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동주 하
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1 간섬유화연구기법 연세대학교의과대학내과학교실, 영동세브란스병원소화기내과 백용한 Methods for Hepatic Fibrosis Research Yong-Han Paik, M.D. Yonsei University College of Medicine, Institute of Gastroenterology, Brain Korea 21 Project for Medical Science, Department of Internal Medicine, Seoul, Korea Abstract Liver cirrhosis results from chronic liver injuries that cause the accumulation of extracellular matrix and progression of hepatic fibrosis. There is a crying need for hepatic fibrosis research so as to understand the molecular mechanisms of hepatic fibrogenesis and to develop effective anti-fibrotic therapies. Hepatic fibrogenesis is a dynamic process and hepaitc stellate cells have a critical role in the development of hepatic fibrosis. Hepatic fibrosis research can be largely divided into in vitro and in vivo study. Isolation and culture of primary hepatic stellate cells from rodent has been widely used for in vitro hepatic fibrosis research. Several immortal hepatic stellate cell lines have been developed and they have increasingly been applied instead of primary cells. Many investigators have been tried to find suitable animal model of liver fibrosis that resemble specific human liver diseases. However, animal models for hepatic fibrosis still have limitations to present the full spectrum of human liver diseases. In vivo animal models for hepatic fibrosis may be categorized by the causative etiologic factor such as carbon tetrachloride, hepatocarcinogens, biliary obstruction, nutritional deficiency, and alcohol. In this review, the in vitro and in vivo methods for hepatic fibrosis research were briefly reviewed. Key Words: Hepatic fibrosis, Research method, Hepatic stellate cell, Animal model - 7 -

