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1 한국임상약학회지제 21 권제 3 호 Kor. J. Clin. Pharm., Vol. 21, No 손상모발을위한 EPA 함유샴푸개발 이보름 1 이옥상 1 강태진 2 임성실 1,# 1 충북대학교약학대학임상약학실, 충청북도청주시흥덕구성봉로410( 개신동 ) 2 삼육대학교약학대학, 서울특별시노원구화랑로 815 (2011년 7월 11일접수 2011년 8월 17일수정 2011년 8월 18일승인 ) Development of Shampoo Formulated by EPA for the Damaged Hair Bo Reum Lee 1, Ok Sang Lee 1, Tae Jin Kang 2, and Sung Cil Lim 1,# 1 Clinical Pharmacy, College of Pharmacy, Chungbuk National University, Sungbongno 410, Cheongju, South Korea 2 Department of Pharmacy, College of Pharmacy, Sahmyook University, Hwarangno 315, Seoul, Korea (Received July 11, 2011 Revised August 17, 2011 Accepted August 18, 2011) Omega-3 fatty acids are a specific type of unsaturated fat that the body cannot manufacture on its own, so they must be obtained from food which is essential fatty acids (EFAs). Omega-3 fatty acids consist of three types which are a- Linolenic Acid (ALA), Eicosapentaenoic (ELA), and Docosahexaenoic Acid (DHA). Especially, EFAs help to prevent skin and hair drying, acne, eczema, prevention from allergies, brittle nails, rashes, and tiny lumps. The aim of this study is to investigate improvement and protection for hair damaged by chemical treatment with omega-3 formulated shampoo. We selected virgin hair sample and divided into two groups for bleaching once and three times and then damaged hair by changing the number of hair bleaching (twice with interval of 15 minutes). Each bleached hair was treated by five different kinds of shampoo (Control, Horse shampoo, DHA shampoo, EPA shampoo, Omega-3 shampoo mixture). Apart from this, EPA/DHA 2, 5, 8, 10 and 12% shampoo were prepared and treated to hair for comparing rate of progress in damaged hair. To quantify improved condition of damaged hair, we performed Scanning Electron Microscope (SEM) for ultrastructure of damaged hair fraction, measurement of thickness change and BCA Protein Assay for recovery rate of damaged hair. The moisture in hair was measured by Thermal analysis machine. In results, we observed the particle of hair surface damaged by bleaching treatment were well improved with treatment with EPA and DHA shampoo. Also, quantity of protein was lowered with higher concentration of EPA & DHA i.e., 8 and 12 % then compared with horse oil shampoo in three times treatment group. It shows that bleached hair have been recovered by treating rapidly and get protective coat. In conclusion, EPA and DHA shampoo improved damaged hair, especially with EPA / DHA 12% shampoo. Also, EPA shampoo could protect the damaged hair depending on increasing concentration of EPA. Therefore, we conclude omega-3 shampoo could make damaged hair protect and get healthy hair environment. Key words - Omega-3 fatty acids. DHA, EPA, hair treatment, bleaching Omega-3 불포화지방산 (PUFAs; poly unsaturated fatty acids) 은둘이상의이중결합을지닌장쇄지방산이다. Omega-3 불포화지방은필수지방아미노산 (Essential Fatty acids; EPAs) 으로써, 피부와모발의성장, 콜레스테롤의메커니즘및재생활성등에필요한요소이다. 최근이지방산의치료학적적용과음식및영양학적이적용에대한가능성이알려지면서많은분야에서이용되어지고있다. 그러나이러한필수 Correspondence to : 임성실충북대학교약학대학임상약학실, 충청북도청주시흥덕구성봉로 410( 개신동 ) Tel: , Fax: slim@chungbuk.ac.kr 지방산 (EPAs) 들은우리몸안에서는생산되지않기때문에 음식으로써섭취되어야한다. 1) Omega-3 불포화지방산의주요식이원천으로는어류, 해조류, 특정견과류및식물성기름에포함되어있고 Omega-3 불포화지방산의가장대표적인 Eicosapentaenoic acid (EPA; C20:5n-3) 과 Docosahexaenoic acid (DHA; C22:6n-3) 는참치 (Tuna), 연어 (Salmon), 고등어 (Macherel), 청어 (Herring) 등에높은함유율을나타낸다. 2) Omega-3 불포화지방산, 즉 EPA와 DHA는심장질환 (Heart disease), 높은콜레스테롤수치 (High cholesterol), 고혈압 (Hypertension), 관절염 (Arthritis), 요통 (Back pain), 골다공증 (Osteoporosis), 건선 (Psoriasis), 루퍼스 (Lupus), Crohn's 256

