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1 농업생명과학연구 47(1) pp Journal of Agriculture & Life Science 47(1) pp 통계적방법을이용한항산화활성증진최적식물추출물조합조건 김은중 * 경북대학교축산BT학부접수일 (2012년 08월 03일 ), 수정일 (2013년 02월 20일 ), 게재확정일 (2013년 02월 21일 ) Optimization of Plant Extract Mixtures for Enhancing Antioxidant Activities Using Statistical Methods Eun Joong Kim * Dept. of Animal Science and Biotechnology, Kyungpook National Univ., Sangju , Korea Received: AUG , Revised: FEB , Accepted: FEB 초록본연구는항산화활성을나타내는식물추출물을이용하여가축용사료첨가제를개발하기위한목적으로수행되었다. 총 10 가지의식물들 ( 익모초, 뽕나무잎, 두충, 민들레, 엄나무, 삼백초, 꾸지뽕나무, 감나무잎, 헛개나무및가시오갈피 ) 을열수추출방법을이용하여추출물을준비하였고, 식물추출물들의총폴리페놀, 총플라보노이드함량을조사하였으며, 항산화활성을측정하였다. 항산화활성의측정후, 모든추출물들이혼합된상태에서항산화활성향상에효과를나타내는추출물들을부분요인실험설계법의일종인 Plackett-Burman 실험설계법을이용하여선별하였으며우수한항산화활성을보이는식물추출물들을통계적인방법인혼합물실험설계법을이용하여조합하였고이조합들에서얻어진반응들은 root mean square prediction error 측정법을적용하여계산하였다. 유의적으로긍정적효과를나타낸식물추출물들로는뽕나무잎, 감나무잎및가시오갈피로나타났다. 이세가지식물추출물들의최적혼합비율을도출하기위하여통계적인방법을적용한결과로뽕나무잎추출물, 감나무잎추출물및가시오갈피추출물의혼합비율이 0.44 : 0.28 : 0.28 에서가장우수한항산화활성이나타났다. 본연구의결과에의하면통계적인방법을이용하여항산화활성이우수한식물추출물의조합을용이하게도출할수있고이를기초로추가적인연구에응용할수있을것으로사료된다. 검색어 - 사료첨가제, 식물추출물, 플라켙 - 버만디자인, 항산화제, 혼합물실험설계법 ABSTRACT This study was conducted to develop plant extracts with antioxidant activities as potential animal feed additives by using statistical models. A total of 10 different plant extracts (Leonurus japonicus Houtt., Morus alba L. leaves, Eucommia ulmoides Oliv., Taraxacum platycarpum Dahlst., Kalopanax pictus Nakai, Saururus chinensisbaill., Cudrania tricuspidata (Carriere) Bureau ex Lavallee, Diospyros kaki Thunb. leaves, Hovenia dulcis Thunb., and Acanthopanax senticosus (Rupr. & Maxim.) Harms) were prepared using a water extraction method, and their total polyphenol, and flavonoid levels and antioxidant activities were determined. The antioxidant activities of the plant extracts, when all the extracts were mixed, were monitored using the Plackett-Burman design, which is a fractional factorial experimental design. Positive effects (p<0.05) were observed in M. alba, D. kaki leaves and A. senticosus leaves. The optimum ratio of the 3 plant extracts was investigated using a mixture design, and the root mean square prediction error was used in the calculation of theresponse. The optimum ratio of M. alba : D. kaki leaves : A. senticosus leaves appeared to be 0.44 : 0.28 : Key words - Antioxidant, Feed additives, Mixture design, Plant extracts, Plackett-Burman design * Corresponding Author: Eun Joong Kim Tel: Fax: ejkim2011@knu.ac.kr

