 때의 효소 활성은 0.18 IU 임(그림 11, 12) 그림 11. Bacillus sp. H9-1균의 섬유소 분해효소 생산을 위한 초기 배지 ph와 배양온도

79 그림 12. 배양 시간에 따른 Bacillus sp. H9-1균의 균체생장곡선과 생산된 조효소의 섬유소 분 해활성(pH 8, 40, 150rpm). 나. 자일라네이즈 활성 우수 균주의 최종 선정 및 효소 생산 최적화 초식동물 배설물에서 분리한 H10-1, H10-2 균주의 효소활성이 가장 우수 하였으며, 이 두 균주의 효소 활성은 배양 8일에 2.15 IU, 1.53 IU 이었음(37, 150 rpm). 최종적으로 H10-1 균주를 xylanase 활성 우수 균주로 선정하였다. Bacillus pumilus H10-1균은 배양 4시간 후에 지수성장기, 배양 10시간에 정지기를 보이는 등 빠른 성장을 보였으며 효소의 활성은 배양 8일 째에 가장 높은 활성을 나타냈다(그림 13) (a) (b) 그림 13. 배양 시간에 따른 Bacillus pumilus H10-1균의 균체생장곡선(a)과 생산된 조효소의 섬유소 분해활성(b)(pH 6.8, 37, 150rpm). 4. 섬유소 분해활성 우수 균주가 생산한 효소를 이용한 전처리 볏짚의 당화 가. 셀룰레이즈 활성 우수 균주의 농업부산물 분해능 섬유소 분해활성이 우수한 균주를 배양하여 생산된 조효소를 동결건조 농축하여 전처리

80 한 볏짚의 당화에 이용하였다. MAHJCA-1, HPHPS-1, H4-3, H9-1 균주가 생산한 효소 모두 전처리한 볏짚 당화액의 HPLC 분석결과 glucose를 생성시키지 못하였다. 섬유질계바 이오매스를 이용한 바이오에탄올 생산을 위해서는 지속적으로 섬유소 분해활성이 우수한 균주의 탐색이 필요하겠다. 나. 자일라네이즈 활성 우수 균주의 농업부산물 분해능 Bacillus pumilus H10-1균이 생산한 xylanase 효소를 동결건조로 농축하고 이를 전처리한 볏짚의 당화에 적용하여 HPLC로 생성된 xylose를 분석하였다(그림 14). 전처리 볏짚의 자일란 이 분해효소에 의해 자일로오스로 분해됨을 확인 할 수 있었으며, 본 균주의 개량 및 효소 활 성 최적화 등을 통해 효소 활성을 증가하는 연구가 계속되어야 할 것이다. 그림 14. Bacillus pumilus H10-1균이 생산한 조효소를 이용한 전처리 볏짚의 당화

81 제3절 농업부산물 바이오매스의 전처리 방법 및 당화, 발효 최적조건 확립 1. 섬유질계 작물별 바이오매스 주요성분 분석 가. 실험방법 Sample 및 표준물질 각 0.3g을 소수점 3째자리까지 정확히 잰다. 그리고 72% H 2 SO 4 3mL(4.92g)을 특수 제작한 둥근 플라스크에 넣는다. 준비된 시료는 30, 1시간 Water Bath 에서 반응시킨다. 이때 15분 간격으로 잘 저어서 혼합시킨다. 반응이 종료되면 증 류서 84g을 추가하여 산농도를 72%에서 4%로 희석한다. 희석된 시료는 2차로 감압멸 균기에서 121, 1시간 가수분해 시킨다. 얼음에 넣어 샘플병을 식힌(10min) 후 Crucible filter 무게 재고 여과(crucible filter)시킨다. 여과액 중에서 10mL을 50mL Falcon Tube 넣고 CaCO 3 을 넣어 중화시키고(pH 6-7), 이중 1mL을 원심분리하여 HPLC로 당함량 (Glucose, xylose, arabinose)을 분석한다. 그리고 soluble lignin분석은 UV측정 205nm로 측정하고, insoluble lignin은 여과후 고상 건조 Crucible Filter(Funnel Type 10-16μm, 50mL)하고 냉방 후 무게측정하여 NREL분석법에 따라 분석하였다.[5-6] 나. 작물별 성분 조성 변화 결과 섬유질계 바이오매스 6종류에 대한 성분을 분석한 결과를 표3-1에 나타내었으며, 이중 단수숫대의 셀룰로오스함량이 38.5%로 가장 높았고, 리그닌 및 회분 함량이 다른 작물에 비하여 낮아서 바이오에탄올 생산를 위한 작물로 가장 우수한 바이오매스로 사료된다. 표 3-1 작물별 주요 성분분석표 시료(%) Cellulose Hemicellulose Lignin A sh 기타 볏짚 보릿짚 유쳇대 옥수숫대 단수숫대 트리트케일짚 Lignin는 insoluble Lignin(klason)과 soluble Lignin을 합한 결과 2. 섬유질계 바이오매스 전처리용 고온 압출 전처리시스템 구축 가. 시스템 구성 및 특징 본 장비는 섬유질계 바이오매스를 효율적으로 전처리하기 위해 개발하여 2010년 특허출원하고 2012년 10월 특허등록(특허번호 제 호)된 시스템으로서 반응기 및 분리조 각 800mL(4개), 2600mL(1개)로 구성되어 있고, 반응기는 온도센서 및 중 앙 제어장치에서 PID제어(최대 250 )를 통해 온도를 제어할 수 있으며, 압력제어는 최 대 압력 10MPa, 실제 압력 6MPa까지 사용이 가능하다. 반응기는 온도, 압력제어 및 교 반제어가 가능하도록 구성되었으며, 분리조는 감압 및 냉각수에 의한 항온상태 유지 가능하도록 구성되었다. 또한 반응기와 분리조 사이에 압출 노즐 밸브를 설치하여 폭

82 쇄가 가능하다. 나. 전처리 원리 및 효과 시료는 산, 알카리용액과 CO 2 혼합하여 의 고온과 최대 0.3~0.8MPa의 고압으로 가 수분해 반응시키며, 반응 종료 후 고압(3~6Mpa)에서 저온 저압의 분리조로 순감 압출시키 도록 그림3-1과 같이 구성되었다. 온도, 압력제어 맟 압출 시스템을 종합적으로 구성하여 고 액 혼합반응과 압출이 가능한 전처리방법을 개발하였다. 그림 3-1 고온 압출식 전처리 시스템 다. CO 2 혼합 반응후 압출한 전처리 결과 본 전처리 방법은 물리적처리 및 화학적 처리를 동시에 병행하는 전처리 방법으로 먼저 물리적처리는 CO2 혼합반응과 고압압출(N 2 )이며, 화학적처리는 묽은황산과 같 은 산용액 및 암모니아, 수산화나트륨등 알카리용액에 의한 고온 가수분해 방법이다. 3. 수산화나트륨 농도별 볏짚 전처리 특성 가. 실험방법 및 조건 NaOH 농도를 0.5M, 1.0M, 2.0M로 하고 볏짚시료의의 비율을 14:1로 하여 총 반응 부피 300g씩 반응기에 투여하여 전처리하였다. 반응온도는 150, 반응시간 60분, 교반 속도 120RPM로 하였고, 반응에 CO 2 3MPa를 충진하여 반응시켰다. 시스템 설정 조건 은 먼저 설정온도 도달시간이 15분±2이며, 반응 종료 후에는 질소를 6MPa로 충진하여 압출시켰다. 나. 전처리 공정 시료를 액상용매와 함께 반응기에 넣고 반응기를 밀폐시킨 다음 CO 2 를 혼합하고 가온시 킨다. 반응설정온도에 도달하면 반응시간을 측정하고 반응 종료후 N 2 를 충진하여 가 압한 후 분리조로 압출시킨다. 반응 후 고상시료를 여과 회수하여 성분분석 및 당화, 발효시료로 사용한다. 그림 3-2는 NaOH 농도별 전처리 후 회수한 고상 건조 볏짚시 료 형태적 비교 결과이다.2.0M NaOH처리시 시료는 과분해되었고 회수량이 매우 낮았 다

83 다. 전처리 공정 0.5M NaOH 1.0M NaOH 2.0M NaOH 그림 3-2 NaOH 농도별 전처리 후 회수한 고상 건조 볏짚시료 비교 NaOH농도별 전처리 후 화학적 조성변화 및 고형물 회수율을 표 3-2에 나타내었다. NaOH 전처리결과 0.5M처리하였을 때 고형물 회수율이 가장 높았음. 2.0M NaOH 처리하 였을 때 Cellulose 함량이 가장 높았지만 전체 회수율이 매우 낮았으며. Hemicellulose는 대 부분 용해되어 고형물 잔존량이 매우 낮았다. 표 3-2 NaOH농도별 전처리 후 화학적 조성변화 및 고형물 회수율 성분(%) Cellulose Hemicellulose Lignin Ash Solid remaining 0.5M NaOH M NaOH M NaOH 그리고 NaOH농도별 전처리물의 회수율을 비교한 결과를 표3-3에 나타내었으며, 셀룰 로오스 회수율이 NaOH농도가 0.5M 및 1.0M에서는 78~80%인 반면 2.0M에서는 58.7%로 감소하였다. 또한 헤미셀룰로오스 회수율은 모든 농도구역에서 21%를 넘지 못하였다. 표 3-3 NaOH농도별 전처리물의 회수율 비교 성분(%) Cellulose Hemicellulose Lignin Ash 볏짚시료 36.3 회수율 21.3 회수율 19.9 회수율 11.7 회수율 0.5M NaOH M NaOH M NaOH 암모니아 전처리 효과별 볏짚 성분변화 특성 가. 실험방법 및 조건 15% 암모니아용액과 고체시료의 비율은 14:1이며, 총 부피 300mL 그리고 반응온도 150도에서 각각 10분, 20분, 60분씩 반응시켰다. 전처리 시스템의 조건은 CO 2 3MPa 충 진하고 압출시 N 2 6M Pa로 충진후 압출시켰다. 나. 전처리 방법별 탄수화물 회수율 비교 전처리 반응시간 및 압출유무 따른 화학적 조성 및 회수율을 비교하여 표3-4에 나타내 었으며, 150, 10분 반응시켜 압출하였을 때 탄수화물 회수율이 CO 2 를 혼합하지 않고

84 반응시켜 압출처리하지 않았을 때 원시료 대비 69%였지만 CO 2 를 혼합하여 반응시키고 압출 처리하였을 때는 82%로 향상되었다. CO 2 혼합 및 압출 유무에 따른 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스의 회수율을 그림3-3에 나 타내었다. 표 3-4 전처리 반응시간 및 압출유무 따른 화학적 조성 및 회수율 비교 성분(%) Cellulose Hemicellulose Lignin Ash 볏짚시료 36.3 회수율 21.3 회수율 19.9 회수율 11.7 회수율 압출 10분 압출 20분 압출 60분 압출X 10분 압출X 20분 압출X 60분 압출X, CO2X 10분 압출X, CO2X 20분 압출X, CO2X 60분 Cellulose(%) Hemicellulose(%) 원시료 82% CO2(O), 압출(O) 76% 69% CO2(O), CO2(X), 압출(X) 압출(X) 그림 3-3 CO 2 혼합 및 압출 유무에 따른 탄수화물 회수율 5. 농업부산물 바이오매스의 전처리 조건 최적화 가. 재료 및 방법 본 연구에 사용된 시료는 건조한 볏짚 분쇄물( mm) 30g과 농노별 암모니아용액 420mL이다. 반응기 교반속도 120RPM이며 반응 종료 후 분리조로 폭쇄시켜 회수하였 다. 전처리 변수는 반응온도, 반응시간, 암모니아농도 및 CO 2 량이며 표3-5와 같이 최적 조건 탐색을 위한 변수 범위를 지정하였다

85 표3-5 표면분석법(RSM) 적용을 위한 전처리 조건 변수 적용범위 Coded lebels Factors Symbol 반응온도( ) X 반응시간(min) X 암모니아농도(%) X CO 2 량(bar) X 나. 반응표면분석법(RSM)을 위한 변수 조건별 전처리 실험 반응표면분석법을 적용하기 위해 본 연구에서는 중심합성분석방법으로 실시하였으며 통계처리를 위해 각각의 독립변수들은 아래 식에 따라 코드화하였다. x i = X i - X o Δx i = 1, 2,..., k 위 식에서 x i, X i 는 각각 코드화된 값과 실제값을 표시하며, X o 는 중앙점에서의 X i 값, ΔX 는 단계 변경값이다. 표면분석법(RSM)의 코드값과 이에 해당하는 변수 조건 30가지를 표3-6에 타나내었다. 표3-6 표면분석법의 코드값 및 변수조건 2^4 factorial Star Pionts Central Points Temp. Time NH3 CO2 No. Temp Time NH3 CO2 ( ) (min) (%) (bar) 다. 전처리 후 성분분석 및 당화율 검정 결과 전처리 실험 조건은 반응온도, 반응시간, 암모니아농도 및 CO 2 충전량에 따라 30가지

86 변수별로 실험을 실시하고 셀룰로오스 함량등 주요 성분분석결과를 표3-7에 나타내었 다. 전처리 결과 셀룰로오스 함량은 40-60% 수준이었다. 표3-7 표면분석법 적용을 위한 변수조건에 따른 전처리 결과 시 료 C e ll u l o s e H e m i c e l lu lo s e L ig n in A s h 당화실험을 위해 전처리물은 60 에서 24시간동안 건조하여 함수율 3-4% 유지하였으며 총 10mL중 Glucan 농도(건물기준) 0.1g을 기질로 사용하였다. 최적 당화반응의 ph유지를 위해 0.05M Citrate Buffer(pH4.8)를 사용하였으며, 효소는 Novozymes 사의 Cellic CTec2, 60 FPU/g-cellulose이며 당화반응 조건은 50 에서 72 시간동안 150rpm으로 진행하였다. 당화반응 결과 얻어진 당 분석은 HPLC를 사용하였 으며, 컬럼은 Biorad Aminex HPX 87H(컬럼온도 65 )이며 검출기는 RID (40 )를 사 용하였다. 이때 사용된 이동상은 5mM H2SO4이며 유속은 0.5mL/min이었다. 당화실험 조건 및 Glucose 전환수율을 표3-8에 나타내었으며 Glucan함량 95%의 Avicel를 reference로 사용하였다

87 시료 구분 잔여물 수분함량 (%) 전처리후 Glucan함량 ODW(%) 전처리물 Clucan 0.1g 포함 무게 (g) 표3-8 당화실험 조건 및 Glucose 전환율 전처리물 Glucan 0.1g 포함 실측정값 (g) 전처리물 Glucan 함량 ODW(0.1g) Cellic CTec2 2x용 (60FPU) 2% Sodium Azide (ml) 0.1 M Citrate buffer ph4.8 (ml) DW추가 총10mL Glucan 농도 (g/l) Glucose 당화율 (%) Avicel 당화실험에 사용한 전처리 시료는 수분를 포함한 상태로 사용하였으며 glucan 0.1을 아 래 식에 따라 정량하여 사용하여 실제무게를 측정하였다. 를포함하는전처리물의무게 전처리물의 수분함량 전처리물의 함량 또한 glucose 당화율은 아래 식에 의해 계산하였다. Glucose당화율(% ) = 전환된Glucose함량 0. 9 전처리된시료중Glucan 함량(% ) 100 다. 반응표면분석법(RSM)의 중심합성분석법(CCD) 구성 전처리 조건 최적화를 위한 변수는 총4개로서 중심합성분석법을 적용하기 위해서

88 2 4 -factorial central composite experimental design으로 4개의 변수를 최적화 하기 위해 30 실험세트를 구성하였다. Reduced cubic polynomial model 을 사용하여 다중회귀분석 법으로 변수들을 최적화하여 아래식에 따라 전산 모사하였다.[8] Y = b o + k i = 1 b 1 X i + k i = 1 b ii X 2 i + i < j b ij X i X j + ε 위 식에서 Y 는 표면분석모델에 의해 예측된 값이며, X i, X j 는 예측값 Y 에 영향을 미치 는 입력변수이다. b o 는 상수계수, b i (i= 1, 2, 3,..., k)는 선형항의 계수, b ii 는 2차항의 계 수, b ij 는 i, j 의 상호관계항의 계수이며 반응표면 2차 다항식 모델은 Design Expert ver.8 software package 이용하였다. 30개 조건에 대한 실험 결과를 중심합성분석법을 적 용하여 당화율 모델을 최적화한 결과 Glucose 수율 모델식은 아래와 같다. Y = X X X X X 1 X X 1 X X 1 X X 2 X X 2 X X 3 X X X X X 2 4 위 모델식에서 Y는 Glucose 수율 예측값이며, X 1, X 2, X 3, X 4 는 각각 온도, 시간, 암 모니아농도 및 CO 2 량을 나타낸다. 이 모델식에 대한 분산분석(ANOVA)을 표3-9에 나타 내었다. Sou rc e 표3-9 표면분석법(RSM)를 위한 분산분석(ANOVA) Su m o f Squa res d f M ea n Sq uare F- Value p -v alue P rob > F M od el A- Tem peratur B- Tim e C - NH < D - CO AB A C AD BC B D CD A^ B ^ C^ D^ R esidu al Lack o f F it P ure Erro r Co r Total 분석분석결과 F-value 및 p-value값은 가각 5.12 와 은 모델은 유의하다. 분산분석 에서 p-value값이 0.05보다 낮으면 유의한 계수의 상관관계를 나타내었으며 독립변수 A, C에 해당되는 온도 와 NH 3 는 각각 , <0.0001로서 유의성이 높음을 나타내었다. Glucose 수율(%)에 영향을 미치는 변수로서 반응온도, 반응시간, 암모니아농도 및 CO 2 량 의 상호관계를 그림3-4에 나타내었고 각 변수들의 크기는 RSM의 코드값으로 표시하였 다. 반응온도와 반응시간와 관계에서는 반응온도가 높을수록 Glucose수율이 높고, 암모니 아농도와 반응온도과의 관계에서는 암모니아농도가 높을수록 그리고 반응온도가 높을수록

89 Glucose수율이 높았다. 반응온도와 CO 2 량과의 관계에서는 CO 2 량의 변화가 Glucose수율 향상에 크게 영향을 미치지 못하였고, 반응시간고 암모니아농도의 관계에서는 암모니아의 농도 변화에 따라 Glucose수율에 큰 영향을 미친 것으로 확인되었다. 결론적으로 Glucose 모델 최적변수는 표3-10과 같이 반응온도 165.1, 반응시간 69.8min, 암모니아농도 14.3% 그리고 CO 2 량 2.2MPa이었다. 최적 Glucose수율에 대한 모델 예측값은 99.39%이었다. 반응온도와 반응시간의 영향 반응시간과 암모니아농도의 영향 반응온도와 암모니아농도의 영향 반응시간과 암모니아농도의 영향 반응온도와 CO 2 량의 영향 암모니아농도와 CO 2 량의 영향 그림3-4 당화율 최적화에 영향을 미치는 변수들의 상호관계 라. RSM 최적화를 위한 동시당화발효(SSF)을 검정 (1) 실험방법 및 조건 실험재료는 60 에서 24시간 건조한 전처리물이며, 반응 유효용적 100mL, 기질 (Glucan)농도는 3%이었다. 또한 ph안정화를 위해 0.05M Citrate Buffer (ph4.8)를 사 용하였으며, 효소는 Cellic CTec2 0.06mL/g Cellulose(10FPU)를 이용하였다. 또한 발 효균주는 Saccharomyces cerevisiae CHY1011을 창해에탄올에서 제공받아 사용하 였다. 동시당화발효 조건은 33, 발효시간 72시간, 150RPM이었다. 에탄올 분석은 GC 컬럼(HP-InnoWax 19091N-213), 검출기 FID, 210, Oven온도 80 (1min holding)-heating 10 /min-180 (4min holding), 분석시간(RT) 17.5min, carrier gas: 15ml/min He이었다.[9] (2) 동시당화발효(SSF)

90 SSF 발효는 먼저 전처리물 시료를 Glucan함량이 3g이 되도록 실제무게를 측정하여 250mL용 삼각플라스크에 넣고 0.1M Citrate Butter(pH4.8) 50mL을 첨가하였다. Cellic CTec2는 무게비로 5배 희석하여 0.90mL (10FPU/g cellulose)를 첨가하였다. 이는 셀룰 로오스계 바이오매스의 당화에 적정농도로 Novzyme사에서 제시한 조건이다. 발효균체 는 종균배양을 10시간씩 2회 계대배양하여 활성을 유시켜 놓고 10mL을 취하여 2회 원 심분리를 통해 균체만 모아 멸균수를 체워 10mL로 만들어 첨가하였다. 무기영양분으 로 yeast extract 1%, peptone 2%를 10배 농축하여 10mL 첨가하였다. 전체 반응실험 에는 100mL을 33, 150RPM으로 48시간 배양하였다. 배양 종료 후 샘플은 끓는 물에 서 5분간 효소 활성을 제거하고 여과하여 분석에 사용하였다. 결과적으로 동시당화발 효(SSF)를 통한 에탄올 수율이 80%로서 대체로 낮으며 이는 효소량 (10FPU/g cellulose)가 적게 너무 낮은 수준으로 후속 실험에서 30FPU로 높여서 수율을 검정하 였다. 마. RSM를 통한 암모니 최적 전처리 조건에 대한 확인 검정 전처리 최적 변수 조건(표3-11)에서 수학적 모델링에 의한 최적 Glucose 전환 수율은 99.4%였다. 이 최적변수 조건을 확인하기 위해 3반복으로 볏짚 전처리를 수행하였으며 그 결과를 표3-11에 나타내었다. 표에서 볏짚 원시료는 전남 무안지역에서 수확한 호품벼이 며, NH3-1-1과 NH3-1-2는 같은 전처리 시료를 2반복 분석한 결과이며, 각각 3회 전처리 한 결과를 표에 나타내었다. 평균 셀룰로오스 회수율은 약52.93%었으며, 헤미셀룰오스는 18.2%였다. 각 반복에 따른 전처리 시료를 동시당화발효(SSF)하고 발효시간에 따른 에탄 올 생산량 변화를 표3-12에 나타내었다. Raw Rice Straw는 볏짚 원시료이며, NH 3 -pretreated 시료는 전처리시료를 3반복한 결과이다. 발효시간에 따라 72시간동안 에탄 올 생산농도를 분석한 결과 원시료의 경우 에탄올 전환율이 30%정도였지만, 전처리한 시 료의 경우 81-88%의 발효율을 나타내었다. 표3-11 전처리물의 성분분석 결과 시료 Cellulose Hemicellulose Lignin As h 기타 수분(%) 볏짚 원시료 볏짚 원시료 평균 NH NH 평균 NH NH 평균 NH NH 평균

91 Sample 표3-12 동시당화발효(SSF)의 발효시간에 따른 에탄올 생산량 변화 Ethanol (g/l) 6h 12h 24h 48h 72h 72h 발효율(%) Raw Rice straw Raw Rice straw NH₃-Pretreated NH₃-Pretreated NH₃-Pretreated NH₃-Pretreated NH₃--Pretreated NH₃-Pretreated 스케일업을 위한 대용량 전처리(10L급) 기술 개발 가. 대용량(10L) 회분식 폭쇄 전처리 기술 개발 실험실 규모의 전처리 반응시스템을 Batch형 15L 벤치규모의 반응기로서 키우고 유효용 적은 10L로 사용할 수 있는 폭쇄 전처리 시스템을 구축하였다. 본 전처리 시스템은 자켓 에 열매유 탑재하여 가열하는 방식으로 반응물을 가온할 수 있도록 구성하였으며, Cyclone를 통해 고체/액체를 분리하여 반응물을 회수하는 시스템이다. 또한 반응기 내부 온도 및 압력을 HMI 시스템으로 자동제어가 가능하도록 구성하였다. 그림3-5 15L 회분식 폭쇄 전처리 시스템 나. 셀룰로오스계 바이오매스의 전처리 스케일업 10L 규모의 전처리 시스템에 의한 볏짚의 전처리를 위해 실험재료로서 1M NaOH 9L와 볏짚분쇄물 1kg를 사용하였다. 실험조건은 반응온도 150, 반응시간 30분, 교반속도 60rpm이었다. 1M NaOH용액 9L에 볏짚시료 1kg넣고 반응시켰으며 설정온도 150 도달 시간은 30분이며 반응은 30분간 60RPM으로 압력은 N 2 를 충진하여 0.3MPa를 유지시켰 다. 전처리후 회수하여 성분 분석한 결과를 표3-12에 나타내었으며 전처리후 평균 Cellulose 함량은 66.9%이며 Lignin 및 Ash 제거율은 80%이상으로 우수함을 확인하였

92 다. 표3-12 전처리물의 성분분석 결과 볏짚(호품) Cellulose(%) Hemicellulose(%) Lignin(%) Ash(%) 원시료 36.3 회수율 21.3 회수율 19.9 제거율 11.7 제거율 전처리물 전처리물 평균 볏짚의 NaOH 전처리 조건 탐색 가. 알칼리(암모니아수와 NaOH) 반응용매에 따른 전처리 비교 기존 암모니아 전처리 보다 NaOH로 처리하였을 때를 비교하였다. 암모니아 전처리 조 건은 위에서 최적화한 결과를 이용하였으며, NaOH 전처리는 반응온도 150, 30분, NaOH 0.4% 및 CO2는 3MPa를 사용하였다. 결과적으로 표3-13과 같이 셀룰로오스 회수 량이나 회분 제거율이 우수함을 확인하였다. 이 결과를 바탕으로 NaOH 전처리에 대한 최적 조건 탐색하였다. 표3-13 알칼리 반응용매에 따른 전처리 비교 시료 Ce llulose Hemicellulose Lignin As h 기타 수분(%) NH3 원시료 NH3 전처리 NaOH 전처리 나. NaOH 전처리물의 당화 및 발효율 검정 당화 기질 농도는 glucan 3%(건물기준)를 함유한 전처리물이며, 발효 배지료는 yeast extract 1%, peptone 2%이며, 당화효소는 30FPU Celli Ctec 2 (Novozymes사)이고, 발효 균주는 S. cerevisiae CHY 1011(창해연구소 제공)였다. 발효균주 접종량은 유효용적의 10%를 이용하였다. 당화 발효 실험은 분리당화발효(SHF) 및 동시당화발효(SSF)실험하여 에탄올 생산량을 비교하였다. 총 유효용적은 100mL이며 플라스크배양을 하였고, ph안정화를 위해 0.1M Citrate buffer 50mL을 첨가하여 전체적으로 0.05M citrate가 포함되도록 하였으며, 기질 농도는 수분함량을 제외한 건조 glucan기준으로 전처리물의 무게를 측정하여 첨가하였 다. 당화효소는 밀도를 고려하여 30FPU g/g-cellulose를 첨가하였다. 발효균주는 2회 액 체배양하여 활성화 한 후 균체만 회수하여 접종하였다. 당화시험은 50 에서 발효실험은 33 에서 각각 150RPM으로 72시간 반응시켰다. 그림 3-6에 볏짚 원시료와 전처리 시료 에 대한 에탄올 생산량 및 발효율 결과를 나타내었다. 전처리 시료의 경우 동시당화발효

93 (SSF)시 발효율이 86.6%로서 분리당화발효(SHF) 75.5%보다 우수함을 확인하였다. 그림 3-6 분리당화발효, 동시당화발효의 에탄올 생산량 및 발효율 비교 다. 반응표면분석법(RSM)에 의한 NaOH 전처리 최적 조건 탐색 효율적인 전처리 공정 개발을 위해 암모니아 대신 NaOH를 이용한 알칼리 전처리 조건 을 최적화하고자 반응표면분석법을 적용하였다. (1) 실험방법 및 조건 시험재료는 볏짚(동안벼 2010년산) 분쇄물(입자크기 0.3~0.5mm)을 사용하였으며, 고온 폭쇄에 의한 전처리를(교반속도 150RPM) 수행하였다. 반응조건은 온도, 시간 및 용매 농도에 따라 적용하였다. (2) RSM 적용을 위한 전처리 조건 변수 범위 앞서 암모니아 전처리에 의한 최적화 변수는 4가지여지만, 본 실험에서는 CO2는 일정하게 공급하고 온도, 시간 및 NaOH농도 3가지 조건으로 구성하였다. 시험재 료는 볏짚 (동안벼 2010년산) 분쇄물(입자크기 0.3~0.5mm)을 사용하였다. 3가지 변수 의 범위는 표3-14에 나타내었다. 표3-14 RSM 적용을 위한 전처리 조건 변수 적용 범위 Factors Symbol Coded lebels 반응온도( ) X 반응시간(min) X NaOH농도(%) X 반응표면분석은 2 3 -factorial central composite experimental design을 사용하여 3개의 변수를 최적화 하기 위해 20 실험세트를 구성하였다. Reduced cubic polynomial model 을 사용하여 다중회귀분석법으로 변수들을 최적화하여 전산 모사하였다. 이론 값을 구하기 위한 모델식 아래와 같다. Yn = βo β + β1xβ 1 + β2xβ 2 + β3xβ 3 + β β12 + β11x β22β 22X β33β 33X X 1 X 2 + β13β 13X 1 X 3 + β23β 23X 2 X 3 + β 12 X 2 1X 2 + β 13 X 2 1X β123 β 12 X 1 X β123x 1 X 2 X 3 전처리 실험은 수행결과 성분 변화와 고형물 회수량을 표3-15에 나타내었다. 처리조

94 건에 따라 고형물 회수량은 35%-71%까지 다양하게 나타났다. 표3-15 실험조건별 전처리 후 성분분석 실험 결과 라. RSM ANOVA 분석 최적화 결과 시료 Cellulose Hemicellulose Lignin Ash 기타 수분함량 Soild remaining 반응표면분석법은 Design Expert ver.8 software package tool를 이용하여 모델링하였으 며 표3-16과 같이 분산분석 결과를 얻었으며 모델식의 p-value는 로서 유의성이 검증되었다. 이때 R 2 값는 이었다. 표3-16 반응표면분석의 분산분석 결과 Glucose 전환율(Y)에 대한 예측 모델식은 아래와 같다. Y = X X X X 1 X X 1 X X 2 X X X X 3 여기서 Y 는 Glucose 전환율이며, X 1 는 반응온도, X 2 는 반응시간, X 2 는NaOH농도를 나 타낸다. Glucose 전환율의 각 독립변수들과의 상관 관계를 그림3-7 및 그림3-8에 나타내 었다

95 그림 3-7 NaOH와 반응시간 및 NaOH와 반응온도와의 관계 그림3-8 반응온도와 반응시간과의 관계 결론적으로 최적 변수조건은 표3-17과 같이 NaOH 4.48%, 반응시간 29.4분, 반응온도 이다. 예측 Glucose 전환율은 96.4% 이었으며, 실제 당화실험에서는 72시간 반응 하였을 때 Glucose 전환율이 97%임을 확인하였다. 표3-17 반응표면분석를 통한 최적 변수 조건 및 당 전환율 Variables Symbols Values NaOH(%) X Reaction time(min) X Temperature( ) X Predicted glucose yield(%) Experimental glucose yield(%) 마. 최적 전처리 조건에서 SHF와 SSF 검정 비교 최적 조건에서 전처리한 시료의 발효율을 검정하기위해 분리당화 및 동시당화를 실시하 여 그림 3-9에 나타내었다. 분리당화발효는 먼저 72시간 당화시킨 다음 72시간 발효하였 다. 동시당화발효도 72시간 발효한 결과이다. 결과적으로 24시간이내에 발효는 종료되었 음을 확인 할 수 있었다. 또한 알칼리 처리한것과 무처리한 전처리물에 대한 에탄올 수 율을 그림3-10에 나타내었다. 무처리 시료의 경우 에탄올 수율이 27%이하였지만, NaOH

96 전처리의 경우 SHF와 SSF는 각각 97%, 98,9%였다. 그림 3-9 분리당화발효(SHF) 및 동시당화발효(SSF) Hotwater pretreated NaOH pretreated 100 ) (% 80 ld ie 60 l y o n 40 a th 20 E SHF SSF 그림 3-10 NaOH 폭쇄 전처리 물의 SHF 및 SSF 결과 비교 바. 10L 스케일업 고온 폭쇄 전처리 및 당화발효 결과 최적 전처리 조건을 10L 고온 폭쇄 전처리 시스템에서 확인실험을 실시하였으며 이때 실 험조건은 볏짚 시료 1kg과 반응용매(NaOH 수용액) 9L를 혼합한 용액이며, 3반복으로 전 처리 실험 결과와 고형물 잔존률을 표3-18에 나타내었다. 셀룰로오스 함량은 실험실용 0.8L반응기를 이용하였때 보다 10%이상 높았으나, 고형물 잔존률은 40% 이하로서 낮았 다. 표 3-18 최적 전처리 조건에서의 성분분석 결과 시료 Cellulose Hemicellulose Lignin Ash 기타 수분(%) Solid remaining 동한벼원시료 rs rs 평균 rs-naoh (2.1) rs-naoh (2.1) 평균 (2.1) rs-naoh (2.1) rs-naoh (0.7) 평균 (1.4) rs-naoh (0.6) rs-naoh (1.8) 평균 (1.2)

