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현수 길
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1 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(2): (2017) ISSN / eissn Research Paper 질내유산균의 Candida albicans 에대한항진균효과연구 정여정 1, 강창호 1,2, 신유진 1, 소재성 1 * Characterization and Antifungal Activity against Candida albicans of Vaginal Lactobacillus spp. Isolated from Korean Women Yeojung Jung 1, Chang-Ho Kang 1,2, YuJin Shin 1, and Jae-Seong So 1 * Received: 9 December 2016 / Revised: 15 May 2017 / Accepted: 20 June The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Abstract: Vulvovaginal candidiasis (VVC) is one of the urogenital infections occurring in women worldwide. Candida albicans is generally observed among various types of microorganisms causing VVC. Antibiotic therapy is typical, and the use of Lactobacilli probiotics is to be recognized as a promising alternative. The aim of this study was to select vaginal lactobacilli with probiotic properties against C. albicans. In a previous study, we isolated 38 lactobacilli from vagina of Korean women and 20 isolates were shown to inhibit C. albicans. We further selected 10 isolates which were able to inhibit C. albicans less than 10 5 CFU/mL. Among these selected strains, Lactobacillus salivarius MG242 (identified by 16s rrna sequencing) was finally selected based on its strong anti-candidal activity, acid/bile salt resistance and adhesion property. Indirect adhesion activity of MG242 measured by auto-aggregation assay showed more than 60% auto-aggregation after 5 h standing. Taken these results together, the selected strain MG242 may have potential for application in vagina health related products. Keywords: Candida albicans, Antifungal activity, Probiotics, Lactobacillus spp. 1 인하대학교생물공학과 1 Department of Biological Engineering, Inha University, Incheon 22212, Korea Tel: , Fax: sjaeseon@inha.ac.kr 2 ( 주 ) 메디오젠 2 MEDIOGEN, Co., Ltd., Seoul 04157, Korea 1. INTRODUCTION 캔디다성질염은진균성질염으로 75% 이상의여성이일생에한번이상겪는질환이며, Candida 진균이질내에과다증식하면서질내의유익한미생물총의균형을깨트려발생하게되는질병이다 [1]. 캔디다성질염의가장흔한원인균은 Candida albicans 으로전체발병율의 85~90% 에해당된다 [2]. 치료제로는 polyene 계열의 amphotericin B 와 azole 계열의 fluconazole 과 ketoconazole 등의항생제를복용또는질내주입하는방법이사용되고있다 [3]. 그러나동물세포와진균세포는같은진핵세포이므로이양자는대사기능및유사한점이많다 [4]. 이에동물세포에독성을보이지않으며, 진핵세포에효과적으로항생작용을일으키는항진균제를찾기는어렵다. 이러한부작용때문에다양한치료방법의개발이요구되고있으며, 그중하나로인체에유익한작용을나타내는프로바이오틱스 (probiotics) 를사용하는방법이대두되고있다 [5]. 프로바이오틱스는적정량을섭취하였을때인체에유용한효과가있는살아있는미생물을의미하며 (FAO/WHO), 섭취한균이사람의소화기관을통과하여장내에도달하여야함으로사람장관의위산과담즙산에대한내성을보유해야한다 [6]. 프로바이오틱스는숙주에게유해한성분을생성하지않고안전성이확보된 GRAS (generally regarded as safe) 미생물로분류되어있으며, 현재프로바이오틱스로사용되고있는미생물로는 Lactobacillus spp. [7], Bifidobacterium spp. [8], Enterococcus spp. [9] 등이있다. 건강한여성의질내에는많은종류의유산균이있고이러한유산균주는건강한질내환경을유지하는데중요한역할을한다. 유산균주는젖산을생성하여질내산도를낮추고 hydrogen peroxide, bacteri-