2 96 Journal of Agriculture & Life Science 47(1) Ⅰ. 서론축산업에있어항생제는가축의성장촉진과생산성향상의목적으로널리사용되어왔다. 그러나최근항생제잔류와내성문제로인하여그사용이치료의목적으로제한되고, 관련규제가매우강화되고있는실정이다. 이에기존의항생제를대체할수있고, 안전축산물생산을가능케하는천연물질의개발이절실히요구되고있다. 일반적으로천연물질에는항산화기능이많이포함되어있고이러한항산화활성은가축의질병저항력증강과축산물의품질향상등에큰도움을주는것으로보고되고있다 (Kayano et al., 2002). 식물에포함된대표적인항산화활성물질로는폴리페놀과플라보노이드화합물을들수있다. 이들은항산화활성뿐만아니라항균활성등다양한생리활성을나타내는것으로알려져있다 (Oliveira et al., 2010). 식품혹은식물에포함된화합물들간의생리활성에대한상호상승효과작용에관해서는앞선연구들에서보고된바있다 (Hras et al., 2000). 특히식물추출물에포함되어있는다양한플라보노이드와폴리페놀화합물들은우수한항산화활성을나타낸다. 또한이러한화합물들간에는상호상승작용 (synergistic interaction) 이존재한다. 실제로자두에함유되어있는 4-amino-4-carboxychroman- 2-one 는 caffe- oylquinic acid isomers와상호상승작용의효과를나타내며, 그효과는 1.5 ~ 2.9 배정도인것으로보고된바있다 (Kayano et al., 2002). 식물에포함된화합물들의상호작용을조사하기위하여서는우선생리활성이우수한물질을탐색및선발하고, 각물질의상호작용을조사하는것이필요하다. 다양한식물추출물과같이, 여러가지변수들중에서목적하는반응에대하여유효한요인을도출하는통계적방법으로한번에한가지요인들을평가하는방법으로 one-factor -at-atime(ofat) 방법을들수있다. 그러나 OFAT 방법의경우, 요인의개수가많을경우에는실험의 수가매우많아지는단점이있다 (Zhang et al., 2012). 이러한단점을보완하는방법으로부분요인실험설계법을들수있다. 부분요인실험설계법중에서각변수들의수준을 2가지로하고, 상호작용을제외한주효과만을검토할경우에유용하게적용될수있는통계적방법으로 Plackett-Burman design을들수있다 (Vanaja & Shobha Rani, 2007). 또한변수들을혼합하여그최적의혼합비율을도출하는통계적방법으로혼합물설계법 (Mixture design) 을들수있다 (Park & Lee, 2011). 이에본연구는 10가지식물추출물에대하여각각의항산화활성을조사한후에통계적방법을이용하여상호상승효과가있는추출물을선발하고최적조합조건을도출하기위하여수행되었다. II. 재료및방법 2.1 식물추출물의준비본연구에서는총 10종의식물추출물을준비하였다. 실험에사용된식물들로익모초 (Leonurus japonicus Houtt.), 뽕나무잎 (Morus alba L. leaves), 두충 (Eucommia ulmoides Oliv.), 민들레 (Taraxacum platycarpum Dahlst.), 엄나무 (Kalopanax pictus Nakai), 삼백초 (Saururus chinensis, Baill.), 꾸지뽕나무 (Cudrania tricuspidata (Carriere) Bureau ex Lavallee), 감나무잎 (Diospyros kaki Thunb. leaves), 헛개나무 (Hovenia dulcis Thunb.) 및가시오갈피 (Acanthopanax senticosus (Rupr. & Maxim.) Harms) 를사용하였다. 추출에사용된모든식물들은식품용으로제조된제품을국내대형마트에서구매하여사용하였으며상품에따라잎또는나뭇가지로판매되는제품을실험에이용하였다. 식물추출물의제조는열수추출방법을이용하였다. 식물시료 30 g을밀봉이가능한유리용기에담고증류수 100 ml를첨가한후에 60 C 항온기에서 48 시간동안추출하였다. 추출이완료된후에여과지 (Whatman No. 1) 를이용하여추출액을