97 동시당화발효는 5L 발효기에서 유효용적 2L로 수행하였으며, ph 5로 조절하기 위해 4% Hcl를 사용하였다. 대조군으로 전처리하지 않은 볏짚시료를 사용하였으며 전처리시료는 2반복 실험으로 72시간 수행하였지만 그림3-11과 같이 약 24시간 안에 에탄올 전환이 완료됨을 확인하였다. ) /L (g n tio a tr c e n n l c o o n a th E Untreated RS Pretreated RS1 Pretreated RS Fermentation time(h) 그림 3-11 발효시간에 따른 에탄올 농도 전처리물의 발효결과 발효율은 미처리 시료(untreated RS)의 경우 30.8%였지만, 전처리 시료(pretreated RS)는 97%로서 플라스크로 배양을 수행한 결과와 유사함을 그림3-12와 같이 확인하였다. 그림 3-12 전처리시료와 무처리시료의 발효율 비교 결과적으로 농업부산물인 볏짚을 이용한 바이오에탄올 생산을 위해서는 전처리 용매로서 4.48% NaOH 사용하고 반응온도 및 시간 조건은 각각 136.8, 29.4분이 최적 조건임을 확인하였다. 당화 발효 조건은 효소농도 30FPU/g-cellulose, 발효균주 saccharomysis cerevisiae CHY1011이며 33 에서 72시간 반응시 발효율은 97%였다

98 제4절 농업부산물 대량 확보 및 수거 시스템 구축 가) 농업부산물 발생량 및 바이오에탄올 생산잠재력 주요 농업부산물 발생량 조사 통계자료(통계청, KOSIS)와 농업과학기술개발 경제성분석 기준자료집 을 활용하여 주요 농업부산물의 연간 발생량을 조사한 결과는 표 1과 같다. 표 1. 작목별 재배면적 및 주 부산물 생산량(2009년) 작목 재배면적 (ha) 주산물생산량 (ton)(정곡기준) 논벼 917,990 4,898,725 보리 23,447 71,662 쌀보리 25,169 76,962 부산물 비율 (%) 112.7(볏짚) 42.2(왕겨) 9.8(미강) 31.7(맥강) 119.7(보리짚) 16.6(맥강) 120.1(보리짚) 부산물 생산량(ton) 5,518,552 2,067, ,075 22,717 85,779 12,776 92,431 밀 5,067 18, ,303 조 1,101 1, (왕겨) 165.8(짚) 151 2,255 옥수수 15,326 76, (줄기) 126,316 메밀 2,176 2,210 콩 70, ,251 땅콩 4,111 10, (줄기) 23.4(겨) 118.9(줄기) 50.4(깍지) 106.3(줄기) 48.8(깍지) 3, ,569 70,183 10,844 4,978 감자 21, , ,300 고구마 20, , ,718 고추 50, , ,600 참깨 34,875 12, ,173 들깨 29,640 28, ,240 유채 1,490 1, ,

99 주요 농업부산물로부터 바이오에탄올 생산 잠재력 추정 볏짚, 밀짚, 보리짚 발생량(생체중)으로부터 함수율(w.b.)을 15% 로 가정하여 건물중 을 추정 바이오에너지작물센터의 시험자료를 활용하여 볏짚, 밀짚, 보리짚의 셀룰로스 함량 을 건물중 기준 36.3%, 35.2% 및 34.8% 로 가정 문헌자료로부터 최대 당화율 0.90, 환원당으로부터의 에탄올 이론 수득률 및 최대 발효수율 0.81을 적용하여 볏짚, 밀집, 보리짚의 바이오에탄올 생산 잠재력을 추정 표 2. 주요 농업부산물로부터 연간 셀룰로스 및 바이오에탄올 생산 잠재력 추정치(배영환 외, 2010) 부산물 생산량(톤) 건조 중량(톤) 셀룰로스 생산량(톤) 바이오에탄올 생산 잠재력(톤) 볏짚 5,518,552 4,690,769 1,702, ,306 밀짚 20,303 17,257 6,074 2,262 보리짚 35,493 30,169 10,498 3,911 볏짚의 바이오에탄올 생산 잠재력을 국내 석유류 소비량과 비교 연간 석유 소비량(자료: 통계청) - 가솔린 연도 소비량 천배럴* 58,151 59,561 59,874 62,500 천톤 6,699 6,862 6,898 7,200 - 등유 연도 단위 천배럴 43,090 39,392 31,450 26,172 천톤 5,615 5,133 4,098 3,410 - 경유 연도 소비량 천배럴* 143, , , ,327 천톤 19,422 19,251 19,238 19,

100 연간 주요 석유 에너지 소비량(2007년, 10 9 MJ) 연료 가솔린 경유 등유 합계 전산업 ,332 도로 수송용 농림수산업 * 1배럴 = 158.9l 연료의 비중: 가솔린 0.725, 경유 0.850, 등유 0.82, 에탄올 연료의 저발열량: 가솔린 45.3MJ/kg, 경유 43.6MJ/kg, 등유 44.0MJ/kg, 에탄올 26.8MJ/kg 볏짚 전량을 수거하여 바이오에탄올을 생산할 경우의 총 에너지 공급량 - 연간 바이오에탄올 634.3천톤 생산, MJ 년 휘발유/경유/등유 소비 에너지 대비 전산업의 1.3%, 도로 수송용의 1.8%, 농림수산업용의 17.9%에 해당 연구 대상지역을 선정하여 농업부산물의 지역적 및 시기적 발생량 정밀 조사 고흥지역 작물별 재배면적 조사 그림 108. 고흥군 작물별 재배면적 그림 109. 고흥군 면별 논 및 밭의 면적

101 고흥지역 각 면별 볏짚 생산량 면 논(ha) 10a 당 수량(kg) * 생산량(ton) 비율(%) 포 두 면 2, , 도 덕 면 1, , 동 강 면 1, , 점 암 면 1, , 풍 양 면 1, , 대 서 면 1, , 남 양 면 1, , 두 원 면 1, , 도 화 면 , 과 역 면 , 도 양 읍 , 고 흥 읍 , 금 산 면 , 영 남 면 , 동 일 면 , 봉 래 면 계 14, , *10a 당 수량은 전남 평균을 이용하였음 볏짚의 이용 현황 조사 조사농가의 현황 고흥군 동강면에 소재한 2개의 대표적 농장(죽암농장 및 개인 농장)을 선택하여 조사하였다. 죽암농장에서는 원형베일러에 의하여 베일링 작업을 수행하였으며, 개인 농장에서는 사각베일 러에 의하여 작업을 수행하였다. 죽암 농장에서는 볏짚의 특성, 볏짚 수거율 및 베일링 작업현 황을 조사 분석하였으며, 일반 농장에서는 베일링 작업현황을 조사 분석하였다. 죽암농장은 고흥군 동강면 장덕리 989에 위치하고 있으며 총 50만평(벼농사 36만평, 조사료 10만평, 건물 4만평)의 농장으로서 농장은 제 1농장과 제 2농장으로 구분되어 있다. 조사료 재 배로서 여름에는 수수 및 옥수수, 겨울에는 이탈리안 라이그라스를 재배하고 있다. 한우를 약 2,000두 사육하고 있으며 볏짚은 한우 조사료로서 이용하고 있다. 보유농기계는 트랙터 7대( ps, 궤도형 2대), 이앙기 2대(승용), 콤바인 3대(자탈형 6조식 2대, 보통형 1대), 레이크 2대, 베일러 2대, 래핑기 2대, 트럭 2대가 있다. 전체 농장의 약 50%에 해당하는 제 1농장에서는 볏짚을 수거하여 한우 조사료로서 이용하 고 있으며, 2농장은 최근에 간척한 습지 논이므로 콤바인 수확 후 볏짚을 세단하여 논에 뿌려 주고 있다. 볏짚 수거방법은 콤바인으로 벼를 수확한 후 2-3일 경과한 다음, [레이크 - 베일러] 작업 을 수행하여 논에서 베일을 1주일 정도 건조시킨 다음 [래핑 - 트랙터 이송(논둑부근까지)]작 업을 수행하여 논에 방치하여 보관한 후 필요에 따라 창고까지 트럭이송(창고, 2 roll/1톤 트 럭)하여 사료로 이용하고 있었다. 베일크기는 직경 1.3 m, 높이 1.2 m로 하며 무게는 kg 정도이다. 한우 사육에 필요한 베일은 자체 생산량만으로는 부족하므로 남원(4만원/1 roll) 또는 영광

102 (4.7만원/1 roll)으로부터 구입하여 이용하는 것으로 조사되었다. 표 4. 고흥군 죽암농장의 현황 농장명 죽암농장 비고 위치 고흥군 동강면 장덕리 989 면적 50만평 용도 벼농사 36만평, 조사료 10만평, 건물 4만평 조사료 재배 여름에는 수수 및 옥수수, 겨울에는 이탈리안 라이그라스 한우 사육두수 2,000두 트랙터 7대( ps, 궤도형 2대), 이앙기 2대(승용), 콤 보유 농기계 바인 3대(자탈형 6조식 2대, 보통형 1대), 레이크 2대, 베일러 2대, 래핑기 2대, 트럭 2대 볏짚 수거방법 콤바인 수확 2 3일 후 레이크-베일- 래핑-트랙터 이송 (논둑까지)작업을 수행 베일의 사양 볏짚 이용방법 베일 구입처 및 가 격 직경 1.3 m, 높이 1.2 m, 무게 kg 한우 조사료 남원(4만원/1 roll) 또는 영광(4.7만원/1 roll) 작물별 부산물의 수거율 조사 죽암 제1농장의 2종류 품종 황금누리(단간종) 및 아사히(장간종)에 대하여 볏짚의 특성, 부산 물의 수거율 및 부산물 사용 용도 등을 조사하였다. 벼의 수확은 2010년 10월 13일 낫을 이용 하여 1 m 2 의 논에 포함된 벼의 밑 부분을 3반복 예취한 후 포장에서 그네(일명 홀테)로 수작 업으로 탈곡한 후 낱알과 볏짚의 무게를 측정하였다. 탈곡한 낱알과 볏짚을 수분이 마르지 않 도록 비닐에 넣어 실험실로 운반한 다음 볏짚을 밑으로부터 100 mm의 높이에서 절단하여 각 각에 대하여 함수율을 측정하였다. 100 mm 로 절단한 이유는 콤바인으로 수확한 미 절단 그 루터기의 길이를 이웃농가의 포장에서 측정한 결과 평균 100 mm로 나타났기 때문에 미 수거 된 볏짚의 양을 파악하기 위해서이다. 그루터기가 100 mm인 것으로 가정하였을 때 단간종 황금누리는 콤바인 수확한 다음의 그루 터기의 무게가 전체 볏짚량의 24.8%이었으며, 장간종 아사히는 17.3%이었다. 정곡에 대한 볏짚이 비율은 황금누리에서 196%(그루터기 제외), 아사히에서 197%(그루터기 제외)로 나타났으며 이는 기존 문헌의 112.7%보다는 매우 높게 나타났으며, 이는 볏짚이 함수 율이 높은 상태에서 구한 값이기 때문인 것으로 판단되었다. 콤바인 수확을 하는 것으로 가정하여 그루터기를 제외하였을 때 ha 당 수거할 수 있는 볏짚 의 건조 중량은 황금누리의 경우 4,389 kg, 아사히의 경우 4,614 kg이며 이의 평균은 4,502 kg 으로 나타났다

103 표 5. 죽암농장 벼 수확시험 결과 품종 포기수/ m 2 낱알무 게 (g/m 2 ) 구분 길이 (mm) 무게 (g/m 2 ) 볏짚 함수율 (%) 건조 중량 (g/m 2 ) 건조 중량 (kg/ha) 비율 (%) 전체 , , 황금 누리 예취 볏짚 , , 그루터기 , 아사히 평균 전체 1, , , 예취 볏짚 , , 그루터기 전체 , , 예취 볏짚 , , 그루터기 , 본 연구에서 조사된 단위면적당 볏짚의 건조중량을 이용하여 고흥군의 볏짚(건조중량) 생산 량을 구하면 표 6과 같다. 표 6에서와 같이 고흥군의 총 건중량 볏짚 생산량은 64,622톤으로 나타났으며 포두면, 도덕면 및 동강면의 순서로 주로 간척지가 농지인 면에서 많이 생산되었 다

104 표 6. 고흥군 면단위별 볏짚의 추정 생산량 면 논(ha) 10a 당 수량(kg) * 생산량(ton) 비율(%) 포 두 면 2, , 도 덕 면 1, , 동 강 면 1, , 점 암 면 1, , 풍 양 면 1, , 대 서 면 1, , 남 양 면 1, , 두 원 면 1, , 도 화 면 , 과 역 면 , 도 양 읍 , 고 흥 읍 , 금 산 면 , 영 남 면 ,315 2 동 일 면 봉 래 면 계 14, , 또한 실제로 미 예취된 그루터기의 볏짚과 베일작업 과정에서 수거되지 않은 볏짚의 양을 콤바인으로 수확작업을 수행한 황금누리 벼 논에서 조사하였다. 콤바인으로 수확하여 흩어진 볏짚을 레이크 - 베일링 - 래핑 - 이송 작업한 다음 수거되지 않은 볏짚을 조사하였다. 수거 되지 않은 볏짚은 미 예취된 그루터기와 베일작업 후 논에 깔려 있는 볏짚이다. 1m 1m 의 구획을 설정하여 이 공간에 포함된 그루터기와 깔려 있는 볏짚을 모두 인력으로 수거하여 그 양과 성분을 측정 분석하였다. 3반복하여 시험한 결과 그루터기는 1 m 2 당 g 이었으며, 논에 깔려 있는 볏짚은 1 m 2 당 58 g 이었다. 그루터기는 함수율이 59.1%이었으며, 깔려 있는 볏짚의 함수율은 19.2%이었 다. 미 수거된 전체의 양 중에서 그루터기의 비율은 77.6%이었으며, 논에 깔려 있는 미 수거량 은 22.4%로 나타났다. 1 m 2 의 논에 포함된 그루터기의 건조중량은 82.3 g 으로서 수작업으로 100 mm로 절단한 무 게인 g 과는 상당한 차이를 보이고 있었다. 이는 황금누리 작업포장의 실제 그루터기의 길이가 100 mm 에 약간 미치지 못했으며 또한 포장에서 볏짚의 건조가 진행되었기 때문인 것 으로 판단된다. 사각베일러 작업현황 조사 사각베일러 작업현황은 2010년 10월 21일 죽암 농장 인근의 소규모 개인 농가에서 수행하는 작업현황을 조사하였다. 포장의 크기는 0.6 ha(100m 60m)로서 이미 콤바인 수확하여 포장에 널려 있는 볏짚을 아세아 사각베일러를 트랙터의 구동에 의하여 작업을 수행하였다. 0.6 ha의 면적에서 총 369개의 사각베일을 생산하였다. 5개 베일의 무게 및 크기를 측정하여 평균값을 구하였으며, 사각베일 1개의 평균무게는 kg이고 크기는 0.6m 0.45m 0.36m 로 나타났다

105 유자 부산물의 이용 현황 조사 유자가공 부산물은 2가지 형태로 배출된다. 유자는 품질이 우수한 경우에는 유자차로 가공하 고 품질이 좋지 않는 경우에는 유자쥬스로 가공한다. 유자차로 가공하는 경우에는 부산물이 유 자씨이며, 유자쥬스로 가공하는 경우에는 유자씨와 유자박이 함께 부산물로 생성된다. 고흥 지 역에서 유자의 생산량은 보통 연간 7,000톤 정도이지만 2010년도에는 작황이 좋지 않아 평년의 약 60%정도 생산될 것으로 예상되고 있다. 해당년도의 작황에 따라 다르지만 일반적으로 전체 의 생산량 중에서 80% 90%정도는 유자차로 가공하며, 나머지 10% 20% 정도를 유자쥬스로 가공하는 것으로 조사되었다. 고흥에는 2010년 3월 기준 25개의 유자 가공업체가 있으며 이중에서 한성푸드영농조합법인 과 두원농협종합유통가공센터가 규모가 크다. 2006년도에 고흥군에서 유자 가공량은 8,550톤이 었으며, 이중에서 한성푸드영농조합법인은 3,000톤의 유자를 가공하였으며, 두원농협종합유통가 공센터는 2,000톤의 유자를 가공하여 2개 가공공장에서 가공한 비율은 58.5%에 달하였다. 2010년 11월 15일 한성푸드영농조합법인을 방문하여 유자즙으로 가공예정인 유자를 수집하 였으며, 유자의 씨를 분리하여 무게를 측정한 결과 유자씨의 무게는 유자 전체 무게의 12.2% 에 해당하였다. 현재 유자씨는 농가에게 무상 제공하여 퇴비의 부재료로서 활용되고 있다. 고흥지역에서 생산되는 유자(평년 생산량 7,000톤 기준)의 90%를 유자차로 가공한다고 가정 하였을 때 부산물로 생산되는 유자씨는 769톤에 이르른 것으로 조사되었다. 고흥지역 벼, 보리 및 옥수수 부산물 발생량 분석 고흥지역의 볏짚, 보리짚 및 옥수수대 발생량을 현지 농장에서 조사 및 시험분석하였으며 각 작물별 부산물 발생량은 표 7과 같다. 표 7. 고흥지역의 단위면적당 볏짚, 보리짚 및 옥수수대 발생량 구분 발생량(kg/ha), 습량 기준 함수율(%) 발생량(kg/ha), 건량 기준 볏짚 13, ,502 보리짚 9, ,768 옥수수대 37, ,768 biorefinery의 규모에 따른 시기별 농업부산물 소요량 및 확보 방안 제시 바이오에탄올 생산 규모에 따른 작물별 원료 소요량 추정 - 바이오에탄올 생산 규모에 따른 작물별 원료 소요량을 추정하기 위해서는 재배면적당 부산물의 발생량 및 바이오에탄올 수율을 결정하여야 한다. 단위 면적당 볏짚 발생량은 포장 시험한 결과를 이용하고 바이오에탄올 수율은 기존의 문헌 결과를 이용하였다 년도 각 지역별 벼 재배면적(KOSIS 2011)과 단위 면적당 볏짚 발생량(건량기준 4.502톤/ha)을 이용하여 전국 각 시도별 및 전남지역 각 시군별 볏짚 발생량 및 바이오 에탄올 생산량(추정)은 다음과 같다

106 표 8. 각 시도별 2010년도 벼 재배면적, 볏짚발생량 및 에탄올생산량 구분 재배면적(ha) 볏짚발생량(톤) 에탄올 생산량(톤) 비율(%) 전국 886,516 3,991, , 서울특별시 267 1, 부산광역시 3,644 16,405 2, 대구광역시 3,217 14,483 1, 인천광역시 12,588 56,671 7, 광주광역시 6,182 27,831 3, 대전광역시 1,628 7, 울산광역시 6,341 28,547 3, 경기도 95, ,715 58, 강원도 38, ,718 23, 충청북도 46, ,505 28, 충청남도 156, ,365 95, 전라북도 134, ,822 81, 전라남도 180, , , 경상북도 116, ,357 70, 경상남도 83, ,943 51, 제주도

107 표 년도 전라남도 각 시군별 벼 재배면적, 볏짚발생량 및 에탄올생산량 구분 재배면적(ha) 볏짚 발생량(톤) 에탄올 생산량(톤) 전국 비율(%) 전라남도 180, , , 목포시 여수시 2,538 11,426 1, 순천시 5,713 25,720 3, 나주시 13,561 61,052 8, 광양시 2,165 9,747 1, 담양군 6,922 31,163 4, 곡성군 5,286 23,798 3, 구례군 3,249 14,627 1, 고흥군 14,526 65,396 8, 보성군 9,476 42,661 5, 화순군 5,716 25,733 3, 장흥군 8,892 40,032 5, 강진군 10,159 45,736 6, 해남군 22, ,048 13, 영암군 15,916 71,654 9, 무안군 9,366 42,166 5, 함평군 8,567 38,569 5, 영광군 10,845 48,824 6, 장성군 5,475 24,648 3, 완도군 2,745 12,358 1, 진도군 6,693 30,132 4, 신안군 9,913 44,628 6, 시기별 농업부산물 발생량 추정에 따른 원료 확보 방안 제시 - 볏짚은 9월 하순부터 11월 중순에 걸쳐 생산되므로 biorefinery의 연중 가동을 위해서는 볏짚을 저장하여 사용하거나 기타 작물을 발굴하여야 한다. 보리는 6월에 수확하므로 연중 부산물 확보를 위해 적절한 작물이다. 보리짚 확보 가능성을 확인하기 위해 보리 재배면적 에 대한 통계자료와 보리수확시 보리짚이 발생되는 양을 조사 분석하였다. 보리의 수확은 자탈형 콤바인 또는 보통형 콤바인으로 수확하고 있으며(그림 3), 수확 후 예취되지 않는 그루터기의 길이가 평균 15cm로 나타났다. 보리짚은 919g/m 2 발생하였으며 함수율은 59%이었다. 보리짚의 발생량은 건조중량으로 환산하여 3.768톤/ha이었다

108 그림 3. 보리 수확기계(좌: 자탈형 콤바인, 우: 보통형 콤바인) - 보리짚은 축산농가가 근처에 있는 경우에는 축산농가가 무상으로 수집하여 가축사료로 활용하지만 축산농가가 없는 경우에는 후속 벼농사를 위한 경운작업을 하여야 하므로 포장 내에서 소각하는 경우가 많았다(그림 4). 이는 보리짚의 손실 뿐만 아니라 보리짚 소각에 의 한 대기오염을 야기하므로 자원의 활용과 환경오염 방지를 위해 바이오에탄올 원료로 활용 하는 것이 필요하다. 그림 4. 보리 수확후 소각장면 년도 각 시도별 보리 재배면적(KOSIS 2011)과 보리짚의 단위면적당 발생량(3.768톤 /ha) 을 이용하여 구한 전국 각 시도별 보리짚 발생량 및 바이오에탄올 생산추정량은 다음 과 같다

109 표 년도 각 시도별 보리 재배면적, 보리짚 발생량 및 에탄올생산량 구분 재배면적(ha) 보리짚 발생량(톤) 바이오에탄올 생산량(톤) 서울특별시 부산광역시 대구광역시 332 1, 인천광역시 광주광역시 420 1, 대전광역시 울산광역시 경기도 강원도 충청북도 충청남도 전라북도 10,484 39,504 5,140 전라남도 11,930 44,952 5,849 경상북도 764 2, 경상남도 4,382 16,511 2,149 제주도 1,315 4, 년도 각 시도별 옥수수 재배면적(KOSIS 2011)과 옥수수대의 단위면적당 발생량 (12.768톤/ha)을 이용하여 구한 전국 각 시도별 옥수수대 발생량 및 바이오에탄올 생산추정 량은 다음과 같다. 표 년도 각 시도별 옥수수 재배면적, 옥수수대 발생량 및 에탄올생산량 구분 재배면적(ha) 옥수수대 발생량(톤) 바이오에탄올 생산량(톤) 서울특별시 부산광역시 대구광역시 인천광역시 광주광역시 대전광역시 울산광역시 124 1, 경기도 1,219 15,564 2,025 강원도 6,054 77,297 10,058 충청북도 3,474 44,356 5,772 충청남도 560 7, 전라북도 683 8,721 1,135 전라남도 1,483 18,935 2,464 경상북도 1,048 13,381 1,741 경상남도 562 7, 제주도 97 1, biorefinery의 가동률 향상을 위한 농업부산물 대체 방안 제시

110 원료의 공급 부족이 예상되는 시기에 대한 대안 제시 셀룰로스계 바이오에탄올 원료로서 볏짚이 가장 큰 비중을 차지하므로 볏짚이 발생하는 시기에 확보한 후 저장하여 사용하는 것이 바람직하다. 그러나 6월에 발생하는 보리짚과 옥 수수대를 확보하여 이용하면 원료부족을 조금이나마 해소할 수 있을 것으로 판단되었다. 나) 농업부산물 수거체계 구축 및 수거비용 분석 기상 데이터를 이용한 수거 가능 일수 분석 - 볏짚의 수거 기간은 벼의 수확시기와 일치한다고 가정하였다. 벼의 수확작업 가능기간 은 당해년도의 기상조건과 지역에 따라 차이가 있다. 수확시기는 9월 하순부터 11월 중 순까지이므로 1년에 약 60일에 걸쳐서 수확이 진행되며, 수확가능일수율은 표 12에서와 같이 지역과 시기에 따라 다르게 나타난다. 표 12. 지역별 시기별 수확가능일수율(정창주, 농업기계학) (단위: %) 지역별 9월 10월 11월 하순 상순 중순 하순 상순 중순 평택 경기도 이천 김포 공주 충청도 서산 논산 정읍 전라도 김제 나주 칠곡 경상도 영일 김해 수거 및 운반용 장비 현황 조사 - 볏짚의 수거는 콤바인에 의하여 벼를 수확한 다음 베일을 만들어 수거하는데 베일은 원 형베일과 사각베일의 2종류가 있다. 원형베일 수거는 콤바인에 의하여 벼를 수확한 다음 집초, 베일, 래핑, 포장내 이동, 상차, 도로 이동, 하차의 순서로 진행된다. 원형베일과 사각베일의 각 작업단계별로 이용되는 작업기의 종류, 사양 및 가격은 다음과 같다. 1) 트랙터(tractor): 트랙터는 자체적으로 주행하면서 집초기, 베일러, 랩피복기, 로더 등의 작업기에 동력을 공급하는 기본 기계로서 농작업에 필수적으로 요구되고 있다. 트랙터는 국내 주요 4개 제작회사에서 생산 공급하고 있으며 각 제작회사별 트랙터의 사양 및 가격은 표 13 과 같다

111 표 13. 각 제작회사별 트랙터 사양 및 가격 (자료: 2010농업기계가격, 한국농기계공업협동조합) 제작회사 형식 출력 가격 비고 TS ,140 대동공업(주) MX ,750 MX , , ,700 국제종합기계(주) KX ,700 KX , ,335 T ,100 동양물산(주) TX ,600 T ,830 MAX ,800 TN60DA 60 36,700 엘에스엠트론(주) TL80A 80 50,700 TL100A ,500 T ,600 2) 집초기(레이크, rake): 집초기는 콤바인 작업후 널리 고르게 분포되어 있는 볏짚을 베일 작업에 용이하도록 미리 큰 규모로 모아주는 작업기로서 트랙터의 부속작업기이다. 국내에서 생산되는 주요 집초기의 규격 및 가격은 표 14와 같다. 표 14. 제작회사별 집초기 사양 및 가격 (자료: 2010농업기계가격, 한국농기계공업협동조합) 제작회사 라이브맥 명성 아세아농기계(주) LRT320 LRT360 LRT420 TI4000 AD S 390S 작업폭(cm) 270~ ~ ~ 로더축 2축 2축 2축 2축 1축 1축 1축 갈퀴암 10개 10개 10개 갈퀴 20개 20개 20개 중량(kg) 소요동력(PS) 35이상 40이상 45이상 가격(천원) 4,000 4,500 4,800 7,440 8,500 7,300 8,

112 3) 원형베일러(baler): 원형베일러는 집초기에 의하여 모아져 있는 볏짚을 그대로 또는 일 정한 길이로 절단한 후 압력을 가하면서 원주형의 형태로 성형시켜 주는 작업기로서 트랙터의 부속작업기이다. 국내에서 생산되는 주요 원형베일러의 규격 및 가격은 표 15와 같다. 표 15. 제작회사별 원형베일러 사양 및 가격 (자료: 2010농업기계가격, 한국농기계공업협동조합) 제작회사 아세아농기계(주) 라이브맥 명성 모델명 355RC 360RC L325 CR10C RB1000 픽업폭(cm ) 베일 직경(cm) 베일 폭(cm) 주행 방식 트랙터견인 트랙터견인 트랙터견인 트랙터견인 트랙터견인 소요동력(PS) 구입가격(천원) 68,200 59,420 52,500 33,900 34,400 4) 사각베일러(baler): 사각베일러는 콤바인으로 수확한 후의 볏짚을 직육면체의 형태로 성 형시켜 주는 작업기로서 트랙터의 부속작업기이다. 국내에서 생산되는 주요 사각베일러의 규 격 및 가격은 표 16과 같다. 표 16. 제작회사별 사각베일러 사양 및 가격 (자료: 2010농업기계가격, 한국농기계공업협동조합) 제작회사 아세아농기계(주) 라이브맥 형 식 명 MARKANT45 MARKANT55 MARKANT65 LS160 LS260 중량(kg) 베일폭 높이 (cm) 베일길이(cm) 40~110 40~110 40~110 40~110 40~110 베일무게(kg) 10~35 10~35 10~35 10~35 10~35 소요동력(PS) 구입가격(천원) 13,470 20,900 22,330 21,000 22,600 5) 옥수수 하베스터 베일러(baler): 옥수수 하베스터 베일러는 옥수수대를 수확함과 동시 에 옥수수대를 일정한 길이로 절단한 후 압력을 가하면서 원주형의 형태로 성형시켜 주는 작 업기로서 트랙터의 부속작업기이다

113 표 17. 옥수수 하베스터 베일러 사양 및 가격 제작회사 형식명 작업방식 (자료: 농업기계카탈로그, 라이브맥) 라이브맥 MR-810 수확 및 베일동시작업 무게(kg) 1,950 적재용량(m3) 2 소요동력(PS) 60 베일직경(cm) 85 베일폭(cm) 85 구입가격(천원) 60,000 6) 랩피복기(lapping machine): 랩피복기는 성형된 베일을 강우에 의한 흡습 방지 또는 기 타 곤충 등으로부터 보호하기 위하여 베일의 외부를 비닐로 피복시켜 주는 작업기로서 트랙터 의 부속작업기이다. 국내에서 생산되는 주요 랩피복기의 규격 및 가격은 표 18과 같다. 표 18. 제작회사별 랩피복기 사양 및 가격 (자료: 2010농업기계가격, 한국농기계공업협동조합) 제작회사 아세아농기계(주) 명성 죽암기계(주) 모 델 명 LW500A LW900A LW900-2AR RF1400 RF1500 BWR1-150 길이 폭 높이 (cm cm cm) 무게(kg) 베일크기 Ø Ø Ø Ø Ø Ø (cm cm) 최대적재하중 (kg) 래핑회전속도 (rpm) 소요동력(PS) 구입가격 (천원) 13,600 15,500 23,000 22,200 32,040 22,000 ㅇ 작업체계별 작업능률 분석 - 볏짚의 수거는 콤바인에 의하여 벼를 수확한 다음 베일을 만들어 수거하는데 베일은 원 형베일과 사각베일의 2종류가 있다. 원형베일은 원주형의 베일로서 베일 1개당 약 300kg의 무 게(함수율 50% 기준)를 가지며 30개/1ha 정도 생산되며, 사각베일은 약 15kg의 무게를 가지며 600개/1ha 정도 생산된다

114 - 원형베일 수거는 콤바인에 의하여 벼를 수확한 다음 집초, 베일, 래핑, 포장내 이동, 상 차, 도로 이동, 하차의 순서로 진행된다. 집초, 베일, 래핑, 포장내 이동은 트랙터에 부속된 작 업기를 이용하는 것이 일반적이다. 포장에서의 상차작업은 트랙터 부속작업기(로더+집게)를 이용하거나 작업능률을 향상시키기 위하여 포크레인을 이용하는 경우가 많다. 도로 운송은 일반적으로 1톤 또는 4.5톤 트럭을 이용하고 있으며, 도로 운송 후 보관창고에서 하역작업은 트랙터 부속작업기(로더+집게) 또는 스키드로더를 이용한다. 그림 5. 원형베일의 제조 및 수거 공정

115 - 도로 운송에 1톤 트럭을 이용하는 경우에는 원형베일 2개를 적재하여 운반하는 경우가 많 았으며, 경우에 따라서는 1톤 트럭에 4개를 적재하여 로프로 밴딩작업을 한 다음 운반하는 경우도 있었다. 4.5톤 트럭을 이용하는 경우에는 구형 4.5톤에는 2층으로 탑재하여 1층에 8개 2층에 4개 모두 12개의 원형베일을 탑재하여 운반하고 있었으며, 신형 4.5톤에는 1층에 10개, 2층에 5개 모두 15개의 원형베일을 탑재하여 운반하고 있었다. 그림 6. 원형베일을 4.5톤 트럭에 탑재하여 운송(좌: 12개 탑재, 우: 15개 탑재) - 베일을 잘 건조하여(함수율 40% 이하) 보관하는 경우에는 래핑작업을 수행하지 않고 베일을 바로 창고로 이동하여 보관하는 경우도 있었지만 기상조건 때문에 볏짚을 충분히 건 조하기가 쉽지 않고 보관창고가 없는 경우가 많으므로 래핑작업을 수행한 후 창고 또는 노지 에서 보관하는 경우가 많았다. - 사각베일 수거는 콤바인에 의하여 벼를 수확한 다음 집초와 래핑과정이 없이 베일, 포장내 상차, 도로 이동, 하차의 순서로 진행된다. 베일은 트랙터 부착 작업기를 이용하며, 포 장내 상차 및 창고 하역은 수작업에 의존하며, 운송은 동력경운기 트레일러를 이용한다. 동력경운 기 트레일러에 사각베일을 40개 정도 탑재하여 이동하고 있었다. 그림 7. 사각베일의 생산, 운반 및 적재 광경 수거 방법 및 운송 거리에 따른 비용 분석 - 고흥지역의 논은 3,000m 2 (0.3ha, 900평) 단위로 경지정리되어 있으므로 집초, 베일, 래핑, 포장내 운송, 상차, 도로 운송, 하차에 소요되는 장비 및 작업능률은 3,000m 2 (900평) 규모의