2 손상모발을위한 EPA 함유샴푸개발 257 disease, Attention-dificity /hyperactivity disorder (ADHD), 눈건조 (Dry eyes) 등넓은범위의질병에서이용되고있다. 3)4) 하여본논문에서는 Omega-3 불포화지방산의인체내에서의재성활성이모발에서도적용되는지평가해보고자한다. 사람의모발은감각작용, 체온유지, 두피보호덩의기본적인인체보호의역할에서출발하여, 美 와개성표현의수단으로발전해왔다. 초기미용산업은모발의모양과색의변화라는단순한범위내에서발전되어왔고사람들의다양한욕구를만족하기위해무분별한화학처리와방법이적용되었으며이로인해모발의손상과두피질병이라는심각한결과를초래하였다. 5) 모발손상의원인은화학처리및환경적요인등매우다양한원인들이있으며이것은모발뿐아니라두피까지도손상시키는결과를야기하였다 (Figure 1). 화학적시술에의한손상은주로모간의외부를둘러쌓고있는모표피와모피질에손상을주게되고, 손상된모발은자기회복력이없기때문에정상모는손상되지않도록주의해야하며, 손상모는더이상진행되지않도록보호하는것이중요하다. 6) 한동안단순히스타일만들기에치중했다면요즘은 Hair care( 헤어케어 ) 의비중이점차커져가고있다. 화학처리전, 후에샴푸및트리트먼트의사용을통해모발손상을최소화하고손상된모발의회복을위한많은방법들이연구되고있다. 7) 모발제품들은스타일링과세정기능을하는정도의단순화제품에서모발과두피상태에따라선택되도록전문화되고세분화되었다. 특히, 모발에대한모세포의세포분열과성장그리고모발미세구조에대한물리적, 화학적특성에대한연구가활발히진행되고있다. 8) 그리하여, 현시대에는세정제로서의목적만을가지던예전과는달리, 샴푸제는계면활성제와같은기본적인성분외에도각종첨 가제들이개발되어비듬방지, 모발의색상보호등의특수효과를지닌샴푸들도개발되고있다. 또한제품의기능도모이스쳐라이징효과 (Moisturizing effect) 와컨디셔닝효과 (Conditioning effect) 등을갖춘세분화된것들도출시되고있다. 최근에는첨가제에대한화학부작용을방지하기위한천연물을이용한천연샴푸들도많이나오고있다. 한예로, 마유는포함한지방산은다른동물성지방과는다르게체내에서만들수없는세포막의중요한구성요소이다. 마유는얇은유막을형성하여외부로부터피부를보호하며수분의증발을막아주며항균작용을하며혈액순환을원활히함으로서마유스킨제품또는샴푸와같은페어제품으로활용하였을때피부환경의개선에도움을준다 ( 특허 ). 또, 마유는체내에서세포막을형성하고콜레스테롤을제거하는다량의불포화지방산을함유하고있는것에서 Omega-3 불포화지방산과비슷한면을가지고있다. 이에본연구에서는 Omega-3도마유처럼샴푸로활용하였을시, 두피환경을향상시키고모발의손상의개선및방지를기대해볼수있을것으로생각된다. 오메가-3 지방을함유하는유지중가장대표적유지인 DHA와 EPA 단일성분을가지고샴푸로만들어서화학적시술로인해손상된모발의보호효과에대하여평가하고샴푸를개발하고자하였다. DHA는 22개의탄소사슬에 6개의이중결합을, EPA 는 20개의탄소사슬에 5개의이중결합을가진천연물질이다. 손상모발에직접 EPA 혹은 DHA 로만든샴푸로처리하여회복정도를표면적으로관찰하고모발성분의변화를측정하여 Omega-3 불포화지방산의샴푸로서의이용가능성을평가하고자한다. 또한현재이용가능한 omega-3는단일성분이아닌 Mixture contents가상용되고있는것으로조사되어, 본 Fig. 1. Major Factors for Damage to Hair.

3 258 Kor. J. Clin. Pharm., Vol. 21, No. 3, 2011 논문에서는오메가-3 지방을함유하는유지중가장대표적유지인 DHA 혹은 EPA 단일성분을가지고샴푸로제조하여화학적시술로인해손상된모발의보호효과에대하여평가하고기능성샴푸로서개발하고자하였다. 연구방법 시약세포배양에사용한 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), RPMI 1640 midum, fetal bovine serum은 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA) 에서구입하여사용하였다. 3 - [4,5 - dimetylthiazol yl ] diphenyltetrazolium bromide MTT) 정량에사용한시약및 Eicosapentaenoic acid (EPA) 와 Docosahexaenoic (DHA) 와단백질정량에사용된 BCA kit는 Sigma Chemical에서구입하여사용하였다. 모발시료본연구에사용된모발시료는 2009년 08월에충북청주의한미용실에서동일인의건강모발 (Virgin hair) 을충분히얻어서준비하였다. 모발은끝부분에서 15~20 cm의길이로잘라서채취하였다. 분석용전자저울로약 0.2 g을측정한후모근방향이일정하게하여 1cm 실리콘으로고정시킨후군별모발시료로나누어제작한다. 모발시료의오염물질이묻지않도록증류수로 3회헹군후상온에서자연건조하였다. 탈색본실험에서는동일한손상모발을얻기위하여건강모발 (Virgin hair) 에대해탈색제 ( 국내 A사 ) 를사용하여일정한시간간격을두고탈색을유도하여동일손상을주었다. 사용된탈색제는청주지역의 G 미용사에서구입하여시술하였다. 실험전, 이물질제거를위해증류수로세정이완료된모발시료 2.0 g에대하여준비된탈색제의제 1제 ( 과황산모늄- 모발탈색제의혼합첨가물 : 높은알칼리성분을유지하여큐티클층을급속도로팽윤시켜과산화수소가모피질층으로의확산촉진 ) 와제 2제 ( 과산화수소 ; H 2 O 2 35%- 모발탈색제 : 멜라닌색소의산화작용 ) 를 1:3으로혼합하여모발에도포하고일정시간 (Interval time: 15 minutes) 경과후 3차증류수 (500 ml) 로 3회헹구어자연건조하였다. 이와같은방법으로 1-5회탈색하여각모발에대한손상정도를조절하였으며, 실제샴푸처리는 1, 3회탈색한모발 2.0 g에대하여샴푸처리하였다. 샴푸제조정제수 44.5 g에 Polyquater 0.5 g을넣고교반시켜준후, SLES 40 g, Cocamide Cocamidopropyl Betaine 10 g을넣고잘교반해준후, Omega-3 불포화지방산인 EPA와 DHA를각각 2, 5, 8, 10, 12% 가되도록첨가하였다. 완성된샴푸는 24시간동안첨가물이잘섞이도록안정화시킨다. 보관시에는직사광선을피하여서늘한곳에보관한다. 샴푸처리샴푸처리는 Control shampoo, DHA & EPA shampoo (each 2, 5, 8, 10, 12%), Horse oil shampoo, Omega-3 shampoo 를가지고모발 2.0 g당 1ml를덜어서거품낸후주물러서세정하였다 ( 약 50회 ). 세정후세정액이맑은물이유지될때까지흐르는증류수로수세하여자연건조하였다. 세정기간은 1일 1회씩 30일간과연속 30회샴푸처리하였다. 세포독성측정 : MTT Assay (1) 세포배양정상세포에대한독성측정을위해한국세포주은행에서분양받은 NIH3T3 섬유모세포는 DMEM 배지를사용하였다. 세포배양온도는 37 o C, 습도 95%, 탄산가스 5% 의배양기 (CO 2 incubator, 제조사 ) 를사용하였다. 