3 Kim : Optimization of Plant Extract Mixtures for Enhancing Antioxidant Activities Using Statistical Methods 97 회수하였고, 다시회수된추출액을 0.45 m syringe filter (Minisart SRP 25, Sartorious stedim, Goettingen, Germany) 를이용하여여과한후에그여과액을실험에사용하였다. 최종추출물은 -20 냉동고에보관하며실험에사용하였다. 2.2 총폴리페놀분석시료의총폴리페놀함량은 phenol reagent를이용한비색정량법에따라서분석하였다 (Juan & Chou, 2010). 시료 0.1 ml와 Folin-Ciocalteu s phenol regent (Sigma, St. Louis, USA) 1.0 ml를혼합한후에상온에서 3분간반응시켰다. 반응이완료된용액에 1 N Na 2 CO 3 용액을 300 μl첨가한후에 90 분동안상온에서반응시켰다. 반응이완료된후 2 ml의증류수를첨가하고분광광도계 (Option, Daejun, Korea) 를이용하여 725 nm에서흡광도를측정하였다. 총폴리페놀함량의계산은 gallic acid (Sigma, St. Louis, USA) 를표준물질로얻어진회귀방정식을이용하였다. 2.3 총플라보노이드분석시료의총플라보노이드함량은 AlCl 3 와 NaNO 3 용액을이용한비색정량방법에따라서분석하였다 (Juan & Chou, 2010). 시료 250 μl와 10 mm Tris-HCl(pH 7.0) 1 ml 그리고 5% NaNO 3 용액 75 μl를혼합한후에상온에서 6 분간반응시켰고, 10% AlCl 3 용액 150 μl를첨가한후에다시상온에서 5분간반응시켰다. 반응이완료된용액에 1 M의 NaOH 500 μl와증류수 275 μl를혼합한후에분광광도계를이용하여 510 nm에서흡광도를측정하였다. 총폴리페놀함량의계산은 quercetin (Sigma, St. Louis, USA) 을표준물질로얻어진회귀방정식을이용하였다. 2.4 항산화활성의측정시료의항산화활성은 DPPH(2,2-Di(4-tertoctylphenyl)-1-picrylhydrazyl, Sigma, St. Louis, USA) 용액을이용한 free radical scavenging activity 측정법을이용하였다 (Juan & Chou, 2010). 시료 0.1 ml와 10 mm Tis-HCl (ph 7.0) 0.4 ml, 99.9% 에탄올및 4 mm DPPH용액 1 ml를혼합한후에상온에서 15분간반응시킨후분광광도계를이용하여 525 nm에서흡광도를측정하였다. 항산화활성의정도는증류수를시료로사용한공시료에서얻어진흡광도에서시료에서얻어진흡광도의차를이용하여평가하였고, ascorbic acid (Sigma, St. Louis, USA) 를표준물질로이용하여흡광도의정도를상대적으로계산하였다. 최종적으로시료의항산화활성은 ascorbic acid mm equivalent로나타내었다. 2.5 식물추출물혼합물에서항산화활성에대한효과에영향력이우수한추출물의선발총 10 종류의식물추출물을혼합한상태에서혼합물의항산화활성에유의적으로긍정적인효과 (positive effect) 를나타내는식물추출물을도출하기위하여본연구에서는 2 수준부분요인실험설계법 (2 n -fractional factorial design) 의하나인 Plackett-Burman design을사용하였다. 실험설계에서의변수들로는각각의식물추출물을사용하였으며각변수들의수준은추출물들의항산화활성을이용하여설정하였다. 변수들의수준은 ascorbic acid 0.2 mm에해당하는항산화활성을나타낼수있는추출물의양으로설정하였고, 높은수준과낮은수준의차이는 10배로하였다. 즉변수들의낮은수준과높은수준은각각 ascorbic acid 0.2 mm과 2 mm에해당하는식물추출물의양으로설정하였다. 총 10개의변수를이용하여 12개의실험들을구성하였다 (Table 1). 실험설계는임의설정 (randomization) 을하지않고마지막 12번째실험에는모든변수들이낮은수준으로포함되게하였다. 그리고각실험들의총부피는서로동일하게조정하기위하여증류수를첨가하였다. 각변수들의효과는다음과같은수식을이용하여평가하였다.

98 Journal of Agriculture & Life Science 47(1) 위수식에서 X + i 는변수 X i 가높은농도수준으로배치된실험에서얻어진항산화활성결과이며, X - i 는변수 X i 가낮은농도수준으로배치된실험에서얻어진항산화활성결과이다. N은총실험의개수이다.