116 포장을 기준하여 작업능률, 사용된 장비 및 가격 등을 조사 분석하였다. 현재 고흥지역에서 이용되고 있는 장비에 의하여 3,000m 2 규모의 농장에서 집초, 베일, 래핑 및 상하차 작업을 수행하는 경우, 도로 운송을 제외하고 총 63분이 소요되었다. - 그러나 위의 작업은 장비가 갖추어지면 동시에 작업을 수행할 수 있으므로 1일 작업시 간이 U(hr), 수확작업 기간이 D(day)이면 장비가 갖추어진 조건에서 작업능률이 가장 낮은 베일러를 기준으로 하여 볏짚 수거시스템이 연간 작업할 수 있는 부담 면적( A )은 다음과 같이 구한다. A = e f e u e d A h U D 여기서, A = 부담면적(ha/year) A h = 시간당 작업면적(m 2 /hr) U = 1일 작업시간(hr/day) D = 연간 작업기간(day/year) e f = 포장작업효율 e u = 실작업율 e d = 작업가능일수율 - 위 식에서 시간당 작업면적은 3,000m 2 의 면적을 작업할 때 20분이 소요되었으므로 9,000m 2 /hr이 되며, 1일 작업시간은 오전 10부터 오후 6시까지 8시간, 수확작업 기간은 9월 하순부터 11월 중순까지 60일로 가정하였다. 시간당 작업면적은 이미 포장효율이 반영된 값 이므로 포장작업효율은 100%, 실작업율은 62%, 작업가능일수율은 전남 나주의 평균값 78.7%로 가정하여(정창주, 농업기계학 25-26, 향문사) 구한 볏짚 수거시스템(베일러)의 연간 부담면적은 다음과 같다. A = e f e u e d A h U D = , = 211 ha 위 볏짚수거 시스템을 구비하였을 경우 연 211ha의 면적에서 생산된 볏짚을 수거할 수 있다. 이 면적은 1ha에서 30개의 베일이 생산된다고 했을 때 6,330개의 베일을 수거하여 볏짚 을 건량기준으로 950톤, 바이오에탄올 128.5톤을 생산할 수 있는 규모이다. - 도로 운송비는 베일 1롤 당 5,000원으로 가정하고, 211ha의 면적을 수거하기 위한 장비 의 감가상각비, 연료비, 인건비 등의 수거에 소요되는 비용과 볏짚 구입비, 래핑재료 구입비를 포함하여 베일의 생산단가를 산출하였다. 연료비는 연료가격(1,100원/L) 연료소비율 (0.2L/(ps hr) 연간투입마력(정격마력의 75% 작업시간)으로 산출하였으며 윤활유비는 연료비

117 의 10%로 가정하였다. 각 작업단계의 작업능률은 포장(0.3ha)에서 숙련된 작업자의 작업시간 을 실측하여 산출하였다. C = F c C i + H (F + O + L ) 여기서 C = 연간 이용비용(원/년) F c = 연간 고정비 비율(0.23) C i = 장비 구입가격(원) H = 해당 작업기의 연간 이용시간(시간/년) F = 연료비(원/년) O = 윤활유비(연료비의 10%, 원/년) L = 인건비(15,000원/시간) - 사용장비의 연간 이용비용(C)은 연간고정비 비율(23%), 연료비(1,100원/L), 연료소비율 (0.2L/(ps hr)), 윤활유비(연료비의 10%), 인건비(15,000원/hr), 1일 작업시간(8hr)을 적용하여 구 하였다(정창주, 농업기계학 23-33, 향문사). 래핑재료비 4,000원/베일(이성현, 2000), 볏짚 구입 비 120,000원/0.3ha(900평)은 현지 설문조사에 의한 자료를 이용하였다. - 베일 수거시스템의 구성은 표 19 및 표 20에서와 같이 211 ha와 1,055 ha의 면적을 기 준하여 구성하였다. 표 19는 작업능률이 가장 낮은 베일러를 기준한 수거시스템으로서 연간 부 담면적이 211 ha인 경우의 수거비용 및 베일 생산단가를 산출한 결과를 나타내주고 있다

118 표 19. 볏짚 수거시스템의 구성 및 소요비용 분석(작업면적 211 ha 기준) 작업 단계 사용 장비명 작업 능률 (m2/hr) 트랙터 가격 (천원) 장비 가격 (천원) 작업 시간 (hr) 수거비용 (천원) 집초 트랙터A(60ps)+집초기 12,000 32,000 7, ,312 베일 트랙터B(100ps)+베일러 9,000 48,000 60, ,375 래핑 트랙터C(80ps)+랩피복기 12,000 41,000 22, ,862 포장내운송 트랙터A(60ps)+로더+집게 36,000 6, ,827 상차 포크레인 45,000 70, ,333 하차 전용 로더 45,000 30, ,721 소계 107,430 볏 짚 12만원/0.3ha 211ha=84,400천원 84,400 도로 운송 5천원/베일 6,330베일 = 31,650천원 31,650 래핑재료 4천원/베일 6,330베일 = 25,320천원 25,320 총비용 248,800 비용/베일1롤 39,305 - 표 19에서와 같이 211 ha의 면적에서 베일은 6,330개의 베일이 생산되며, 볏짚을 수거하 는데 소요되는 비용은 248,800천원이 되어 베일 1개당 수거비용이 39,305원으로 나타났다. 그러 나 다양한 용도로 이용되는 트랙터, 상차에 이용되는 포크레인, 하역작업에 이용되는 스키드로 더는 볏짚의 수거에만 이용되는 것이 아니므로 다른 용도로 활용한다면 위 장비의 고정비 비 용이 낮아지므로 볏짚의 생산단가는 더 낮아지게 된다. - 표 20은 작업능률이 가장 높은 포크레인을 기준한 수거시스템으로서 연간 부담면적이 1,055 ha인 경우의 수거비용 및 베일 생산단가를 산출한 결과를 나타내주고 있다. 표 20. 볏짚 수거시스템의 구성 및 소요비용 분석(작업면적 1,055 ha 기준) 작업 단계 사용 장비명 작업 능률 (m2/hr) 트랙터 가격 (천원) 장비 가격 (천원) 작업 시간 (hr) 수거비용 (천원) 집초 트랙터A(60ps)+집초기 4 set 48, ,000 28, ,058 베일 트랙터B(100ps)+베일러 5set 45, , , ,735 래핑 트랙터C(80ps)+랩피복기 4 set 48, ,000 66, ,365 포장내 운송 트랙터A(60ps)+로더+집게 2 set 72,000 64,000 12, ,599 상차 포크레인 1 set 45,000 70, ,263 하차 전용 로더 1set 45,000 30, ,004 소계 312,023 볏 짚 12만원/0.3ha 1,055ha= 422,000천원 422,000 도로 운송 5천원/베일 31,650베일= 158,250천원 158,250 래핑재료 4천원/베일 31,650베일= 126,600천원 126,600 총비용 1,018,873 비용/베일1롤 32,192 - 표 20에서와 같이 1,055 ha의 면적에서 베일은 31,650개의 베일이 생산되었으며, 볏짚을

119 수거하는데 소요되는 비용은 1,018,873천원이 되어 베일 1개당 수거비용이 32,192원으로 나타났 다. ㅇ 요약 바이오에탄올 생산을 위한 볏짚 수거 시스템은 고흥지역의 포장에서 작업하는 작업기를 기 반으로 구성하였으며, 수거 작업 단계는 집초, 베일, 래핑, 포장 내 이송, 상차, 도로 운송, 저장 고 하차로 이루어진다. 수거 시스템을 구성하는 장비는 트랙터, 집초기, 베일러, 랩피복기, 로 더, 집게, 포크레인, 전용 스키드 로더로 구성하였다. 수거 장비 중에서 작업능률이 가장 낮은 베일러를 기준으로 한 수거 시스템의 부담면적은 211 ha로 나타났다. 도로 운송비를 제외하고 211ha 면적의 볏짚을 수거하기 위한 장비의 감가상각비, 연료비, 인 건비 등의 수거에 소요되는 비용과 볏짚 구입비, 래핑필름 구입비를 포함하여 베일의 생산단가 를 산출한 결과 베일 1개당 34,305원으로 나타났으며, 도로 운송비를 베일 1개당 5,000원으로 가정하면 베일 1개당 39,305원의 수거비용이 소요되는 것으로 나타났다. 수거 장비 중에서 작업능률이 가장 높은 상차용 장비인 포크레인을 기준으로 하여 수거 시 스템을 구축하였으며, 이 시스템의 연간 부담면적은 1,055 ha로 산출되었다. 1,055 ha의 면적에서 베일은 31,650개의 베일이 생산되었으며, 볏짚을 수거하는데 소요되는 비용은 1,018,873천원이 되어 베일 1개당 수거비용이 32,192원으로 나타났으며, 위 내용을 요약 하면 다음과 같다. 1) 농업 자원(볏짚, 보리짚 및 사료작물)의 수거시스템을 구축하였다. 2) 볏짚 수거에 필요한 장비시스템을 작업면적(211 ha, 1,055 ha)에 따라서 구축하였으며, 볏 짚 수거에 소요되는 비용을 산출하였다. 3) 장비의 능률이 가장 낮은 베일러를 기준하여 볏짚 수거시스템을 구축한 결과 부담면적은 211 ha로 나왔으며, 베일 1개의 생산비가 39,305원으로 산출되었다. 4) 장비의 능률이 가장 높은 포크레인을 기준하여 볏짚 수거시스템을 구축한 결과 부담면적 은 1,055 ha로 나왔으며, 베일 1개의 생산비가 32,192원으로 산출되었다. 5) 기존 시중의 베일 가격 55,000원 보다 22,208원이 낮아 1,055 ha의 면적에서 연간 7억 2천 만원의 소득을 창출할 수 있는 것으로 판단되었다. 6) 본 수거시스템이 구축되면 볏짚 외에 보리짚 및 사료작물의 수거에 활용할 수 있으므로 경제성은 훨씬 향상될 수 있을 것으로 판단되었다. 7) 보리짚의 수거를 통하여 보리짚이 포장에서 소각되는 것을 방지하여 대기오염을 줄일 것 으로 판단되었다. 8) 사료작물의 수거체계가 구축됨에 따라 사료작물의 재배가 확대되어 양질의 사료를 공급 하여 축산농가의 경제성을 제고하고 고급육의 한우를 생산할 수 있다. 9) 사료작물의 재배확대를 통하여 농촌경관이 좋아지므로 농촌관광이 활성화되어 농촌 소득 증대에 기여할 수 있다. 10) 향후 셀룰로스계 농업부산물을 이용하여 바이오에탄올을 생산할 경우 농업부산물 수거 에 대처할 수 있다. 다) GIS를 이용한 수거 체계 최적화

120 작물 재배지 분포 GIS DB 탐색 1) 농촌진흥청 토양환경정보시스템 자료를 이용한 분석 - 농촌진흥청에서는 정밀토양조사사업(1964~1979), 논토양배양 10개년사업(1980~ 1989) 및 밭토양 세부정밀조사사업(1995~1999)의 결과를 토대로 토양비옥도 DB와 수치토양도 DB를 구축한 바 있으며, 토양정보를 주축으로 하여 GIS 기반 농업환경정보시스템 구축사업을 진 행하고 있다. - 농촌진흥청의 토양환경정보시스템( 작물재배적지와 토양 GIS 주제 도를 수치지도로 제공하고 있으며, 이를 통하여 토지이용, 토양분류, 토양의 물리 화학적 특 성 등 50개 주제의 정보를 활용할 수 있다. - 또한 토지이용(1995~1999) 현황지도로부터 농작물 재배지역을 논, 밭, 과수, 상전, 하우 스, 초지 등으로 분류하였으며, 논의 경우에는 보통답, 사질답, 미숙답, 습답, 염해답 및 특 이산성답으로 구분하고 있다. 그림 8. 토양환경정보시스템 예시 - 농촌진흥청의 토양환경정보시스템은 비록 오래 전의 조사자료에 근거하고 있지만 전국 을 대상으로 하는 DB가 최소 행정단위인 동/리를 기반으로 구축되어 있다. - 토양환경정보시스템으로부터 추출한 전남 고흥군의 논 면적은 총 17,616ha로서, 2010년 벼 재배면적 통계자료인 14,526ha에 비해 21.3% 높은 것으로 나타났다. 이는 도로, 산업단 지 및 시설재배 면적의 확대에 따라 벼 재배면적이 감소하였기 때문인 것으로 판단된다

121 표 21. 전라남도 고흥군 동강면의 유형별 논 면적 분포( 추출) 시/군 읍/면 동/리 논 면적(ha) 계 보통답 사질답 미숙답 습답 염해답 특이산성답 노동리 대강리 마륜리 매곡리 오월리 고흥군 동강면 유둔리 장덕리 죽암리 청송리 한천리 합계 1, 비율(%) 표 22. 전라남도 고흥군의 유형별 논 면적 분포( 추출) 시/군 고흥 군 읍/면 논 면적(ha) 계 보통답 사질답 미숙답 습답 염해답 특이산성답 고흥읍 과역면 1, 금산면 남양면 1, 대서면 1, 도덕면 1, 도양읍 도화면 1, 동강면 1, 동일면 두원면 1, 봉래면 영남면 점암면 1, 포두면 3, , 풍양면 1, 합계 17,616 6,122 1,495 4,419 1,010 4,569 0 비율(%) 바이오매스 수량의 공간적 분포를 추정하는 경우에는 일정 간격의 그리드에 대한 셀 단위(1km 1km)로 표현하는 것이 보편적이지만, 토양환경정보시스템을 이용할 경우 최소 행정구역인 동/리 단위로 표현 할 수 있다. 고흥군의 경우 131개 동/리의 전체면적이 776km 2 으로서 1개 리의 평균 면적은 5.9km 2 에 해당하지만, 벼 재배지역인 평야지대에서의 1개 리의 면적은 이보다 훨씬 적을 것이다. - 농촌진흥청의 토양환경정보시스템으로부터 기초 행정구역 별 볏짚 생산량을 추정할 수

122 있지만 도로망과 연계되어 있지 않기 때문에 운송비용을 고려한 Biorefinery 입지 분석에는 사용할 수 없는 단점을 가지고 있다. 2) 국토지리정보원 수치지도v2.0을 이용한 분석 - 작물 재배지 분포를 추정할 수 있는 국토지리정보원( 지도자료 는 다음 표와 같다. 표 23. 국토지리정보원의 토지 관련 지도 DB 현황( 구분 축척 도엽수(종이) 도엽수(수치) 1: ,673(Ver. 2) 1: ,783 17,793(Ver. 2) 지형도 1:10, :25, :50, :250, 토지이용현황도 1:25, 토지특성도 1:1000-9,809 1:5000-7,065 - 국토지리정보원의 수치지형도는 비교적 최근(2000년 이후)에 촬영한 영상을 바탕으로 제작한 것으로서 농촌지역의 경우 논, 밭, 과수원 등의 구분이 가능한 반면, 수치토지 이용 현황도는 농지의 경우 경지정리답, 미경지정리답, 밭, 과수원을 구분할 수 있으나 1973~1983 년에 제작된 종이토지이용도를 기반으로 하며 전국토 면적의 58%에 대한 자료가 구축되어 있다. 그림 9. 전국 수치지도 제작 현환(1:25,000) - 논 면적에 근거한 볏짚 부산물 생산량의 지역 분포를 조사하기 위하여 국토지리정보원 에서 제작한 수치지도v2.0(1:5,000)를 이용하였다. 지역 : 전라남도 고흥군 전역(135도엽)

123 도엽의 범위 : km 도엽의 수치 데이터 : 묘지, 식생, 수계, 지형, 주기, 도로경계, 도로중심선, 인도, 건물, 시설 - 구입한 수치지도v2.0 파일의 확장자가 ngi이므로 국토지리정보원에서 제작한 수치지도 활용 소프트웨어의 Export Shape 기능을 이용하여 확장자를 shp로 변환하였다. - shp 파일에 ArcGIS10.0의 Select By Attributes 기능을 적용하여 논 데이터만을 선택 하였다. - ArcGIS10.0의 Calculate Geometry 기능을 이용하여 논의 면적을 산정하였다. 그림 10. ngi 확장자를 shp 확장자로 변환 그림 11. 논 필지만 선택

124 그림 12. 논 면적 구하기 - 도엽별 논의 면적 분포를 고려한 도심을 ArcGIS10.0의 Mean Center 기능을 이용하여 구했다. - 데이터 분석을 단순화하기 위하여 각 도엽당 논 면적의 도심 좌표에 논의 면적과 예상 되는 볏짚 생산량을 속성으로 부여하였다. 그림 13. Mean Center 작업 그림 14. 도엽 별 Mean Center 결과

125 표 24. 도엽 별 논 면적의 도심 및 볏짚 생산량 추정 값 예시 도엽 번호 도심 좌표 추정 논 면적(ha) 추정 볏짚 생산량 (t, 건량 기준) 원형 베일 수량(개) 순천 X : Y : 순천 순천 순천 순천 복내 순천 순천 순천 순천 X : Y : X : Y : X : Y : X : Y : X : Y : X : Y : X : Y : X : Y : X : Y : , , , ,936 12, , , , ,203 8,023 3) 국가교통DB센터 도로망 분석 - 운송비용을 추정 할 수 있는 국가교통DB센터( 도로망 데이터 를 수집하였다. 지역 : 전국 수치 데이터 : 차선 수, 도로 이름, 일방/양방 통행, 최고/최저 속도, 도로 건설 년도, 도로 길이 등 - 도로망 데이터는 전국 도로망 데이터로 분석하려는 고흥군의 도로망만 사용하기 위해 ArcGIS10.0의 Edit Features 기능을 이용하여 수정하였다. - 도로망 데이터에 각 구간별 이동 시간 정보가 포함되어 있지 않아서 ArcGIS10.0의 Field Calculator 기능을 이용하여 이동시간을 산출하였다

126 그림 15. 고흥군 도로망 추출 그림 16. 구간별 이동 시간 데이터 구하기 - 수치지도v2.0과 도로망 데이터의 제작 기관이 달라 지도 좌표 체계가 상이하므로 수치 지도 활용 소프트웨어의 좌표변환 기능을 이용하여 도로망 데이터의 좌표 값을 수치지도 v2.0의 좌표 체계와 일치시켰다. 그림 17. 좌표변환 수치지도v2.0과 도로망 통합을 통한 Biorefinery 입지 분석

127 - Biorefinery 후보 입지까지의 운송비용을 분석하기 위하여 각 도엽의 논면적 도심 좌표 로부터 각 후보 입지까지의 도로망을 이용한 운송거리 및 운송시간을 분석하여 운송비용을 추정하였다. 그림 18. 도로망을 이용한 운송거리, 시간 분석 - 분석 결과 건량 기준 2만톤(베일 수량 약 134,500개) 소요 규모의 Biorefinery 입지 분석 (운송 연료비만 고려하여 계산하였음.) 후보 입지 1 (분홍색 34개 도엽의 중심지) 도엽 번호 : 순천 좌표 : x , y 지역 : 전남 고흥군 점골 대상 지역 베일 수량 : 약 134,216개(2만톤 근접, 건량 기준) 대상 지역 면적 : 20570ha(34개 도엽) 베일 당 최저 운송 연료비 : 480원 베일 당 최고 운송 연료비 : 1,030원 운송 연료비 합계 : 79,943,506원 후보 입지 2 (빨강색 40개 도엽의 중심지) 도엽 번호 : 고흥 좌표 : x , y 지역 : 전남 고흥군 송강리 대상 지역 베일 수량 : 약 134,539개(2만톤 근접, 건량 기준) 대상 지역 면적 : 24200ha(40개 도엽) 베일 당 최저 운송 연료비 : 480원 베일 당 최고 운송 연료비 : 1,100원 운송 연료비 합계 : 80,897,106원 후보 입지 3 (파랑색 61개 도엽의 중심지) 도엽 번호 : 회천 좌표 : x , y 지역 : 전남 고흥군 율치리

128 대상 지역 베일 수량 : 약 131,458개(2만톤 근접, 건량 기준) 대상 지역 면적 : 36905ha(61개 도엽) 베일 당 최저 운송 연료비 : 480원 베일 당 최고 운송 연료비 : 1,300원 운송 연료비 합계 : 102,375,005원 그림 19. Biorefinery 입지 분석 * 이론적, 실험적 접근방법, 연구내용, 연구결과를 기술

129 제5절 농업부산물로부터 분해균주(곰팡이)이용 당 전환기술 개발 Ⅰ. 연구 방법, 내용 및 결과 Xylanase 활성 우수 곰팡이 균주 선별 각 균주를 27 에서 4일간 배양한 뒤, 그 상층액을 기질과 50 에서 30분간 반응 시킨 후 540 nm에서 그 활성을 측정하였음. 기질로써 1% oat spelt xylan을 사용하였다. 스크리닝 결 과 Fomitopsis rosea, Gymnopilus aeruginosus, Phycomyces blakesleeanus, Coriolus pubescens, Tricholoma matsutake 등 고활성 균주가 선별되었다 (Table 1). Table 1. Screening of fungal strains with high xylanase activity Organism Activity (U/ml) Specific Activity (U/mg) Aspergillus oryzae Aspergillus clavatus Mycena rorida T. hirsuta Grifola frondosa Pleurotus geiogerius Fomitopsis rosea Phanerochaete chrysosporium Phellinus pini Cantharellus cibarius Tricholoma matsutake Coltricia perennis Gymnopilus aeruginosus Fusarium oxysporum Crepidotus sulphurinus Neosartorya fischeri Coriolus pubescens Chaetomium globosum Pterula multifida Psathyrella multissima Fusarium graminearum Podospora anserina Ustilago maydis Phycomyces blakesleeanus Humicola fuscoatra T. reesei Fomitopsis rosea로부터 xylanase의 대량 생산 Xylan 분해가 우수한 균주의 스크리닝 결과 Fomitopsis rosea의 xylanase 활성이 3,950 U/mg 으로 종래에 보고된 다른 곰팡이 균주보다 월등히 뛰어남을 확인하였다. 균주의 정확한 분류파악을 위해 ITS-5.8S rdna sequencing을 수행하였으며 Genbank database 상

130 Fomitopsis rosea KMJ815로 명칭하고 한국농업미생물센터에 기탁번호 KACC 93081P로 기탁 하였다. 그리고 기존의 xylanase 활성이 높은 것으로 잘 알려진 T. reesei 균주를 대조군으로 xylanase 활성을 비교하였다 (Fig. 1A). 96시간에 기존에 활성이 높은 것으로 알려진 T. reesei xylanase 보다 훨씬 더 높은 활성을 나타내었다. 그리고 이 균주로부터 고활성 xylanase를 대 량 생산하기 위하여 최적 생산 조건실험을 수행하였다. 배지조건은 7 L fermentor에서 oat spelt xylan, 펩톤, 효모추출액, 질산나트륨, 이인산칼륨, 황산마그네슘의 농도를 각각 10, 2, 1, 3, 1, 0.5 g/l로 하고 교반속도 250 rpm, 통기량 1.2 vvm, ph 5에서 배양온도를 27 o C로 했을 때 최대 생산 및 활성을 나타내었다 (6,530 U/mg-protein). 최적 조건에서의 배양 시간 별 xylanase의 활성 변화는 Fig. 1B와 같다. (A) (B) Fig. 1. Activity of xylanase from Fomitopsis rosea. (A) Comparison of xylanase activities from F. rosea and T. reesei as control; (B) activity of F. rosea xylanase after optimization of culture condition. 신규 Xylanase 유전자 클로닝 Xylanase는 xylan을 특이적으로 분해하는 효소로서 폐자원을 분해하는 차원에서 아주 유용 하다. 따라서 xylan 분해능이 뛰어난 균주로부터 xylanase 효소유전자를 클로닝하고 정제하여 그 특성을 규명하고자 하였다. 우선 기존의 유전자 database를 바탕으로 Chaetomium globosum cdna로부터 PCR을 통해 612 bp의 xylanase 유전자를 얻은 후, sequencing 분석을 통하여 기존의 알려진 Chxyn 유전자효소와 그 염기서열이 정확히 일치하는 것을 확인하였다. 그 후 확보된 효소유전자의 발현을 위하여 발현벡터인 pet28a로 옮겨 재조합 xylanase 유전 자를 확보하였다 (Fig. 2a, b). 그리고 재조합 plasmid는 pet28a-chxyn로 명명하였다. (a) (b)

131 Fig. 2. Cloning of xylanase gene from Chaetomium globosum. a. PCR amplification of xylanase from cdna of Chaetomium globosum. b. Subcloning of xylanase into pet28a (Marker: 1 kb ladder) - Neosartorya fischeri로부터 xylanase 유전자의 클로닝 Neosartorya fischeri는 두 개의 xylanase를 보유하고 있는 것으로 알려져 있다. 기존의 유 전자 database를 바탕으로 Neosartorya fischeri의 cdna로부터 PCR을 통해 634 bp와 606 bp의 xylanase 유전자 xyn1, xyn2를 얻은 후 (Fig. 3), sequencing 분석을 통하여 기존의 알려 진 Nfxyn 유전자 효소와 그 염기서열이 정확히 일치하는 것을 확인하였다. (a) (b) Fig. 3. PCR amplification of xylanase from Neosartorya fischeri cdna. a. xyn1, b. xyn2 Xylanase 효소의 발현 및 정제 재조합 Chxyn 유전자의 E. coli 에서의 발현 및 ChXyn 효소의 정제 - Chxyn 유전자는 204개의 아미노산으로 구성되어 있으며 계산된 분자량은 약 21.9 kda임. pet28a-chgxyn를 E. coli BL21 codon+에 형질 전환시킨 후 재조합균주를 발현시켜 그 발현 정도를 알아보았다. 발현 결과 예상 크기의 단백질인 약 22.5 kda 단백질을 soluble fraction에 서 확인할 수 있었다 (Fig. 4a). Chxyn 단백질이 soluble form임을 확인한 후 효소 특성을 규 명하기 위하여 soluble form의 발현된 효소로부터 pet28a의 정제 시스템인 His-tag을 이용한 Ni-NTA chromatography를 수행하여 순수 Chxyn 효소를 회수하였다 (Fig. 4b)

132 (a) (b) Fig. 4. (a) Determination of subunit molecular mass pet28a-chgxyn by SDS-PAGE. Lane M, molecular standard marker; 1, soluble fraction of vector control(pet28a); 2, insoluble fraction of vector control; 3, soluble fraction of pet28a-chgxyn; 4, insoluble fraction of pet28a-chgxyn. (b) Purification of Chxyn by Ni-NTA affinity column chromatography. Lane M, molecular standard marker; 1,crude fraction of pet28a-chxyn; 2-6, elution fraction; 7-9, washing fraction. 재조합 xylanase의 특성 규명 Chxyn의 최적 온도 및 ph - 정제된 Chxyn로부터 xylose 분해의 최적 ph를 알아보는 실험 결과 ph 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0에서 최대 활성이 각각 40, 58, 80, 98, 96, 40, 20%로 나타났으며, ph 5.5에서 최대 활성을 나타냄을 확인하였다 (Fig. 5a). 또한 최적 온도는 40 o C로 확인되었다 (Fig. 5b). Chxyn의 기질특이성 - Chxyn의 기질특이성을 알아보기 위해 다양한 기질로 Oat spelt xylan, Birch wood xylan, rice straw, sugarcane bagasse, avicel, cellulose, carboxymethyl cellulose, PNPG, PNPX (1%)를 사용하였다. Chxyn은 Birch wood xylan, rice straw, avicel에 대하여 각각 52.8, 24.3, 21.6%의 활성을 보였으며, Oat spelt xylan에 대하여 가장 높은 활성을 보였음. 그리고 나머지 기질에 대 하여는 거의 활성이 나타나지 않았다 (Table 2)

133 (a) (b) Fig. 5. Effect of ph (a) and temperature (b) on the activity of Chxyn. Assays were carried out under standard conditions in the presence of 1% oat spelt xylan. Activities at the optimal temperature and ph were defined as 100%. Each value represents the mean of triplicate measurements and varied from the mean by not more than 10%. 20 mm Sodium acetate buffer (ph ), 20 mm potassium phosphate buffer (ph ), 20 mm Tris-HCl buffer (ph ). Table 2. Relative activities of purified xylanase towards different substrates. Substrate (1%, W /V) Relative activity (%) Oat Spelt Xylan 100 Birch wood Xylan 52.8 Rice Straw 24.3 Sugarcane baggase 2.63 Avicel 21.6 Cellulose ND Carboxylmethyl cellulose ND PNPG ND PNPX ND Chaetomium globosum xylanase (Chxyn) 구조의 분자모델링 Chxyn 효소의 규명 - Chxyn은 이미 알려진 다른 xylanase 효소들과의 아미노산 염기서열의 유사성을 통해 GH11로 추정되었다 (Fig. 6). 본 연구에서는 Chxyn model을 제작하여 기존의 crystal structure가 보고된 효소와 비교함으로써 GH11 효소들에서 공통적으로 보존된 활성잔기 및 활 성잔기 주변의 잔기들이 잘 보존되어 있음을 확인하였다. 주형 crystal structure는 Trichoderma reesei xylanase II이며 비교 결과 Fig. 7에서와 같이 (Glu115, Glu177) 활성 잔기 가 거의 유사한 위치에 존재하며, 그 주변의 잔기들 또한 상당히 잘 보존되어있음을 확인함으 로써 Chxyn은 GH11임을 검증하였다

134 Fig. 6. Xylanase sequence from Chaetomium globosum, showing 55% sequence identity with Xylanase II of Trichoderma reesei. Fig. 7. Superimposed image of xylanase from C. globosum (Chxyn) on the template of xylanase II from Trichoderma reesei. Cellulase 활성이 우수한 곰팡이 균주를 선별 (총 950 종 스크리닝) - 스크리닝 결과 Agaricus arvensis, Trametes hirsuta, Penicillium pinophilum 등의 균주 가 우수한 활성을 나타내었다. Table 3. 고활성 cellulase 생산 균주의 스크리닝 BGL (mmol/min/mg-protein) EG (mmol/min/mg-protein) CBH (mmol/min/mg-protein) Agaricus arvensis 6.94 Agaricusarvensis 1.06 Agaricus arvensis 2.33 Trametes hirsuta 3.86 Cantharellus cibarius 3.01 Trametes hirsuta 0.65 Penicillium purpurogenum 3.32 Grifola frondosa 1.94 Phellimus pini 0.61 Nectria cinnabaria 3.24 Sparasis crispa wulf. Ex.Fr 1.82 H yphodanatia sambuci 0.57 Fistulina hepatica 3.21 H yphodanatia sambuci 1.73 Grifola frondosa 0.43 Grifola frondosa 2.91 Trametes hirsuta 1.19 Fomitopsis rosea 0.41 Penicillium pinophilum bgl (Ppibgl) 유전자의 효모에서의 발현

135 - Cellulase 분해능이 우수한 균주인 Penicillium pinophilum cdna로부터 알려지지 않은 beta-glucosidase(bgl)를 degenerate PCR 및 genome walking PCR로 증폭한 후 T-vector 클 로닝하여 sequencing을 수행하였다. 그 결과 2.5 kb의 orf를 얻었으며, 이 유전자는 glycosyl hydrolase family 3로 밝혀졌다. 유전자의 특성 규명을 위하여 yeast 발현벡터인 ppicza로 클 로닝 함. 클로닝 된 재조합 유전자는 적절한 제한효소의 절단에 의해 PCR에 의해 얻어진 2.5 kb의 bgl 유전자임을 확인하였다 (Fig. 8). Fig. 8. Confirmation of ppicza-ppibgl clone by enzyme digestion. lane M, 1 kb ladder marker; 1, after digestion sample with Xho1-Xba1. 재조합 Ppibgl 효소의 활성 측정 - 재조합 Ppibgl 유전자를 yeast 균주 P. pastoris에서 발현시켰으며, 발현유도제로는 0.5% methanol을 이용하였다. 발현 후 72, 96, 120시간 별로 그 활성을 측정하였으며, 활성은 각각 2.9, 3.8, 4.0 U/mg으로 120시간에 최대 활성을 나타내었다 (Table 4). Table 4. BGL activity of recombinant Ppibgl in P. pastoris Time (h) BGL activity (U/ml) BGL specific activity (U/mg) Ppibgl의 구조 분석 - Ppibgl은 이미 알려진 다른 glycosyl hydrolase family 3 (GH3) 효소들과의 아미노산 염기 서열의 유사성을 통해 GH3로 동정되었다 (Fig. 9). 본 연구에서는 Ppibgl model을 제작하여 crystal structure가 기존에 보고된 효소와 비교함으로써 GH3 효소들에서 공통적으로 보존된 활성잔기 및 활성잔기 주변의 잔기들이 잘 보존되어있음을 확인하였다. 주형 crystal structure 는 식물체인 BARLEY의 β-d-glucan- hydrolase isoenzyme exo1이며 비교 결과 Fig. 10a 에 서와 같이 세 개의 (Glu155, Asp273, Glu201) 활성 잔기가 거의 유사한 위치에 존재하며, 그 주변의 잔기들 또한 상당히 잘 보존되어있음으로써 Ppibgl은 GH3임을 확인하였다 (Fig. 10b)