2 2006년대한간학회 Single Topic Symposium 서 론 간섬유화연구방법에는크게간섬유화와관련된세포들, 특히간성상세포 (hepatic stellate cell) 의 특성을연구하는 in vitro 연구와간섬유화동물모델을이용하여연구하는 in vivo 연구가있다. 간 성상세포를이용한 in vitro 연구는동물또는사람의간에서간성상세포를분리, 배양하여실험을 할수있으며여러가지방법으로불멸화(immortalized) 시킨간성상세포주를이용하여실험을하는 경우도있다. 간섬유화동물모델에는간섬유화를일으키는원인에따라서간독성물질 (hepatotoxin), 영양학적(nutritional), 면역학적(immunological), 담즙성(biliary), 알코올성(alcoholic), 유전학 적(genetic) 간섬유화동물모델이개발되어있어연구방법과목적에따라적절한간섬유화동물모 델이선택되어이용되고있다. 1 간섬유화연구기법은현대분자생물학에서이용되는거의모든실험 방법이동원되므로이를모두기술하는것은무리이며따라서본문에서는간섬유화연구기법중가 장기본이되는 in vitro 및 in vivo 실험기법을정리해보고자하였다. 간섬유화 in vitro 연구기법 1. 간성상세포분리 간성상세포를배양하여실험을하기위해서는사람또는마우스, 랫드등동물의간으로부터순 수한간성상세포분획을얻어야한다. 사람으로부터간조직을얻는것은쉽지않고시기도예측하 기어렵기때문에마우스나랫드의간으로부터간성상세포를분리, 배양하여간섬유화실험에널리 쓰고있다. 분리된간성상세포는코팅되지않은플라스틱표면에서배양하면세포가활성화되어 in vivo 상태에서여러가지간손상요인에의하여간성상세포가활성화되는것과유사한세포의활성 화및변화된표현형을보이게되므로간섬유화발생과정의분자생물학조절기전을연구하기위한 실험에널리이용되고있다. 2 간성상세포의분리는간조직을 collagenase 와 pronase 가포함된버퍼 액으로관류시킨뒤 Nycodenz, Metrizamide, Stractan, Percoll 등을이용한 density gradient 방법 으로간성상세포를부유시켜분리하는방법이일반적으로사용되고있다. 3 간성상세포는백서의간을 구성하는전체세포들중약 10% 를차지한다. 정상적인사람의간에서간성상세포의개수는 1000개 의간세포 (hepatocyte) 당 63.45±19.18 개로알려졌다. 4 간성상세포는간내레티노이드의 70-90% 를 retinyl ester 형태로저장하고있으며지질성분을함유하여비간실질세포 (nonparenchymal cell) 들 중에서가장부유성이크므로원심분리를통하여약 85% 이상의순수한간성상세포를상층에서얻 을수있다. 원심용출법(centrifugal elutriation), side scatter activated cell sorting 등의추가적인 방법을통하여좀더순수한(>98%) 간성상세포분획을얻을수도있다. 간섬유화를연구하는실험 - 8 -

3 백용한 : 간섬유화연구기법 실마다나름대로의프로토콜을가지고있으며세부적인부분은조금씩다르지만 density gradient 방법이라는큰줄기는모두같다. 본문에서는백서에서간성상세포를분리하기위하여저자의실험 실에서사용하고있는방법을소개하고자한다. 1) 재료및시약 - 수컷 Sprague-Dawley rat, g 무게 - 마취약(Tiletamine/zolazepam (Zoletil R ), atropine) - Hank s balanced salt solution (HBSS) (with Ca 2+ /Mg 2+ ) - Hank s balanced salt solution (HBSS) (without Ca 2+ /Mg 2+ ) - Schwartz buffer - Bovine serum albumin (BSA) - Dulbecco s modified Eagle medium (DMEM) - Penicillin/Streptomycin (X100 solution) - Perfusion pump (Masterflex R ) - Pronase - Collagenase B - DNase I - Nycodenz solution contains 28.7% (w/v) Nycodenz in modified HBSS (with Ca 2+ /Mg 2+, without NaCl) - Trypan blue solution contains 0.4% (w/v) Trypan blue - 50 ml centrifugation tubes 2) 방법 (1) 마취 : Atropine 을 0.05 mg/kg 근주하여전처치하고 Zoletil을 25 mg/kg 근주한다. 다른방법 으로는체중 1 kg 당 1 ml의 Ketamin (10%) 과 50 µl의 Xylazin (2%) 을복강내로투여하여 마취한다. (2) 복부의털을깎고반듯이뉘운자세로팔다리를테이프로고정한다. (3) 해부용가위로복부중앙을따라흉골까지개복한다. (4) 복강내에하대정맥과간문맥이보이도록내장을시술자를기준으로오른쪽으로제친다. (5) 겸자(forcep) 를이용하여간문맥아래로실을통과시켜묶을수있는준비를한다. (6) Vinca needle 을간문맥에삽입하고실로묶어빠지지않도록단단히고정시킨다. (7) Perfusion pump 를작동시켜관류를시작한다 (15-17 ml/min 의속도)