2 질내유산균의 Candida albicans 에대한항진균효과연구 147 ocins 등다양한항생물질을생성하여질염원인균의증식과감염을예방하며, Borges [10] 의연구에따르면유산균주는질내상피세포에부착부위를선점하여질건강유지에기여한다고알려져있다. 기존의유산균을이용한질내환경개선방안은탐폰, 질정의형태로유산균을질내로직접주입하는방법을이용하고있으나, 사용시거부감과불편함에대한문제가지속적으로제기되고있다. 이에대체방안으로요거트, 아이스크림, 유산균캡슐과같이식품으로섭취하여질내환경개선을도와주는다양한형태의프로바이오틱스연구가진행되고있다 [11]. 이에본연구에서는건강한한국여성의질에서분리한유산균주를대상으로 C. albicans 에대한항진균효과를확인하고, 프로바이오틱스로서의특성을확인하는데목적이있다. 이에캔디다성질염의주요원인균인 C. albicans 에대한항진균활성이우수한유산균주를선별하여산성과담즙염에대한내성및장내세포의부착성을간접적으로확인할수있는 auto-aggregation 특성을확인하였다. 2. MATERIALS AND METHODS 2.1. Candida albicans에대한항진균효과본연구에서는선행연구를통해 [12] Gardnerella vaginalis에대한항균효과를보인한국여성의질에서분리한유산균주 38여종의 Candida albicans SC5314 (C. albicans) [13] 에대한항진균활성을확인하기위해 Martinez의연구 [14] 를변형하여실험하였다. 유산균주는 MRS (Lab M, UK) 액체배지에 24시간정치배양하고배양액을새로운 MRS 배지에 1% 접종하여, 18시간동안배양한배양액을 1.5% MRS 고체배지위에 5 µl씩 spot하여 37 o C에서 8시간배양하였다. 배양한 MRS 고체배지에 C. albicans (10 5 ~10 6 CFU/mL) 를접종한 YM (0.3% malt extract, 0.3% yeast extract, 0.5% peptone, 1% glucose, 0.7% agar) 배지 5 ml를붓고 37 o C에서 18시간배양한후, 저해환을확인하였다. C. albican에대해저해환을보인유산균주의정량적인항진균효과를확인하기위해, 유산균주와 C. albicans를혼합배지 (MRS 액체배지와 YM 액체배지를 1:1 (v/v) 로혼합 ) 에균의농도가최종적으로 10 5 CFU/mL 되도록각각접종하였다. 37 o C에서 20시간정치배양후, erythromycin (0.3 µl/ml) 를도포한 YM 고체배지에도말하여 C. albicans의생균수를확인하였다 산과담즙염에대한내성 C. albicans 에대한항진균효과가우수한유산균주를선별한후, 선별된유산균주의위산및담즙염에대한내성을확인하기위해 Guo 의방법 [15] 으로실험을진행하였다. 선별된유산균주를 MRS 배지에 18 시간계대배양하였다. 배양액은원심분리 (4,000 g, 4 o C, 5 분 ) 한후, phosphate-buffer saline (PBS, ph 7) 에 2 번세척하고, OD 600 =1.0 (10 8 ~10 9 CFU/mL) 으로조 정하여각각산성과담즙염에대한내성실험에사용하였다. 산성에대한내성을확인하기위하여유산균주현탁액 1 ml 를 9 ml PBS (ph 3) 에첨가후진탕한뒤 37 o C 에서 3 시간배양한후생균수를확인하였다. 담즙염내성은 0.3% oxgall (Difco, MI, USA) 을포함한 MRS 배지에유산균현탁액을 1% 접종하고 37 o C 에 24 시간배양한후생균수를확인하였다 Auto-aggregation 선별된유산균주의장내세포내부착능력을간접적으로확인하기위하여 Kassa의연구 [16] 를변형하여 auto-aggregation 실험을진행하였다. 선별된유산균주를 MRS 배지에 18시간계대배양한후, 원심분리 (4,000 g, 4 o C, 5분 ) 한다. PBS를사용하여 2번세척하였고, OD 600 =1.0 (10 8 ~10 9 CFU/mL) 으로조정하여유산균주현탁액 4 ml을 10초간진탕한뒤 5시간동안방치하면서 auto-aggregation을확인하였다. 실험시작직후 (A0) 와 1, 3, 5시간후 (A), 각각 0.1 ml의상등액을취해 0.9 ml PBS와혼합한뒤 600nm에서흡광도를측정 (A0, A) 하고, 다음계산식에따라 autoaggregation을계산하였다. Auto-aggregation (%) 2.4. 계통수분석최종선별된유산균주는 universal primers (785F 와 908R) 을이용하여 16S ribosomal RNA gene sequencing 을통해동정하였다. 염기서열은 PHYDIT program version 3.1 을통해분석하였고, 계통수 (phylogenetic tree) 는 MEGA 5.0 프로그램을통해 neighbor-joining methods 법으로작성하였다 Jar fermenter를이용한배양전용배지 (Glucose 2.0%, Peptone 2.0%, Yeast extract 0.5%, Whey 1.0%, Tween %, Na-acetate 0.25%, Ammonium sulfate 0.1%, Sodium citrate 0.1%, K 2 HPO 4 0.2%, KH 2 PO 4 0.1%, MnSO %, MgSO %) 를이용하여 7 L jar fermenter (KBT, KoBioTech. Co., Ltd., Korea) 에서배양을진행하면서배양액의생균수와흡광도를측정하였다. 배양조건으로 working volume은 4 L, 교반속도는 250 rpm, 배지성분들을혼합한후 121 o C에서 20분간멸균하였고, 암모니아수를이용해 ph를 5.5로조정하였다. 종균은 MRS에접종하여 15시간배양하였고, 전용배지 100 ml에 2% 접종하여 8시간배양하였다. 이후전용배지 4 L에 2% 접종하였고 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15시간의생균수와흡광도를측정하였다. 3. RESULTS AND DISCUSSION ( A0 A) = A Candida albicans 에대한항진균효과항생제의대표적인부작용으로는유익한미생물총의균형파괴, 항균물질의체내잔류, 내성균의출현등이보고되었