136 Fig. 9. β-glucosidase sequence from Penicillium pinophilum, showing 36% sequence identity with β-d-glucanhydrolase isoenzyme exo1 of barley. Fig. 10. Comparison of the homology model of Ppibgl and structure of beta-d-glucan hydrolase isoenzyme exo1 from barley. (a) Well conserved three catalytic residues, (b) Conserved residues around the catalytic amino acids, green-ppibgl and orange-exo1. 고활성 신규 cellulase 유전자 Ppieg12 클로닝 - Cellulase 분해능이 우수한 균주인 Penicillium pinophilum genomic DNA로부터 Tail-PCR (Fig. 11)을 이용하여 glycoside hydrolase family 12의 알려지지 않은 신규 endo-glucanase (eg) 유전자 염기서열의 일부인 572 bp를 얻었다 (Fig. 12). 얻어진 염기서열은 기존의 알려진 P. marneffei ATCC endoglucanase와 95% 유사성을 지닌 것으로 확인되었다. Fig. 11. Schematic representation of specific primers designed for TAIL-PCR

137 Fig. 12. Partial sequence of P. pinophilium eg12 고활성 신규 cellulase 유전자 Ppieg5의 클로닝 - Cellulase 분해능이 우수한 균주인 Penicillium pinophilum genomic DNA로부터 genome walking PCR을 이용하여 1,227 bp의 GH5의 endo-glucanase (eg) 유전자 orf를 밝혔 으며, 상위 염기서열을 분석한 결과 기존의 밝혀진 GH5 eg 유전자들에서 공통적으로 존재하 는 regulatory region인 CBM, linker region, catalytic domain 등이 Ppieg5에도 매우 잘 보존되 어 있음을 확인하였다 (Fig. 13). Fig. 13. Organization of Ppieg5 - 신규 Ppieg5 효소의 E. coli 에서의 발현: 앞서 밝혀진 Ppieg5의 catalytic domain (EGCD) 과 1,227 bp의 orf를 E. coli 발현벡터 pet15b에 옮겨 재조합 플라스미드 pet15b-ppieg5를 제작하였다. 이는 발현균주인 E. coli Rosetta origami 균주로 형질전환시켜 단백질 발현을 시 도하였다. 형질전환된 Ppieg5 유전자를 0.5 mm IPTG에 의해 30 o C에서 발현 유도한 결과 예 상했던 Ppieg5 효소의 크기인 26 kda에서 밴드가 확인되었으며 30% 정도가 soluble form 임 을 확인하엿다 (Fig. 14). Fig. 14. SDS-PAGE analysis of transformants carrying pet15b-eg

138 Lane M, marker; 30CIS, insoluble fraction of pet15b only; 30CS, soluble fraction of pet15b only; 30TIS, insoluble fraction of pet15b-ppieg5; 30TS, soluble fraction of pet15b-ppieg5. 고활성 Stereum hirsutum 균주를 이용한 BGL의 대량생산 - S. hirsutum로부터 7 L 발효기를 이용하여 최적 조건을 잡은 결과 ph 6.0, 30 o C, 600 rpm 에서 1% tryptone, 2% avicel, 20 mg/l myo-inositol의 배지를 사용했을 때 7 L 발효기에서 BGL 효소활성이 24 U/mg으로 최대임을 확인하였다. S. hirsutum으로부터 고활성 BGL의 정제 - 7 L jar fermentor를 이용하여 BGL 활성이 24.6 U/mg으로 증가된 것을 확인한 후 10 kda Cut-off viva spin을 이용하여 농축하였으며, gel filtration chromatography를 통하여 정제하였 다. 그 결과 fraction 30-33에서 강한 signal을 보였으며 fraction에 대한 각각의 활성을 체크한 결과 30 fraction에서 가장 높은 BGL 활성을 보였다 (Fig. 15). 그리고 활성은 10 kda cut-off으로 농축된 단백질 보다 170배 증가하였으며, crude 효소보다 208배 증가하였다 (Table 5). Fig. 15. Purification of S. hirsutum BGL by gel filtration chromatography

139 Table 5. Purification of BGL from the culture broth of S. hirsutum Total protein(mg) Total activity(u) Specific activity(u/mg) Purification fold Recovery (%) Culture filtrate MWCO 10 kda Gel filtration Chromatography 정제된 ShBGL의 분자량 - Sephacryl S-300 high resolution column (Amersham, UK)을 이용한 gel filtration chromatography를 통해 native 분자량이 784 kda임을 확인하엿다 (Fig. 16a). 또한 SDS-PAGE 상에서 그 예상 크기의 protein 밴드를 확인하였다 (Fig. 16b). 또한 SDS-PAGE 결과 하나의 subunit이 98 kda이므로 용액 내에서 octamer로서 존재함을 알 수 있었다. (a) (b) Fig. 16. Determination of the molecular mass of S. hirsutum BGL by SDS-PAGE and gel filtration chromatography. (a) Determination of native molecular mass of ShBGL by gel filtration chromatography on a sephacryl S-300 high resolution column from Amersham. (b) Determination of subunit molecular mass by SDS-PAGE. Lane 1, molecular standard marker; 2, purified ShBGL. ShBGL의 최적 온도 및 ph - 정제된 ShBGL의 cellulose 분해의 최적 ph를 알아보는 실험결과 ph 4.5에서 최대 활성을 나타내었고, ph 4.0, 5.0에서 최대 활성의 81, 88%를 나타냄을 확인하였으며 (Fig. 17a), 최적 온도는 65 o C로 확인되었다 (Fig. 17b). (a) (b)

140 Fig. 17. Effect of ph (a) and temperature (b) on the activity of ShBGL Assays were carried out under standard conditions in the presence of 10 mm pnpg. Activities at the optimal temperature and ph were defined as 100%. Each value represents the mean of triplicate measurements and varied the mean by not more than 10%. 20 mm Sodium acetate buffer ( ), 20 mm potassium phosphate buffer ( ), 20 mm Tris-HCl buffer ( ). ShBGL의 금속이온 효과 - 금속 이온과 다양한 화합물의 존재 하에 ShBGL의 활성도를 조사하였다. 결과적으로 대부 분의 금속 이온이 ShBGL 활성에 큰 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. Hg 2+ (5 mm, 10 mm)의 존재 하에서는 상당한 활성 저해가 일어났다 (Table 6). Table 6. Effect of different metal ions on the activity of ShBGL Reagents Relative activity (%) at final conc' n of 5 mm 10 mm Tween 20 (1 and 2%) N-ethylmaleimide L-cysteine b-mercaptoethanol EDTA ZnCl FeCl HgCl MnCl CaCl CoCl MgSO CuSO None 정제된 ShBGL의 동역학 매개변수 측정 - ph 4.5, standard assay condition에서 ShBGL은 hyperbolic saturation curves를 나타내었 고, double-reciprocal plot에서는 선형을 나타내었다. 기질 pnpg 농도는 1에서 50 mm까지 측 정하였고, cellobiose 농도는 1에서 250 mm까지 측정하였다. Fig. 18에서와 같이

141 Michaelis-Menten 식을 이용하여 pnpg와 cellobiose에 대한 ShBGL의 Km이 각각 2.5, 86 mm이고 kcat은 각각 4925, 286 s -1, 그리고 Vmax는 각각 2,955, 172 U/mg-protein으로 확인되 었다. (a) (b) Fig. 18. Effect of substrate concentration on the activity of ShBGL toward pnpg (a) and cellobiose (b). N eosartoya fischeri로부터 BGL 유전자의 클로닝 - BGL은 cellulose 분해과정에서 최종산물로 glucose를 생산하는 효소이다. 기존의 유전자 database를 바탕으로 Neosartoya fischeri cdna로부터 PCR을 통해 1,467 bp의 BGL 유전자를 얻은 후, sequencing 분석을 통하여 기존의 알려진 Nf-bgl 유전자와 그 염기서열이 정확히 일 치하는 것을 확인하였다. 그 후 확보된 효소유전자의 발현을 위하여 발현벡터인 pet28a로 옮겨 재조합 plasmid pet28a-nfbgl를 제작하였다 (Fig. 19). Fig. 19. Cloning of pet28a-bgl from Neosartorya fischeri. 재조합 NfBGL 효소의 발현 및 정제 - NfBGL 유전자는 488개의 아미노산으로 구성되어있으며 분자량은 약 56 kda 이다. pet28a-nfbgl을 E. coli BL21 codon+에 형질 전환시킨 후 재조합균주를 발현시켜 그 발현 정도를 알아보았다. 발현 결과 예상크기의 단백질인 약 56 kda의 단백질을 soluble fraction에 서 확인할 수 있었다. NfBGL 단백질이 soluble form임을 확인한 후 특성을 규명하기 위하여 soluble form의 발현된 효소로부터 His-tag을 이용하여 순수 NfBGL 효소를 정제하였다 (Fig

142 20). Fig. 20. Purification of NfBGL by Ni-NTA affinity chromatography. Lane M, molecular standard marker; 1, soluble fraction of pet28a; 2, soluble fraction of NfBGL; 3, purified NfBGL fraction. 재조합 NfBGL의 생화학적 특성 규명 - NfBGL의 온도 및 ph 최적화 정제된 NfBGL로부터 pnpg 분해의 최적 ph를 조사한 결과 ph 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0 에서 최대 활성이 각각 2, 12, 79, 100, 48, 37, 그리고 2%로 ph 6에서 최대 활성이 나타남을 확인하였다 (Fig. 21a). 또한 최적 온도는 40 o C로 확인되었다 (Fig. 21b). Fig. 21. a) Effect of ph on NfBGL activity. b) Effect of temperature on NfBGL activity towards pnpg (10 mm). The purified enzyme exhibited ph and temperature optima at 6.0 and 40 C, respectively. Activities at the optimal temperature and ph were defined as 100%. Each value represents the mean of triplicate measurements and varied from the mean by not more than 10%. 100 mm Sodium acetate buffer (ph ), 100 mm potassium phosphate buffer (ph ), 100 mm Tris-HCl buffer (ph ). NfBGL의 기질 특이성 - NfBGL의 기질특이성을 알아보기 위한 실험에서 다양한 기질로, p-nitrophenyl-β -D-glucopyranoside (pnpg), pnp-β-galactopyranoside (pnpgal), pnp-β-cello- bioside (pnpc), cellobiose, cellotriose, cellotetraose 그리고 cellopentaose를 각각 10 mm씩 사용하였 다. NfBGL은 pnpg, pnpgal, pnpc, 그리고 cellobiose에 대하여 각각 100%, 1.55%, 0.28% 그 리고 0.01%의 활성을 보였으며, pnpg에 대하여 가장 높은 활성을 보였다 (Table 7)

143 Table 7. Substrate specificity of the recombinant NfBGL1 Substrate (10 mm) Enzyme activity Relative activity (Umg-protein -1 ) (%) pnp-β-d-glucopyranoside pnp-β-galactopyranoside pnp-β-cellobioside Cellobiose Cellotriose ND ND Cellotetraose ND ND Cellopentaose ND ND The recombinant enzyme was assayed in the standard assay condition with various compounds. Each value represents the mean of triplicate measurements and varies from the mean by not more than 10%. ND, not detected. 재조합 NfBGL의 금속이온의 효과 - 금속이온과 다양한 화합물의 존재 하에 NfBGL의 활성도를 조사하였다. 여러 금속이온이 NfBGL 활성에 큰 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 하지만 Hg 2+ (0.1 mm과 0.5 mm)의 존 재 하에서는 30% 및 90%의 활성 저해가 일어났다. 재조합 NfBGL의 kinetic constants 측정 - 초기 속도상수는 ph 6.0에서 standard assay 조건 하에서 결정되었다. NfBGL은 hyperbolic saturation curves를 나타내었고, double-reciprocal plot에서는 선형을 나타내고 있다. 기질 pnpg에 대한 NfBGL의 농도는 5에서 400 mm까지 측정하였고, Fig. 21에서와 같이 Michaelis-Menten 식을 이용하여 pnpg에 대한 NfBGL의 Km과 kcat 각각 68 mm 과 49,616 min -1, Vmax는 886 U/mg-protein으로 확인되었다 (Fig. 22). Fig. 22. Effect of substrate concentration on the activity of NfBGL. Hydrolysis activity of the enzyme was measured in the presence of indicated concentration of substrate at ph 6. The data represent an average of all statistically relevant data with a standard deviation of less 10%. NfBGL 특성 규명

144 - NfBGL은 이미 알려진 다른 GH 효소들과의 아미노산 염기서열의 유사성을 통해 GH3로 동정되었다 (Fig. 23). 본 연구에서는 NfBGL model을 제작하여 기존에 보고된 효소의 crystal structure와 비교함으로써 GH1 효소들에서 공통적으로 보존된 활성잔기 및 활성잔기 주변의 잔기들이 잘 보존되어 있음을 확인하였다. 주형 crystal structure는 P. chrysosporium의 BGLA이며 비교 결과 Fig. 24에서와 같이 두 개의 (Glu177, Glu388) 활성 잔기가 거의 유사한 위치에 존재하며, 그 주변의 잔기들 또한 잘 보존되어 NfBGL은 GH1임을 확인였다 (Fig. 24). Fig. 23. Sequence alignment of NfBGL with other BGLs using accessory discovery studio client 2.5 program. The accession numbers are: AAL34084 (T. emersonii), AAF74209 (A. niger), and BAE87008(P. chrysosporium). GH1 catalytic conserved motifs are shown in box. Fig. 24. Superimposition of the proposed catalytic residues of PcBGLA (Blue) and N. fischeri BGL (Orange), showing the similar arrangement and orientation of active site residues. NfBGL 모델을 통한 기질특이성 규명 - 앞선 실험결과에 따르면 NfBGL은 pnpg에 대한 활성이 우수한 aryl-bgl로 확인되었으며, 기질특이성을 pnpg와 cellobiose를 docking 시킨 model을 통하여 활성잔기와 기질 사이의 상

145 호작용 차이점을 비교해 보았다. 그 결과 pnpg를 docking 시켰을 때 두 개의 활성잔기 (E177, E388)가 기질의 C2와 각각 3.7Å, 3.0Å의 수소결합을 형성하는 것을 확인하였으며 (Fig. 25a), cellobiose의 경우 두 활성 잔기 모두 기질의 C2로부터 각각 8.4Å, 4.8Å로 멀리 떨어져 있으며 수소 결합 또한 형성하지 않음을 확인하였다 (Fig. 25b). Fig. 25. Molecular modeling of NfBGL with pnpg or cellobiose in the active site pocket. a. pnpg docking into the active site of N. fischeri BGL. pnpg was bound into the active site through H-bonds (green dotted lines) with E177 (3.7Å) and E388 (3.0Å). b. Cellobiose docking into the active site of N. fischeri BGL. Distances of 8.4Å and 4.8Å have been observed between C2 of cellobiose and oxygen in carboxyl groups of E177 and E388, respectively. 분자모델링 및 Rational design NfBGL의 분자모델링 - NfBGL은 기존에 알려진 다른 GH 효소들과의 아미노산 서열 유사성을 통해 GH1으로 추 정되었다 (Fig. 26). 결정 구조가 알려진 P. chrysosporium BGL을 template로 하여 NfBGL 구 조를 분자모델링하여 분석하였으며 P. chrysosporium BGL과 NfBGL의 identity는 43%이었다 (Fig. 26). Template로 사용한 P. chrysosporium BGL과 잘 superimpose 됨을 확인하였다. 즉, GH1 효소들에서 공통적으로 보존된 활성잔기 및 활성잔기 주변의 잔기들이 잘 보존되어있음 을 확인하였다. 주형 crystal structure는 P. chrysosporium의 BGLA이며 비교 결과 Fig. 27에 서와 같이 두 개의 (Glu177, Glu388) 활성 잔기가 거의 유사한 위치에 존재하며, 그 주변의 잔 기들 또한 잘 보존되어 NfBGL은 GH1임을 확인였다 (Fig. 27)

146 Fig. 26. Sequence alignment between NfBGL and its template structure P. chrysosporium BGL. Secondary structure cartoon shown is based on Kabsch and Sander method. Residues in red background are conserved active site residues. Residues in black background are identical residues. Residues in gray background are similar and white background are weak similar or non similar. Fig. 27. Superimposed Homology Model (gray color) of NfBGL on its template P. chrysosporium BGL (blue color). Based C-alpha atoms, RMSD was calculated between target and template structure and found to be 1.01Å. PROMOTIF analysis suggested that modeled structure contains 20 strands, and 12 alpha helices. - BGL model의 Ramachandran' s plot을 통하여 BGL 분자 모델링 구조의 타당성을 계산하였 을 때, 99.3% 잔기가 일치됨을 보였다 (Fig. 28). Profile-3D score를 계산하였을 때, NfBGL과 template로 사용한 P. chrysosporium BGL 구조 사이의 수치는 , 을 보였다. Fig. 28. Ramachnadran' s plot calculation was computed with PROCHECK program. Altogether 99.3% residues were in favored and allowed region. - NfBGL의 binding/active site 잔기를 확인하기 위해서 이미 결정 구조가 밝혀진 P. chrysosporium BGL의 binding/active 잔기와 비교하였을 때, binding/active residue가 conserved 됨을 확인하였다 (Fig. 29)

147 Fig. 29. Prediction of binding site was carried out using binding site analysis module of DS3.1, which suggest that there are several binding/active site present in model structure. Upon comparison with template it was observed that site 1 (green color) highly conserved in nature. Since both NfBGL model and template P. chrysosporium BGL share reasonable identical sequence and structural trait, it is assumed that their biological function should be similar. NfBGL의 활성 결정인자 탐색: Y320 - BGL 활성 부위 내에 docking된 기질과 4.5A 이내에 존재하는 11개 잔기들을 선정하고 이 들에 대한 alanine scanning을 수행하였다 (Fig. 30A). 각 alanine mutant를 발현시킨 결과 wild-type NfBGL과 유사한 발현 수준을 보였으며, Ni-resin을 통해 순수 정제하였다 (Fig. 30B). - Site-directed mutagenesis를 통해 활성에 큰 영향을 끼치는 잔기로서 Y320 및 E445 잔기 를 결정하였다 (Fig. 30). 각 잔기의 돌연변이 제작, 발현 및 정제한 후 kinetics 실험 결과 Table 8과 같이 320번 잔기의 방향족 환이 사라지고 크기가 감소할수록 기질에 대한 효소의 활성이 wild-type이 비해 크게 감소하였으며 (Y320A의 V max : 20 U mg-protein -1 ), 분자모델링 을 통하여 방향족 Tyr이 작은 Ser 혹은 Ala로 치환 시 효소 반응에 현저히 불리한 상태에 놓 임을 입증할 수 있었다. (A) (B) Fig. 30. Substrate binding pocket of NfBGL. pnpg was docked into substrate binding pocket of modelled NfBGL (A). All 11 residues were mutated into alanine and the mutants were expressed and purified (B)

148 Table 8. Kinetic parameters determined for the NfBGL1 wild-type and mutants. Enzyme V max K m k cat (μmol min -1 mg-protein -1 ) (mm) (s -1 ) WT 886 ± ± ± 57 E177A ND ND ND E388A ND ND ND H130A 213 ± ± ± 13 N176A 328 ± ± ± 17 Y320A 20 ± ± ± 2 W361A 659 ± ± ± 30 W438A 399 ± ± ± 22 E445A 625 ± ± ± 34 W446A 756 ± ± ± 41 F454A 310 ± ± ± 22 Kinetic parameters of BGLs were shown for pnpg. ND, not determined due to the very low activity of the enzyme. NfBGL 모델을 통한 기질특이성 규명 - 앞선 실험결과에 따르면 NfBGL은 pnpg에 대한 활성이 우수한 aryl-bgl로 확인되었으며, 기질특이성을 pnpg와 cellobiose를 docking 시킨 model을 통하여 활성잔기와 기질 사이의 상 호작용 차이점을 비교해 보았다. 그 결과 pnpg를 docking 시켰을 때 두 개의 활성잔기 (E177, E388)가 기질의 C2와 각각 3.3Å, 3.4Å과 3.3Å의 수소결합을 형성하는 것을 확인하였다 (Fig. 31A). 또한 Y320은 기질과 수소결합 및 π-sigma interaction을 하는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 Y320 잔기 또한 활성에 중요한 잔기라고 사료된다. Y320A mutant에서는 기질과 잔기 사이에 수소결합이나 π-sigma interaction을 하는 것을 관찰할 수 없었다. 그 이유는 기질의 C2 위치와 E177, E388사이에 거리가 멀어지기 때문이다 (Fig. 31D). Y320F, Y320W mutant에 서는 k cat 값은 야생균주와 같은 활성을 보였고 또한 기질과 E177과 E388 잔기 사이에 수소결합 및 π-sigma interaction을 하는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig. 31B). 동시에 E338 잔기의 carbonylate 그룹이 기질의 C1위치를 친핵성 공격을 할 수 있도록 위치한다. Y320 잔기를 Lys 이나 Glu 같은 극성 전하를 띤 잔기로 대체하였을 경우는 기질의 C2 위치와 E177, E388 잔기 사이에 수소결합이 끊어짐을 확인할 수 있었다. 즉, NfBGL의 320번째 잔기는 aromatic 잔기여 야 하고, 이 잔기는 기질과 수소결합 또는 π-sigma interaction을 하는데 중요한 역할을 한다. 이 결과로 불안정한 oxocarbenium ion의 전이 상태를 안정화시키고 Glu388 잔기의 carbonylate 그룹이 친핵성 공격을 할 수 있는 위치에 놓이게 한다. 이상과 같은 결과를 통해 NfBGL의 기작을 Fig. 32과 같이 예상할 수 있었다. (A) (B)

149 (C) (D) Fig. 31. Homology model of the NfBGL active site with bound pnpg substrate. pnpg was docked into the substrate binding pocket of wild-type NfBGL (A), Y320F (B), Y320V (C), and Y320A mutant (D). Y320 mutant lost hydrogen bonding and pi interactions between the substrate and the residue at 320 position. Fig. 32. A suggested mechanism for the NfBGL along with the role of Tyr320 in the stabilization of enzyme-substrate complex. Dotted line: H-bonding, solid line: pi-sigma interaction. NfBGL의 ITC를 이용한 열역학적 상수 분석 - 효소와 기질이 강력하게 결합할 때에는 결합자유에너지(ΔG)가 작게 나타난다. Wild-type NfBGL, Y320F, Y320V, Y320A의 ΔG 값은 kcal mol -1, kcal mol -1, -6.9 kcal mol -1, -5.4 kcal mol -1 이었다 (Table 9). ΔG 값은 wild-type에서 mutant 보다 훨씬 낮게 나왔 다. Y320F에서는 ΔG 값이 wild-type에 비해 매우 낮게 변한 것을 확인하였다. 이는 pnpg의 pyranose ring과 320번째 잔기 사이의 결합이 깨지면서 발생한 것으로 사료된다. 따라서 Y320 잔기는 mutant의 ΔG 값에 많은 영향을 미치는 것을 알 수 있었으며, Y320F의 mutant로 Tyr 잔기의 기능을 증명할 수 있었다. 또한 wild-type과 mutant에서 ITC를 통하여 열역학적 상수 (평형상수와 해리상수 등)를 계산하였다. Wild-type은 mutant에서 보다 낮은 K d 값( μ M)이 얻어졌고, K d 값이 mutant에서 높은 것은 이 잔기가 기질 결합 및 활성에 많은 영향을 미치는 것을 보여주는 결과이다 (Table 9). 따라서 aromatic 잔기인 Tyr320는 효소와 기질사이 에 수소결합과 π-sigma interaction을 하면서 효소-기질 복합체의 안정성에 기여함을 확인하였 다

150 Table 9. Thermodynamic parameters determined by ITC for wild-type NfBGL and Y320 mutants Enzyme -TΔS ΔH Log K K d (μm) ΔG b Δ(ΔG b ) Wild-type Y320F Y320V Y320A All energy parameters are represented in kcal mol -1. ΔG b free energy of binding. Log K, K d and ΔG b calculated using the mathematical relation. ΔG b =- RT ln K, where K is the equilibrium constant, R is the ideal gas constant, and T is the temperature in kelvin. Δ(ΔG b ) = ΔG b (mutant) - ΔG b (WT). NfBGL의 활성 결정인자 탐색: E445 - Alanine scanning을 수행한 결과 E445A mutant의 경우 K m 값이 27배 증가하는 것을 발견 하였다. 따라서 E445 잔기는 활성에 큰 영향을 끼치는 것으로 사료됨. 또한 Glu 잔기를 acdic 잔기인 Asp 잔기로 대체하였을 경우 다른 mutant에 비해 k m 값이 현저하게 낮으며, 야 생형과 비슷한 k m 값을 갖는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 E445 잔기는 기질과의 결합에 관련 된 잔기이고, acidic 잔기일 때 결합력이 증가하는 것으로 사료된다 (Table 10). - 기질특이성을 알아보기 위하여 pnpg를 docking 시킨 model을 통하여 활성잔기와 기질 사 이의 상호작용 차이점을 비교해 보았다. 그 결과 pnpg를 docking 시켰을 때 활성잔기인 E445 의 carboxyl 그룹의 산소와 pnpg의 C4의 수산화기가 2.7Å의 수소결합을 형성하는 것을 확인 하였다 (Fig. 33A). 따라서 E445잔기는 기질 결합을 통해 활성에 중요한 역할을 하는 잔기라고 사료되었다. E445A mutant에서는 기질과 잔기 사이에 수소결합을 하는 것을 관찰할 수 없었 다 (Fig. 33B). E445D mutant에서는 acidic 잔기인 Asp과 기질사이에 수소 결합이 형성되는 것을 관찰할 수 있었으며, 445번 잔기는 acidic한 잔기일 경우 기질과 정상적인 결합을 하여 활 성을 가질 수 있음을 확인였다

151 Table 10 Kinetic parameters determined for wild-type NfBGL1 and E445 mutants a Enzyme V max (U/mg-protein) K m (mm) k cat b (min -1 ) k cat/ K m (min -1 mm -1 ) Δ(ΔG) c (kj mol -1 ) Wild-type , E445A 625 1,449 35, E445D , E445L 689 1,034 38, E445V , E445S , E445R 893 1,745 50, E445Q , E445W 961 1,525 53, a The V max, K m, and k cat values presented are the mean of triplicate measurements and varied from the mean by no more than 15%. b The k cat values were calculated by considering the enzyme to be a monomeric form. Values are means_standard deviations of results from three experiments. c Δ(ΔG) = -RT ln[(k cat /K m )mut/(k cat /K m )wt], where (k cat /K m )mut and (k cat /K m )wt are the k cat /K m ratios for the mutant and the wild-type, respectively, R is the ideal gas constant, and T is the temperature. d ND, not determined due to the very low activity of the enzyme. (A) (B) Fig. 33. Homology model of NfBGL s active site with bound pnpg substrate. pnpg was docked into the substrate binding pocket of wild-type NfBGL (A) and E445A mutant (B). The hydrogen bonding between residue E445 and the substrate is visible. NfBGL의 ITC를 이용한 열역학적 상수 분석 - Wild-type NfBGL1, E445D, E445A의 ΔG b 값은 kcal mol -1, kcal mol -1, -8.2 kcal mol -1 으로서 (Table 11), E445 잔기는 단백질의 안정성, 즉 ΔG b 값에 많은 영향을 끼치 는 것을 알 수 있었다. 또한 E445D mutant의 경우 ΔG b 값이 wild-type 값과 유사함으로써, 445번 위치에서 acidic 잔기가 필요함을 확인하였다. 따라서 E445 잔기는 기질과의 결합에 중 요한 역할을 하고, acidic한 잔기일 때 기질과 올바른 결합을 함으로써 활성에 긍정적인 영향을 미침을 알 수 있었다. 또한 기존에 알려진 다른 GH 효소들의 아미노산 서열 유사성을 통해 E445 잔기가 잘 보존되어 있음으로써, 이 잔기는 GH family 효소들의 기질 결합 및 활성에 중 요한 잔기임이 증명되었다 (Fig. 34)

152 Table 11. Thermodynamic parameters determined for wild-type NfBGL1 and E445 mutants Enzyme -TΔS ΔH Log K K d (μm) ΔG b Δ(ΔG b ) Wild-type E445D E445A All energy parameters are represented in kcal/mol. ΔG b free energy of binding. Log K, K d and ΔG b are calculated using the mathematical relation. ΔG b =- RT ln K, where K is the equilibrium constant, R is the ideal gas constant, and T is the temperature in kelvin. Δ(ΔG b ) = ΔG b (mutant) - ΔG b (WT). Fig. 34. Sequence alignment of 57 GHs with common homology to NfBGL1. Note: Only partial sequences of these proteins are shown. The fully conserved E445 is shaded cyan. 정량적 in silico 스크리닝 시스템 확립 - Quantum-Mechanics/Molecular-Mechanics (QM/MM) calculation을 통해 wild- type 및 mutant 등 서로 다른 단백질의 conformation을 비교하고 다양한 에너지 상수를 구할 수 있었 다. 본 과제에서는 MM을 위해 Discovery Studio 3.1, QM을 위해서는 Material Studio 5.0을 사용하여 in silico 스크리닝 시스템의 핵심인 모든 mutant 효소 반응의 해리상수 (K d ) 및 free energy of activation 값 ( G + )을 확보하고, 이에 근거한 정량적 in silico 스크리닝 시스템을 도입하고자 하였다 (Fig. 35)

153 Fig. 35. QM/MM 기법을 이용한 K d 및 G + based in silico screening 시스템. - K d, G + 계산을 위한 Material Studio는 무기화학 혹은 재료 분야에서 주로 사용되며, 효소 분야에서는, 특히 이와 같은 스크리닝 목적으로는 사용이 보고되지 않고 있다. 따라서 K d, G + 에 근거한 정량적 in silico screening 시스템의 개발 및 도입은 그 자체로도 단백질공학 분 야에서 큰 의미를 가진다. - 당해년도에는 본 in silico 스크리닝 시스템의 신뢰도가 명확히 입증될 때 까지 생물학적 스 크리닝과 병행하였다. 즉, in silico 스크리닝 시스템을 통해 제시된 candidate mutants의 pnpg, cellooligosaccharides 등 다양한 기질에 대한 명확한 catalytic efficiency를 모두 구하여 신뢰도를 비교 분석하였다. Validation을 성공적으로 완료 시, 차후의 스크리닝을 solid-phase 혹은 liquid phase에서 실험적으로 수행하지 않고, QM/MM calculation을 통해 수행하였다. 정량적 in silico 스크리닝 시스템의 목적 mutant - NfBGL wild-type 효소는 pnpg (cellobiose)에 대해 비교적 높은 G + (-12.9 kcal/mol) 값 을 보유하였다. 따라서 wild-type 효소의 aglycon 부위로부터 일정 거리 내에 있는 모든 잔기 (Fig. 36A)의 순차적인 in silico mutagenesis와 G + 값에 따른 스크리닝을 수행할 때, pnpg (cellobiose)에 대한 G + 값이 감소한 mutant를 선별하였다 (Fig. 36B). - 즉, GH에 대해 제안된 기작은 거의 유사하므로 reactant로서 효소의 acid/base 잔기와 pnpg 및 cellobiose의 complex를 일차적으로 제공하고, intermediate로는 S N 2 (또는 S N 1) 반응 의 중간체를, product로는 가수분해 산물과 acid/base잔기의 complex를 제공한 후, QM/MM calculation을 통해 모든 mutant 효소 반응의 rate determining step의 G + 값을 분석였다. 이 를 통해 cello-oligosaccharide에 대한 G + 값이 현저히 감소한 mutant들을 선별하고, 실험적 으로 검증하였다. (A) (B)