세포배양후 flask의세포를 0.25% trypsin-edta로처리하여분리한후세포독성측정을하였다. (2) MTT (3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2.5-diphenyltetrazolium bromide) assay NIH3T3 섬유모세포배양용기 (96 well) 에넣은후 ( cells/ml), DHA, EPA 를각농도별 (10, 20, 50, 100, 200 µm) 로 50 µl 첨가하고각각 6, 12, 24, 48시간동안배양하였다. 3 - [ 4,5 - dimetylthiazol yl ] diphenyltetrazolium bromide (MTT) 시약을 20 µl/well 씩첨가하고 2시간동안반응시킨후, Centrifuge를 10분간 2000 rpm 처리후, 120 µl/well를빼내고 DPBS를 100 µl를첨가한후, centrifuge를다시 10분간 2000 rpm으로돌린후, 200 µl를다시빼냈다. Isobutanol 15 ml + HCl 50 µl를 100 µl/well 넣고 complex 결합을위해 MTT formazan 을용해하여흡광도는 ELISA reader 로 MTT의흡광도 (570 nm) 를측정하였다. 모발의형태학적변화관찰및두께측정 : SEM method 각샴푸처리한모발에대하여 0, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30회처리한모발시료의모표피와모피질의변화를알아보기위해 SEM (Scanning Electron Microscope, S-2500C, Hitachi, German) 을이용하여관찰하였다. 모발시료 10가닥을선택하여 2cm 정도로잘라서 SEM의샘플받침대 (silver fasten) 에고정시킨다. 고정시킨시료는진공상태에서 130초간의백금코팅을 2번의전처리를거친후, 주사전자현미경을이용하여모발의표면을관찰하고, 굵기를측정하였다. 배율은 500배로관찰하였다. 모발의단백질량측정 : BCA Protein assay BCA에 CuSO 4 5% 용액을넣어섞어서발색제 (BCA : CuSO 4 =50:1) 를 BSA 0, 1 2, 4, 8, 19, 20 µg이든 microtube 에

4 손상모발을위한 EPA 함유샴푸개발 ml 씩넣는다. 모발시료를 2cm씩 5가닥를넣은 microtube 에도발색제를 1.5 ml씩넣어준후 voltexing하여 Water beth(34.7 o C) 에서 30분간담가두었다. Cuvette에각각옮겨담은후, 한방향으로 cuvette을분광기에넣어 562 nm에서흡광도를측정하였다. 처음샘플은증류수를넣어측정하여 0으로 calibration 한다음에농도를측정하였다. 모발내의수분측정 : Thermal analysis method 샴푸처리한모발의수분함량변화를측정하기위하여건강모발과농도별 DHA shampoo (8, 10, 12%), EPA shampoo (8, 10, 12%), Horse oil shampoo, Omega-3 shampoo로각각샴푸처리한모발시료를기름종이 (Oil paper) 위에 1cm 미만의길이로잘라서중량을측정한다음 ( 약 2.0 mg), 열분석용 sample holder에장착하였다. 모발시료에대한열분석은 sample holder와 reference holder에열을동시에가하면서표준물질과상대비교하였다. 표준물질은 N 2 를사용하였다. 표준물질과모발과의무게차이를컴퓨터프로그램을이용하여 0점 (0 point) 까지정확히미세조정한다음, 열분석기 (Thermal Analyzer: TA Instruments, SDT2960) 를사용하여컴퓨터프로그램상에서모발의가열계획 (Heating schedule) 을 Table 1. Questionnaire <Condition of hair> 1. The length of hair? 1) very short 2) short 3) middle 4) long 5) very long 2. The density of hair? 1) very less 2) less 3) middle 4) many 5) very many 3. The Thickness of hair? 1) very thin 2) thin 3) middle 4) thick 5) very thick 4. The type of hair? 1) straight hair 2) tend to straight hair 3) naturally curly hair 4) very naturally curly hair 5. Whether the stain? 1)natural hair 2) dyed hair 3) coat hair 4) bleach hair 5) 2 or more hair treatment 6. Degree of hair damage? 1) healthy hair 2) tend to healthy hair 3) middle 4) little damage to the hair 5) very damage to the hair 7. The type of hair? 1) dry 2) tend to dry 3) normalcy 4) tend to oily 5) oily 8. The state of your scalp? 1) healthy 2) is sensitive 3) is wound 4) hair loss is serious 9. The type of the scalp? 1) dry 2) sensitivity 3) normalcy 4) oily 5) dandruff 6) Etc. 10. Day and the number of shampoo? 1) more than twice a day 2) once a day 3) 4~5 times a week 4) 2~3 times a week 11. How to dry your hair after shampoo? 1) natural dry 2) use the dryer and tools 3) go to bed without drying <Evaluation of use shampoo> -Choose one answers following the each questions 1) very good 2) good 3) middle 4) bed 5) very bed 12. The scent of shampoo? 13. The viscosity of shampoo? 14. The viscosity of shampoo you use? 15. The occurrence of bubbles using shampoo? 16. The feeling of shampoo? 17. Feel when rinsing the hair? 1) very tender 2) tender 3) middle 4) stiff 5) very stiff 18. The detergency of shampoo? 19. The moisture of shampoo? 20. Day towels feel after? 21. Completely dry feel after? 22. After drying for the hair shine? 23. After shampoo, it is easy to comb out? <Patients' characteristics> 25. sex? 1) man 2) woman 26. Age? years 27. Job? 1) employees 2) high school students 3) (graduate) students 4) housewife 5) Etc. 28. Timing and type of hair treatment perm ex) one month ago, Decolorization