148 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(2): 146-152 (2017) Table 1. Screening of selected strains for antifungal activity against C.

3 148 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(2): (2017) Table 1. Screening of selected strains for antifungal activity against C. albicans Strains Inhibition of Inhibition of Strains C. albicans C. albicans KLB13 + KLB235 KLB14 + KLB236 + KLB46 KLB238 KLB58 + KLB240 KLB99 KLB241 KLB101-2 MG242 + KLB103-1 KLB243 KLB103-2 KLB245 KLB213 + KLB247 KLB214 + KLB248 KLB215 + KLB251 KLB218 + KLB265 KLB219 + KLB267 KLB220 + KLB270 + KLB221 + KLB272 + KLB228 + KLB285 KLB229 + KLB288 + KLB233 + KLB296 KLB234 + KLB = visible clear zone, = no visible clear zone. 다. 이에국내외적으로항생제의사용이규제되고있으며, 항생제의대체물질이요구되고있다 [5]. 유산균주는젖산, hydrogen peroxide, bacteriocins 등다양한항생물질을생성하여이를통해질염원인균의증식과감염을예방하는것으로알려져있다 [7]. 선행연구 [12] 에서국내여성의질에서분리한유산균주의세균성질염의주요원인균인 G. vaginalis 에대한항균실험결과가우수한유산균주 38 균주를 1 차선별하였다. Fig. 1. Antifungal activity against Candida albicans by MG242 and KLB296. 이중 20 균주가 C. albicans에대해저해환을보였으며 (Table 1, Fig. 1), 저해환을보인유산균주중 C. albicans와동량을접종하였을때 20시간후 C. albicans의생균수를 10 5 CFU/ ml 미만으로저해시키는유산균주 10종 (KLB58, KLB213, KLB214, KLB215, KLB221, KLB233, KLB234, KLB236, MG 242, KLB306) 을 2차선별하였다 (Fig. 2). Martinez의연구 [14] 에따르면 Lactobacillus rhamnosus GR-1와 C. albicans를함께배양하였을때, 24시간후 C. albicans는약 10 6 CFU/mL 이상의생균수를보였고, 이는대조군인단일배양한 C. albicans의생균수와비슷한값을보였다. L. reuteri RC-14와 C. albicans를함께배양하였을때, 24시간후 C. albicans는약 10 5 CFU/mL 이상의생균수를보였다. Fig. 2. Screening of anti-candidal activity of selected strains co-cultured with C. albicans (cell to cell) at 20 h.

질내유산균의 Candida albicans 에대한항진균효과연구 149 3.2. 산과담즙염에대한내성프로바이오틱스로사용되는유산균주는생균제로서효능을발휘하기위해서는위와장환경인강산성과담즙염에대한안정성을갖추어야한다 [6]. 따라서본연구에서는 C. albicans 에대해높은항진균효과를보인 10 균주의산성및담즙염에대한내성을확인하였다 (Fig. 3).