154 Fig. 36. Molecular model of NfBGL and the energetic profiles along the reaction coordinate obtained. (A) NfBGL molecular model by Discovery Studio 3.0 showing the residues in the substrate binding pocket. (B) Potential energy surface (PES) corresponding to the BGL mechanism with the wild-type (black dotted line) and with the mutant showing lower G + (blue dotted lines). Reactant-relative free energies calculated at the BLYP/DNP theory level are in kcal/mol. TS1: transition state 1, TS2: transition state 2, INT: intermediate. - Table 12와 같이 다양한 alanine mutant의 에너지 값을 계산한 결과 N318A의 경우 wild-type NfBGL보다 낮은 free energy 및 dissociation constant 값을 나타내었다. N318A mutant의 활성을 실험적으로 검증한 결과 wild-type 보다 2.1배의 고활성을 나타내었다. Table 12. Thermodynamic parameters (kcal/mol) determined for NfBGL wild-type and mutants Enzyme -TΔS ΔH Log K K d (μm) ΔG b Δ(ΔG b ) Wild-type N318A H130A N176A W438A E445A ΔG b (free binding energy) = - RTln K (K, equilibrium constant; R, ideal gas constant; T, temp.) Laccase 분리 정제 및 당화저해 물질 페놀화합물 분해 Laccase 활성이 우수한 균주의 스크리닝 - 다양한 균주로부터 lignin 분해능이 뛰어난 균주를 기질인 2,2-azino-bis 3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonate (ABTS)를 이용하여 선별하였고, 그를 통하여 28개의 균주를 선 별하였다. 28개 균주 중 laccase를 가장 효율적으로 생산하는 균주를 이차 선별하였다. 균주의 정확한 분류파악을 위해 ITS-5.8S rdna sequencing을 수행하였으며 Yarrowia lipolytica로 동 정하였다. 정제된 Yarrowia lipolytica laccase (YlLac)의 분자량 결정 - Sephacryl S-300 high resolution column (Amersham, UK)을 이용한 gel filtration chromatography를 통해 native 분자량이 67 kda임을 확인하였다 (Fig. 12c). 또한 SDS-PAGE 상에서 그 예상 크기의 밴드를 확인하였으며 (Fig. 37a), active staining에서 해당 기질에 대한 활성 밴드를 확인할 수 있었다 (Fig. 37b). 또한 SDS-PAGE 결과 하나의 subunit이 67 kda, gel filtration chromatography에서는 약 70 kda 정도로서 용액 내에서 monomer로 존재함을 알 수 있었다 (Fig. 37c). 또한, 정제된 YlLac의 타입을 결정하기 위한 UV spectroscopy 실험 에서 610 nm에서 peak가 나타남으로써 YlLac이 전형적인 type 1 laccase임을 확인하였다

155 (Fig. 38). (A) (B) (C) Fig. 37. Determination of molecular mass of purified YlLac by a) SDS-PAGE of laccase (M-Marker, L1-Crude protein, L2-DEAE cellulose purification, L3-Biogel Hiload 16/60 Superdex 200 chromatography), b) Zymogram activity and glycoprotein staining of purified laccase enzyme with native PAGE (L1-ABTS, L2-2,6-DMP, L3-glycoprotein staining). c) Determination of the native molecular mass of YlLac by gel filtration chromatography on a Sephacryl S-300 high-resolution column. Fig. 38. Absorbance spectrum of YlLac (0.5 mg ml 1 in 50 mm sodium acetate buffer, ph 4.8). 정제된 YlLac의 최적 온도, ph 및 열안정성 - 정제된 YlLac으로부터 lignin 분해의 최적 ph를 확인하고자, 기질로 ABTS, 2,6- DMP, tolidine 그리고 guiacol을 사용했으며, 그 결과 각각 ph 3.0, 5.0, 4.0 그리고 4.5에서 최대 활성 을 나타냄을 확인하였고, 최적 온도는 기질 ABTS에 대하여 70 o C로 확인되었다 (Fig. 39). 또 한 온도 안정성 실험 결과 60 o C, 65 o, 70 o C에서 각각 480, 160, 42 min의 half-life를 보였다

156 (Fig. 40). (A) (B) Fig. 39. a) Effect of ph on the activity of purified YlLac towards: ( ) ABTS, ( ) toluidine, ( ) guiacol, ( ) 2, 6-DMP. Reactions were at room temperature for 3 min in citrate/acetate/ phosphate buffer. b) Effect of temperature on the activity of purified YlLac assessed by the standard assay method. Activities are expressed as percentages of maximum activity; error bars do not exceed the dimensions of the symbols. Fig. 40. Thermal stability profiles of the purified YlLac in the presence of 0.1 mm ABTS at 60 C ( ), 65 C ( ) and 70 C ( ). Residual activity was measured at standard conditions. 금속이온의 효과 - 금속 이온과 다양한 화합물의 존재 하에 YlLac의 활성도를 조사하였다. 결과적으로 sodium azide가 YlLac 활성에 가장 큰 영향을 주었으며, 1 mm의 L-cysteine과 dithiothreitol 존재 하 에 상당한 활성 저해가 일어났다 (Table 13)

157 Table 13. Effects of inhibitors on laccase activity Compound Concentration (mm) Relative activity (%) None Sodium azide L-Cysteine ± ± Dithiothreitol ± ± Thiourea ± ± ± 1.5 SDS ± ± ± 2.0 EDTA YlLac의 기질특이성 - YlLac의 기질에 대한 특이성을 알아보기 위해 ABTS, 2,6 DMP, L-DOPA, 3-aminobenzoic acid, phenyldiamine, tolidine, guiacol, veratryl alcohol를 각각 1 mm 농도로 사용하였다. 그 결과 Table 14 과 같은 결과를 얻었으며, YlLac은 ABTS와 2,6 DMP, tolidine에 대하여 높은 활성을 보였다. Table 14. Substrate oxidizing activity of purified laccase from Yarrowia lipolytica Substrate (1 mm) Absorbance Molar extinction coefficient (єmaxm 1 cm 1 ) Relative activity (%) ABTS , ± 1.1 2,6 DMP , ± 1.4 Tolidine , ± 1.7 Guiacol 436 6, ± 3.1 L-DOPA , ± Aminobenzoic acid , ± 2.1 Phenyldiamine , ± 1.0 Veratryl alcohol ND ND: Not Detected 정제된 YlLac의 kinetic constants 측정

158 - 초기 속도상수를 기질 ABTS와 2,6-DMP에 대하여 각각 ph 3.0과 4.0에서 standard assay 를 통해 결정하였다. YlLac은 hyperbolic saturation curves를 나타내었으며, double-reciprocal plot에서는 선형을 나타내었음. 기질 ABTS와 2,6- DMP는 모두 mm의 농도를 사용하였 을 때, ABTS와 2,6-DMP에 대한 YlLac의 K m 이 각각 125.6, mm, k cat 은 각각 2442, 1144 s -1 으로 기존의 보고된 다른 laccase의 활성보다 현저히 높음을 확인하였다. YlLac을 이용한 phenolic compound의 분해 최적화 - Phenolic compound는 당화 저해 인자로 잘 알려져 있다. 따라서 YlLac을 이용하여 당화 저해 인자를 제거함으로써 당화효율을 높이고자 한다. 따라서 YlLac을 이용한 phenolic compound를 효율적으로 분해할 수 있는 최적조건을 찾고자 한다. 따라서 통계적 기법(CCRD) 에 따라 phenolic compound를 볏짚으로부터 제거하는 방법을 최적화하였다 (Table 15). Table 9의 변수들을 변화하여 최적화 조건을 찾았다. 효소의 농도와 HBT 농도가 phenolic compound 의 분해에 끼치는 영향은 Fig. 41a에 볼 수 있듯이 HBT 농도가 높을수록 phenolic compound 의 분해가 증가하고, 높은 효소 농도 (5 IU ml -1 )와 1.5 mm의 HBT 농도를 사용하였을 경우 phenolic compound의 분해속도가 증가되었다. Fig. 41b는 효소 농도와 온도가 phenolic compound의 분해에 끼치는 영향을 보여주었다. Laccase의 농도를 증가시키고, 온도 40 에서 반응하였을 경우에는 phenolic compound 분해 정도가 서서히 증가하였다. 중간 온도 범위 (32~40 )와 높은 효소농도 (5 U ml -1 )에서 최적화 된 phenolic compound의 분해는 76~92%에 이르렀다. Table 15. The variables and their levels for the central composite experimental design Variable Symbol Coded level α α Enzyme (IU/ml) A Redox mediator (mm) B Temperature ( ) C

159 Table 16. Experimental design and the results of the central composite design Run A B C Phenol Predicted phenol R-studentized reduction (%) reduction (%) residual A는 효소 농도 (IU/ml), B는 HBT 농도 (mm), C 온도 ( ) (A) (B) Fig. 41. Response surface plots showing the interaction between variables in the reduction of phenol from MASERS: a) Interaction between enzyme (IU/ml) and HBT (mm); b) Interaction between enzyme (IU/ml) and temperature ( o C). YlLac을 이용한 당화 - Phenolic compound는 cellulase의 활성을 저해함으로써 당화효율을 저해하는 것으로 잘 알 려져 있다. 따라서 YlLac을 이용하여 phenolic compound를 제거함으로써 당화효율을 증가시킬 수 있다. 따라서 볏짚의 당화 전에 YlLac으로 전처리를 하였을 경우 최종 당 생산량이 622 mg/g-substrate에 이르렀다. YlLac으로 전처리를 하지 않았을 경우 볏짚의 당화율은 52.2% 였

160 고, YlLac으로 전처리를 하였을 경우 볏짚의 당화율을 68.0%이었다. 또한 YlLac와 mediator인 HBT의 전처리를 동시에 한 경우 당화율이 90.4%까지 증가하였다 (Fig. 42). 따라서 YlLac을 처리함으로써 당화의 저해요소인 phenolic compound를 제거함으로써 당화효율을 증가시킬 수 있을 것으로 사료되었다. Fig. 42. Reducing sugar production from MASERS by Celluclast 1.5L: without laccase pretreatment ( ); with laccase pretreatment ( ); laccase with mediator (HBT) pretreatment ( ). Xylanase 분자모델링 재조합 Chaetomium globosum xylanase (Chxyn)의 kinetic constants 측정 - 초기 속도상수는 ph 5.5에서 standard assay 조건 하에서 결정되었다. Chxyn은 hyperbolic saturation curve를 나타내었고, double-reciprocal plot에서는 선형을 나타내었다. 기질 스펠트 자일란에 대한 Chxyn의 V max 는 4,529 mg-protein -1 로 측정되었고, Michaelis-Menten 식을 이 용하여 스펠트 자일란에 대한 Chxyn의 kcat/km는 7,638 ml s -1 mg -1 으로 확인되었으며 (Table 17), 이는 현재까지 보고된 활성 중 최대 활성이다. Chxyn 구조의 분자모델링 - Chxyn은 이미 알려진 다른 xylanase 효소들과의 아미노산 염기서열의 유사성을 통해 GH11로 추정되었다 (Fig. 43). 본 연구에서는 Chxyn model을 제작하여 기존의 crystal structure가 보고된 효소와 비교함으로써 GH11 효소들에서 공통적으로 보존된 활성잔기 및 활성잔기 주변의 잔기들이 잘 보존되어 있음을 확인하였다. 주형 crystal structure는 Trichoderma reesei xylanase II이며 비교 결과 Fig. 18 에서와 같이 (W48) 활성 잔기가 거의 유사한 위치에 존재하며, 그 주변의 잔기들이 aromatic 잔기 (W/Y/F) 들로 잘 보존되어있음을 확인하였다

161 Fig. 43. Multiple sequence alignment and secondary structure prediction of XylCg with other fungal xylanases. The conserved amino acids are indicated with blue background. Catalytic residues and W48 are indicated with yellow and red background, respectively. Binding/active site의 확인 및 분석 - Chxyn의 binding/active site 잔기를 확인하기 위해서 이미 결정 구조가 밝혀진 T. reesei Xyl II의 binding/active site 잔기와 비교하였을 때, binding/ active site 잔기가 잘 보존됨을 확인하였다 (Fig. 44). Fig. 44. Superimposed image of xylanase from C. globosum (Chxyn) on the template of xylanase II from Trichoderma reesei. Chxyn의 활성 결정인자 탐색 - Site-directed mutagenesis를 통해 활성에 큰 영향을 끼치는 잔기로서 W48 잔기를 결정하 였다 (Fig. 45). 각 잔기의 돌연변이 제작, 발현 및 정제한 후 kinetics 실험 결과 Table 17과 같이 48번 잔기의 방향족 환이 사라지고 크기가 감소할수록 기질에 대한 효소의 활성이 wild-type이 비해 크게 감소하였으며 (W48A의 V max : 126 U mg-protein -1 ), 분자모델링을 통하 여 방향족 Trp이 작은 Tyr 혹은 Ala로 치환 시 효소 반응에 현저히 불리한 상태에 놓임을 입 증할 수 있었다

162 - Xylohexaose를 docking 시켰을 때 두 개의 활성잔기 (E115, E206)가 기질의 pyranose 링의 C2, C3의 수산화기와 각각 2.0Å, 2.4의 수소결합을 형성하는 것을 확인하였다 (Fig. 46A). 또한 E115 잔기의 carboxyl 그룹이 기질의 anomeric carbon 위치를 용이하게 친핵성 공격할 수 있 는 곳에 위치하였다 (3.1Å). 또한 상기 docking 실험에서 W48잔기 또한 기질과 수소결합과 π -sigma interaction을 하는 것을 관찰할 수 있었다. 따라서 W48잔기 또한 활성에 중요한 잔기 로 사료되었다. Fig. 45. Catalytic domain of XylCg model showing conserved aromatic residues. Aromatic residues within 5Ǻ radius around the two catalytic residues (E115 and E206) are displayed in green stick. The importance of W48 was studied by site-directed mutagenesis. Table 17. Kinetic parameters determined for XylCg wild-type and W48 mutants Enzyme V max (U mg-protein -1 ) K m (mg ml 1 ) k cat b (s -1 ) k cat/k m (ml s 1 mg 1 ) Δ(ΔG) c Wild-type 4529± ± ± ± W48Y 3042± ± ± ± W48F 1990± ± ± ± W48A 126± ± ± ± The V max, K m, and k cat values presented are means ± standard deviations. b The k cat values were calculated by considering the enzyme to be a monomeric form. Values are means ± standard deviations of results from three experiments. c Δ(ΔG) = - RT ln[(k cat /K m )mut/(k cat /K m )wt], where (k cat /K m )mut and (k cat /K m )wt are the k cat /K m ratios for the mutant and the wild-type, respectively, R is the ideal gas constant, and T is the temperature in kelvin

163 (A) (B) Fig. 46. Homology model of the Chxyn active site with bound xylohexaose substrate. (A) Xylohexaose was docked into the substrate binding pocket of wild-type Chxyn. (B) Mutant model of the W48A active site with bound xylohexaose substrate

164 Chxyn 모델을 통한 기질특이성 규명 - W48Y mutant에서는 기질과 잔기 사이에 수소결합이나 π-sigma interaction이 하나만 남게 됨을 관찰하였다. 따라서 aromatic 잔기인 W48은 기질의 pyranose 링이 기질의 결합부위에 잘 결합하여 기질과 단백질사이의 결합하는데 안정성을 주는 것으로 사료되었다. W48A mutant에 서는 기질의 pyranose 링과 48번째 잔기인 Ala 사이에 아무런 결합도 하지 않음을 관찰하였 다. W48A mutant에서 수소결합이나 π-sigma interaction이 사라짐으로써 xylohexaose가 이동 하게 된다. 이러한 이동에 따라 E115 잔기와 anomeric carbon 사이의 거리가 멀어지게 된다. W48 잔기를 aliphatic 잔기로 대체하였을 경우 (W48R, W48N, W48D, W48C, W48I, W48L, W48V), xylanase의 효소 활성이 없었다. 그 이유는 mutant에서는 기질과 잔기 사이에 수소결 합이나 π-sigma interaction이 깨지면서 활성잔기인 E115의 carboxyl group이 기질을 친핵성 공격을 할 수 없게 된다. 따라서 상기 실험으로 Chxyn의 48번째 잔기는 aromatic 잔기여야 하 고, 이 잔기는 기질과 수소결합 또는 π-sigma interaction을 하는데 중요한 역할을 하며, 이 결 과로 E48 잔기의 carboxyl 그룹이 친핵성 공격을 할 수 있는 위치에 놓이게 한다. 따라서 기질 과 효소사이에 결합을 함으로써 안정성에 영향을 미치는 것을 관찰함. 이와 같은 실험으로 Chxyn의 메커니즘을 예상할 수 있었다 (Fig. 47). k Fig. 47. Schematic representation of substrate interaction and reaction in the catalytic domain towards xylohexaose

165 Chxyn의 ITC를 이용한 열역학적 상수 분석 - Wild-type Chxyn, W48Y, W48A의 ΔG 값은 40.31, 40.87, kj mol -1 (Table 18) 으로 서, ΔG 값은 wild-type에서 mutant 보다 적게 나왔다. W48Y에서는 ΔG 값이 wild-type에 비 해 아주 낮게 나타난 것을 확인하였다. 이는 xylohexaose의 pyranose ring과 48번째 잔기사이 의 수소결합이 깨지면서 발생한 것으로 사료되었다. 또한 W48의 mutant로 해당 잔기의 기능 을 증명할 수 있었다. Wild-type은 mutant에서 보다 현저히 낮은 K d 값을 보였고, 이는 이 잔 기가 기질 결합을 통해 활성에 많은 영향을 미치는 것을 증명였다 (Table 18). 따라서 W48 잔 기는 효소와 기질사이에 수소결합과 π-sigma interaction을 하면서 효소-기질 복합체의 안정성 에 기여함을 확인였다. Table 18. Thermodynamic parameters determined by ITC for XylCg wild-type and W48 mutants. Enzyme Log K K d(µm) ΔG b Δ(ΔG b ) ΔG Wild-type W48Y W48A All energy parameters are represented in kj mol -1. ΔG b free binding energy. Log K, K d and ΔG b are calculated using the mathematical relation. ΔG b = -RT ln K, where K is the equilibrium constant, R is the ideal gas constant, and T is the absolute temperature in kelvin. ΔG = RT [ln (k B /h) ln (K/T)], where k B is the Boltzmann constant and h is the Planck constant (k B /h = K 1 s 1 )

166 바이오매스 분해효소 생산 균주 스크리닝 셀룰라제 활성이 우수한 곰팡이 균주의 스크리닝 - 고활성 바이오매스 분해 효소를 생산하는 곰팡이를 스크리닝하였으며, EG, CBH, BGL 등이 고활성을 보인 균주를 선별하였다. 균주의 정확한 분류파악을 위해 ITS-5.8S rdna sequencing 을 수행하여 고활성 균주를 동정하였음. BGL의 활성은 Stereum hirsutum이 가장 높았으며, EG 및 CBH의 활성은 Schizhophilum commune이 가장 높았음 (Table 19). 이에 두 균주를 이 용한 cellulase의 생산최적화를 수행하였다. Table 19. Screening of fungal strains with high cellulase activity Stereum hirsutum 및 Schizophilum commune에 의한 cellulase의 대량 생산 - Stereum hirsutum 및 Schizophilum commune에 의한 cellulase의 생산 최적화를 7L 및 70L 발효기에서 진행하였다. 탄소원, 질소원, 온도, ph 등의 최적화 후 (Table 20), 볏짚 및 옥 수수 침지액 등을 탄소원 및 질소원으로 사용하여 70L 발효기(35L 워킹 볼륨)에서 배양을 수 행한 결과 Stereum hirsutum은 FPU 0.36 U/ml의 효소를 생산하였으며, Schizhophilum commune은 FPU 0.44 U/ml의 효소를 생산하였다. 이 두 균주로 부터 생산된 효소 20 FPU/g-기질을 사용하여 볏짚의 당화를 수행한 결과 %로서 Novozyme (celluclast) 효소와 유사한 당화 활성을 나타내었다 (Table 21)

167 Table 20. Effect of carbon and nitrogen sources on the activity of cellulase C source BGL activity CBH activity EG activity (U ml -1 ) (U ml -1 ) (U ml -1 ) Cellulose Rice Straw Corn steep CMC Glucose Avicel Table 21. Saccharification of rice straw using S. commune and S. hirusutum Strains mg sugar produced/g-substrate Saccharification % Schizophyllum commune 401± ± 5.5 Stereum hirsutum 388± ± 5.8 Agaricus arvensis 369 ± ± 4.6 Trametes hirsuta 350 ± ± 2.3 Novozyme (celluclast) 381 ± ± L 발효기에서의 consortium 배양을 통한 cellulase cocktail의 대량 생산 - Stereum hirsutum, Schizophilum commune은 각기 다른 효소 특성을 보이므로, 보다 우수 한 당화/분해효소 칵테일을 얻고자 이 두 균주의 co-culture를 7L 및 70L 발효기에서 진행하 였다. 다양한 배양 조건을 지표로 RSM 기법 (Table 22)으로 최적화 한 결과 각각의 single culture 보다 50% 가량 증가한 FPU/ml을 나타내었다 (Fig. 48). Table 22. Parameter optimization by response surface methodology using Design Expert version

168 Fig. 48. Cellulase cocktail production from consortium culture (70L) of S. hirsutum and S. commune. Consortium cocktail 효소를 사용한 당화 최적화 - Stereum hirsutum 및 Schizophilum commune co-culture를 통해 얻어진 칵테일 효소를 이 용하여 당화를 수행하였다. 다양한 당화조건을 역시 RSM 기법을 이용하여 최적화 한 결과 칵 테일 효소를 사용하여 85%의 당화수율을 얻을 수 있었음. 이는 상용화 효소 칵테일(Celluclast + BGL 188)보다 우수한 결과에 해당한다. (A) (B) Fig. 49. Response surface plots showing the relationships between independent variables in the conversion of cellulose to reducing sugars: (A) relationship between substrate and enzyme concentration; (B) relationship between enzyme concentration and ph; (C) relationship between enzyme concentration and temperature; (D) relationship between predicted and actual value of saccharification. 신규 라카아제를 생산하는 효모 균주(Yarrowia lipolytica)의 선별 - 다양한 박테리아, 곰팡이, 효모 등 미생물의 리그닌 분해 활성을 테스트하였으며, 그 과정에

169 서 고활성을 보이는 균주를 선별하고 KCCM에 균주 동정을 의뢰하였다. 그 결과 Internal transcribed spacer (ITS) rdna sequence에 근거하여 Yarrowia lipolytica로 동정되었다 (Fig. 50). 이는 곰팡이나 박테리아가 아닌 효모에서 laccase를 생산하는 것으로 동정된 최초의 예이 다. Fig. 50. Strain identification based on ITS rdna sequence 고활성 신규 라카아제의 정제, 클로닝, 발현 및 특성 규명 - 고활성 laccase를 Y. lipolytica로 부터 순수 정제하고, 정제된 단백질로부터 얻어진 peptide fragment 서열로부터 TAIL-PCR 기법을 이용하여 유전자 클로닝을 진행하였다. Cu sites 기 반 degenerate primer를 이용하여 partial sequence를 확보한 후, TAIL-PCR을 이용하여 fragment로부터 고활성 Y. lipolytica laccase(yllac)의 유전자 full sequence를 확보하였다 (Fig. 51). YlLac의 과량 발현을 위해 ppicz-alpha에 클로닝하고 P. pastoris에 transformation 한 후, plate assay 기법을 이용하여 고활성 재조합 균주를 선별한 후, recombinant YlLac을 과량 발현시키고, 정제하였다. 우측 그림에 zymogram 및 glycoprotein staining과 더불어, DEAE, Biogel chromatography를 이용한 효소 정제과정을 나타내었다 (Fig. 52). (A) (B) Fig. 51. (A) Cloning of laccase gene (YlLac) from a Yeast Yarrowia lipolytica in ppiczaa. (B) Selection of clone by plate assay. (A) (B)

170 Fig. 52. (A) Zymogram activity and glycoprotein staining of purified laccase enzyme using native PAGE (L1- ABTS, L2-2,6-DMP, L3- glycoprotein staining). (B) SDS-PAGE of laccase (M- Marker, L1 - Crude protein, L2 - DEAE cellulose purification, L3 - Biogel Hiload 16/60 Superdex 200 chromatography) - 재조합 YlLac의 enzyme kinetics를 수행한 결과 ABTS 및 2, 6-DMP에 대한 k cat 값이 각 각 1,777 s -1, 1,075 s -1 로서, 현재까지 보고된 laccase 중 가장 높은 활성을 가짐을 확인하였다 (Table 23). Table 23. Kinetic parameters of YlLac YlLac 라카아제를 이용한 바이오매스의 detoxification - 효모 유래 라카아제인 YlLac를 이용하여 전처리된 바이오매스 볏짚의 detoxification에 적용 하여 고효율 당화공정을 확립하고자 하였다. YlLac를 이용하여 전처리 된 바이오매스의 detoxification 과정을 최적화 하고자 다양한 변수를 적용한 RSM 기법을 사용하였다 (Fig. 53). (A) (B)

171 Fig. 53. RSM optimization of rice straw detoxification by YlLac. (A) relationship between HBT and enzyme concentration; (B) relationship between temperature and enzyme concentration. - 이와 같이 최적화 된 조건하에서 전처리 된 바이오매스의 detoxification을 수행하였다. HPLC와 LC/MS를 통해 phenolic compounds를 동정 및 정량한 결과 (Fig. 54), YlLac을 처리 하지 않은 경우에는 다량의 phenolic 화합물들이 Table 24와 같이 고농도로 검출되었다. 그에 반해 YlLac 미처리구에 비해 YlLac을 처리하여 detoxification 과정을 수행하자 gallic acid를 포함한 다양한 phenolic 화합물의 양이 5-30% 수준으로 현저히 저하됨을 확인할 수 있었다 (Table 24). Table 24. Detoxification of phenolic compounds by YlLac

172 Fig. 54. Quantification of phenolic compounds by HPLC. 바이오매스의 당화에 대한 YlLac detoxification의 영향 - Celluclast (30 FPU/g-substrate)를 사용하여 볏짚의 당화를 시도하였다. 당화 시에 laccase YlLac 를 처리하였을 때 미처리에 비해 30% 가량 당화 수율이 증가함을 보였다. 이는 YlLac 처리로 인해 저해성 방향족 화합물들이 분해되면서 cellulase의 활성저해가 완화되었기 때문으 로 추정된다. 여기에 laccase의 mediator를 추가할 경우 당화수율은 더욱 증가하여 미처리 구 에 비해 50% 이상 높은 환원당 생산량을 나타내었다 (Fig. 55). Fig. 55. Time course of reducing sugar production from rice straw by Celluclast 1.5L. - 이와 같은 당화수율의 증가는 cellulase 활성 저해의 완화에 기인한 것으로 추정하였다. 실 제 시간 별로 5 U/ml의 laccase YlLac 처리구, YlLac+ mediator 처리구, YlLac 미처리구의 시 간에 따른 cellulase 효소 활성을 비교하였다. 그 결과 YlLac 미처리 시에는 36시간 경과 후 40-75%의 cellulase 활성저하가 나타난 반면, YlLac이 처리되어 detoxification 과정을 거치자 YlLac 단독 처리의 경우 20% 내외, YlLac+mediator의 경우는 5%내외의 활성 저하만이 나타 났다 (Fig. 56). YlLac laccase가 cellulase의 활성 저하를 낮춤으로써 높은 당화 효율을 얻을 수 있었다. (A)

173 (B) (C) Fig. 56. Deactivation of cellulases by phenolic compounds during saccharification. (A) YlLac Untreated. (B) YlLac treated (5 U/ml). (C) YlLac treated (5 U/ml). + mediator (HBT 1.5 mm). Celluclast (30 FPU/g-substrate) was used. - YlLac을 이용한 detoxification을 plant biomass에도 적용하였음. ph 별로 YlLac으로 전처 리한 Populus balsamifera prehydrolysate의 시간별 phenolic content를 그림에 나타내었다 (Fig. 57). ph 5에서 phenolic 화합물이 가장 많이 분해되었다. ph 5에서 당화 반응을 진행하 였으며 결과를 그림 d에 나타내었다. 볏짚과 마찬가지로 YlLac 처리로 인해 30% 수준의 당화 수율 증가를 얻을 수 있었다

174 Fig. 57. Time course of phenolic content of P. balsamifera prehydrolysate during pretreatment with laccases from YlLac, at different phs, a) 3, b) 4, c) 5. Untreated control (without laccase) is also shown, d) Reducing sugar production from acid-pretreated P. balsamifera by Celluclast 1.5L: without laccase pretreatment ( ), and with YlLac pretreatment ( ). Error bars indicate standard deviations from mean values

175 Quantum-Mechanics/Molecular-Mechanics(QM/MM)에 의한 cellulase의 개량 - 구조기반 단백질공학을 실험적이 아닌 컴퓨터 상에서 수행하였다. 즉, Quantum mechanics (QM)에 기반한 초고속 및 정량적 in-silico 스크리닝 시스템을 개발하여 보다 효율적으로 고활 성 lignocellulase를 개발하고자 하였다. In silico 상에서 모든 mutation을 수행하였으며, Molecular mechanics (MM)를 통해 컴퓨터 상에서 모든 목적 돌연변이 효소의 구조를 제작 하였다 (Fig. 58). QM 기법으로 G 또는 K d 값을 슈퍼컴퓨터를 이용해서 모든 돌연변이에 대해 계산하고, wild-type에 비해서 G 값이 감소한, 즉, 활성이 증가하거나, 기질 결합이 우 수한 돌연변이를 찾았다 (Fig. 58). 현재까지 문헌상에는 기질이 직접 결합하는 1st shell까지는 QM/MM이 활발히 사용되고 있으나, 기질과 멀리 떨어진 2 nd, 3 rd shell에는 적용이 되지 않고 있다. - NfBGL 1 st 및 2 nd shell 부위의 잔기들에 대한 100여 종의 돌연변이 제작 및 QM 계산이 진행되었으며, 그 중 N318A mutant가 유리한 열역학적 상수값을 나타내었다. 이를 선정하여 enzyme kinetics를 수행한 결과 표 25와 같이 N318A mutant (k cat /K m = 3,080 s -1 mm -1 )가 wild-type (k cat /K m = 924 s -1 mm -1 )에 비해 약 3배의 효소활성 증가를 나타내었다. (A) (B) Fig. 58. G + -based in silico 스크리닝 시스템의 적용 예. (A) 열역학적 상수, 즉 G + -based in silico 스크리닝 시스템을 통한 고활성 mutant의 선별. (B) N. fischeri β-glucosidase (NfBGL)의 기질 결합부위, 2 nd shell, 3 rd shell 잔기들의 in silico mutation 후 분자모델을 MM 을 통해 구축

176 Table 25. Thermodynamic parameters (kcal/mol) determined for NfBGL wild-type and mutants 고활성 lignocellulase cocktail 효소 생산 균주 확보, 효소 생산 및 규명 - 고활성 lignocellulase cocktail 효소를 생산하는 곰팡이를 추가 스크리닝하였으며, EG, CBH, BGL 등의 cellulase 활성 뿐 만 아니라 lignin 등의 분해활성까지 높은 균주를 선별하였 다. ITS 서열분석 및 동정결과 Pholiota adiposa로 동정되었다 (Fig. 59). Fig. 59. Phylogenetic dendrogram for P. adiposa and related strains based on the ITS rdna sequence. - P. adiposa의 배양 최적화를 통해 Fig. 60과 같이 다양한 lignocellulase (EG, CBH, BGL, mannanase, xylanase, laccase, lignin peroxidase 등)의 고효율 생산을 확인하였다. 70L 발효기 에서 1.52 U/ml 수준의 cellulase의 생산을 확인하였다. (A)

177 (B) Fig. 60. (A) Time course of total cellulase activity of (FPU) BGL, CBH and EG production in 70-L fermenter by P. adiposa SKU0714. ( ) BGL activity; (О) CBH activity; ( ) EG activity; (Δ) FPU activity. (B) Time course of xylanase, laccase, mannanase, and lignin peroxidase activities of P. adiposa SKU0714. ( ) Xylanase activity; (О) Laccase activity; ( ) Mannanase activity; (Δ) Lignin peroxidase activity. - 대표적 lignocellulase인 BGL, CBH, EG, xylanase 등을 Fig. 61과 같이 순수 정제하였다. 그 중에서 xylanase의 특성을 규명한 후, 기존에 보고된 xylanase와 특성을 비교한 결과, 기존 효소들에 비해 매우 높은 k cat /K m 값을 보여주고 있다 (Table 26). Lignin peroxidase, laccase, mannanase 등도 정제 후 특성규명을 수행한 결과, specific activity 수준에서 타 미생물 유래 효소들에 비해 매우 높은 수준의 활성을 보여주고 있다. 이와 같은 고활성 lignocellulase cocktail 효소의 과량 생산이 고효율 당화에 크게 기여하는 것으로 판단되었다