4 98 Journal of Agriculture & Life Science 47(1) 위수식에서 X + i 는변수 X i 가높은농도수준으로배치된실험에서얻어진항산화활성결과이며, X - i 는변수 X i 가낮은농도수준으로배치된실험에서얻어진항산화활성결과이다. N은총실험의개수이다. 각변수들의유의성은 t-검정법을이용하여평가하였고, 실험에대한통계분석은분산분석법을이용하였다. 2.6 혼합물설계 Plackett-Burman design 실험을통하여유의적인긍정적효과 (p<0.05) 를나타낸요인들을선택한후에각변수들의최적혼합비율을혼합물설계실험법을이용하여분석하였다. 혼합물실험을통하여얻어진결과는실험을통하여얻어진관측치와산술적으로계산하여예측된예측치의차이를이용하여평가하였고, 각실험의결과는 root mean square prediction error (RMSPE) 값을측정하여계산하였다 (Chaves et al., 2006). RMSPE = 2.7 통계분석 Plackett-Burman design 실험과혼합물실험설계, 각실험결과들의분산분석및요인들의효과분석은 Minitab (version 14, Minitab Co. Ltd, USA) 프로그램을사용하여분석하였다. III. 결과및고찰 3.1 폴리페놀, 플라보노이드및항산화활성평가총 10 종류의식물추출물들의총폴리페놀함량과총플라보노이드함량및항산화활성을평가한결과는 Fig. 1에서보는것과같다. 총폴리페놀함량은민들레, 감나무잎, 가시오갈피및삼백초에서높게나타났고 (Fig. 1A), 총플라보노이드함량은감나무잎에서가장높게나타났다 (Fig. 1B). 항산화활성은민들레, 삼백초, 감나무잎및가시오갈피에서높게나타났다 (Fig. 1C). 본실험에서나타난식물추출물별항산화활성정도는총폴리페놀함량과매우유사한형태를나타내었다. 이에각식물추출물의항산화활성은주로폴리페놀에서기인하는것을알수있었다. 선행연구에의하면본연구에이용된삼백초 (Lee et al., 2004), 꾸지뽕나무 (Lee et al., 2005), 엄 Fig. 1. Total polyphenol content (A), total flavonoid content (B) and antioxidant activity (C) of ten plant extracts. A, Leonurus japonicus Houtt.; B, Morus alba L. leaves; C, Eucommia ulmoides Oliv.; D, Taraxacum platycarpum Dahlst.; E, Kalopanax pictus Nakai; F, Saururus chinensis Baill.; G, Cudrania tricuspidata (Carriere) Bureau ex Lavallee; H, Diospyros kaki Thunb. leaves; I, Hovenia dulcis Thunb.; J, Acanthopanax senticosus (Rupr. & Maxim.) Harms.

5 Kim : Optimization of Plant Extract Mixtures for Enhancing Antioxidant Activities Using Statistical Methods 99 나무 (Lee et al., 2010), 익모초 (Kim et al., 2004), 헛개나무 (Lee et al., 2004), 뽕나무잎 (Jean & Kim, 2011), 민들레 (Chang et al., 2011), 가시오갈피와두충 (Khang et al., 2010), 및감나무잎 (Jeaong et al., 2010) 은항산화활성, 면역성, 항염증효과등이뛰어나인간이섭취할경우면역작용에뛰어난효과를보이는것으로보고되었으며동물에게급여시에도증체율개선및면역작용개선에효과를보이는것으로나타났다. 3.2 식물추출물혼합물에서항산화활성에유효한추출물의선발총 10 종류의식물추출물들이나타낸항산화활성결과를바탕으로 ascorbic acid 1 mm의항산화활 성을나타낼수있는추출물의양을계산하였고, 그결과를바탕으로 Plackett-Burman design을적용하여실험설계를작성하였다. Table 1에서 12 번째실험은모든추출물의변수들이낮은농도로배치되어있는것이며, ascorbic acid 1 mm의항산화활성을얻을수있는추출물의부피를나타내고있다. Plackett-Burman design 실험설계에따라서배합된총 12개의실험들의항산화활성을평가한결과, 최저 0.31 mm에서최대 1.13 mm ascorbic acid에해당하는항산화활성이나타났다. Plackett-Burman design 실험설계상 12번째실험은모든추출물이 0.2 mm ascorbic acid 항산화활성에해당하는추출물부피로배치되었고, 총부피를 1 ml로보정한후에 1/10로희석하여항산화활성평가분석을실행하였다. 따라서 Table 1. Plackett-Burman design configuration for 12 experimental runs with 10 plant extracts as variables Variables 1 Free radical, μl Sum of Distilled Runs extract, water, Total, scavenging activity, μlμlμl X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 ascorbic acid, mm ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± Variables are water extract of X1, Leonurus japonicus Houtt.; X2, Morus alba L. leaves; X3, Eucommia ulmoides Oliv.; X4, Taraxacum platycarpum Dahlst.; X5, Kalopanax pictus Nakai; X6, Saururus chinensis Baill.; X7, Cudrania tricuspidata (Carriere) Bureau ex Lavallee; X8, Diospyros kaki Thunb. leaves; X9, Hovenia dulcis Thunb.; X10, Acanthopanax senticosus (Rupr. & Maxim.) Harms. 2 Mean ± standard deviation in triplicate.