5 260 Kor. J. Clin. Pharm., Vol. 21, No. 3, 2011 분당 5 o C로설정후 500 o C까지상승시키면서모발의무게감량비를측정하였다. 샴푸사용성평가 (1) 연구방법본연구는 Control shampoo와가장효과가판단되어진 EPA 12% 샴푸를가지고각 3회사용한결과에대한평가를얻어샴푸의사용성에대해평가하고자하였다. 자료수집방법은총 50명대한설문조사를통하여얻었다. 각한명당 10 ml의샴푸를제공하였고, 하루 1회 3일간실시하도록하였고, 쓰고난후바로설문을작성할수있도록충분히설명하였다. 샴푸의평가목록으로는 Omega-3 샴푸의향, 점도, 기포생성력의적정성, 질 ( 느낌 ), 헹굼후의모발의질 ( 느낌 ), 세정력, 보습력, 타올드라이후의질 ( 느낌 ), 완전건조후의느낌, 모발의광택, 빗질의용이성을각항목에포함시켜서작성하도록하였다. 답안은 1~5번까지의문항으로구성되어있다 (Table 1). (2) 평가방법본연구는 Omega-3 불포화지방산을첨가한샴푸를사용한후사용성에대한만족도를측정하고자각문항에대한평균을구하였다. 평균값이 1에가까울수록사용성이긍정적인것으로 5에가까울수록부정적인것으로평가하였다. 통계처리분석은 SPSS 12K (Window version) 를이용하였으며, 분석방법으로는 Student t-test 및 ANOVA one way analysis를이용하였다. Significant value는 p < 0.05로하였다. Fig. 2. The Cytotoxicity of EPA Based on MTT Assay in NIH3T3 Fibroblasts. The cells were treated with 10, 20, 50, 100, 200 µm EPA, and incubated at 37 o C for 6-48 h. Results represented mean±s.e.m. of five experiments. Significantly different from control values : p < 0.05 (ANOVA followed by Turkey's test). 연구결과 EPA 및 DHA의섬유모세포 (NIH3T3 cell; fibroblast cell) 에대한세포독성정상세포주인 NIH3T3 섬유모세포에 Omega-3 불포화지방산 EPA, DHA를각각 10, 20, 50, 100, 200 µm을 6, 12, 24, 48시간처리하여 MTT assay한결과, 농도와시간에의존적으로세포독성이증가하였다. Omega-3 불포화지방산인 EPA와 DHA 10, 20, 50 µm에서 48시간까지처리된세포에서세포의생존율의차이가나타나지않았고 100 µm와 200 µm에서 EPA, DHA 모두에서시간의존적으로세포독성 Table 2. Effect of Bleaching Degree on Hair Morphology Degree of bleaching None once 2nd 3rd 4th 5th Boundary Disquamation Dissolution Swelling Elution ;+: A little, ++: Slightly, +++: Sever, ++++: Very sever ;Boundary (line of cuticle), Disqumation (break away, peeling off or fall off the cuticle), Swelling (expend the combination of internal hair), Elution (flow out protein in cortex and medullar)

6 손상 모발을 위한 EPA 함유 샴푸 개발 261 Table 3. Improvement of 1 Bleached Hair Morphology Following EPA Shampoo Treatment Treatment (Day) % 5% E P A 8% 10% 12% Table 4. Improvement of 3 Bleached Hair Morphology Following EPA Shampoo Treatment Treatment (Day) 1 2% 5% E P A 8% 10% 12%

7 262 Kor. J. Clin. Pharm., Vol. 21, No. 3, 2011 이 증가하였고, EPA보다 DHA에서 세포독성이 높은 것으로 나타났다(Figure 1, 2). 샴푸 처리에 따른 손상모발의 형태학적 개선 효과 (1) 탈색 횟수에 따른 모발의 형태학적 변화 탈색정도에 따른 모발의 형태학적 변화를 관찰한 결과, 탈 색을 하지 않은 정상모발(Virgin hair)은 전체적으로 매끄러 운 외형을 보이고 있으며 스케일이 규칙적으로 겹쳐있었다. 1, 2회 탈색모에서는 큐티클층의 경계불분명(Boundary)과 큐 티클층의 들림을 나타내는 박리현상(Disquamation)이 나타났 으며 3회 탈색모에서는 경계불분명(Boundary), 박리현상 (Disquamation)에 부분적인 큐티클층의 용해(Dissolution) 가 관찰되었다. 4회에서는 큐티클층의 용해(Dissolution)와 모발 내의 용출 (Elution)이 관찰되었고, 5회 탈색모에서는 경계불 분명(Boundary), 박리(Disquamation), 용해(Dissolution), 팽창 (Swelling), 용출현상(Elution)이 심한 것으로 관찰되었다 (Table 2). (2) 농도별 EPA 및 DHA 샴푸 처리에 따른 손상모발의 형태학적 개선효과 ① 농도별 EPA 샴푸 처리 EPA 2, 5, 8, 10, 12% 첨가한 샴푸를 손상모발(1, 3회 탈 색모)에 처리한 결과, EPA의 함유량이 높은 샴푸에 대해 손 상모의 상태가 개선되는 것을 확인하였다. 특히, EPA 12% 샴푸 처리한 모발에서 20회 처리 후의 모발표면이 많이 매 끄러워진 것을 볼 수 있다(Table 3, 4). ② 농도별 DHA 샴푸 처리 DHA를 2, 5, 8, 10, 12% 첨가한 샴푸를 손상모발에 처리 한 결과, DHA의 함유량이 높은 샴푸에 대해 손상모의 상태 가 개선되는 것을 확인하였다. DHA를 2, 5% 첨가한 샴푸의 경우, 20회 처리 후에도 부분적으로 거칠어 보였다. DHA를 10, 12% 첨가한 샴푸의 경우, 10회 처리 후에 눈에 띄게 모 발의 표면의 들린 큐티클층의 각질이 제거되어 균일하여 보 였으며 30회 처리 후에는 정상모발과 비슷하게 모발의 표면 이 매끄러워진 것을 관찰 할 수 있었다(Table 5, 6). ③ Horse oil 샴푸와 Omega-3 샴푸 처리 Horse oil 샴푸를 손상 모발에 처리한 결과, 샴푸 10회 처 리 후에는 1회 시술 보다 눈에 띄게 큐티클층의 각질이 제 거되어 세정되었다. 20회 처리 후에는 10회와 크게 다르지 않았다. 샴푸 처리 30회의 경우, 표면이 매끄러워졌음을 알 수 있었다. Omega-3 샴푸의 경우 10회 처리 후 큐티클층의 각질이 조금 제거된 것으로 관찰되었고 샴푸처리 전과 후의 차이가 크게 나타나지 않았다. 30회 시술 후에는 일부 각질 이 보이지만 세정효과는 있는 것으로 보였다(Table 7). Table 5. Improvement of 1 Bleached Hair Morphology Following DHA Shampoo Treatment Treatment (Day) 1 2% 5% DHA 8% 10% 12%