4 2006년대한간학회 Single Topic Symposium (8) 하대정맥을절단하여관류된버퍼액이배출되도록한다. (9) 다음의세가지버퍼용액을순서대로관류를계속한다 ( 버퍼액은 37 를유지한다.) A) Hank s buffer without Ca: 140 ml (100 ml+extra) with heparin (10 Unit/mL): 1400 Unit B) Hank s buffer with Ca 1 mm: 100 ml with 0.1% pronase: 100 mg C) Hank s buffer with Ca 1 mm: 400 ml with 0.02% pronase: 80 mg with 0.015% collagenase B: 60 mg (10) 관류가끝나면간을백서로부터분리하여 Hank s buffer containing with Ca가담긴 50 ml tube 로옮긴다. (11) 간조직을 P-100 디쉬로옮기고 50 ml Hank s buffer with Ca (1 mm), 0.02% pronase (10 mg), DNaseI (10 µg/ml) (500 µg) 를부은다음면도칼로고체성분이거의없어질때까지분 쇄한다. (12) 분쇄된액체상태의간조직을멸균된 250 ml 삼각플라스크로옮긴다. (13) Shaking incubator 에서 37 에서 15 분간진탕배양한다. (14) 완전히분쇄된액체상태의간조직을거즈에통과시켜불순물을제거하고두개의튜브에나누 어담는다. (15) 1500 rpm (=470 g), 4 에서 5-8 분간원심분리한다. (16) 침전물에 Schwarts buffer ml (depend on pellet size) + DNaseI (10 µg/ml) 를더하 여잘섞어주고 1500 rpm (=470 g), 4 에서 5-8 분간원심분리하여세척한다. (17) 위의 과정을총 3-4 회반복한다. (18) 침전물을버퍼액으로풀어주고 Nycodenz density gradient 위에살짝얹는다. - 두개의튜브에담긴침전물인경우, 각각의침전물에 9.5 ml Hank s with Ca, 0.3% Bovine Serum Albumin (28.5 mg), DNaseI (10 µg/ml: 95 µg) 를더하여세포들이서로떨어질수 있도록피펫을이용하여잘풀어주고 8mL Nycodenz (28.7%) 를더하여잘섞어준다. - 이상태에서 6 ml Hank s with Ca, 0.3% BSA (18 mg) 용액을위의세포액위에매우천천 히얹어층이생기게한다. (19) 2600 rpm (=1400g), 4 에서 20 분간원심분리한다. (20) 상층과하층사이에띠가보이게되며이층의세포를모아 DMEM without FBS (more than 1 volume) 에희석한뒤 1500 rpm, 4 에서 5-8 분간원심분리하여세척한다 (2 회) 간성상세포 (21) 마지막으로모여진침전물에세포배양액 (DME with 10% FBS 50 ml, Pen-Strep 50 ml,

5 백용한 : 간섬유화연구기법 Glutamine 5 ml/500 ml 또는 DMEM (GIBCOBRL) with 10% FBS, Pen-Strep 5 ml) 10 ml 를더한다. (22) 얻어진세포의수는 hemocytometer 를이용하여측정한다.) (23) 세포의분주는 p-60 의경우 개, p-35 의경우 개정도로하여세포를배양 한다. (24) 다음날배양액을갈아준다. 