6 100 Journal of Agriculture & Life Science 47(1) Table 2. Analysis of variance for 12 experimental runs by Plackett-Burman design Sources Main effect Residual error Degree of freedom Sum of square Mean of square F-value P-value Total 항산화활성을예측할수있다. 그러나분석결과는 0.92 ~ 1.30 mm ascorbic acid 항산화활성으로예측치보다다양하게나타났다. 실험결과들의분산분석을실시한결과 Table 2에서보는것과같이주효과에대한유의성은나타나지않았으나유의성에근사하는경향을나타냈었다 (p=0.075). 각변수들의주효과와그효과에대한통계적유의성을분석한결과는 Table 3에서보는것과같다. 유의적인긍정적효과 (positive effect, p<0.05) 는요인 X 2( 뽕나무잎 ), X 8( 감나무잎 ) 및 X 10( 가시오갈피 ) 에서나타났다. Table 3. Effect of variables and their probabilities Terms Effect Standard error T-value P-value ;Constant X X X X X X X X X X R 2 = (ascorbic acid, mm) 10 ( 변수의개수 ) 0.1 ( 희석비율 ) = 0.2 mm ascorbic acid 항산화활성을예측할수있다. 그러나실험결과상으로는 0.31 mm ascorbic acid 항산화활성을나타내었다. 또한다른실험들에서는높은농도수준과낮은농도수준으로설정된변수들이각각 5개씩배치되었다. 따라서총 1.1 mm ascorbic acid 3.3 혼합물설계및최적배합비율의계산총 10 종류의식물추출물들을혼합한조건에서항산화활성에대한유의성있는긍정적인효과를나타낸추출물 3가지를혼합할경우에나타날수있는상호상승효과를혼합물실험설계법을이용하여분석하였다. 사용된식물추출물로는뽕나무잎, 감나무잎및가시오갈피추출물이었고, 혼합물실험설계결과는 Table 4에서보는것과같다. 추출물개별적인항산화활성평가결과 (Fig. 1C) 에서뽕나무잎, 감나무잎그리고가시오갈피추출물들은각각추출물 100 μl당 1.40 mm, 2.78 mm 및 2.59 mm ascorbic acid 항산화활성을나타내었다. 이에상호간의항산화활성정도를유사하게조정하기위하여감나무잎과가시오갈피추출물들은증류수를이용하여 2배희석한후에실험에사용하였다. 혼합물실험설계상에서실험번호 1, 2 및 3은각각의추출물들이단독으로사용된것으로나머지실험들의결과예측시기준값으로사용하였다. Table 4에서는각실험들에서얻어진반응값으로항산화활성에대한관측값과예측값그리고 RMSPE 값을나타내고있다. 각실험들의항산화활성에대한예측값계산의예로서실험4에는 0.95 mm과 1.21 mm ascorbic acid 항산화활성을나타낸뽕나무잎과감나무잎이각각 1/2씩혼합되어있다. 따라서산술적으로예측할수있는항산화활성은 1.08 mm ascorbic acid이다. 최

7 Kim : Optimization of Plant Extract Mixtures for Enhancing Antioxidant Activities Using Statistical Methods 101 종적으로예측치와관측치에대한 RMSPE값을이용하여상호간의상승작용의유무와최적혼합비율을계산하였다. RMSPE값은관측치가예측치에비하여오히려작아지는현상을구별하여나타내지못한다. 따라서관측치가예측치보다낮은수준으로나타난실험결과가존재할경우, 상호상승효과에대한분석에적용할수없게된다. 그러나본실험에서는모든실험들에서관측치가예측치보다높게나타났다. RMSPE 값들을실험에대한반응값으로설정한후에분산분석을수행한결과, 회귀식과 2차모형에서는 95% 이상의유의성이나타났으나, 선형모형에서는유의성이나타나지않았다 (Table 5). 분산분석을통하여실험에사용된각추출물들은항산화활성향상에있어곡률효과 (quadratic effect) 가존재하는것을알수있었다. 각실험들에서얻어진반응값들을이용하여등고선그래프를작성한결과모든혼합물이함께혼합된경우에서가장높은 RSMPE 값을나타내었다 (Fig. 2). 