8 손상 모발을 위한 EPA 함유 샴푸 개발 263 Table 6. Improvement of 3 Bleached Hair Morphology Following DHA Shampoo Treatment Treatment (Day) % 5% DHA 8% 10% 12% Table 7. Improvement of Hair Morphology Following Other Shampoo Treatment Treatment (Day) 1 OME Once bleached Hair H.O Con 3rd bleached hair H.O OME: Omega-3 shampoo H.O: Horse oil shampoo

9 264 Kor. J. Clin. Pharm., Vol. 21, No. 3, 2011 Fig. 3. The Cytotoxicity of DHA Based on MTT Assay in NIH3T3 Fibroblasts. The cells were treated with 10, 20, 50, 100, 200 µm DHA, and incubated at 37 o C for 6-48 h. Results represented mean±s.e.m. of five experiments. Significantly different from control values : p < 0.05 (ANOVA followed by Turkey's test). Fig. 5. The Effect of EPA & DHA Shampoo on Hair Thickness after Hair Bleaching. (a) The thickness of 1 bleached hair, (b) The thickness of 3 bleached hair. The hair tresses were treated once a day for 8, 10, 12% EPA shampoo, 8, 10, 12% DHA shampoo, Horse oil shampoo (H.O), Omega-3 shampoo (OME). Results represented mean±s.e.m. Significantly different from control values: p <0.05 Fig. 4. The Effect of Bleaching Degree on Hair Thickness. 농도별 EPA 및 DHA 샴푸처리에따른손상모발의두께증가효과 (1) 탈색횟수에따른모발의굵기변화모발의굵기는개개인에따라다르고동일인의모발이라하여그굵기는다르지만, 일반적인동양인의모발굵기인 50~150 µm 정도이다. 9) 본실험에서사용한모발의평균굵기는 µm로건강한정상모발인것을확인한후, 사용하였다. 탈색횟수에따른모발굵기변화를측정한결과, 탈색횟수가반복됨에따라모발의굵기가얇아졌다 ( p< 0.05, p =.012). 정상모발과 1회탈색한모발굵기사이의유의한차이는나타나지않았으며 (p > 0.05; p = 0.307), 2회부터유의하였다 (Figure 4). (2) 농도별 EPA 샴푸처리에따른손상모발의두께증가 효과 1, 3회탈색으로인해손상된모발에 EPA 0, 2, 5, 8, 10, 12% 샴푸를처리하여두께변화를측정한결과, 농도가증가함에따라모발의두께가증가하였고 (p >0.05, p =.021; 1 bleached hair, p=.024 ; 3 bleached hair), EPA 12% 샴푸처리한 1, 3회탈색모발이각각 4.6%( µm; 1 bleached hair), 3.8%(96.67 µm; 3 bleached hair) 의두께증가율로가장큰차이를보였다 (Figure 5). (3) 농도별 DHA 샴푸처리에따른손상모발의두께증가효과 1, 3회탈색으로인해손상된모발에 DHA 0, 2, 5, 8, 10, 12% 샴푸를처리하여두께변화를측정한결과, 농도가증가함에따라모발의두께가증가하였다 (p > 0.05, 1 bleached hair- p=.032, 3 bleached hair- p=.017). DHA 12% 샴푸처리한 1, 3회탈색모발이각각 4.5%( µm; 1 bleached hair), 2.5% (95.43 µm; 3 bleached hair) 의두께증가율로가장큰차이를보였다 (Figure 5). (4) Horse oil 샴푸와 Omega-3 샴푸처리한손상모발의두께증가효과 Horse oil 샴푸및 Omega-3 샴푸처리함에따라모발의

10 손상모발을위한 EPA 함유샴푸개발 265 Fig. 6. The Effect of Bleaching Degree on Hair Protein Content. Significantly different from control values : p <0.05. 두께변화를측정한결과, Horse oil 샴푸는 Control 샴푸에비해모발의두께증가율이 Omega-3 샴푸의두께증가율보다크게나타났다 (Figure 5). 농도별 EPA 및 DHA 샴푸처리에따른손상모발의단백질감소효과 (1) 탈색정도에따른모발의단백질량측정 BCA protein 정량법을실시하여모발손상이많이될수록단위시간당모발내의단백질이많이유출된다는것을이용하여실험한결과탈색횟수가증가할수록유출된단백질이많음을확인하였다 (Figure 6). (2) 농도별 EPA 샴푸처리에따른손상모발의단백질량감소효과 1 하루한번 30회샴푸처리한손상모발 1회탈색한모발의 EPA 의농도별단백질감소율 (3.271 µg) 은 EPA 0, 2, 5, 8, 10,12% 함량에따라각각 11.3%(2.690 µg), 27.9%(2.357 µg), 32.8%(2.199 µg), 42.0% (1.896 µg), 45.1% (1.79 µg), 51.0%(1.602 µg) 이였다. 3회탈색한모발의 EPA 의농도별단백질량의감소율 (4.165 µg) 은 EPA 0, 2, 5, 8, 10, 12% 의함량에따라각 12.9% (3.626 µg), 17.9%(3.418 µg), 24.1%(3.160 µg), 36.9%(2.624 µg), 45.8% (2.255 µg), 50.5% (2.058 µg) 이었다. EPA 2, 5, 8, 10,12% 샴푸처리한손상모발에대해 protein assay한결과, 농도에의존적으로모발의단백질량이감소하는것으로나타났다 (p < 0.05; 1 bleached hair- p=.024, 3 bleached hair- p =. 001). 1회탈색모에대한샴푸처리에서는 10회처리후, 3회탈색모에서는 15회처리후 EPA 8, 10, 12% 를샴푸처리한모발에서단백질량의차이나나타났다 (p < 0.05; 1 bleached hair- p = 0.031, 3 bleached hairp =.021). 2 연속 30회샴푸처리한손상모발 1회탈색한모발의 EPA의농도별단백질감소율 (3.271 µg) 은 EPA 0, 2, 5, 8, 10,12% 함량에따라각각 11.3% (2.690 µg), 27.9%(2.357 µg), 32.8%(2.199 µg), 42.0%(1.896 µg), 45.1%(1.796 µg), 51.0%(1.602 µg) 로나타났다. 