4 질내유산균의 Candida albicans 에대한항진균효과연구 산과담즙염에대한내성프로바이오틱스로사용되는유산균주는생균제로서효능을발휘하기위해서는위와장환경인강산성과담즙염에대한안정성을갖추어야한다 [6]. 따라서본연구에서는 C. albicans 에대해높은항진균효과를보인 10 균주의산성및담즙염에대한내성을확인하였다 (Fig. 3). 일반적으로위장의 ph 는 3.0 을유지하며음식물이위내에서 3 시간머무르는것으로알려져있다 [15]. ph 3 환경에대한내성실험에서 10 균주모두 10 4 CFU/mL 이상의생균수를보였으며 KLB236 균주는 10 5 CFU/mL 로가장높은생균수를유지하였다. 담즙염에대한내성을확인하기위해 0.3% oxgall 를함유한 MRS 액체배지에균을접종하여실험을수행하였다. 모든균주는 10 7 CFU/mL 이상의높은생균수를보였으며, 특히 MG242 는 10 8 CFU/mL 의매우높은생균력을보임을알수있었다. Lin 의연구결과 [17] 에서 0.3% 담즙염환경에서유산균주의생균수가 10 4 CFU/mL 이하로나타난것에비해본연구에서선별 된 10 균주들은담즙염에대해우수한내성을보이는것을확인할수있다 Auto-aggregation 프로바이오틱스로사용되는유산균주는체내에서지속적으로작용하기위해체내에서부착할수있는세포부착능이요구된다. Latha의연구 [18] 에의하면 auto-aggregation 능력은장내상피세포에대한부착능과직접적으로연관이있다고보고되었으며, auto-aggregation 능력이 50% 이상일때 biofilm 을형성하여병원균의증식과확산을막는다고알려져있다. 이에 C. albicans에높은항진균능력을보이는 10균주를 autoaggregation 실험을진행하였다 (Fig. 4). 선별된균주들은평균 49.94% 의 auto-aggregation 능력을보였고, 이중 KLB213 과 MG242 균주가각각 60.47, 60.10% 로높은 auto-aggregation 능력을나타내었다. Kos의연구 [19] 를따르면, L. acidophilus M92의 in vitro상의 auto-aggregation 능력이약 60% 으 Fig. 3. Survivablity of selected strains in acid (A) and bile salt (B).

150 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(2): 146-152 (2017) Fig. 4. The auto-aggregation ability of selected strains at 1, 3, 5 h. 로본연구의결과와비슷한값을보였다. 3.4. 계통수분석산과담즙염에대한내성과 auto-aggregation 결과가가장우수한 MG242 균주를최종적으로선별하였다.

5 150 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(2): (2017) Fig. 4. The auto-aggregation ability of selected strains at 1, 3, 5 h. 로본연구의결과와비슷한값을보였다 계통수분석산과담즙염에대한내성과 auto-aggregation 결과가가장우수한 MG242 균주를최종적으로선별하였다. MG242 의 16S rrna gene sequencing 결과, L. salivarius 로동정되었으며 (Fig. 5), L. salivarius MG242 는 National Center of Biotechnology Information 으로부터 accession number KX 을부여받았다. L. salivarius 는식품의약품안전처건강기능식품의기준및규격 [20] 에등재되어안전성이확인된균주이므로프로바이오틱스로사용이가능하다 Jar fermenter 를이용한배양전용배지를사용하여 jar fermenter 로배양한균주는배양 7 시간후 CFU/mL 이상의생균수를유지하였다. 기존의 MRS 배지를사용한배양실험에서 10 9 CFU/mL 의생균수를보인것과비교하여식용이가능하며저렴한배지조성에서도높은생균수를유지하는것을확인하였다 (Fig. 6). 식품의약품안전처건강기능식품의기준및규격에의하면, 프로바이오틱스는생균을 10 8 CFU/g 이상함유하여야한다고제시하고있으며 [20], L. salivarius MG242 의상용화에있어서경제적인배지를이용하여대량생산을가능하게할수있을것으로판단된다. 4. CONCLUSION 본연구에서는선행연구인한국여성의질에서분리한유산균주를통해세균성질염의주요원인균인 Gardnerella vaginalis 에대해항균효과가있는유산균주중캔디다성질염의 Fig. 5. Neighbor-joining tree based on bacterial 16S rrna gene sequence. Isolated strain was compared with sequences available from the GenBank database.