즉본실험에사용된추출물들은모두가혼합되었을경우에상호상승작용을통하여항산화활성이개선될수있음을알수있었다. 최종적으로각추출물의최적혼합비율을조사하였다. 그결과, 뽕나무잎, 감나무잎및가시오갈피추출물을 0.44:0.28:0.28 의비율로혼합할경우가장우수한상호상승효과를기대할수있을것으로나타났다. 본연구는다양한식물추출물에서항산화활성을측정하고통계적모델을이용하여최적항산화활성을나타내는식물추출물들의조합을도출하는데에그목적이있으며이를이용하여가축의사료첨가제를개발하기위한기초자료로활용 Table 4. Mixture design for 10 experimental runs with 3 plant extracts (variables) and their responses Responses Runs Variables 1, μl Free radical scavenging activity, ascorbic acid, mm RMSPE 2 X2 X8 X10 Sum Observed Predicted Variables are X2, Morus alba L. leaves; X8, Diospyros kaki Thunb. leaves and X10, Acanthopanax senticosus (Rupr. & Maxim.) Harms. 2 RMSPE = root mean square prediction error.

102 Journal of Agriculture & Life Science 47(1) Fig. 3. Optimum levels of variables ((A), Morus alba L. leaves; (B), Diospyros kaki Thunb. leaves; (C), Acanthopanax senticosus (Rupr. & Maxim.) Harms).

8 102 Journal of Agriculture & Life Science 47(1) Fig. 3. Optimum levels of variables ((A), Morus alba L. leaves; (B), Diospyros kaki Thunb. leaves; (C), Acanthopanax senticosus (Rupr. & Maxim.) Harms). Fig. 2. Contour plot for root mean square prediction error. 하고자하였다. 식물추출물들의상호작용을나타내는모델의반응값으로항산화활성을측정, 이용하였으며, 통계적방법을이용하여가능한모든식물추출물들의상호관계를짧은시간에효율적으로측정하고, 얻어진모델을통하여최적조합을도출하는방법을제시하고있다. 항산화활성뿐만아니라사료첨가제로이용하기위한필요한다른조건들도, 본연구에서사용된통계적인방법을이용하여우수한능력을보이는혼합물을만들수있는방법을찾아낸다면많은식물추출물들이가지는특성들을적절하게조합하여보다우수한사료첨가제를개발할수있으리라사료된다. IV. 감사의글이연구는 2011학년도경북대학교신임교수정착연구비에의하여수행되었으며이에감사드립니다. Literature Cited Chang, M. S., M. Park, M. C. Jeong, D. Kim, and G. H. Kim Antioxidative and antibrowning effects of Taraxacum platycarpum and Chrysanthemum indicum extracts as natural antibrowning agents. Korean J. Food Preserv. 18: Chaves, A. V., I. M. Brookes, G. C. Waghorn, S. L. Woodward, and J. L. Burke Evaluation of Table 5. Analysis of variance for mixture design Sources Degree of freedom Sum of square Mean of square F-value P-value Regression Linear Quadratic Residual error Total

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Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,