178 Fig. 61. SDS-PAGE of BGL, CBH, EG, and xylanase purified from P. adiposa. Lane 1, molecular marker; lane 2, crude cell extract; lane 3, purified BGL; lane 4, purified CBH; lane 5, purified EG; and lane 6, purified xylanase. Table 26. Comparison of various xylanases including P. adiposa xylanase P. adiposa lignocellulase cocktail 효소를 이용한 당화 최적화 - P. adiposa 유래 lignocelllulase를 이용한 볏짚의 당화최적화를 RSM을 통하여 진행하였다 (Fig. 62). 그 결과 기존 S. commune + S. hirsutum consortium 배양에 비해 유사하거나 약간 우수한 결과를 나타내었다 (Table 27). 공정의 용이성 측면에서 P. adiposa 단독 배양이 우수 하다고 판단되었다

179 Fig. 62. Response surface plots showing the relationships between independent variables in the conversion of cellulose to reducing sugars: (A) relationship between substrate and enzyme concentration; (B) relationship between enzyme concentration and ph; (C) relationship between enzyme concentration and temperature

180 Table 27. Saccharification of rice straw using various cellulase sources including P. adiposa culture - 볏짚과 더불어 P. adiposa lignocellulase를 이용한 다양한 plant biomass의 당화 또한 수행 하였다. 그 결과 Populus nigra에서 가장 높은 초기 당화 수율을 얻을 수 있었다. 따라서 P. nigra를 사용한 당화 반응의 최적화를 다음과 같이 RSM 기법을 통해 진행하였다. Table 28. Results from regression analysis of the design - Populus nigra의 당화 최적화 결과 83.4%의 당화 수율을 얻음으로써 (Table 29), 노보자임 효소보다 우수한 결과를 얻을 수 있었다. 현재 P. adiposa lignocellulase 생산의 전체적 체계를 규명하기 위해 whole genome sequencing이 진행 중이다

181 Table 29. Saccharification of P. nigra using various cellulase sources including P. adiposa lignocellulase P. adiposa lignocellulase의 나노입자에의 고정화 - P. adiposa lignocellulase의 고정화를 위해 다양한 캐리어에 고정화 시킨 후 고정화 효율을 비교 분석한 결과 silicone oxide nanoparticle을 사용했을 때 가장 높은 고정화 효율을 보였다 (Fig. 63). Fig. 63. Selection of carriers for immobilization. Immobilization yield = 100 X Immobilized protein/total protein. Immobilization efficiency = 100 X Immobilized enzyme activity/total free enzyme activity - Silicone oxide nanoparticle에의 고정화 효율을 더욱 높이기 위해 glutaraldehyde를 통해 유 도체화 하였다 (Fig. 64). 그 결과 고정화 효율의 추가 상승과 더불어 25 cycle 반응 후에도 90%이상의 free enzyme 대비 효소 활성을 보유할 정도로 안정적인 시스템을 확보하였다 (Fig. 65)

182 Fig. 64. Schematic representation of activation of silicon oxide nanoparticles and immobilization of cellulase onto the functionalized silicon oxide nanoparticles by covalent bonding. The amino groups of lysines present on the surface of the cellulase react with the activated silicon oxide nanoparticles to form the covalent bond at multiple points. 100 Relative immobilization efficiency (%) Number of cycles Fig. 65. Reusability of the immobilized A. arvensis BGL. One cycle is defined as the time taken to hydrolyze all of the substrate present in the reaction mixture under the standard assay condition. Cellulase, xylanase, laccase 등 유전자 library 구축 현황

183 Table 30. Cellulase, xylanase, laccase 등 유전자 library 구축 현황 미생물메타게놈 라이브러리 구축 퇴비로부터 메타게놈 라이브러리 구축 - 퇴비 숙성 중 고온발효단계의 시료를 대상으로 메타게놈 DNA를 분리하였다. - 분리된 DNA는 50 kb 이상으로 확인되었다. - 메타게놈 DNA를 pcc2fos cosmid vector와 ligation시킨 후 infection 방법으로 transformation을 수행하였다. - Cosmid clone으로 약 45,000 clone을 얻었으며, insert DNA의 크기는 평균 40 kb로서 약 1,800 Mb를 확보하였다. 산양 반추위로부터 메타게놈 라이브러리 구축 - 산양 반추위 고형 성분으로부터 genomic DNA를 pulsed-field 전기영동을 사용하여 메타게 놈을 분리하였다. - 분리된 메타게놈을 위와 같은 방법으로 하여 약 40,000 clone을 얻었으며, insert DNA의 크 기는 평균 40 kb로서 약 1,600 Mb를 확보하였다. Lichenase 유전자 선발 및 선발 클론 분석 - 고산지대 토양으로부터 분리된 Paenibacillus sp. X4의 lichenase 유전자를 클로닝하기 위하 여 chromosomal DNA를 추출하여 shotgun cloning 방법으로 클로닝하고 이로부터 활성 클론 을 확보하였다. - 확보된 클론으로부터 유전자를 확인하고 lic8h로 명명함. 이 클론으로부터 High-Q와 CHT-II chromatography를 통해 Lic8H를 정제 하여 효소의 특성을 조사함. SDS-PAGE 단백 질 전기영동 결과 Lic8H는 40 kd로 확인되었다. 또한, DNS법을 이용하여 효소의 특성을 조사 한 결과 50 와 ph 5.0에서 최대 활성을 나타내었다

184 Fig. 66. SDS-PAGE of the purified Lic8H. (M : molecular weight marker; 1 : crude extract; 2 : High-Q chromatography; 3 : CHT-II chromatography) Fig. 67. Characterization of Lic8H. (A): optimum temperature; (B): optimum ph. Table 31. Effect of chemical agents on the activity of Lic8H - Lic8H의 기질에 대한 영향을 조사한 결과 barley-β-d-glucan을 가장 효과적으로 분해 하였 으며 Lichenan, Laminarin, CMC 순으로 가수분해 하였다. Table 32. Substrate specificity of lichenase Lic8H

185 퇴비 유래 곰팡이로부터 cellulase 유전자 확보 - 고온상태의 부숙기인 퇴비 시료를 사용하여 곰팡이를 확보하여 0.85%의 NaCl에 현탁하여 PDA(Potato Dextrose Agar) plate에 도말하여 곰팡이를 선발하였다. - 선발된 곰팡이를 각각 Peptone 에 볏짚, filter paper이 첨가된 배지에 재배양하여 배양속도 와 모양으로 1차 분류 하였다. Table 33. 퇴비유래 곰팡이 분류 - 총 15종의 곰팡이를 분류하여 각각 시간에 따른 기질(CMC, pnpc, filter paper)별 activity assay를 확인하였다. 이를 20일 동안 진탕배양과 정치 배양하여 0, 3, 6, 9, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20일에 sampling 하여 activity를 확인하였다

186 CMCase activity U/ml Culture time (day) #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10 #11 #12 #13 #14 #15 #건국 Fig. 68. 생장 시간에 따른 CMC activity assay ( rpm 진탕 배양) CMCase activity U/ml #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10 #11 #12 #13 #14 #15 #건국 Culture time (day) Fig. 69. 생장 시간에 따른 CMC activity assay (30 정치 배양)

187 pnpc activity U/ml Culture time (day) #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10 #11 #12 #13 #14 #15 #건국 Fig. 70. 생장 시간에 따른 pnpc activity assay ( rpm 진탕 배양) pnpc activity U/ml Culture time (day) #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10 #11 #12 #13 #14 #15 #건국 Fig. 71. 생장 시간에 따른 pnpc activity assay (30 정치 배양)

188 Filter paper activity U/ml #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10 #11 #12 #13 #14 #15 #건국 Culture time (day) Fig. 72. 생장 시간에 따른 filter paper activity assay ( rpm 진탕 배양) Filter paper activity U/ml Culture time (day) #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10 #11 #12 #13 #14 #15 #건국 Fig. 73. 생장 시간에 따른 filter paper activity assay (30 정치 배양)

189 - 이들 결과로 #7, #13을 최종 선발하여 10일간 30 에서 정치 배양 후 동결건조시켜 total RNA를 추출하였다. Fig. 74. 퇴비유래 곰팡이로부터 RNA 추출 후 1% Agarose 전기영동 (M : 1 kb sizer marker; 1 : #건국(TS) ; 2 : #7; 3 : #13) B. subtilis W B800를 이용한 xylanase 고발현 XynX 발현 - 내열성 xylanase 효소의 유전자 xynx를 갖는 pjx33과 pcx33 재조합 DNA를 단백질분 해효소가 8개 결손된 B. subtilis WB800와 E. coli BL21(DE3)에 각각 형질전환 시켰다 (Fig. 75). 먼저 TBAB agar plate에 WB800 streaking하여 30 에서 overnight 배양된 균주를 SPⅠ media와 SPII media를 이용하여 WB800을 형질전환 시켰다. 형질전환주 B. subtilis WB800 (pjx33)의 배양 상층액과 E. coli BL21(DE3) (pcx33)의 세포내 분획을 각각 회수하여 activity staining 및 SDS-PAGE를 수행하였다 (Fig. 76). - B. subtilis WB800 (pjx33)에서는 세포외로 분자량 105, 85, 65 kda인 xylanase를 생산 하였으며, E. coli BL21(DE3) (pcx33)에서는 세포내에 105, 85, 64 kda인 xylanase를 생산하 였다. B. subtilis WB700 (pjx33)에서는 세포외로 65와 44 kda인 훨씬 작은 절단된 xylanase 를 생산하였다 (Fig. 76). Fig. 75. B. subtilis WB800 (pjx33) transformants (A) (B)

190 Fig. 76. Activity staining (a) and protein staining (b) after SDS-PAGE of the xylanase produced by E. coli BL21(DE3) (pcx33), B. subtilis WB700 (pjx33) and B. subtilis WB800 (pjx33). Lanes 1 and 4, crude extract of E. coli BL21(DE3) (pcx33); 2 and 5, concentrated supernatant of B. subtilis WB700 (pjx33); 3 and 6,concentrated supernatant of B. subtilis WB800 (pjx33). Lanes 1 to 3, in the absence of PMSF; 4 to 6, in the presence of 5 mm PMSF. M, protein markers. Numerals in parenthesis and at the left side represent the molecular masses in kilodaltons of the proteins. EP, proteins from the E. coli strain; BP, proteins from the B. subtilis strains. pwb705를 활용한 xylanase Xyn10J의 cloning - Xylanase gene Xyn10J를 제한효소 BamHI으로 절단 하여 pwb705에 삽입하기 위해 Xyn10J insert 양 끝 부분에 BamHI site를 첨가하여 primer를 제작하였고 (Table 34), 이 primer를 이용해 PCR을 수행하였다. - pwb705의 plasmid와 증폭된 Xyn10J를 BamHI으로 처리하였고, pwb705는 CIP처리 후 벡터로 사용하였다. Xyn10J를 만들어진 pwb705 벡터에 삽입하고 transformation을 진행하여 형질전환 균주를 확보하였다. Table 34. BamHI site를 포함하는 primer 제작 Primer name Primer sequence F1 5 ATAACTGGATCCATGAGC 3 F2 5 GCAAAAGGATCCGCCATT 3 R 5 TAGAGGATCCCAGAGCTT 3 Lichenase Lic8H 발현 및 반응 특성 Lic8H의 이온안정성 및 Ca이온의 첨가에 따른 최적 온도 및 열안정성

191 - DNS법을 이용하여 Lic8H의 이온에 대한 안정성을 조사한 결과 Ca ++ 이온을 첨가하였 을 경우 400%의 활성이 증가하는 것을 확인하였고 (Fig. 77) 최대 5 mm을 첨가하였을 때 가 장 높은 활성을 보였다. Fig. 77. Effect of metal ions on the activity of Lic8H. - 위의 결과를 토대로 Ca 이온 첨가에 따른 Lic8H의 최적 온도를 재 측정 한 결과 Ca 이 온을 첨가하기 전과 동일 한 50 에서 최적의 활성을 나타내었다 (Fig. 78). 또한 효소에 Ca 이온을 첨가하고 미리 각 40, 50, 60, 70 에 전처리 후 효소활성을 측정한 결과 Ca 이온을 첨 가하지 않은 효소에서는 70 에서 15분간 처리하여 반응 시켰을 때 50%이하의 활성을 유지하 고 30분간 처리하여 반응시켰을 때 40%이하의 활성을 보였으나 (Fig. 79), Ca 이온을 첨가하 였을 경우 70 에서 거의 기존 활성을 유지 하는 것으로 보였다 (Fig. 80). Fig. 78. Effect of temperture on the of Lic8H and addition Ca

192 Fig. 79. Heat stability of Lic8H. (- -, 40 ; - -, 50 ; - -, 60 ; - -, 70 ) Fig. 80. Heat stability of Lic8H addition Ca ++. (- -, 40 ; - -, 50 ; - -, 60 ; - -, 70 ) Lic8H의 end product 분석 - 정제된 Lic8H의 End product의 분석을 위하여 50 mm의 cellooligosaccharide [Glucos (G 1 ), cellobiose (G 2 ), cellotriose (G 3 ), cellotetraose (G 4 ), cellopentaose (G 5 ) and cellohexaose (G 6 )]을 기질로 사용하였다. 반응물과 표준물질을 Silica gel 60 F254 plate (Merck, Darmastadt, Germany, cm)에 각각 점적하여 확인한 결과 정제된 Lic8H는 cellotetraose (G 4 ), cellopentaose (G 5 )와 cellohexaose (G 6 )를 가수분해 했을 때 주로 cellobiose (G 2 )와 cellotriose (G 3 )을 생산하였다 (Fig. 81). Cellopentaose (G 5 )및 cellohexaose (G 6 )를 가수 분해 했을 때 주요 생성물은 G 3 이고, 그보다 약간 적은 양의 cellobiose (G 2 )가 생산 되었다. 또 한 적은 양이지만 cellotriose (G 3 )를 가수분해 했을 때 G 2 도 생산 되는 것이 보여진다 (Fig. 81). 하지만 Barley-β-D-glucan과 Lichenan을 기질로 하여 가수분해 생성물을 분석한 결과 생 성물이 확인 되지 않았다

193 Fig. 81. End products of Lic8H hydrolysis from cellooligosaccharides. G 1 -G 6 ; standard materials, Glucose (G 1 ), cellobiose (G 2 ), cellotriose (G 3 ), cellotetraose (G 4 ), cellopentaose (G 5 ) and cellohexaose (G 6 ). E 1 -E 6, end products of thereaction with Glucos (E 1 ), cellobiose (E 2 ), cellotriose (E 3 ), cellotetraose (E 4 ), cellopentaose (E 5 ), and cellohexaose (E 6 ). Lic8H의 효소 활성 부위 확인 - QuikChange R II Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene, Santa Clara, USA)를 사용 하여 Lic8H의 효소 활성부위를 확인하였다. 아미노산 치환을 목적으로 primer를 제작하고 (Table 35), pfuturbo DNA polymerase를 이용하여 PCR을 수행하였다. Table 35. Primer for site-directed mutagenesis Primer name Primer sequence F 156D 5 GCCACGGATGGAGACATGGACATTGCTT 3 R 156D 5 AAGCAATGTCCATGTCTCCATCCGTGGC 3 F 95E 5 ACTGTATCTGAGGCACACGGTTACGGAA 3 R 95E 5 TTCCGTAACCGTGTGCCTCAGATACAGT 3 - Lic8H의 아미노산 서열을 pfam database를 이용하여 활성 부위를 확인한 결과 Glu95과 Asp156로 분석되어 Glu95과 Asp156을 Ala로 치환한 결과 효소활성의 대부분을 잃었다 (Table 36). Table 36. Enzyme activity of Lic8H mutants Relative activity (%) Lic8H 100 Lic8H D156A 5.2 Lic8H E95A 6.2 퇴비 유래 섬유소분해 곰팡이 분리 - 고온상태의 부숙기인 퇴비 시료를 사용하여 곰팡이를 확보하여 0.85%의 NaCl에 현탁하 여 PDA (Potato Dextrose Agar) plate에 도말하여 곰팡이를 선발하였다 (Fig. 82). 배양된 곰 팡이 중 CMC와 Xylan에서 활성을 보이는 곰팡이를 선발하여 임의적으로 7번 16번 17번을 명

194 명하였고, 또한 CMC 및 Xylan에서 활성을 보이는 TS (Trametes suaveolens IUM 2851)와 함께 control을 사용하여 Cellulase, Xylanase, β-glucosidase activity를 측정하였다. Fig. 82. 퇴비로부터 분리한 곰팡이의 CMC 및 Xylan plate에서의 활성 효소를 이용한 천연 갈대 분말의 당화 Xyn10J를 이용한 당화 - 갈대를 기질로 하여 상업적인 효소의 혼합액 (Celluclast 1.5L, 8.72 U + Novozym 188, 37.5 U)과 Xyn10J (1.85 U)로 효소당화를 실시하였고, 혼합액의 효소당화율 보다 Xyn10J의 효 소 당화율이 약 30% 더 증가 하는 것으로 나타났다 (Fig. 83). Fig. 83. Hydrolysis of reed powder by Xyn10J added to a commercial enzyme preparation. Reaction mixture of 5 ml contained 6% reed powder (100 mesh) in 50 mm sodium citrate buffer (ph 5.5) and incubated at 50 o C with shaking at 150 rpm. Enzyme concentrations of Celluclast 1.5L (Novozyme), Novozym (Sigma), and Xyn10J were 8.72, 37.5 and 1.85 U, respectively. Symbols: - -, Celluclast 1.5L; - -, Novozym 188; - -, Celluclast 1.5L + Novozym 188; - -, Celluclast 1.5L + Novozym Xyn10J. Lic8H를 이용한 당화 - 갈대를 기질로 하여 시중에서 판매되는 Celluclast, Novozyme 188과 본 연구팀에서 보 유하고 있는 Lic8H, Xym10J, XynX, Lic8H에 Ca 이온을 첨가하여 효소 당화를 실시하였다. 사 용되어진 효소의 각각의 U는 Celluclast (8.72 U), Novozyme 188 (37.5 U), Lic8H (0.1 U), Xyn10J (1.85 U), XynX (0.1 U)를 사용하였다. Ca 이온을 첨가한 Lic8H가 가장 효율이 높았 고 그 당화율은 약 g/l이었으며 Lic8H> Xyn10J> pjx33 > Celluclast+Novozym 188> Celluclast> Novozym 188 순으로 당화율이 높았다 (Fig. 84)

195 Fig. 84. 갈대 분말을 대상으로 한 효소 당화 효소를 이용한 전처리 갈대 및 볏짚 분말의 당화 (1) 당화분석의 조건 기질의 종류 및 농도 - 천연 갈대 및 전처리된 갈대 (100 mesh) - 천연 볏짚 및 전처리된 볏짚 (100 mesh) - 표준 기질 농도 6% 포함 9%, 12%, 15% 효소의 농도 기질의 전처리 조건 - 반응조건 : 150, 30 min, 120 rpm - 처리조건 : 1 M NaOH(15x 희석), CO 2 3 Mpa 혼합 기질의 성분

196 (2) 당화분석 - 실험효소를 단독으로 첨가하였을 때 3 g/l 미만의 당화율을 보였다 (Fig. 85). - 상용 효소만을 첨가 하였을 때보다 상용 효소에 Lichenase를 추가 첨가하였을 때 8~10% 증가하였고 5 mm Ca ++ 을 추가 첨가하였을 때 당화율은 20%까지 증가하였다. - 상용 효소의 양을 2배로 높였을 때 당화율의 증가는 미미하였다. - 갈대의 경우 기질의 농도 12%에서 30%의 당화율 증가를 보였으며 9%, 15%에서는 20%미만의 당화율 증가를 보였다. - 갈대와 볏짚의 전처리 후 당으로 전환되는 셀룰로스 성분이 많아지고 리그닌이 제거 되어 당화율이 증가하였다. 실험효소 단독첨가 Fig. 85. 실험효소 단독 첨가 시 당화 분석 갈대 당화 - 기질 6%, 상용효소 1X Fig. 86. 갈대 6% 조건에서 당화 분석

197 - 기질 6%, 상용효소 2X Fig. 87. 갈대 6% 및 증가된 상용효소 조건에서 당화 분석 볏짚 당화 - 기질 6%, 상용효소 1X Fig. 88. 볏짚 6% 조건에서 당화 분석 - 기질 6%, 상용효소 2X Fig. 89. 볏짚 6% 및 증가된 상용효소 조건에서 당화 분석

198 갈대 당화 - 갈대 9%, 12%, 15% Fig. 90. 갈대의 농도를 변화시켰을 때의 당화 분석

199 제6절 섬유소의 당화 및 에탄올발효 통합공정을 위한 균주 개발 섬유질계 바이오매스로부터 바이오에탄올을 생산하는 과정은 크게 전처리(pretreatment), 당화(saccharification), 발효(ethanol fermentation) 및 정제(purification) 공정으로 이루어지 며, 각 공정은 개별적으로 이루어지고 있다. 효소를 이용한 당화공정과 에탄올 생산균주를 이용한 발효공정도 개별적으로 이루어져, 섬유소 분해효소 생산균주에 의해 생산된 효소를 이용하여 먼저 섬유질을 포도당으로 변화시킨 후 Saccharomyces 등의 발효균주에 의해 발 효공정이 수행되고 있다. 당화효소의 생산과 에탄올 발효는 미생물에 의해 이루어지므로 당화효소 생산균주와 에탄올 발효균주의 혼합배양방법의 개발 또는 당화와 발효를 동시에 수행할 수 있는 균주의 개발이 이루어져 당화/발효 통합공정이 수행된다면 보다 효율적으 로 에탄올을 생산할 수 있을 것이다. 본 연구에서는 섬유질계 원료로부터 효율적으로 bioethanol을 생산하기 위한 기초 연구로 당화와 발효 공정을 통합하여 수행할 수 있는 균주를 개발하고자 하였다. 즉 효소적 방법 으로 섬유소로부터 포도당을 얻는데 필수적으로 요구되는 endoglucanase, cellobiohydrolase 및 β-glucosidase를 대표적인 에탄올 생산균인 Saccharomyces cerevisiae 세포표면에 발현시킨 형질전환체를 제작하여 당화와 발효를 동시에 수행할 수 있는 가능성을 타진하였다. 한편 효소적 방법으로 섬유질계 원료를 당화시키는 방법에서는 높은 효소 가격이 제한사항이 되고 있는 점에 착안하여 섬유질 분해효소를 생산하는 미생 물과 발효균주를 혼합배양하여 에탄올을 생산하는 방법의 적용 가능성에 대해서도 확인하 였다. 또한 NaOH 전처리가 볏짚, 보릿짚, 밀짚 및 억새풀의 구조적 특성에 미치는 영향을 조사하여 농업부산물의 전처리 방법을 개발하는데 기초자료로 활용하고자 하였다. Ⅰ. 세포표면발현 기술을 이용한 당화/ 발효 통합공정용 효모 균주 개발 최근들어 functional protein을 세포표면에 발현시키기 위한 다양한 연구가 이루저져왔다 (Belien et al., 2005; Desvaux et al., 2006; Kaya et al., 2008; Lee et al., 2011). 단백질을 세포표면에 발현시키기 위해서는 먼저 관심 단백질의 유전자와 target organism의 세포표 면에 발현되는 단백질의 유전자를 유전적으로 융합하여야 한다. 효모 세포표면 발현 (yeast surface display, YSD)는 항체의 친화도, 특이성, 안정성을 향상시키기 위한 강력한 도구로 사용되어 왔으며 (Kondo and Ueda, 2004), 최근에는 산업적으로 이용할 목적으로 다양한 단백질을 효모 세포표면에 발현시켰다 (Pepper et al., 2008; Pan et al., 2008; Zhu et al., 2006). 농업부산물과 같은 섬유질계 원료로부터 바이오에탄올을 생산하기 위해서는 먼저 전처리 와 당화과정을 거쳐야 한다. 효소적 방법으로 섬유질 원료를 당화하기 위해서는 3 종류의 효소(enddoglucanase, cellobiohydrolase, β-glucosidase)가 필수적으로 요구된다. 본 연구에 서는 당화/발효 통합공정용 효모 균주를 개발하기 위해 먼저 enddoglucanase, cellobiohydrolase, β-glucosidase를 각각 세포표면에 발현시킨 효모 형질전환체를 제작한 후에, 이 세 효소의 기능을 모두 가진 융합 유전자를 구축하고 이를 세포표면에 발현시킨 효모 형질전환체를 제작하고 이의 당화 및 발효 능력을 확인하였다. 1. 단일 효소를 세포표면에 발현시킨 효모 형질전환체 개발

200 가. Trifuncional 효소 (Ce44)를 세포표면에 발현시킨 효모 형질전환체 개발 (1) 사용균주 및 배지 Tri-functional 효소 (Cel44)는 인삼 뿌리에서 분리한 Paenibacillus polymyxa w균주에서 클 로닝하여 사용하였으며 (그림 1 & 그림 2) (Cho et al, 2006; Cho et al, 2007). Saccharomyces cerevisiae EBY100는 YPD배지 (1% yeast extract, 2% peptone and 2% dextrose) 및 transformed S. cerevisiae EBY100는 tryptophan free SD 배지(Clontech Laboratories Inc., CA 94043, USA)를 사용하여 배양하였다. < 그림 1> Characterization of cel44 gene for yeast surface display (2) cel44 유전자 클로닝을 위한 primer design cel44 gene fragment 분리를 위해 Paenibacillus polymyxa genomic DNA를 template로 하 여 sense primer #2525F 5' -GCTAGCGTGGTTCACGGTCAA ACG-3' (with NheI restriction site)와 antisense primer #2526R 5' -GGATCC TGGAGACGTGTAATG CCA-3' (with BamHI restriction site)를 사용하였다 (그림 2). (3) cel44 유전자 증폭 위의 primer set을 사용하여 PCR로 증폭한 1.5kb의 DNA fragment를 elution하였다 (그림 3). (4) cel44 유전자 클로닝 증폭된 cel44 gene는 제한효소 NheI와 BamHI으로 절단한 다음 shuttle vector인 pct에 클 로닝하였다 (그림 4, 5). 이 plasmid를 pct-cel44로 명명하고 E. coli DH5α에 형질전환시킨 다 음 이후 실험의 자료로 사용하였다. 다시 plasmid를 분리한 후 cel44 존재여부를 확인하였다 (그림6)

201 1 ATGAGAGCGAAAAATAGTAGTAGTATTCTGTTCAAACGTTCCAAATGGCTGCCTGTCGTC 61 ATGGCCTGCACGATGATAGTAGGGGGGGCTTTACCTGCTCCAGCTGTGGTTCACGGTCAA 121 ACGGCAAAGACTATTACTATTAAAGTAGATACATCCAAGGAACGTAAGCCTATTAGCCCT 181 TATATATACGGTACAAATCAGGATTTGGCAGGCGATGAAAATATGGCTGCCAGACGACTT 241 GGTGGCAATCGAATGACCGGATACAACTGGGAAAACAATATGTCCAATGCAGGAAGTGAC 301 TGGCAGCAATCTAGCGATAACTATTTATGCAGTAATGGTGGCCTGACACAAGCCGAATGT 361 GAAAAGCCAGGAGCGGTGACGACTTCGTTTCATGACCAATCGCTGAAGCTTGGCACTTAT 421 TCTTTAGTTACGTTGCCGATGGCCGGTTATGTGGCTAAGGATGGAAACGGAAGTGTGCAG 481 GAAAGCGAAAAGGCCCCTTCCGCTCGTTGGAATCAGGTCGTAAACGCCAAAAATACACCG 541 TTCCAACTACAGCCTGATCTGAATGACAATCGGGTCTATGTTGATGAGTTCGTCCATTTT 601 TTAGTGAACAAGTACGGCACTGCTTCAACAAAGGCGGGTGTGAAAGGATATGCCCTCGAC 661 AATGAACCCGCTCTCTGGTCGCATACGCACCCACGCATTCATGGTGAAAAAGTCGGAGCG 721 AAAGAGTTGGTAGACCGGTCAGTCAGTTTATCCAAAGCTGTGAAAGCGATTGACGCAGGT 781 GCAGAAATTTTTGGGCCGGTTCTTTACGGATTTGGCGCCTATAAAGATCTTCAAACTGCA 841 CCTGATTGGGACTCTGTAAAAGGCAATTATAGCTGGTTCGTAGACTATTACCTGGATCAA 901 ATGCGCCTTAGCTCGCAAGCCGAAGGCAAGAGATTGCTGGATGTATTCGACGTACACTGG 961 TATCCCGAAGCGATGGGCGGAGGCATACGAATTACGAATGAGGTAGGCAATGACGAAACG 1021 AAGAAAGCCAGAATGCAGGCACCTCGCACCTTGTGGGACCCGACCTATAAGGAAGATAGT 1081 TGGATCGCTCAATGGAACAGCGAGTTTTTGCCCATACTACCTCGATTGAAGCAGTCGGTG 1141 GATAAATATTATCCGGGAACCAAGCTGGCAATGACCGAGTATAGCTATGGCGGCGAAAAT 1201 GATATTTCCGGCGGGATTGCGATGACCGATGTGCTGGGTATCTTGGGCAAAAATGATGTT 1261 TATATGGCAAACTACTGGAAGCTAAAGGATGGTGTCAACAACTACGTTAGTCCCGCTTAC 1321 AAGCTTTATCGCAATTATGACGGAAAAAACTCTACTTTCGGTGATACCAGTGTTAGTGCG 1381 CAAACATCGGATATTGTCAATAGCTCGGTCCACGCTTCCGTAACGAATGCATCCGACAAA 1441 GAACTGCACCTCGTTGTCATGAATAAAAGCATGGACAGCGCATTCGACGCCCAATTTGAT 1501 CTTTCCGGCGCGAAGACTTACAGTTCCGGTAAAGTATGGGGGTTCGATAAAAACAGCTCG 1561 CAAATTAAAGAAGCAGCGCCAATCACGCAAATTTCAGGCAACCGTTTTACTTATACCGTA 1621 CCGCCTTTGACGGCATATCACATTGTGCTGACTACTGGCAATTACACGTCTCCAGTGGAA NheI # F 2525 GCT AGC GTG GTT CAC GGT CAA ACG 25 mer 65.3 deg C BamHI # R 2526 GGA TCC TGG AGA CGT GTA ATT GCC AG 27 mer 63.8 deg C Fragment size: 1.5 kb < 그림 2> Primer for cel44 sequence for cloning into pct yeast display vector A <그림 3> PCR amplification of cel44 gene B <그림 3> Plasmid map of pctcon. A: CON cd20 is expressed from the plasmid as a fusion to the yeast mating protein Aga2. B: The CON cd20 gene can be replaced with an interesting gene using the Nhe1 and BamH1 sites

202 < 그림 5> Vector constriction for yeast surface display of Cel44 enzyme <그림 6> (A) Restriction digestion of pgem-t/cel44 and pct vector for isolation of cel44 gene with NheI and BamHI enzyme for cloning into pct vector. (B) restriction digestion of pct+cel44 vector with NheI and BamHI enzyme. (5) 섬유질 분해효소 endoglucanse 세포표면발현 효모 형질전환체 제작 (가) pct-cel44의 Saccharomyces cerevisiae EBY100에 형질전환 효소의 세포 표면발현용으로 사용한 효모는 Saccharomyces cerevisiae EBY100 (MATα ura3-52 trp1 leu2-δ1 his3δ200 pep4::his3 prb1δ1.6r can1 GAL1)로 uracil 영양요구성 변이 주이며 haploid 상태이다. Plasmid pct-cel44를 electro-transformation method에 의하여 S. cescerevisiae EBY100에 형질전환시킨 후 tryptophan free SD 배지에서 형질전환체를 선발하 여 BY100/pCT-cel44로 명명하였다

203 (나) 선발된 형질전환체의 cel44 확인 cel44 gene의 클로닝 primer을 사용하여 효모 형질전환체의 colony PCR을 통해 1.5kb의 cel44 유전자가 효모 형질전환체에 도입된 것을 확인하였다 (그림 7). <그림 7> Colony PCR for the confirmation of transformation of pct/cel44 vector into Saccharomyces cerevisiae EBY100. (다) 효모 세포표면에 발현된 Cel44의 활성 확인 효소활성은 생성되는 환원당의 양을 DNS method에 의해 비교분석하였다. 형질전환 및 유도 된 효모의 배양액을 원심분리한 후 pellet을 O.2 M citrate buffer (ph 7.0)에 2회 세척 후 현탁 하여 사용하였다. 현탁된 효모액에 기질로 100 ul의 1% carboxy-methylcellulose를 첨가한 후 37 C에서 1 시간 반응시킨 후 생성된 환원당의 양을 DNS method에 의한 발색도를 대조구와 비교하여 세포표면 발현된 Cel44 효소가 활성을 나타냄을 확인하였다 (그림 8). <그림 8> Enzyme activity assay of surface displayed Cel44 on Saccharomyces cerevisiae EBY100 using DNS method. (A) positive control (used Oph enzyme). (B) transformed yeast cell induced with galactose, (C) transformed yeast cell without induced with galactose. 나. 섬유질 분해효소 β-glucosidase (BGL)의 세포 표면발현 효모 형질전환체 제작 (1) 사용균주 및 배지 β-glucosidase 유전자 (bgl)는 실험실에서 선발한 Neosartory fischeri Nf 1595 균주에서 클 로닝하여 사용하였다 (Ramachandran et al, 2012). Saccharomyces cerevisiae EBY100는 YPD 배지 (1% yeast extract, 2% peptone and 2% dextrose) 및 transformed S. cerevisiae EBY100는 tryptophan free SD 배지(Clontech Laboratories Inc., CA 94043, USA)를 사용하여