3회탈색한모발의 EPA 의농도별단백질량의감소율 (4.165 µg) 은 EPA 0, 2, 5, 8, 10, 12% 의함량에따라각 12.9%(3.626 µg), 17.9% (3.418 µg), 24.1%(3.160 µg), 36.9%(2.624 µg), 45.8%(2.255 µg), 50.5%(2.05 µg) 로나타났다. EPA 2, 5, 8, 10,12% 샴푸처리한손상모발에대해 protein assay한결과, 농도에의존적으로모발의단백질이감소하는것으로나타났다 (p < 0.05; 1 bleached hair- p =.024, 3 bleached hair- p =.001). EPA 8, 10, 12% 샴푸처리한 1회탈색모는 10회, 3회탈색모는 15회처리후부터모발로부터의단백질량이비첨가군과 EPA 2, 5% 첨가샴푸군보다통계적으로유의하게차이나나타났다 (p < 0.05; 1 bleached hair-p =.031, 3 bleached hair-p=.021). (3) 농도별 DHA 샴푸처리에따른손상모발의단백질량감소효과 1 하루한번 30회샴푸처리한손상모발 1회탈색모의 DHA 농도별단백질감소율 (3.271 µg) 은 Fig. 7. The Effect of Increasing Moisturizing for Damaged Hair Following Shampoo Treatment. (a) One bleached hair-b1, (b) Three bleached hair-b3. The hair tresses were treated once a day for 8, 10, 12% EPA shampoo, 8, 10, 12% DHA shampoo, Horse oil shampoo (H.O), Omega-3 shampoo (OME). Results represented mean±s.e.m. Significantly different from control values: p <0.05

11 266 Kor. J. Clin. Pharm., Vol. 21, No. 3, 2011 DHA 0, 2, 5, 8, 10,12% 에따라각각 11.3%(2.690 µg), 23.1%(2.513 µg), 23.6%(2.499 µg), 39.8%(1.968 µg), 42.1% (1.895 µg), 46.2%(1.759 µg) 로나타났다. 3회탈색모의 DHA 농도별단백질량의감소율 (4.165 µg) 은 DHA 0, 2, 5, 8, 10, 12% 에각 12.9%(3.626 µg), 19.2(3.365 µg), 24.3%(3.152 µg), 38.3%(2.549 µg), 49.6%(2.101 µg), 52.4%(1.982 µg) 의감소율로나타났다. DHA 2, 5, 8, 10, 12% 샴푸처리한손상모발에대해 protein assay한결과, DHA 비첨가군 (DHA 0%; Control) 과 DHA 첨가군모두에서모두의존적으로단백질이감소하였다 (p > 0.05; 1 bleached hair- p =.035, 3 bleached hairp =.010). 1회탈색한모발에서는옴 8, 10, 12% 처리한모발의단백질량이 15회샴푸처리후, DHA 비첨가군과 DHA 2, 5% 처리한모발군모두보다단백질량이유의하게감소하였고, 3회탈색모에서는 20회처리후에 DHA 8, 10, 12% 샴푸처리한모발의단백질량감소율이유의하게감소하였다 (p < 0.05; 1 bleached hair- p =.002, 3 bleached hair- p =.021). 2 연속 30회샴푸처리한손상모발 1회탈색한모발의 DHA의농도별단백질감소율 (3.271 µg) 은 DHA 0, 2, 5, 8, 10,12% 함에따라각각 11.3%(2.690 µg), 23.1%(2.513 µg), 23.6%(2.499 µg), 39.8%(1.968 µg), 42.1%( µg), 46.2%(1.759 µg) 로나타났다. 3회탈색한모발의 DHA 농도별단백질량의감소율 (4.165 µg) 은 DHA 0, 2, 5, 8, 10, 12% 의함량에따라각 12.9%(3.626 µg), 19.2(3.365 µg), 24.3%(3.152 µg), 38.3%(2.549 µg), 49.6% (2.101 µg), 52.4% (1.982 µg) 의감소율로나타났다. DHA 2, 5, 8, 10,12% 샴푸처리한손상모발에대해 protein assay한결과, DHA 비첨가군 (DHA 0%; control) 과 DHA 첨가군모두에서농도에의존적으로모발단백질이감소하는것으로나타났다 (p > 0.05; 1 bleached hair- p =.035, 3 bleached hair- p =.010). DHA 8, 10, 12% 처리한모발의단백질정량에서는 1회탈색모에서는 15회처리, 3회탈색모 Table 8. Patients' Characteristics Shampoo groups EPA 12% shampoo Control shampoo Total (n) Gender (n) Male 11(21.2%) 11(31.4%) Female 41(78.8%) * 24(68.6%) * Age (years) 24.67± ± Worker 9(17.3%) 3(8.6%) Occupation (n) Students 38(73.1%) * 27(77.1%) * House keeper 4(7.7%) 2(5.7%) Etc. 1(1.9%) 3(8.6%) Experience of hair perm (n) Yes 48(92.3%) 30(85.7%) No 4(7.7%) 5(14.3%) Hair Condition Non treatment 4(7.7%) 4(11.4%) Dyed hair 31( %) * 16(45.7%) * Kind of hair (n) Coated hair 4(7.7%) 3(3.8%) Bleached hair 8(22.9%) 6(17.1%) More than 2 perm 5(9.6%) 6(17.1%) More than 2 a day 6(11.5%) 3(8.6%) # of shampoo (n) Once a day 41(78.8%) * 26(74.3%) 4~5 a week 4(7.7%) 4(11.4%) 2~3 a week 1(1.9%) 2(5.7%) Natural dry 7(13.5%) 2(5.7%) Methods of drying (n) Dry machind 43(82.7%) * 30(85.7%) * Sleep without dry 2(3.8%) 3(8.6%) ; * p <0.05