간성상세포주 (Hepatic stellate cell line) 1. HSC-T6 rat stellate cell line Sprague-Dawley 백서로부터관류및밀도차원심분리방법으로분리한간성상세포를 15일간배 양한뒤에 Rous sarcoma virus promoter 에의해 SV40 large T antigen 을발현하는플라스미드를 Lipofectamine (Gibco BRL) 을이용하여핵산전달감염 (transfection) 시킨다. 5-7일간더배양한후 에계대배양과정을거쳐약 20개의클론을얻고그중한개의불멸화된클론을 HSC-T6 로명명하 였다. 5 HSC-T6 는 desmin, α-sma (smooth muscle actin), glial acidic fibrillary protein (GFAP) 등을발현하며 retinol 을 retinyl ester로에스테르화시키는등활성화된간성상세포의특징을지녔 으며여러연구자에의해이용되어이세포주를이용한약 40 편이상의논문이발표되었다. 2. LI90 human HSC cell line 사람간 mesenchymal tumor로부터과증식한세포로부터얻어졌으며세포질에 α-sma 을발현 한다. LI90 세포주는 collagen types I, III, IV, V, VI, laminin, fibronectin 과같은여러가지세포 외기질을생성하며, vitamin A를함유한배양액에서 LI90 세포주는세포질내에지질소적을형성, 형광을보인다. 이세포주를마우스에주사하여 tenascin 에대한특이항체가얻어졌다. 이와같은 소견에의해 LI90 세포주는사람간성상세포와유사한특성을보이는세포주로생각되어실험에 이용되고있다. 6 이세포주를이용해서주로일본에서 20 여편이상의논문이현재까지발표되었다. 그러나 density gradient 방법으로분리된것이아니고결체조직으로부터세포과증식으로얻어진 것이므로진정한간성상세포라고는확실히이야기할수없다

6 2006년대한간학회 Single Topic Symposium 3. GREF-X human HSC cell line 의 간경변증이있는사람간조직으로부터유래한 myofibroblast 에 Polyoma virus large T antigen coding sequence 를함유한플라스미드를핵산전달감염시켰다. 이과정을거쳐활발하게증식 하는세포주가얻어졌고 GREF-X 로명명되었다. 그러나이세포주는 large T antigen을발현하지 않았으나 1 년이상계대배양이가능하였으며자연적으로불멸화되었다. GREF-X의표현형은활 성화된사람 myofibroblast 와유사하다. GREX-F의증식 doubling time은 72시간이며 density inhibition 이있고세포증식은혈청의존적이다. 하지만종양을유발하지않으므로 transform된 것은아니다. GREF-X는 α-sma, vimentin 과같은 myofibroblast marker 를발현하여 collagens type I, IV, V, VI, fibronectin, laminin을발현하며 matrix-metalloproteinase-2 를분비한다. 또한 GREF-X 세포주는 [ 3 H]retinol 을포합하여에스테르화하는기능이있어이세포주가실질적으로 간성상세포에서유래했음을보여준다. GREF-X는 transforming growth factor-beta 1에반응하여 fibronectin 과 plasminogen activator-inhibitor type 1 분비를증가시킨다. 7 그러나 GREF-X 역시 세포과증식으로얻어진세포주의한계를가지며그리널리이용되지는않고있다. 4. LX-1 and LX-2 human HSC cell lines 백서간성상세포는분리와배양이용이하여실험에널리쓰이고있으나백서간성상세포에서관 찰된현상을그대로사람에적용하기는무리이며따라서사람간성상세포를이용한실험의필요성 이꾸준히대두되고있다. 사람간성상세포를얻는데있어서문제점은첫째, 세포분리에적절한 간조직을얻기가쉽지않고조직을얻을수있는시기의예측이어렵다. 둘째, 세포분리율이높지 않고순수하게분리하기가쉽지않다. 셋째, 서로다른간조직에서세포를분리할때마다세포의특 성이약간씩달라실험시비교가어렵다. 넷째, 계속계대배양시세포가늙어증식력을잃고세포 사에빠지므로 3-9 단계정도만계대배양하며사용이가능하다. 이와같은이유로불멸화된사람 간성상세포를만들고자하는노력이꾸준히있어왔다. LX cell line은사람간조직으로부터분 리한간성상세포를 3단계까지계대배양한뒤에 Rous sarcoma virus promoter에의해 SV40 large T antigen을발현하는 prsvtag 플라스미드를 Fugene (Roche) 을이용하여핵산전달감염 (transfection) 시켰다. 