204 배양하였다. (2) bgl gene 내의 BamHI 제한효소 부위 제거 그림 9에서 보는 바와 같이 bgl gene 내에는 BamH1 site가 있어 직접 클로닝을 할 수 없다. Codon degeneracy를 이용하여 효소의 아미노산 서열에 변화가 없도록 primer를 design하여 site-directed mutagenesis를 수행하여 BamHI restriction site가 제거된 bgl gene을 얻었다 (그 림 10, 11). XhoI (337) ApaI (247) BamHI (96) EcoRI (577) XhoI (919) PvuI (1002) bgl gene 100bp < 그림 9> Restriction map of bgl gene of Neosartory fischeri Nf1595. (3) BamHI 제한부위가 제거된 bgl 유전자 (BamHI-free bgl mutant)의 PCR 증폭 Neosartory fischeri Nf 1595의 genomic DNA를 template로 하여 sense primer #2539F 5' -GCTAGCATGTCCATACATTCGCGA-3' (with NheI restriction site)와 antisense primer #2540R 5' -TGATCA TCGCGCATGTTTTCTACG-3' (with BamHI restriction site)를 사용 하여 PCR로 증폭된 1.6 kb의 BamHI restriction site가 제거된 bgl을 얻었다 (그림 12). < 그림 10> Primers for site-directed mutagenesis of BamHI site of bgl gene

205 < 그림 11> Confirmation of the site directed mutation of BamHI site of bgl gene. <그림 12> PCR amplification of bgl gene (BamHI-free bgl mutant) with NheI and BamHI restriction sites. L1, molecular marker (100 bp ladder); L2 to L7, amplified bgl gene with NheI and BamHI enzyme restriction site. (4) BamHI-free bgl 유전자의 pct vector 클로닝 PCR 증폭된 1.6 kb의 DNA fragment를 elution하여 제한효소 NheI와 BamHI로 절단한 다음 shuttle vector인 pct에 클로닝하여 얻은 pct-bgl을 E. coli DH5α에 형질전환시킨 후 plasmid를 분리하여 colony PCR 및 DNA sequencing로 bgl 유전자의 존재를 확인하였다 (그 림 13, 14)

206 < 그림 13> PCR amplification of E. coli DH5α with pct/bgl (BamHI-free bgl mutant). < 그림 14> Restriction map of pct-bgl (BamHI-free bgl mutant). (5) bgl을 도입한 Saccharomyces cerevisiae EBY100 형질전환체 선발 pct-bgl을 electrotransformation method를 사용하여 S. cescerevisiae EBY100에 도입한 후 tryptophan free SD medium에서 형질전환체를 선발하고 EBY100/ pct-bgl (BamHI-free bgl mutant)로 명명하였다. Colony PCR로 효모 형질전환체에 pct-bgl (BamHI-free bgl mutant) 이 도입된 것을 확인하였다. Aga2p/BGL fusion protein의 발현은 GAL1 promoter에 의하여 조 절되므로 형질전환체를 YPDG medium에서 생육시킨 후 BGL의 기질을 첨가하여 효소활성을 육안으로 관찰하였다 (Kalyani et al, 2012). 다. 섬유질 분해효소 cellobiohydrolase (CBH) 세포 표면발현 효모 형질전환체 제작 (1) 사용균주 및 배지

207 Cellobiohydrolase (cbh) 유전자는 실험실에서 선발한 Fusicoccum sp. BCC4124 균주에서 클 로닝하여 사용하였다. Saccharomyces cerevisiae EBY100는 YPD배지 (1% yeast extract, 2% peptone and 2% dextrose) 및 transformed S. cerevisiae EBY100는 tryptophan free SD 배지 (Clontech Laboratories Inc., CA 94043, USA)를 사용하여 배양하였다. (2) Cellobiohydrolase 유전자 (cbh)의 PCR 증폭 및 pgem-t/cbh 구축 : Fusicoccum sp. BCC4124의 genomic DNA를 template로 하고 sense primer #2545F 5' -GCTAGCCAGCAGGTCGGCACG-3' (with NheI restriction site)와 antisense primer #2546R 5' -GGATCCAGCGGTCTTGTTGAAGGT-3' (with BamHI restriction site)를 사용하 여 PCR한 후 증폭된 1.4 kb의 DNA fragment를 elution하여 pgem-t vector에 ligation시켜 pgem-t/cbh를 구축한 후 E. coli DH5α에 도입하여 얻은 형질전환체로부터 cbh의 존재를 확 인하였다 (그림 15, 16, 17). < 그림 15> DNA sequence of cbh (cellobiohydrolase) gene and primer set used. <그림 16> Colony PCR for the confirmation of E. coli DH5α harboring pgem-t/cbh. L1, molecular marker (100 bp ladder); L2 to L6, amplified cbh gene with NheI and BamHI enzyme restriction site

208 <그림 17> Restriction digestion of pgem-t/cbh with (A) NheI and BamHI enzyme, and (B) EcoRI enzyme. (3) 효모 형질전환을 위한 pct-cbh 구축 pgem-t/cbh를 NheI와 BamHI로 절단하여 1.34 kb의 DNA framgment를 분리하고 shuttle vector인 pct에 ligation하여 얻은 pct-cbh를 E. coli DH5α에 도입한 후 형질전환체로부터 pct-cbh를 분리하여 DNA sequencing으로 cbh의 존재를 확인한 후 효모의 형질전환에 사용 하였다 (그림 18). <그림 18> Restriction digestion of pct/cbh with NheI and BamHI enzyme. L1, molecular marker (100 bp ladder); L2, pct-cbh; L3 and L4, restriction digestion of pct-cbh with NheI and BamHI enzyme. (4) pct-cbh를 도입한 Saccharomyces cerevisiae EBY100 형질전환체 선발 pct-cbh를 electrotransformation method를 사용하여 S. cerevisiae EBY100에 도입한 후 tryptophan free SD medium에서 형질전환체를 선발하고 EBY100/pCT-cbh로 명명하였다. Colony PCR로 효모 형질전환체에 pct-bgl (BamHI-free bgl mutant)이 도입된 것을 확인하 였다. 2. 효모 세포 표면발현 증진을 위한 섬유소 분해효소 개량

209 활성이 증가된 섬유소 분해효소를 효모 세포표면 발현용 유전자원으로 이용하기 위해 cellulase와 β-glucosidase를 DNA shuffling과 효소의 C-terminal 부위 제거에 의한 효소분자 의 최소화 방법을 사용하여 개량을 시도하였다. 가. DNA shuffling에 의한 Cel44C의 cellulase, xylanase, lichenase 활성 증진 (1) 사용 유전자, 운반체, 숙주세포 Cellulase (endoglucanse), xylanase, lichenase의 3중 활성을 가지는 Cel44 효소의 유전자는 인삼 뿌리에서 분리한 Paenibacillus polymyxa w균주에서 클로닝하여 사용하였다. pgemt-easy를 cloning vector로 사용하였으며, 형질전환용 숙주세포로는 E. coli DH5α를 사 용하였다. (2) cel44c의 DNA shuffling cel44c는 #1471F5'-TTGGATCCTTTGACACAGCCGAAGTG-3', #1585R5- 'GTCGACTTAGCC AGTAGTCAGCACAATG-3' 의 primer를 사용하여 PCR하여 사용하였다. 얻은 1.8 kb의 cel44c gene은 DNase 1 (INtRON, 10 mg/ml)로 처리하여 random fragment pool을 준비하고 전기영동한 후 10 bp bp 사이 크기의 DNA fragment를 분리하였다. 분리한 DNA fragment와 original plasmid를 primer를 사용하지 않고 PCR 증폭하여 본래의 크기와 유사한 1.8 kb 정도의 얻었다. 이를 다시 primer set (#1471F 5' -TTGGATCCTTTGACACAGCCGAAGTG-3', #1585R 5' -GTCGACTTAGCCA GTAGTCAGCACAATG-3' )를 사용하여 PCR을 한 다음 약 2 kb 정도 크기의 fragment를 mutant일 가능성이 있는 것으로 추정하여 분리 정제하였다 (그림 19). <그림 19> Reassembling of 1.8 kb gene from 2 kb random fragments. A. 1.8 kb DNA fragment randomly encoding cellulase, xylanase, and linchenase was amplified by PCR. B. After digestion of the gene with 0.15 unit DNase I for 15 min at 20 C (b), fragements of 2 kb were purified from an agarose gel (c). Purified fragements were reassembled into a full-length gene at high fragment concentration (50ng/µg) in the absence of primers. The average size of the PCR product increases gradually via the priming of one product on another. The heterogeneous appearance of the product is largely

210 due to the partially single-stranded nature of the product. (e) After addition of primers and additional cycles of PCR, a single PCR product of the correct size is typically obtained. Cloning of this product into plasmid yielded appr. 60% clones displaying cellulase activity, reflecting that mutation occurred during the reassemble process. (3) Mutated cel44 유전자를 가진 형질전환체 선발 DNA shuffling에 의해 얻어진 mutated cel44는 pgemt-easy vector를 사용하여 E. coli DH5α에 형질전환시켜 얻은 clone library로부터 cellulase 활성을 가진 clone을 선별한 후 377 clone을 1차 선발하였다. 이 중에서 Cel44에 비해 활성이 가장 큰 M2, M2-1, M32를 2차 선 발하여 cellulase, xylanase, linchenase 활성을 확인한 후 M2d와 M2-1을 이후 실험에 사용하 였다 (그림 20). <그림 20> Screening for mutants with CMCase activity. A, Negative control with E. coli harboring vector. B, Mutant M2 displaying relatively highest activity among mutants. C. Mutant M2-1. D. Mutant M32. E. Original cel44c. (4) Mutant M2와 M2-1의 cel44c 유전자 돌연변이 부위 확인 Mutated cel44 gene 가진 형질전환체 M2와 M2-1의 cel44c 유전자의 염기서열 을 분석한 결과 M2 clone에서 amino acid residue Pro471이 Ala471로 변환된 것을 확인하였으며, M2-1 clone에서는 Arg26 Gln26, Ala317 Thr317, Pro471 Ala471의 3곳에서 아미노산이 대 체되어 있는 것을 확인하였다 (그림 21). (5) Mutated Cel44C의 효소학적 특성 변이 Cel44의 cellulase 활성 최적 ph는 7.0으로 wild type Cel44C의 cellulase의 최적 ph와 같았으나, 최적 ph에서 Cel44CM2와 cel44cm2-1의 효소활성은 Cel44C에 비해 각각 약 50%, 20% 높았다. Cel44CM2와 Cel44CM2-1의 cellulase 최적 온도는 Cel44 celluase의 최적 온도 5 0 보다 약간 높았으며, 50 에서 Cel44CM2와 Cel44CM2-1 활성은 Cel44C에 비해 각각 약 48%, 23% 높았다 (그림 22). 변이 Cel44C의 xylanase 활성도 cellulase와 같은 경향을 나타냈다. Cel44CM2와 Cel44CM2-1의 xylanase 활성 최적 ph는 6.0으로 wild type Cel44C와 같았으나, ph 6.0에서의 Cel44CM2와 Cel44CM2-1의 xylanase 활성은 Cel44C에 비해 각각 약 48%, 22% 높았다. Cel44CM2와 Cel44CM2-1의 xylanase의 최적온도는 Cel44 celluase의 최적온도보다 약간 높은 것으로 나타났으며, Cel44CM2와 Cel44CM2-1 xylanse 활성도 Cel44C에 비해 높은 것으로 나

211 타났다 (그림 23). 변이 Cel44의 lichenase의 최적 ph는 7.0으로 wild type의 최적 ph와 같았으나, 최적 ph에 서 Cel44C lichenase에 비해 Cel44CM2와 Cel44CM2-1 lichenase는 각각 약 65%, 30%가 높았 으며, 최적온도에서 Cel44CM2와 Cel44CM2-1 lichenase 활성은 Cel44C에 비해 각각 약 60%, 20% 높았다 (그림 24). <그림 21> Homology alignment of the amino acid sequences of the wild type and two mutants M1 and M2-1. <그림 22> Effect of ph and temperature on relative CMCase activities of Cel44C, M2 and M2-1 enzymes. CMC was used as the substrate

212 <그림 23> Effect of ph and temperature on xylanase activities of Cel44c, M2 and M2-1 enzymes. Oat spelt xylan was used as the substrate. <그림 24> Effect of ph and temperature on lichenase activities of Cel44c, M2 and M2-1 enzymes. Linchenan was used as the substrate. 나. 효소 분자의 최소화(C-terminal 부위 제거)에 의한 효소활성 증진 (1) 사용 유전자 Bacillus subtilis bglc (pbg150), Pectobacterium chrysanthemi cel5z (pcz250), Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum cela (ply100), Thermotoga maritima cel5c (ptc450)의 4종류의 유전자를 사용하여 효소 분자의 C-terminal 부위 제거에 의한 효소 활성 증진을 시도하였다. 표 1. Bacterial strains and plasmids used Designation Relevant characteristics Sources Escherichia coli DH5α pola12, lacz53, rpsl151, thya36, rha-5, deoc2, λ -, IN(rrnD-rrnE) Bacillus subtilis A-1 For bglc This study Pectobacterium chrysanthemi PY35 For cel5z This study Pectobacterium carotovorum subsp. For cela carotovorum LY34 This study Thermotoga maritima MSB8 For cel5c This study pbluescript II SK+/ KS+ Cloning vector, Amp r, T3 primer, T7 primer Stratagene pgem-t Easy vector PCR cloning vector, Amp r, T7 primer, SP6 primer Promega

213 표 2. Glycosyl hydrolase genes used Clone pbg150 pcz250 ply100 ptc450 Relevant characteristics 2.0 kb fragment containing bglc gene of Bacillus subtilis in pgem-t easy vector 1.9 kb fragment containing cel5z gene of Pectobacterium chrysanthemi in pgem-t easy vector 1.7 kb fragment containing cela gene of Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum in pgem-t easy vector 1.5 kb fragment containing cel5c gene of Thermotoga maritima in pgem-t easy vector Accession number AF AF AE (2) Bacillus subtilis A-1 bglc의 C-말단 단축 유전자 클로닝 C-terminal 부위가 제거된 truncated cellulase를 만들기 위해 original gene의 염기서열에 기초하여 new stop codon을 가진 primer를 제작하여 bglc를 PCR 증폭한 후 클로닝 제한효소 로 처리하여 pbluescript II KS+ vector에 ligation시킨 후 Escherichia coli DH5α에 도입하고 효소활성을 가진 형질전환체들을 선발하였다. 형질전환체들의 효소 활성과 truncated bglc 염 기서열을 분석한 결과 298 aa 이하의 단백질들은 cellulase 활성을 보여 주지 않았고, 1,005 bp 로 334 aa을 암호화하는 p334 clone이 최소 크기의 cellulase clone으로 판명되었으며, extracellular signal peptide를 제외한 mature enzyme은 298 aa 이었다. C-terminal 부위 제거 에 의한 효소 활성증가는 관찰되지 않았다. BglC SK+ p356 p351 P346 P341 P338 P336 P335 P334 P333 P332 P331 P330 P326 <그림 25> Detection of cellulase activity and comparison of intact BglC of B. subtilis with several truncated BglCs by the agar diffusion method. The cells were incubated for 24 h at 37 o C. The E. coli harboring pbluescript II SK+ as a negative control. (3) Pectobacterium chrysanthemi cel5zc의 C-말단 단축 유전자 클로닝 P. chrysanthemi cel5z 유전자를 기본으로 한 일련의 truncated protein을 암호화하는 modified cellulase gene은 cel5z p309 - cel5z p426 에 해당되는 primer 사용하여 PCR에 의해 제작 한 후 bglc에서와 같은 방법으로 실험하였다 (표 3). 활성을 가진 clone 중 가장 분자량이 작 은 것은 p323 clone으로 972 bp DNA로 323 amino acid를 암호화하였으며, 이 효소의 활성은 wild type enzyme에 비해 높은 것으로 나타났다 (그림 26, 그림 27). (4) Pectobacterium chrysanthemi LY34 cela의 C-말단 단축 유전자 클로닝 Pectobacterium chrysanthemi LY34의 cela 유전자를 기본으로 cela p318 - cela p505 에 해당하

214 는 primer를 사용하여 위에서와 같은 방법으로 C-terminal이 제거된 효소들을 생산하는 형질 전환체를 선발하였다. 활성을 가진 clone 중에서 효소의 분자량이 가장 작은 것은 p327 clone 으로 modified cela gene은 987 bp 였으며, 327 amino acids를 암호화하였다. Modified CelA 의 효소활성은 wild type CelA의 활성보다 높지 않았다 (그림 28). 표 3. List of primers used Name Sequence Stop codon clone 61F AAAAGCTTGC AATATTGATG AACACACCG (HindIII) 309R AGGATCCTTA ATAGGTCGAT GCCCCCTCA (BamHI) Ocher p R AGGATCCTTA TATAGAATCC GGATAATA (BamHI) Ocher p R AGGATCCCTA ATTTATAGAA TCCGGATA (BamHI) Amber p R AGGATCCTCA CAAATTTATA GAATCCGG (BamHI) Opal p R AGGATCCCTA GGTCAAATTT ATAGAATC (BamHI) Amber p R AGGATCCTCA CTCGGTCAAA TTTATAGA (BamHI) Opal p R AGGATCCTCA AGACTCGGTC AAATTTAT (BamHI) Opal p R AGGATCCCTA ACCAGACTCG GTCAAATT (BamHI) Amber p R AGGATCCTTA CTTACCAGAC TCGGTCAA (BamHI) Ocher p R AGGATCCTCA TTTCTTACCA GACTCGGT (BamHI) Opal p R AGGATCCCTA TACTTTCTTA CCAGACTC (BamHI) Amber p R AGGATCCCTA TTTTACTTTC TTACCAGA (BamHI) Amber p R AGGATCCTCA GCTTTGAATG ATCGATTT (BamHI) Opal p R AGGATCCTTA CGCTTTATAT GGCCAGCT (BamHI) Ocher p R AGGATCCTCA TTGCCGGCGT GTCGGTCG (BamHI) Opal p R AGGATCCTTA GTTACAGCTA CCAACCAG (BamHI) Ocher p426 Restriction enzyme sites are underlined and stop codons are boldfaced.(2) KS+ p309 p329 p324 p334 p364 p426 p323 Cel5Z

215 <그림 26> Detection of cellulase activity and comparison of intact Cel5Z of P. chrysanthemi with several truncated Cel5Zs by the agar diffusion method. A NcoI PstI NcoI NdeI ClaI ClaI ClaI ClaI T7 Cel5Z T3 B p426 p364 p334 61F 334R 364R 426R PCR / HindIII + BamHI Cloning in KS+ A43? A334 W364 N426??? + 43aa 291aa 30aa 62aa + Y310 A334?? + DNA sequence: TATCCGGATTCTATAAATTTGACCGAGTCTGGTAAGAAAGTAAAATCGATCATTCAAAGCTGGCCATATAAAGCGGGC aa sequence: Y P D S I N L T E S G K K V K S I I Q S W P Y K A G Position of aa: New stop : *2 *2 *1 *3 *1 *3 *3 *1 *2 *3 *1 *1 *3 *2 p334 p329 p324 p323 p322 p321 p320 p319 p318 p317 p316 p315 p314 p : SP : CD : LR : CBD + : CMCase activity *1 : Amber stop *2 : Ochre stop *3 : Opal stop C α 2 α 1 α 3 A334 G320 K321 K324 S325 I327 Q328 α 8 α 4 Y310 α 8 α 7 α 5 E318 S319 K322 I326 S329 V323 α6 <그림 27> (A) Physical map of the cel5z gene and the truncated cel5z genes of P. chrysanthemi. (B) A part of nucleotide and deduced amino acid sequence of second construction of truncated cellulase genes (cel5z p309 to cel5z p329 ). Last three nucleotides indicated by arrow were site-directed mutated to the corresponding new stop codon. (C) 3D structure of Cel5 Erwinia chrysanthemi (36) and magnification of α8 region ranging from E318 to S329 of Cel5Z. Position of boxed V323 is the final amino acid residue for the active cellulase. SP, signal peptide; CD, catalytic domain; LR, linker region; CBD, cellulose binding domain. 표 4. List of primers used in the study of cela gene of Pcc LY34 Name Sequence Stop codon clone 1388F AAA AGC TTC TCA CTA CAT CAC ACG C (BamHI) 1744R AAG GAT CCT TAT GCT CTG ACA AAT TT (BamHI) Ocher p R AAG GAT CCT TAC TGT GCT CTG ACA AA (BamHI) Ocher p R AAG GAT CCT TAA ATC TGT GCT CTG AC (BamHI) Ocher p R AAG GAT CCT TAG CGA ATC TGT GCT CT (BamHI) Ocher p R GTT GGT CGG TTA CGT TGG Ocher p344 Restriction enzyme sites are underlined and stop codon is boldfaced

216 KS+ p318 p326 p327 p328 p329 p354 p377 Cel5A <그림 28> Detection of cellulase activity and comparison of intact CelA of Pcc LY34 with several truncated CelAs by the agar diffusion method. The cells were incubated for 24 h at 37 o C. The E. coli harboring pbluescript II KS+ as a negative control. (5) Thermotoga maritima cel5c의 C-말단 단축 유전자 클로닝 T. maritima cel5c 유전자를 기본으로 cel5c p292 - cel5c p317 에 해당되는 primer를 사용하여 위에서와 같은 방법으로 C-terminal이 제거된 Cel5C를 생산하는 형질전환체를 선발하였다 (표 5, 그림 29). 선발된 clone 중에서 분자량이 가장 작은 modified Cel5C를 생산하는 clone은 p310 clone으로 modified cel5c의 크기는 933 bp로 310 amino acids의 효소를 암호화하였다. 표 5. List of primers used in the study of cel5c gene of T. maritima Name P1F 316R 315R 314R 313R 312R 311R 310R 309R 308R 307R 302R 297R 292R Sequence TCT GCT TTG GAC GTT TCG ATT (XhoI) CCG ATA TCT TAA ATG CTA TCT CCT CCT (EcoRV) CCG ATA TCT TAG CTA TCT CCT CCT ATT AA (EcoRV) CCG ATA TCT TAA TCT CCT CCT ATT AAA (EcoRV) CCG ATA TCT TAT CCT CCT ATT AAA GCT (EcoRV) CCG ATA TCT TAT CCT ATT AAA GCT TCT (EcoRV) CCG ATA TCT TAT ATT AAA GCT TCT AAA AGA T (EcoRV) CCG ATA TCT TAT AAA GCT TCT AAA AGA TC (EcoRV) CCG ATA TCT TAA GCT TCT AAA AGA TCT (EcoRV) CCG ATA TCT TAT TCT AAA AGA TCT TTA TTC (EcoRV) CCG ATA TCT TAT AAA AGA TCT TTA TTC C (EcoRV) CCG ATA TCT TAC CAG GTT TTT CTC AG (EcoRV) CCG ATA TCT TAA GTA TCA TAA ACA CC (EcoRV) CCG ATA TCT TAA AAA CCG GAA CAA AA (EcoRV) Stop codon Ocher Ocher Ocher Ocher Ocher Ocher Ocher Ocher Ocher Ocher Ocher Ocher Ocher Clone p316 p315 p314 p313 p312 p311 p310 p309 p308 p307 p302 p297 P292 Restriction enzyme sites are underlined and stop codon is boldfaced

217 KS+ p317 p316 p315 p314 p313 p312 p311 p310 p309 p308 p307 p302 p297 p292 <그림 29> Detection of cellulase activity and comparison of intact Cel5C of T. maritima with several truncated Cel5Cs by the agar diffusion method. The cells were incubated for 24 h at 37 o C. The E. coli harboring pbluescript II SK+ as a negative control. 3. 세종류의 섬유소 분해효소를 세포표면에 발현시킨 효모 형질전환체 개발 섬유질 원료로부터 bioethanol을 생산하기 위해서는 먼저 섬유소를 발효성 당으로 분해하여 야 하며, 효소를 이용하여 섬유질을 당화하기 위해서는 3종류의 효소인 endoglucanase, cellobiohydrolase 및 β-glucosidaserk 필요하다. 따라서 당화/발효 통합공정용 효모 균주도 이 3 종류의 섬유소 분해효소를 모두 가지고 있어야 한다. 섬유소 분해효소를 세포표면에 발현시 킨 효모 형질전환체를 제작하는 방법으로는 각각의 효소를 표면발현시키는 방법도 있으나 세 종류의 효소 기능이 한 분자에 통합된 효소 분자를 발현시키는 것이 더 효율적일 것으로 판단 된다. 본 연구는 세 종류의 섬유소 분해효소 기능을 가진 유전자를 제작하여 이를 효모의 세 포 표면에 display시켜 당화와 발효를 동시에 수행할 수 있는 형질전환 효모를 제작하기 위해 수행하였다. 가. 3 종의 효소를 하나의 fusion 효소로 클로닝을 위한 전략 (1) 기존 전략 Minicellullosome의 assembly를 통한 yeast surface display system을 개발하여 왔으나, 이 방법을 통하여 display되는 단백질은 거대 분자가 되어야하는 문제가 있다. (2) 본 실험에서 사용한 전략 본 연구자가 분리 클로닝한 cel44 gene을 이용하였다. cel44 유전자 (GH44)는 trifunctional enzyme으로 cellulase, xylanase 및 lichenase 활성을 가지는 domain이 있으며 이 유전자에 연 결된 FN domain은 일종의 linker protein으로 작용하며 그 다음에는 mannase domain (GH26) 이 위치하며 그 뒤에는 CBM (Cellulose binding domain)이 존재한다 (그림 30A) (Cho et al, 2006). 이는 하나의 enzyme protein에 4종의 효소기능을 가지는 것이 된다. 본 연구에서는 이 효소의 다기능성을 target으로 사용하여 하나의 enzyme protein에 cellulase, xylanase, lichenase, β-glucosidase, cellobiohydrase의 5종의 기능을 가지게 되는 효소를 구축하고자 하

218 였다. 구체적인 클로닝 전략으로 그림 30B 및 그림 30C에서와 같이 cel44 유전자의 mannase (GH26) domain 대신에 FN domain을 linker region으로 하여 β-glucosidase (BGL) gene을 overlap PCR 기법을 통하여 Cel44-FN-BGL의 fusion protein을 구축하였으며 (1단계), 독립적 으로 CBM region과 cellobiohydrase (CBH) gene을 overlap PCR 기법을 통하여 CBM-CBH fusion protein을 만든 다음 (2단계) 최종적으로 (3단계) 두 fusion 단백질을 연결하여 그림 30C와 같이 하나의 enzyme protein에 cellulase, xylanase, lichenase, β-glucosidase, cellobiohydrase의 5종의 기능을 가지게 되는 효소의 유전자가 하나로 연결된 5.5 kb 크기의 유전자로 클로닝하고자 하였다 (그림 31). <그림 30> Cloning strategy for the construction of fusion enzyme (3) 사용 유전자 본 연구에 사용한 Cel44, FN, CBD domain은 Paenibacillus polymyxa GS01에서 온 것이며, Neosartory fischeri Nfbgl1595의 BGL (β-glucosidase) (Ramachandranaet al, 2012) 및 Fusicoccum sp.의 CBH (cellobiohydrolse)는 제 2 세부과제의 연구 결과물로 이를 분양받아 사용하였다. <그림 31> Nucleotide sequence of the fused enzyme (cel + bgl + cbh) 나. Fusion 유전자 클로닝 (1) (cel44+fn+bgl) fusion 유전자 클로닝 1단계 실험으로 overlap PCR 클로닝을 통해 cel44+fn+bgl을 fusion한 3.68 kb의 DNA fragment를 얻어 (그림 32), 이를 pgem-t vector에 클로닝하고 숙주세포에 도입하였다. 형 질전환체에서 얻은 DNA의 PCR 증폭과 제한효소 분석결과 가상의 map과 일치하는 것을 확인

219 한 후 2단계 실험을 진행하였다 (그림 33). < 그림 32> Gradient overlap PCR of cel44+fn and bgl

220 <그림 33> Confirmation of cel44+fn and bgl fusion by PCR and restriction enzyme analysis. (2) (cbd +cbh) fusion 유전자 클로닝 2단계 실험으로 (cbd+cbh) fusion 유전자를 얻기 위해 그림 34에 제시된 sequence로부터 primer를 제작한 후 (그림 35), 이 primer를 사용한 overlap PCR을 통해 예상과 일치하는 약 1.8 kb의 (cbd+cbh) fusion DNA fragment를 얻었다 (그림 36). 이 DNA fragment를 pgem-t vector에 클로닝한 후 숙주세포에 도입한 후 colony PCR을 fused gene의 존재를 확인하였다 (그림 36). <그림 34> Fusion of cbd and cbh gene fusion

221 (3) Overlap PCR에 의한 [(cel44+fn+bgl)+(cbd+cbh)] fusion 유전자 클로닝 그림 37의 overlap PCR primer로 [(cel44+fn+bgl)+(cbd+cbh)] fusion 유전자 클로닝을 시도 하였으나 long DNA size PCR용 taq polymerase를 사용하여도 예상되는 PCR product를 얻을 수 없었다 (그림 38). < 그림 35> Overlap PCR primer design for cbd & cbh gene fusion < 그림 36> PCR confirmation for cbd and cbh gene fusion

222 <그림 37> Overlap PCR for [(cel44+fn+bgl)+(cbd+cbh)] fusion <그림 38> Confirmation of [(cel44+fn+bgl)+(cbd+cbh)] fusion by overlap PCR (4) pgem-t vector 제한효소 map에 의한 fusion 유전자 클로닝 1, 2단계에서 얻어진 clone들은 pgem-t vector에 클로닝하였기 때문에 pgem-t vector의 multiple cloning site (MCS) 상의 제한효소 map에 의한 [(cel44+fn+bgl)+(cbd+cbh)] fusion 유전자 클로닝을 시도하였다. 그림 39, 40, 41, 42에 제시된 전략에 따라 순차적인 클로닝을 시 도하여 최종적으로 그림 43에서 해당되는 kb의 insert DNA fragment 및 pgem-t vector의 위치를 확인하고 (cel44+fn+bg+cbd+cbh)] fusion gene이 pgem-t vector에 클로닝 된 것을 최종적으로 확인하였다. 그림 44, 45은 제한지도 상에 존재하는 다른 제한효소를 사용

223 하여 작성한 cloning된 융합 유전자의 제한지도로 본 실험에서 얻은 최종 clone이 (cel44+fn+bg+cbd+cbh)] fusion gene인 것을 확인할 수 있다. <그림 39> New cloning strategy using the restriction map of the multiple cloning site of pgem-t vector <그림 40> New cloning strategy using the restriction map of the multiple cloning site of pgem-t vector

224 < 그림 41> PCR for cbd (D) and cbh (H) (with SpeI and PstI site) < 그림 42> Digestion of pgem-t/cb by SpeI and PstI C : cellulase gene (cel44c), B : β-glucosidase gene (bgl) < 그림 43> Digestion of pgem-t/cbdh by SpeI and PstI C: cellulase (cel44c), B: β-glucosidase (bgl), D: cellulose binding domain (cbd), H: cellobiohydrolase (cbh) < 그림 44> Restriction mapping of pgem-t/cbdh

225 < 그림 45> Restriction mapping of pgem-t/cbdh (colony 7)wq (5) pgem-t에 클로닝된 (cel44+fn+bgl+cbd+cbh) fusion 유전자의 효소 활성 pgem-t에 클로닝된 (cel44+fn+bgl+cbd+cbh) fusion 유전자를 도입하여 얻은 E. coli DH5α형질전환체에 의한 cellulase (Kim et al, 2012) 및 β-glucosidase의 활성 생성 (An et al, 2012; Kim et al, 2013)을 확인할 수 있었다 (그림 46, 47). < 그림 46> Cellulase activity of E. coli DH5α haboring pgem-t/cbdh (with stop codon + SpeI site) <그림 47> β-glucosidase activity of E. coli DH5αhaboring pgem-t/cbdh (with stop codon + SpeI site) 다. (cel44+fn+bgl+cbd+cbh) fusion 유전자를 도입한 효모 형질전환제 제작 (1) pct vector에 (cel44+fn+bgl+cbd+cbh) fusion 유전자 클로닝 (cel44+fn+bgl+cbd+cbh) fusion 유전자를 효모에 도입하기 위하여 먼저 fusion 유전자를