12 손상모발을위한 EPA 함유샴푸개발 267 에서는 20회처리후, DHA 비첨가군과 DHA 2, 5% 처리한모발군모두보다단백질량이유의하게감소하였다 (p <0.05; 1 bleached hair- p =.002, 3 bleached hair- p =.021). (4) Horse oil 샴푸와 Omega-3 샴푸처리에따른손상모발의단백질감소효과 1 1회탈색모 (B1; 1 bleached hair) 의단백질량 Horse oil을 30일처리한후단백질량의감소율이 51.1% (1.375 µg) 로 EPA 10, 12% 첨가된샴푸군과비슷한비율로 단백질량줄어든것으로나타났다 (45.1%; EPA 10%, 51.0%; EPA 12%)(p > 0.05, p =.670). DHA 첨가한샴푸의경우, 12% 를첨가한샴푸를처리한모발이 Horse oil 처리한모발의단백질감소량과유의하게비슷한경향을나타내었다 (p > 0.05, p =.520). 2 3회탈색모 (B3; 3 bleached hair) 의단백질량 Horse oil을 30일처리한후단백질량의감소율이 50.6% (2.055 µg) 로 EPA 12% 와 DHA 10, 12% 첨가한샴푸군과비슷한감소율을보였고통계적으로유의한것으로나타났다 (p > 0.05, p =.038). 농도별 EPA 및 DHA 샴푸처리에따른손상모발내수분함량증가효과 (1) 농도별 EPA 샴푸처리한손상모발내의수분증가효과손상모발 (1, 3회탈색모 ) 에 EPA 8, 10, 12% 샴푸처리하여모발내의수분함량을측정한결과, EPA 첨가농도가높을수록샴푸처리후수분함량이높은것으로나타났다 (p > 0.05). EPA 10, 12% 샴푸가 Control 샴푸처리군 (2.23 mg) 에비해샴푸처리함에따라수분함량이높아지는것으로나타났으며 EPA 12% 샴푸처리한모발의수분함량이 21.9% (2.72 mg; 1 bleached hair), 52.1% (2.54 mg; 3 bleached hair) 의증가율로가장높았다 (Figure 7). (2) 농도별 DHA 샴푸처리한손상모발내의수분증가효과손상모발 (1, 3회탈색모 ) 에 DHA 8, 10, 12% 샴푸처리하여모발내의수분함량을측정한결과, DHA 첨가농도가높을수록샴푸처리후수분함량이높은것으로나타났으며 (p >0.05), DHA 10, 12% 샴푸가샴푸처리함에따라 Control에비해유의하였다. DHA 12% 샴푸가샴푸처리전에비해 17.0% (2.61 mg; 1 bleached hair), 47.9% (2.47 mg; 3 bleached hair) 의수분함량이증가한것으로나타났다 (Figure 7). (3) Horse oil 샴푸와 Omega-3 샴푸처리한손상모발내의수분증가효과 Horse oil 샴푸처리한모발의경우, 20.6% (2.69 mg; 1 bleached hair), 52.6% (2.55 mg) 의수분증가율을보여 EPA 12% 샴푸처리한모발과비슷한경향을나타내었으며 Omega-3 샴푸처리한모발은 8.9%(1.82 mg; 1 bleached hair), 9.0% (2.43 mg) 의증가율로 EPA 8% 샴푸처리한모발과비슷한경향을나타내었다 (Figure 7). 샴푸사용성평가 (1) 환자의특성본연구는손상모발개선에가장효과가있다고판단되어 Fig. 8. Summary of Questionnaire Regarding the Use of 12% EPA Shampoo. Significantly different from control values : p <0.05

13 268 Kor. J. Clin. Pharm., Vol. 21, No. 3, 2011 진 EPA 12% 샴푸에대해사용성을평가하기위한임상평가를실시하였다. 설문에참여한환자는총 52명으로성별, 직업, 모발손상도, 모발타입, 두피상태등에관한특성은 Table 8과같다. (2) 샴푸의사용성평가샴푸의사용성을평가한결과, 평균 2.37±0.6977의만족도로평가되었다. 샴푸의점도 (2.65±0.6069), 샴푸사용시퍼짐성 (2.58±1.0099), 기포생성력적절성 (2.6±0.6661), 헹굼시의모발의느낌 (2.27±0.6476), 타올드라이후의느낌 (2.45±0.6457), 건조후모발의광택 (2.45±0.3659), 사용후빗질의용이성 (2.38±0.5879), 보습력 (2.3±0.5414) 등이긍정적인평가였으며샴푸향 (3.2±0.7410), 샴푸의세정력 (1.78±0.5698) 등의항목에서부적정인평가였다 (Figure 8). 고찰및결론 본논문에서는동일한사람의정상모발에탈색시술로동일손상을주었고샴푸로트리트먼트한후, 손상모발의보호효과를평가하였다. 샴푸처리군은 Control 샴푸, DHA와 EPA 샴푸, horse oil 샴푸, Omega-3 샴푸였으며, 처리모발에대해서는 MTT assay, 광학현미경 SEM (Scanning electron microscope) 을이용한모발의형태학적관찰및두께측정, BCA kit를이용한 Protein assay, 열분석 (Thermal analysis) 을이용한수분측정, 설문을통한임상평가를실시하였다. 정상세포에대한 DHA와 EPA의세포독성을알아보기위해 NIH3T3 섬유모세포 (NIH3T3) 에대해 MTT assay 한결과, EPA, DHA 모두 50 um 이하에서는세포독성이나타나지않았으며, 100, 200 um 처리한세포군에서세포독성이나타났다. 따라서샴푸에 DHA 와 EPA 를첨가할때독성이나타나지않은 50 um 이하의농도를사용해야할것으로생각된다. Menendez 등의오메가 3 불포화지방산이정상세포에는영향을주지않고, 인체암세포에만선택적으로세포독성을유발한다는것과일치하며이러한암세포의선택적세포독성을나타내는기전에는지방산합성억제와 malonyl- COA 세포독성의억제의한세포고사에기인한다고보고하였다. 10) 손상모발의개선을알아보기위해모발의특성을측정한결과, 모발은탈색정도가증가할수록즉, 손상된모발일수록단위시간당용출되는단백질량이증가하는것으로나타났으며, 모발의두께가감소하는것으로나타났다. 또한형태학적으로는큐티클층의경계불분명, 큐티클층의들림을나타내는박리현상, 큐티클층의용해, 모발내의용출현상이심해지는것으로나타났다. 손상모발의보호효과를평가하기위해손상된모발일수록모발내부에있는모피질로부터단백질이많이용출된다는것을이용하여 Protein assay한결과, DHA의농도가증가함 에따라서단위시간당용출되는 Protein의양이감소하는것을확인할수있었으며, DHA 8, 10, 12% 처리한모발의단백질량의감소율이높았으며, 하루한번처리한손상모보다연속하여샴푸처리한모발에서단백질량이더많이줄것으로나타났다. 따라서 DHA 12% 가가장보호효과가있는것으로나타났다. EPA 샴푸를처리한모발의경우, EPA 8, 10, 12% 가첨가된 EPA 샴푸에서큰폭으로단백질량이줄어드는것으로나타났으며 DHA를처리한모발보다단백질량감소율이높은것으로나타났다. 따라서 EPA 12% 가가장큰단백질감소율을보였다. DHA와 EPA 샴푸와의비교평가를위해마유샴푸와 OMEGA-3 샴푸를각각비교하면마유샴푸가 omega-3 샴푸보다샴푸처리횟수가증가함에따라단백질량이더큰폭으로줄어드는것으로나타났으며, 1 회탈색모에서는마유샴푸, EPA 10% 샴푸, EPA 12% 샴푸, DHA 12% 샴푸와단백질감소율이비슷한경향을나타냈으며, 3회탈색모에서는마유샴푸, EPA10% 샴푸, 12% 샴푸와 DHA 12% 샴푸와비슷한것으로나타났다. 샴푸처리에따른손상모발의형태학적변화는 EPA 와 DHA를각각 8, 10, 12% 첨가한샴푸의경우, 10회처리후에눈에띄게모발의표면의들린큐티클층의각질이제거되어균일하여보였으며 30회처리후에는정상모발과비슷하게모발의표면이매끄러워진것을관찰할수있었다. 특히, EPA 12% 를첨가한샴푸에서 20회처리후의모발표면이많이매끄리워진것을볼수있었다. 샴푸처리함에따라모발의두께변화는 DHA와 EPA 첨가 % 가높을수록두께가굵어지는것으로나타났으며, 1회탈색모발의두께변화는마유샴푸, EPA 12%, DHA 12%, EPA 10% 샴푸의순이었으며, 3회탈색한모발의굵기는 EPA 12%, DHA 12%, 마유샴푸순인것으로나타났다. 9)11) 모발내의수분함량변화는 DHA와 EPA의함량이높을수록처리횟수가증가함에따라모발내의수분함량이감소하였으며 1회탈색모발에서는 EPA 12%, 마유, DHA 12% 샴푸순이었으며, 3회탈색모발에서도 EPA 12%, 마유, DHA 12% 샴푸순이었다. 모발내의수분은모발의형태유지, 열에대한저항성, 케라틴결합사이의수소결합의형태유지및큐티클의부서짐등의중요한역할을한다. 12) 샴푸의사용성에대한임상평가는 EPA 12% 샴푸가 Control 샴푸에비해세정력, 사용시감기는느낌, 수분공급효과, 드라이건조후의느낌등이좋은것으로나타난반면에점도및향에대해서는좋지않게평가되었다. 본논문의연구결과, EPA 와 DHA는손상모를개선시키고특히, EPA 샴푸의농도가증가할수록보호효과는높은것으로나타났다. 또한, EPA 12% 첨가된샴푸가가장손상모발에대해샴푸의처리가반복됨에따라개선되는것으로나타났다. 따라서, EPA 12% 샴푸는손상모를보호하고모발환경개선을위한샴푸로서의개발가능성이있는것으로사