추가로 DMEM with 10% FBS 배지에서 7차례의계대배양과정을거쳐 SV40 large T antigen 을발현하는 LX-1 cell line 이얻어졌다. LX-1 cell line 을저농도혈청배지(DMEM with 1% FBS) 에서배양하여 LX-2 cell line이얻어졌으며이세포주는 SV large T antigen 을발현 하지않았다. 두가지 LX cell line들은 α-sma, vimentin, glial acidic fibrillary protein 등을발현 하며 βpdgf-r, DDR2, Ob-RL 등활성화된간성상세포에서만발현되며비활성상태에서는발현

7 백용한 : 간섬유화연구기법 되지않는수용체들을발현하여 myofibroblast 의특징을지녔다. 8 LX-1, LX-2 두가지세포주는 몇가지다른특징을보이는데두가지세포주모두 βpdgf-r를발현하지만 LX-2 세포주만이 PDGF-BB 에반응하여세포증식을나타내며 LX-2 세포주는무혈청배지에서생존이가능하다. LX-2 세포주의또다른특징의하나는핵산전달감염의효율성이높다는점으로서 LX-1 및일반적 인간성상세포에서효율성이 1% 미만인점에비해서 LX-2 는약 30% 의효율성을보인다. LX-2 세 포주의이러한장점들로인해간섬유화기전및항섬유화효과연구에많이이용되고있으며 편이상의논문이발표되었다. 10여 5. htert human HSC cell line 정상세포는증식을거듭할수록 telomere가짧아져 9-15회의계대배양이지나면결국에는증 식이중단되게된다. Telomere는반복된 DNA (TTAGGGn) 로서염색체끝에자리잡고있으며 telomerase 라고하는리보핵단백질에의해만들어진다. Schnabl 등은정상사람간조직으로부 터 density gradient방법으로간성상세포를분리한뒤에레트로바이러스를이용하여 htert (human telomerase reverse transcriptase) 를발현시켜불멸화된사람간성상세포주를만들었 다. 9 Telomerase 양성간성상세포는종양발생성이없으며활성화된간성상세포의특성을보였다. Microarray 검사에서 htert HSC는활성화된사람간성상세포와비교하여 97.2% 의유전자에서 유사한발현을보였으며 152 개유전자(1.8%) 는간성상세포에서더발현이많았고나머지 87개유 전자(1%) 는 htert HSC 에서더발현이많았다. htert HSC는 IL-6, IL-8, IL-10, PDGFR- α, β, GFAP, collagen α1(i), αsma mrna 를발현하였다. htert HSC는또한 retinol 을포합하여 vitamine A autofluorescence 를보였다. htert HSC는활성화된간성상세포와매우유사한표현 형을띠고있어향후간성상세포연구에유용하게쓰일수있을것으로생각된다. 간섬유화 in vivo 연구기법 간섬유화동물모델은간섬유화연구에서매우중요하며꼭필요하다. 그이유는동물모델을 통해서연속적인간조직획득이가능하며윤리적인이유로사람에서직접할수없는실험이가능 하기때문이다. 간섬유화동물모델은간섬유화를유발하는방법에따라크게간독성물질(CCl 4, dimethylnitrosamine, thioacetamide), 면역학적손상(heterologous serum, schistosomiasis), 담즙 성(bile duct ligation), 알코올성 (baboon ethanol diet, Tsukamoto/French model in rat) 등이있 다