6 질내유산균의 Candida albicans 에대한항진균효과연구 151 Fig. 6. Growth curve of L. salivarius MG242 in 200 ml flask using 100% MRS medium and 7 L jar fermenter using optimal medium. 주요원인균인 Candida albicans 에대한항진균효과를확인하였다. 항진균효과가우수한 10 균주는모두 C. albicans 의생장을 10 5 CFU/mL 미만으로억제하는것을확인하였으며, 추가적인특성확인을위해내산성및내담즙염, auto-aggregation 실험을결과를종합하여최종적으로 MG242 균주를선별하였다. 16S rrna sequencing 결과 MG242 는 Lactobacillus salivarius 로동정되었으며, L. salivarius 는건강기능식품의기준및규격에등재되어안정성이입증되어있다. 이에 L. salivarius MG242 를프로바이오틱스로의대량생산가능성을확인하였고, 향후질건강을위한프로바이오틱스의주요한소재자원으로활용될수있을것이라기대된다. REFERENCES 1. Morales, D. K. and D. A. Hogan (2010) Candida albicans interactions with bacteria in the context of human health and disease. PLoS Pathog. 6: e Yoo, J. E., H. J. Lim, and D. Y. Yoo (2010) A clinical study on 2 cases of recurrent Vulvovaginal candidiasis. Korean J. Obstet. Gynecol. 23: Han, Y. M. (2003) A role of neutrophils in anti-candida monoclonal antibody protection against vaginal infection due to Candida albicans. Yakhak Hoeji 47: Koh, C. M. and S. K. Kim (1987) Growth phase in relation to Amphotericin B and Ketoconazole susceptibilities of Candida albicans. J. Korean Soc. Microbiol. 12: Ro nnqvist, D., U. F. Brusk, U. Husmark, and E. G. Hakansson (2007) Lactobacillus fermentum Ess-1 with unique growth inhibition of vulvo-vaginal candidiasis pathogens. J. Med. Microbiol. 56: Saarelaa, M., G. Mogensenb, R. Fondénc, J. Mättöa, and T. M. Sandholm (2000) Probiotic bacteria: Safety, functional and technological properties. J. Biotechnol. 84: Bang, J. H., H. J. Shin, H. J. Choi, D. W. Kim, C. S. Ahn, Y. K. Jeong, and W. H. Joo (2012) Probiotic potential of Lactobacillus isolates. J. Life Sci. 22: Kailasapathy, K. and J. Chin (2000) Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp. Immunol. Cell Biol. 78: Franza, C. M. A. P., M. Hucha, H. Abriouelb, W. Holzapfelc, and A. Gálvez (2011) Enterococci as probiotics and their implications in food safety. Int. J. Food Microbiol. 151: Borges S., J. Silvia, and P. Teixeira (2014) The role of lactobacilli and probiotics in maintaining vaginal health. Arch. Gynecol. Obstet. 289: Bastani, P., A. Homayouni, S. Ziyadi, and V. G. Tabrizian (2012) Dairy probiotic foods and bacterial vaginosis: a review on mechanism of action. pp In: Rigobelo, E. C. (Ed.), Probiotics. Intech., USA 12. Kim, Y. G., C. H. Kang, Y. J. Shin, N. S. Paek, and J. S. So (2015) Characterization and antimicrobial activity against Gardnerella vaginalis of vaginal Lactobacillus spp. isolated from Korean women. KSBB J. 30: Birse, C. E., M. Y. Irwin, W. A. Fonzi, and P. S. Sypherd (1993) Cloning and characterization of ECE1, a gene expressed in association with cell elongation of the dimorphic pathogen Candida albicans. Infect. Immun. 61: Martinez, R. R., S. Seney, K. Summers, A. Nomizo, E.P. De Martinis, and G. Reid (2009) Effect of Lactobacillus rhamnosus GR-1 and Lactobacillus reuteri RC-14 on the ability of Candida albicans to infect cells and induce inflammation. Microbiol. Immunol. 53: Guo, X. H., J. M. Kim, H. M. Nam, S. Y. Park, and J. M. Kim (2010) Screening lactic acid bacteria from swine origins for multistrain probiotics based on in vitro functional properties. Anaerobe 16: Kassa, I. A., M. Hamze, D. Hober, N. E. Chihib, and D. Drider (2014) Identification of vaginal lactobacilli with potential probiotic propertied isolated from women in North Lebanon. Microb. Ecol.

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DBPIA-NURIMEDIA Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 30(5): 239-244 (2015) http://dx.doi.org/10.7841/ksbbj.2015.30.5.239 ISSN 1225-7117 / eissn 2288-8268 연구논문 한국여성의질에서분리한유산균의 Gardnerella vaginalis