14 손상모발을위한 EPA 함유샴푸개발 269 료된다. 감사의글 이논문은 2010년도정부 ( 교육과학기술부 ) 의재원으로한국연구재단의지원을받아수행된기초연구사업임 ( ). This research was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea(NRF) funded by the Ministry of Education, Science and Technology( ) 참고문헌 1. C.A. Patterson, Ph.D., P.Ag : The Pathfinders Reasearch & Management LTd. : Omega-3 Fatty Acids (marine-derived) : Health Canadian Ingredients, Agriculture and Agri-Food Canada Andrew P. DeFilipps, MD, and Laurence S. Sperling, M.D, FACC, FACP Atlanta, GA. Understanding Omega- 3's, American Heart Journal. 2006; 151: Seth D. Feuerstein, New Haven, Ann Coric, Madison, Louis C. Sanfilippo, Orange : Omega 3 Fatty Acid Formulation, No. 60/752,146 file, US2007/ A A. L. Stoll, C.A. Locke, L.B. Marangell, W.E. Severus : Omega-3 Fatty Acids and Bipolar Disorder: a Review, Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids, 1999; 60(5&6); 김덕록 : 화장과화장품, 답계, 119 ISSN So Youn Kim, Ju Seub Kim : The Study on Hair According to Keratin Treatment Method, J. Beau. Tricho, 2008; 4(1): Mi-Ryeong An : A Study on the Usability and Foaming Ability of Shampoo According to Additives: Focused on the Addition of Chitosan, Dept. of Beauty Industrial Management Graduate school of Business Administration Yong-in university Song, Pal-Yong : Management of Hair Damage Rate and Mechanical Properties after Chemical Treatment, master of cosmetology, graduate school of engineering, Konkuk University Yeon Jung : Changes of Human Hairs According to Hair Bleaching and Coating Treatment, International Journal of Beauty Industry, 2007; 2(2): Menendez, J. A., Lupu, R. and Colomer, R : Exogenous Supplementation with Omega-3 Polyunsaturated with Acid Docosahexaenoic Acid (DHA; 22:6n-3) Synergistically Enhances Taxane Cytotoxicity and Downregulates HER-2/ neu (cerbb-2) Oncogene Expression in Human Breast Cancer Cells, Eur. J. Cancer Prev, 2005; 14: Jin hee Park, Jeung sook Choi : The Study of Heat Treatment Effect Before Using Ample on the Permanent Waving in Heavy Damaged Coloring Hair, Journal of Korea Society Cosmetic, 2003; 9(3): Alvaro L. Gomes and Sueli S. Aguiar, Silicones as Protective Agents in Thermal Treatment for Hair, Dow Corning Latin America, 최미경, Poly unsaturated fatty acid (PUFA) 인오메가 3의임상적적용근거와예 한경희강영숙김세욱김춘득소영진윤수용장경옥정영태, 모발과학, 훈민사. p Caryl J. Antalis, Laura J. Stevens, Mary Campbell, Robert Pazdro, Karen Ericson, John R. Burgess : Omega-3 Fatty Acid Status in Attention-deficit/hyperactivity Disorder, Prostaglandins, Leukotriens and Essential Fatty Acids, 2006; 75: Darish Mozaffarian, Eric B. Rimm, Fish Intake, Contaminants, and Human Health: Evaluating the Risks and the Benefits, JAMA. 2006; 295(15): Du Seok Han, Hyoung Gyu Choi, Jeong Il Kang, Hwa Jung Choi, Seung Hwa Baek : Growth Inhibitory Effects of Omega-3 Unsaturated Fatty Acid Cancer Cell Lines, Yankhak Haeji. 2008: 52(4); Gary M. Davenport, PhD, Gregory A. Reinhart PhD : The Impact of Nutrition on Skin and Hair Coat, The lams Company, Dayton. 2000; 4: Jae Jin Cho, Young Suk Kim, Jeong Seok Nam, Jeong Hwan Che, Jae Man Yang, Suk Man Lee, Jae Hak Park, Young Sonn Lee : A Study on Ocular and Skin Irritation Test of Shampoos and Rinses, Korean Journal of Lab. Ani. Science, 1995; 11(2):