8 2006년대한간학회 Single Topic Symposium 1. Carbon tetrachloride 가장오래되고많이사용되어온모델로서간섬유화과정이규명이잘되었으며여러면에서사 람간섬유화를반영한다. 가장큰장점은여러연구자들에의한광범위한연구경험으로간손상, 염증, 섬유화와관련된조직, 생화학변화가잘규명되어있다는점이다. 간섬유화와관련된여러 세포외기질특히 type I collagen, matrix metalloproteinase (MMPs) 와그억제제(tissue inhibitor of metalloproteinases; TIMP) 역할이규명되었다. 또한이모델은간섬유화에대한재현성이높아 유용한모델로지금도사용되고있다. 10 CCl 4 간섬유화모델의단점은간경변증유발에 12주이상소요되는점과첫주사망률이 30-60% 에이르고이모델에해당하는사람간질환상대가없다는점이다. 또한사람간섬유화와달리이 모델은간섬유화가진행되면 cholangiolar cell hyperplasia 가관찰되며간세포암이잘발생하지않 는다. CCl 4 는다른 halokanes 과마찬가지로 oxidase 에의하여 trichloromethyl radical 을형성한다. 이 free radical 들은지질과산화 (lipid peroxidation) 를일으키고단백질의 sulphydrol 그룹과반응한 다. CCl 4 는설치류에흡입, 경구투여, 피하또는복강내주사로투여할수있다. CCl 4 는투여후활 성화과정이필요하므로식이의종류나다른외인성물질의존재에따라영향을많이받는다. 특히 microsomal cytochrome P450의활성화를유발하는경우는 한현상을이용하여 CCl 4 투여시음용수에 기도한다. 11 CCl 4 유발간손상을증강시킨다. 이러 barbiturate 를추가하여간섬유화유발속도를증가시키 가장흔히이용되는방법을소개하면, Sprague-Dawley rat, g young male adult, C57 black mice, 6 week of age를준비하여 CCl 4 : olive oil을 1:1 (rat), 1:3 (mice) 비율로 hood 내에서 섞는다. Olive oil과섞은 CCl 4 의투여용량은 rat에서는 ml/100 g, 주 2회투여하며 mice에 서는 1 µl/g을주 2 회투여한다. CCl 4 를이용한간손상/ 간섬유화모델은연구의목적에따라서투 여기간을달리하여선택될수있다. 12 1) 급성간손상모델: 일시적인간손상을유발하여간성상세 포의활성화및섬유화관련유전자를발현시키고간재생을관찰하는모델로서 CCl 4 를 2회투여하 며마지막투여후 24 시간후에조직을얻는다. 2) 초기간섬유화모델: CCl 4 를 4주간투여하여초 기간섬유화를유발한다. 마지막투여후 3 일뒤에조직을얻는다. 3) 가역적인간섬유화모델: 간 섬유화는확실히유발되지만투여중단후간섬유화가원래대로회복가능한모델이다. CCl 4 를 간투여하게되며마지막투여 6주 3 일뒤에조직을얻는다. 이모델은손상후자연회복을관찰하는 데유용하며자연회복에는투여중단후 일정도걸린다. 4) 가역적인간경변증모델: CCl 4 를 8주간투여하게되며마지막투여 3 일뒤에조직을얻는다. 투여중단후약 84일정도가지나면 간경변증은회복된다. 5) 비가역적인간경변증모델: CCl 4 를 12주이상투여하면소결절간경변이 만들어지며마지막투여 3 일뒤에조직을얻는다. 이모델도투여중단후 일이지나면조직

9 백용한 : 간섬유화연구기법 의리모델링이일어나일부간섬유화가회복되지만완전히회복되지못하며투여종료후 366일이 지나도간경변증이남아있게된다. C57B 마우스의경우약 4주간투여하면간섬유화가확립되며 8 주간투여하면초기간경변증이유발된다. 2. Hepatocarcinogen Dimethylnitrosamine (DMNA) 와 thioacetamide (TAA) 는간섬유화동물모델에서가장흔히 사용되는발암물질이다. CCl 4 와같이간내에서대사되어독성을나타내는물질로바뀐다. 저농도 로장기간투여하면간내종양을유발시키며고농도로투여시간내괴사와섬유화를유발한다. DMNA는미세소체에의해 acetaldehyde 로대사되어간세포의기능장애를유발하고단백질과결합 한다. 또한메틸화기능으로핵산과단백질을메틸화하여간세포괴사를유발한다. DMNA는랫드 에서주 3회복강내에주사했을때 4주이상에서간섬유화가유발되며 13주이상에서간경변증이 발생한다. CCl 4 와달리 DMNA 는지방변성을초래하지않으며간섬유화 / 간병변이발생한뒤약물을 끊어도조직소견이불변하거나오히려더진행하는것으로알려졌다. 13 Thioacetamide 모델은 CCl 4 모델보다재생결절과간섬유화가더뚜렷하고조직소견이사람간 경변증과더유사하다고평가된다. 14 TAA는음용수에섞어서랫드로하여금자유롭게마시게하여 투여하거나복강내주사로투여하는두가지투여방법이있다. 랫드에서음용수에 300 mg/l (0.03%) 섞어서투여할때소결절간경변이 3달이후에발생하여시간이많이걸리는게단점이지 만사망률은 20% 미만이다. 