226 yeast surface display vector인 pct vector에 클로닝하였다. Fusion gene의 cel44 gene에는 signal peptide (SP)가 존재하므로 이를 포함시킨 primer를 사용하면 이 SP 존재로 cel44 gene 전방에 있는 AGA2 region이 세포막을 통과시 절단되며 fusion gene의 최후방에 위치한 cbh gene의 stop codon을 제거하여 후미에 있는 Cmyc region과 연속성을 위해 이들 부분을 제외 하고 primer를 design하여 목적하는 PCR product를 사용하여 pct/cbdh를 구축하였다 (그림 48, 49). pct/cbdh의 제한효소지도를 작성한 결과 예상대로 (cel44+fn+bgl+ cbd+cbh) fusion 유전자를 가지고 있음을 확인하였다 (그림 50). <그림 48> Strategy for the introduction of the fused (cel44+fn+bgl+cbd+cbh) gene into Saccharomyces cerevisiae EBY100 using yeast surface display vector pct < 그림 49> Construction of pct/cbdh

227 < 그림 50> Restriction digestion for confirmation of pct/cbdh (2) pct/cbdh를 도입한 효모 형질전환체 제작 pct/cbdh를 electroporation transformation method를 이용하여 S. cescerevisiae EBY100 에 도입한 후 tryptophan free SD medium에서 배양하여 형질전환체를 선발하고 S. cescerevisiae EBY100/pCT-cel44-bgl-cbh로 명명하였으며, Aga2p/Cel44- Bgl-Cbh fusion protein의 발현은 GAL1 promoter에 의하여 조절되므로 세포표면발현을 위해 YPDG medium (1% yeast extract, 2% peptone, 1% glucose, 1% galactose)에서 생육시켰다. (3) 효모 세포표면에 display된 Cel44, BGL CBH 효소 활성 측정 Cel44, BGL, CBH가 cell surface에 display된 효모 형질전환체들(EBY-Cel44, EBY-BGL, EBY-CBH)을 72시간 배양한 후 각각의 효소활성을 측정한 결과는 표 6과 같다. EBY-Cel44 활성은 CMC 가수분해에 의하여 측정하였으며 EBY-CBH 및 EBY-BGL 활성은 PASC 가수분 해에 의해 측정되었다. EBY-Cel44은 2.01 U/L 정도의 효소 활성을 보였으며 EBY-BGL 및 EBY-CBH 효소 활성은 4.01 U/L, 0.56 U/L으로 각각 분석되었다. 이러한 결과는 무정형의 섬 유질에서 이들 효모 형질전환체가 작용할 때 초기에 EBY-Cel44의 endoglucanase가 작용하고 이 후 EBY-CBH가 작용하여 다당류를 보다 작은 cellobiose가 생성되어 최종적으로 생성된 cellobiose 및 oligomer 들이 EBY-BGL에 의해 최종적으로 glucose로 유리되어 효모의 에탄올 발효로 연결되는 것으로 추정된다. 본 실험에서 얻은 EBY-BGL 활성이 비교적 타 효소들 보 다 높아 glucose 생성율이 높아 유리할 것으로 사료된다. 표 6. Enzyme activities of the surface-displayed yeast transformants Transformants Enzyme activity (U/OD600) EBY-Cel ± EBY-BGL 4.01 ± EBY-CBH 0.56 ± EBY N.D. S. cerevisiae EBY100의 단독원 효소 접종, [(EBY-Cel44)+(EBY-CBH)]와 같은 2종의 효모 형질전환체 효소 혼합 처리, [(EBY-Cel44)+(EBY-CBH)+(EBY-BGL)]와 같은 3종의 효모 형질 전환체 혼합 효소원 및 EBY-Cel44-BGL-CBH fusion 효모균주 각각을 PASC (phosphoric acid-swollen cellulose) 기질에 처리하고 30 에서 72 시간 배양 후 생성되는 환원당을 측정한 결과는 그림 51과 같다. <그림 51> Time-course of synergistic hydrolysis of amorphous cellulose by S. cerevisiae

228 EBY100 (open sqare), [(EBY-Cel44)+(EBY-CBH)] yeast mixture (closed circle), [(EBY-Cel44)+(EBY-CBH)+ (EBY-BGL)] yeast mixture (closed square), and EBY-Cel44-BGL-CBH fusion yeast (open circle). [(EBY-Cel44)+(EBY-CBH)]와 같은 2종의 효모 형질전환체 효소의 혼합 처리 결과 경시적 으로 환원당의 농도가 증가되었다. 이 처리에서는 최종적인 glucose를 생성할 수 있는 β -glucosidase (BGL) 기능이 없기 때문에 생성되는 환원당 산물이 축척되며 생성물이 에탄올 생산으로 전환되지 못하기 때문인 것으로 추정된다. 한편 [(EBY-Cel44)+(EBY-CBH)+(EBY-BGL)]와 같은 3종의 효모 형질전환체 효소 처리구는 생성 되는 환원당이 아주 미약하였는데, 이 처리구는 endoglucanase, cellobiohydrase, β-glucosidase 의 기능을 모두 가지고 있어 이들 3종류의 효소활성으로 기질에서 최종적으로 glucose가 생성 되며 생산되는 포도당은 즉시 효모의 에탄올 발효와 연결되어 glucose가 에탄올로 전환되는 것으로 추정되며, [(EBY-Cel44)+ (EBY-CBH)]에 의해 중재되는 섬유질 분해가 전체과정의 율 속단계 (rate limiting step)임을 보여 준다. 따라서 endoglucanase 및 cellobiohydrase 효소활성 개량은 섬유질에서 bioethanol을 효과적으로 발효하는데 중요할 것이다. (4) 효모 형질전환체에 의한 에탄올 발효 [(EBY-Cel44)+(EBY-CBH)+(EBY-BGL)]의 3종 효모 형질전환체 균주 혼합체 및 EBY-Cel44+BGL-CBH fusion 효모 형질전환체를 ethanol 생성배지에 각각 접종하여 30 에서 혐기적으로 배양하면서 총당과 ethanol 농도의 경시적 변화를 측정한 결과는 그림 52와 같다. <그림 52> Changes in the concentration of total sugar and ethanol during the growth of [(EBY100/pCT-Cel44)+(EBY100/pCT-BGL)+(EBY100/pCT-CBH)] (red) and (EBY100/pCT-Cel44+BGL-CBH) fusion yeast (blue). Circles represent ethanol concentration and squares represent total sugar concentration. The experiment was done in triplicate and average values or the results are shown. [(EBY-Cel44)+(EBY-CBH)+(EBY-BGL)]의 3종 효모 형질전환체 균주 혼합체는 PASC를 가수분해하여 효과적으로 bioethanol을 생산하였다. 최종 에탄올 농도는 2.0 g/l로 나타났으며 EBY-Cel44-BGL-CBH fusion 효모균주 처리구에서는 전반적으로 혼합체 처리구 보다는 다소 적게 생성되었으나 발효공정의 효율적인 측면을 고려한다면 EBY-Cel44-BGL-CBH fusion 효 모균주 처리가 효과적일 것으로 추정된다. 그리고 이러한 차이는 fusion으로 인한 각각의 효소 기질과의 접촉적인 측면에서 혼합처리구에 비해 약간 감소될 것으로 사료된다. 한편 이러한

229 gene integration expression system은 발현되는 단백질의 양을 감소시키므로 실제적 관점에서 gene integration system은 유전자 안정성 및 plasmid 소실 방지에 보다 적합할 것이다. 또한 본 실험에서 사용한 Cel44는 다기능 효소로 endoglucanase, xylanase, lichenase의 3종 기능을 가지므로 농산물 부산물과 같은 섬유질 biomass는 이러한 다양한 종류의 당질을 함유하고 있 어 이 효소의 사용은 유리할 것으로 기대된다. 그리고 본 실험에 사용한 효소 유전자원들은 모 두 국내에서 분리되었으며 일부는 특허 등록 및 등록 예정으로 외국과의 특허 경쟁에 유리할 것이다. Ⅱ. 섬유소 분해효소 생산 미생물과 에탄올 발효균주 혼합배양에 의한 에탄올 생산 농업부산물로부터 당화/발효 통합공정에 의해 bioethanol을 생산하는 방법은 유전자 조작 에 의해 당화/발효를 동시에 수행할 수 있는 알코올 발효균주의 개발과 섬유소 분해효소 생산균주와 알코올 발효균주를 혼합배양하여 당화/발효 통합공정을 수행하는 방법이 있을 수 있다. 국내에서는 Aspergillus awamori와 Zymomonas mobilis의 혼합고정화 (Lee et al., 1995), Rhizopus japonicus와 Zymomonas mobilis의 혼합고정화 (Choi, et al., 1996) 등 전분질계 원료로부터 섬유소 분해효소 생산균과 알코올 발효균의 혼합배양에 의한 에탄올 생산에 대한 연구가 이루어졌을 뿐 섬유질계 원료로부터 혼합배양에 의해 bioethanol을 생 산하려는 시도는 이루어진 바가 없다. 외국의 경우에도 hydrolyzed agricultural wastes로 부터 Candia tropicalis 와 Zymomonas mobilis의 혼합배양에 의한 bioethanol 생산 (Patle and Lal, 2007, 2008), glucose/xylose 혼합물로부터 P ichia stipitis와 Z ymomonas mobilis 의 혼합배양에 의한 ethanol 생산 (Fu et al., 2009), glucose/xylose 혼합물로부터 P achysolen tannophilus와 Zymomonas mobilis의 혼합배양에 의한 ethanol 생산 (Fu and Peiris, 2008) 등의 연구가 이루어졌으나 직접 섬유질 원료로부터 섬유소 분해효소 생산균 주와 알코올 발효균주의 혼합배양에 의한 에탄올 생산에 대해서는 보고돤 바가 없다. 본 연구에서는 당함유 모델 시스템, 섬유소 함유 모델 시스템 및 볏짚 함유 배지를 이용 하여섬유소 분해효소 생산 미생물과 에탄올 발효 미생물의 혼합배양에 의한 섬유질 원료로 부터 bioethanol 생산 가능성을 타진하였다. 1. 사용 균주 섬유소 분해효소 생산균주로는 Trichoderma viridae (KCCM 11765), Trichoderma reesei (KCCM 11770), Tramaetes suaveolens (제2 세부과제로부터 분양받음)를 사용하였으며, 에 탄올 발효균주로는 Zymomonas mobilis (KCCM 32321)와 Saccharomyces cerevisiae (KCCM 50549)를 사용하였다. 섬유소 분해효소 생산 균주는 Malt extract 배지(Malt extract 20 g, Glucose 20 g, Peptone 1 g, Agar 20 g / 1L) 또는 PDA (Diced potatoes 300 g, Glucose 20 g, Agar 15 g / 1L) 접종한 후 26 에서 5일간 배양하여 균체의 증식 정도를 확 인하고 4 에서 냉장 보관하며 사용하였고, 1개월 마다 계대배양 하였다. Z. mobilis는 ZM배 지 (Glucose 20 g, Yeast extract 5 g, KH 2 PO 4 2 g / 1L)에 S. cerevisiae 균주는 YM 배지 (Yeast extract 3 g, Malt extract 3 g, Peptone 5 g, Dextrose 10 g / 1L)를 사용하여 30 에 서 2일간 배양하여 접종원으로 사용하였다

230 2. 당 함유 모델시스템에서 Z. mobilis와 혼합배양이 분해효소생산 미생물 혼합배양 가. 섬유소 분해효소 생산 조건 섬유소 분해효소 생산균주 Trichoderma viride와 Trichoderma reesei를 효소유도용 배지에 CMC 또는 cellulose를 2% 첨가한 후 배양하면서 섬유소 분해효소 활성도를 측정한 결과 T. viride와 T. 모두 섬유소 분해에 필요한 endoglucanase, exoglucanase와 β-glucosidase 및 xylanase를 생산하여 섬유질 자원으로부터 에탄올 생산을 위한 당화효소 생산 균주로 적합한 것으로 나타났다 (그림 53). Endoglucanase의 경우 T. reesei 효소 생성능이 T. viride보다 높았으며, CMC와 cellulose에 의한 endoglucanase 생산 유도 효과는 비슷하였다 (그림 53a). Exoglucanase의 경우에도 T. reesei 효소 생성능이 T. viride보다 높았으며, cellulose에 비해 CMC의 exoglucanase 생산 유 도 효과가 더 큰 것으로 나타났다 (그림53b). β-glucosidase의 경우에도 T. reesei 효소 생성능 이 T. viride보다 높은 것으로 나타났으며, 효소 유도 효과는 T. reesei 경우에는 CMC가 더 컸으나 T. viride에서는 cellulose가 더 큰 것으로 나타났다 (그림 53c). Xylanase의 경우에도 T. reesei 효소 생성능이 T. viride보다 높은 것으로 나타났으며, 효소 유도 효과도 T. reesei 경우에는 CMC가 더 컸으나 T. viride에서는 cellulose가 더 큰 것으로 나타났다 (그림 53d). 이상의 결과로 판단할 때 섬유질 biomass로부터 bioethanol 생산에는 T. viride보다 T. reesei 가 더 적합하였으며, 효소 생산에는 섬유소와 같은 기질이 유도 작용을 하며, 4가지 효소의 생 산을 위해서는 5일 정도의 배양 기간이 필요한 것으로 판단된다. 나. Zymomonas mobilis 균주의 에탄올 생산 조건 Z. mobilis의 증식 및 에탄올 생산에 미치는 기질(포도당) 농도와 산소공급(교반속도)의 영 향을 조사한 결과 150 rpm으로 교반하면서 배양하였을 때에는 당 농도가 증가함에 따라 15% 까지는 증식하여 에탄올을 생산하였으나, 20% 및 30% 당 농도에서는 증식 및 에탄올 생산이 불가능하였다 (그림 54). 교반하지 않고 배양하였을 경우에는 25%의 당 농도에서도 증식이 가 능하였으나, ethanol 생산성은 15%당 농도에서 최대이었으며, 그 이상의 농도에서는 감소하는 것으로 나타났으나 (그림 55), 섬유소를 분해하여 bioethanol을 생산할 때 당의 농도를 높게 하 기는 어려울 것이므로 이러한 현상이 문제가 되지는 않을 것으로 판단된다. a b

231 c d <그림 53a> Production of endoglucanse(a), exoglucanse (b), β-glucosidase(c), and xylanase (d) by T. viride and T. reesei 다. Zymomonas mobilis 단독 고정화에 따른 에탄올 생산 최적 조건 단독고정화 발효를 위한 최적 균체농도를 확인하기 위해 식염수 1L에 건조균체량 1 g, 5 g, 10 g, 20 g을 각각 고정화한 후 glucose 10% 농도에서 30, 150 rpm으로 배양하면서 당소비 를 측정한 결과 균체 농도가 높을수록 glucose 소비가 왕성하게 일어나, 이 후 실험에서는 20g/L 농도의 균체를 고정화에 사용하였다 (그림 55). 단독고정화한 Z. mobilis 균체를 사용 하여 당 농도를 달리하여 에탄올 생성을 조사한 결과는 20% 당 농도에서도 효과적인 ethanol 생성이 이루어 졌으며, ethanol 생성은 48시간 이내에 완료되는 것으로 나타났다 (그림 56)

232 <그림 54> Effect of glucose concentration on (a) the growth of Z. mobilis, (b) glucose consumption, and (c) ethanol production

233 <그림 54> Effect of glucose concentration and agitation on (a) the growth of Z. mobilis, (b) glucose consumption, and (c) ethanol production <그림 55> Consumption of glucose by immobilized Z. mobilis (10% glucose containing medium) <그림 56> Effect of glucose concentration on the production of ethanol by immobilized Z. mobilis (10% glucose containing medium) 단독 고정화한 Z. mobilis 균체의 재사용 가능성을 조사한 결과 1차 사용이 끝난 후 재사용

234 시까지 걸린 시간이 증가할수록 당소비와 ethanol 생성이 감소하는 것으로 나타났으며, 4일 이 상 보관 후 재사용시에는 당소비와 ethanol 생성이 현저히 감소하였다. 재사용 횟수가 증가함 에 따라서도 당소비와 ethanol 생성이 감소하는 것으로 나타났으며 2회 이상 재사용하기는 어 려운 것으로 판단되었다 (그림 57). <그림 57> Effect of reusing immobilized Z. mobilis cells on glucose consumption and ethanol production (10% glucose containing medium) 라. 섬유소 분해효소 생산균주와 Zymomonas mobilis 혼합배양 (1) 균체 혼합배양 섬유소 분해효소 생산균주 Trichoderma viridae와 Zymomonas mobilis를 동시/순차적 혼합 배양하면서 endoglucanase, exoglucanase, b-glucosidase 및 xylanase 생산을 조사한 결과 네 가지 효소 모두 두 균주를 동시 접종하는 것보다는 순차적으로 접종하는 것이 효소 생산에 유 리한 것으로 나타났으며, 효소 유도에는 cellulose보다 CMC가 효과적인 것으로 나타났다 (그림 58)

235 (a) (b) (c) (d) <그림 58> Production of (a) endoglucanase, (b) exoglucanase, (c) β-glucosidase, and (d) xylanase by simultanous and stepwise mixed culture of T. viridae and Z. mobilis Trichoderma reesei와 Zymomonas mobilis를 동시/순차적 혼합배양하면서 endoglucanase, exoglucanase, β-glucosidase 및 xylanase 생산을 조사한 결과도 섬유소 분해 효소 생산균으로 Trichoderma viridae를 사용하였을 경우와 비슷하였지만 효소 생산량을 현저 히 높아 Trichoderma viridae 보다는 Trichoderma reesei를 사용하는 것이 유리한 것으로 나 타났다 (그림 59)

236 (a) (b) (c) (d) <그림 59> Production of (a) endoglucanase, (b) exoglucanase, (c) β-glucosidase, and (d) xylanase by simultanous and stepwise mixed culture of T. reesei and Z. mobilis (2) 고정화 균체를 이용한 혼합배양 단독 고정화한 T. viridae 또는 T. reesei와 Z. mobilis를 동시/순차적 혼합배양하면서 생성 되는 효소 endoglucanase, exoglucanase, β-glucosidase 및 xylanase의 활성도를 조사한 결과 네 가지 효소 모두 두 균주를 동시 접종하는 것보다는 순차적으로 접종하는 것이 효소 생산에 유리한 것으로 나타났으며, 효소 유도에는 cellulose보다 CMC가 효과적인 것으로 나타났으며, 고정화하지 않은 균체의 순차적 혼합배양시보다 효소 활성도가 낮은 것으로 나타났다 (그림 60, 61)

237 (a) (b) (c) (d) <그림 60> Production of (a) endoglucanase, (b) exoglucanase, (c) β-glucosidase, and (d) xylanase by simultanous and stepwise mixed culture of T. viridae and immobilized Z. mobilis (a) (b)

238 (c) (d) <그림 61> Production of (a) endoglucanase, (b) exoglucanase, (c) β-glucosidase, and (d) xylanase by simultanous and stepwise mixed culture of T. reesei and immobilized Z. mobilis 3. 섬유소 함유 모델 시스템에서 섬유소 분해효소 생산균주와 에탄올 발효균주의 혼합배양 가. Trichoderma reesei와 Saccharomyces cerevisiae 혼합배양시 효소 생산 (1) CMC 함유배지에서 혼합배양 T. reesei와 S. cerevisiae를 CMC를 함유한 배지에 동시/순차적 혼합배양하면서 배양액 중 endoglucanase, exoglucanase, β-glucosidase 및 xylanase의 활성을 조사한 결과 T. reesei를 먼저 접종하고 배양 3일 후 S. cerevisiae를 접종 배양하는 것이 효소 생산에 효과적이었다 (그림 62). A)

239 B) C) D) <그림 62> Production of endoglucanse (A), exoglucanase (B), β-glucosidase, and xylanase (D) during the mixed culture T. reesei and S. cerevisiae in a CMC containing medium. (2) Avicel 함유배지에서 혼합배양 T. reesei와 S. cerevisiae를 Avicel을 함유한 배지에 동시/순차적 혼합배양하면서 배양액 중 endoglucanase, exoglucanase, β-glucosidase 및 xylanase의 활성을 조사한 결과 Avicel을 함유한 배지에서의 네 가지 효소의 생산량은 CMC를 기질로 함유한 배지에서보다 적었다. CMC를 함유한 배지에서와 같이 T. reesei를 먼저 접종하고 배양 3일 후 S. cerevisiae를 접종 배양하는 것이 효소 생산에 효과적이었다. (3) Cellulose powder 함유배지에서 혼합배양 T. reesei와 S. cerevisiae를 cellulose powder를 혼합배양하면서 배양액 중 효소의 활성을 측정한 결과 cellulose powder를 함유한 배지에서의 네 가지 효소의 생산량은 CMC 또는 Avicel을 기질로 함유한 배지에서보다 적었다. Cellulose powder를 기질로 사용하기 위해서는

240 cellulose powder의 결정성을 낮추기 위한 전처리가 필요한 것으로 판단된다. Cellulose powder 를 함유한 배지에서도 CMC 또는 Avicel을 함유한 배지에서와 같이 T. reesei를 먼저 접종하 고 배양 3일 후 S. cerevisiae를 접종 배양하는 것이 효소 생산에 효과적이었다. (4) 고정화 균체의 혼합배양시 효소 생산 T. reesei는 고체배지에서 5일간 배양한 후 포자만을 회수하고 S. cerevisiae는 액체배지에 서 2일간 배양한 후 회수하고 세척하여 단독 또는 혼합 고정화에 사용하였다. 회수 세척한 균 체 현탁액은 동량의 4% alginate 용액과 혼합한 후 22 gauge 바늘이 부착된 주사기를 사용하 여 2% CaCl 2 용액에 적하시켜 생성된 gel bead를 4 에서 하룻밤 숙성시킨 후 여과하여 얻어 진 gel bead를 고정화 균체로 사용하였다. 고정화 균체를 CMC, Avicel, cellulose powder를 함유한 배지에서 배양하면서 효소활성을 측 정한 결과 고정화하지 않은 균체를 접종 배양할 때보다 효소 생성량이 적은 것으로 나타났으 며, 단독 고정화 균체의 동시접종 배양 또는 혼합고정화 균체를 5일간 배양했을 때보다 고정화 된 T. reesei를 먼저 접종하고 배양 3일 후 S. cerevisiae를 접종하여 2일간 배양하는 것이 효 소 생성량이 더 많은 것으로 나타났다. 표 7. Production of enzymes by immobilized T. reesei and S. cerevisiae. Endoglucanase Exoglucanase β-glucosidase Xylanase CMC Simultaneous 1.88 U 0.47 U 1.65 U 5.02 U Mixed 1.54 U 0.34 U 1.24 U 4.44 U Stepwise 2.03 U 0.56 U 2.31 U 5.44 U Avicel Simultaneous 1.11 U 0.22 U 1.11 U 3.02 U Mixed 0.82 U 0.23 U 0.25 U 2.70 U Stepwise 1.78 U 0.31 U 1.50 U 3.70 U CMC Simultaneous 0.80 U 0.20 U 1.05 U 3.30 U Mixed 0.55 U 0.44 U 0.20 U 2.10 U Stepwise 1.25 U 0.51 U 1.44 U 3.67 U * Simultaneous: T. reesei and S. cerevisiae cells were immobilized separately and grown for 5 days after simultaneous inoculation. Mixed: T. reesei and S. cerevisiae cells were immobilized together and grown for 5days after inoculation. Stepwise: T. reesei and S. cerevisiae cells were immobilized separately and T. reesei was grown for 3 days before inoculating S. cerevisiae and the growth was further continued for 2 days. 4. 볏짚 함유 배지에서 섬유소 분해효소 생산균주에 의한 효소 생산 및 당 생성 가. 볏짚 함유 배지의 제조 분쇄한 볏짚 또는 분쇄한 볏짚을 1% NaOH로 분 처리한 후 원심분리한 후 증류수에 현탁하여 다시 원심분리하여 건조한 분말을 배지 제조에 사용하였다. 배지는 볏짚 분말과 0.5%의 yeast extract를 함유하였으며, ph는 이 되도록 조절하였다. 나. 볏짚 함유 배지에서 Trichoderma reesei와 Trametes suaveolens에 의한 CMCase 및 환원 당 생성

241 볏짚 함유 배지에 Potato Dextrose Broth에서 5일간 전배양한 Trichoderma reesei와 Trametes suaveolens를 배지량의 5% 접종하고 25, 200 rpm에서 5일간 배양한 후 CMCase 활성 및 환원당 농도를 조사한 결과는 표8, 9와 같다. Trametes suaveolens에 의한 효소 및 환원당 생성량이 Trichoderma reesei에 의한 것보다 높았으며, NaOH 전처리한 볏짚을 함유한 배지에서의 효소 생성량은 무처리 볏짚을 함유한 배지에서의 효소 생성량과 비슷하였으나 환 원당 생성량은 약간 증가하였다. 15% 및 20% 볏짚 분말을 함유한 배지는 교반이 잘 되지 않 아 균주의 배양이 어려웠다. 실험조건에서 두 균주 모두 5일간 배양하여도 2% 이하의 환원당 만을 생성하여 에탄올 발효에는 부적합한 것으로 나타났다. 표 8. Production of CMCase and reducing sugar by Trichoderma reesei in powdered rice straw containing medium Material CMCase activity (U/ml) Reducing sugar (mg/ml) 5% untreated straw % NaOH treated straw % untreated straw % NaOH treated straw 표 9. Production of CMCase and reducing sugar by Trametes suaveolens in powdered rice straw containing medium Material CMCase activity (U/ml) Reducing sugar (mg/ml) 5% untreated straw % NaOH treated straw % untreated straw % NaOH treated straw 다. 볏짚 함유 배지에서 섬유소 분해 균주와 에탄올 발효균주의 혼합배양에 의한 에탄올 생산의 문제점 볏짚 함유 배지에서 섬유소 분해효소 생산균주의 증식에 의한 당화효소 생산에는 5일 이상 이 소요되며, 충분한 증식 및 효소 생산을 위해서는 0.5% yeast extract 첨가만으로는 불충분 한 것으로 판단되고, 고농도 볏짚 함유 배지에서는 균의 배양이 어려울 뿐 아니라 섬유소 분해 효소 활성 및 발효성 당의 농도가 낮아 당화효소를 사용하지 않고 혼합배양에 의해 에탄올을 생산하고자 하는 시도는 어려운 것으로 판단된다. Ⅲ. Bioethanol 생산을 위한 기질의 전처리 조건 검토 농업부산물과 같은 lignocellulosic biomass는 일반적으로 cellulose, hemicellulose 및 lignin의 tightly-packed matrix로 되어 있으며, lignin은 biomass recalctrance (natural resistance to decomposition)의 중요한 요소이다 (Matsuki et al., 2010). Ligno- cellulosic biomass로부터 bioethanol을 생산하는 과정의 첫 단계는 전처리과정인데, 전처리과정은 효소가 접근가능한 표 면적을 증가시키고, 가수분해과정에서 분해율을 높여주는 역할을 한다 (Gao et al., 2010). 지금 까지 dilute acid (Lioyd and Wyman, 2005), flow through (Liu and Wyman, 2005), liquid hot

242 water (Mosier et al, 2005), ammonia fiber/freeze explosion (Teymouri et al., 2005), ammonia recycle percolation (Kim and Lee, 2005), lime (Kim and Holtzapple, 2005) 등 다양 한 전처리 방법이 연구되어 왔다. 최근에는 dilute alkali pretreatment에 연구가 집중되고 있는 데, 이는 이 방법이 다른 전처리 방법에 비해 비교적 낮은 온도와 압력에서 단시간 처리에 의 해 목적을 달성할 수 있기 때문이다(Vancov and McIntosh, 2011). 알칼리 처리의 중요한 효과 중 하나는 xylan과 lignin, hemicellulose 등의 다른 biomass 구성성분 사이의 intermolecular hydrogen bond의 파괴로 보이며, 알칼리 첨가에 의해 세포벽 구성성분의 swelling이 일어나고 이에 따라 효소에 의한 분해력이 증가되는 것이다. 그러나 알칼리 처리에 의한 lignin의 변형에 대해서는 잘 알려져 있지 않은데, lignin depolymerization 또는 partial dissolution을 일으키는 것으로 보인다 (Vrije et al., 2009) 본 연구에서는 농업부산물로부터 bioethanol을 생산하기 위해 효과적인 전처리 방법을 찾기 위해 NaOH 전처리가 섬유소 함유 기질 보릿짚, 볏짚 및 억새풀의 구조 및 효소 당화에 미치 는 영향을 조사하여 최적 알칼리 전처리 조건을 찾고자 하였다. 1. NaOH 전처리가 볏짚에 미치는 영향 조사 가. 재료 및 방법 표면관찰에는 잎 표면을 사용하였으며, FT-IR 및 XRD 분석에는 볏짚을 0.25 mm 이하가 되도록 분말화하여 사용하였다. NaOH 전처리는 0.25%, 0.5%, 0.75%, 1.0% NaOH 용액에 중량 으로 10%의 볏짚을 첨가한 후 autoclave를 사용하여 105 에서 10 분간 처리하였다. 처리 전 과 후의 표면 변화는 주사전자현미경 (SEM)과 원자현미경 (AFM)로 조사하였으며, 결정성 변 화는 FT-IR (Fourier Transmittance Infrared spectroscopy), XRD (X-ray diffractometer)로 분석하였다. 을 실시하였다 (Barman et al, 2012; Hagque et al, 2012; Hagque et al, 2013;). 나. FE-SEM 관찰 1000x에서 FE-SEM로 관찰한 결괴는 처리되지 않은 벼 잎의 표면은 화학처리된 시료와 표 면 구조가 상이하였다. 0.5 to 1.0% NaOH 전처리시 잎 표면의 물질이 제거되고 세포 내부 섬 유질이 노출되어 효소의 접촉이 용이할 것으로 보인다 (그림 62). 잎 표면에서 제거된 성분은 lignocellulose의 supramolecular waxy coat structure로 추정되며, % NaOH 처리구에 서 이러한 현상이 보다 확실히 관찰되었다 (그림 63E, 63F). <그림 63> SEM images of rice straw A) Natural rice straw, B) Water treated rice straw

243 , C) 0.25% NaOH treated rice straw, D) 0.5% NaOH treated rice straw, E) 0.75% NaOH treated rice straw, F) 1.0% NaOH treated rice straw. All treatments carried out at 105 for 10 minutes. 다. AFM (Atomic Force Microscopy) 관찰 처리한 볏짚을 AFM으로 관찰한 결과 처리하지 않은 보리 잎의 표면은 long chain fatty acids, lipids 및 phenolic compounds를 함유한 cuticular waxy layer로 표면이 덮혀 있는 것으 로 추정되며 입자모양의 구조를 형성하는 것으로 관찰되었다. 이들 입자의 수자와 크기는 NaOH의 농도를 증가시키며 따라 그 크기와 수는 감소되어 0.75% - 1.0% alkaline NaOH 처 리구에서 입자층이 완전히 제거되는 것으로 관찰되었다 (그림 64). AFM graph에 의해 측정된 peak의 average roughness <그림 64> AFM topographic images of A) Natural rice straw, B) Water treated rice straw, C) 0.25% NaOH treated rice straw, D) 0.5% NaOH treated rice straw, E) 0.75% NaOH treated rice straw, F) 1.0% NaOH treated rice straw. All treatments carried out at 105 for 10 minutes. 경우에도 처리한 NaOH 농도가 증가함에 따라 average roughness가 감소되는 것으 로 나타나 NaOH 처리 결과 벼 표면의 비섬유소성 물질이 감소함을 보여주고 있다 (그림 65) 라. FT-IR (Fourier Transmittance Infrared spectroscopy) 분석 Lignocellulosic biomass의 화학적 전처리에서 과정에서 일어나는 구조적 변화를 cm -1 region의 FT-IR spectral peak로 조사한 결과 NaOH 처리에 의해 1733, 1711, 1604, 1516, 1432, 1373, 1248, 1163, 1050 및 895 cm -1 peak에서 특이적인 변화가 일어났으며, 이는 NaOH 처리가 lignin과 carbohydrate 사이의 ether linkage 및 ester linkage를 제거하는 것으로 추정 된다. 1.0% NaOH 처리구는 보리의 waxy coat 및 lignin의 부분적인 분해에 가장 효과적인 것 으로 나타났으며 이것은 hemicellulose의 동반적인 제거를 수반하는 것으로 보인다

244 <그림 65> AFM RMS graphs of A) Natural rice straw, B) Water treated rice straw, C) 0.25% NaOH treated rice straw, D) 0.5% NaOH treated rice straw, E) 0.75% NaOH treated rice straw, F) 1.0% NaOH treated rice straw. All treatments carried out at 105 for 10 minutes. <그림 66> FT-IR spectra of A) α-cellulose, B) Untreated rice straw, C) 1% NaOH treated rice straw, D) 0.75% NaOH treated rice straw, E) 0.5% NaOH treated rice straw, F) 0.25% NaOH treated rice straw, and G) water treated rice straw. 표 10. Band characteristics of FT-IR spectra by NaOH treatment*