첫 2 달동안에는조직변화는미미하다. 복강내로투여시 200 mg/kg 농도로 saline에녹여투여하며 12주후간경변증이수립되며사망률은 5% 미만으로알려졌다. 3. Bile duct ligation 총담관을묶어폐쇄성황달을유발하여담즙정체성간경변증을유발하는방법으로랫드, 토끼, 개, 원숭이등에시도되었다. 15 이모델은기술적인문제점들이있으며묶어준담관이재개통되어 간손상이회복될수있다는점, 하부총담관을결찰한경우담즙이간이담도내에축적되는문제, 비교적높은사망률등이다. 랫드를마취후복부정중앙을개복하고총담관을두군데결찰하고 그사이를절단한다. 대조군으로는개복후총담관을건드리기만하고복막과피부를봉합한다. 약 5 일이지나면담관폐쇄에의한변화, 즉호중구의침착과담관증식이나타난다. 약 2주가지나면 간섬유화가유발되며 4 주가지나면간경변증이유발된다. 이모델의조직특징은간내염증반응과 괴사가적다는점이다. 이모델은간경변증유발에비교적시간이적게걸리는장점이있으며사람 의담즙정체간경변증질환모델에합당하여여러항섬유화치료제의효과연구에쓰이고있다

10 2006년대한간학회 Single Topic Symposium 4. High fat-low choline-low protein diet 저단백질, 저 choline, 고지방식이는랫드에서간경변증을유발한다. 16 이모델은 choline 결핍으 로인해중심정맥부위에지방증이유발되며아미노산결핍으로문맥역에지방증이초래된다. 약 6-12 주후중심정맥부위로부터간섬유화가문맥역쪽으로진행되며, 간경변증은 주후에발 생한다. 문맥역의지방증을제외하면이간경변증모델은사람의알코올성간경변증과유사하다. 이모델의단점은반응차가동물마다크고실험기간이오래걸리며 choline 결핍에대한반응이종 마다다르다는점이다. 그럼에도불구하고이모델은간경변증에서영양학적인관점의중요성을제 시해주었다. 5. 알코올 사람에서알코올간경변증에해당하는동물모델로서식이를이용하는방법과수술을통해위 로직접알코올을투여하는방법이있다. 일반적으로랫드는알코올을싫어하므로음용수를통한 자연적인섭취를통해고혈중알코올농도를얻는것은어려우며알코올의빠른대사로높은혈 중농도를유지하기가어렵다. 이러한문제를해결하기위하여 Lieber-Decarli 식이가고안되었 다. Lieber 등은 1974 년개코원숭이 (baboon) 에 modified Lieber-Decarli 식이라고명명된특별히 고안한식이를투여하여지방간과간경변증이유발되는것을관찰하였다. 17 이식이는에탄올양 이전체칼로리의 50% 에해당하도록구성되어있으며대조군에는총칼로리의 21% 는지방, 18% 는단백질, 61% 는탄수화물로구성되도록고안되었다. 에탄올식이를섭취한개코원숭이는 6-12 개월이지나자지방간이생겼으며 1-3년간에탄올을섭취한동물의 1/3 은간경변증이발생하였다. 그러나이모델은장기간이소요되는점과간경변증발생률이낮아잘쓰여지지않고있다 년 Tsukamoto 등은만성알코올간질환동물모델을발표하였다. 18 이모델은랫드나마우스의복 강을열고도관을위내로장치한뒤알코올을지속적으로투여하여 16.5 g/kg/ 일의높은용량까지 알코올을투여할수있다. 이모델은사람의알코올간질환과유사한변화, 즉지방간, 세포사, 중심 성괴사, 문맥역및가교섬유화등이관찰된다. 그러나좀더심한조직변화를유발하기위해서는 철분또는불포화지방산이포함된고지방식이가필요하다. 이모델의단점은수술기술이요구 되며지속적인알코올투여는사람의음주습관과는다른비생리적인 (unphysiological) 방법이라 는점이다

11 백용한 : 간섬유화연구기법 참고문헌 1. Tsukamoto H, Matsuoka M, French SW. Experimental models of hepatic fibrosis: a review. Semin Liver Dis 1990;10: Friedman SL. Molecular regulation of hepatic fibrosis, an integrated cellular response to tissue injury. J Biol Chem 2000;275: Ramm GA. Isolation and culture of rat hepatic stellate cells. J Gastroenterol Hepatol 1998;13: Giampieri MP, Jezequel AM, Orlandi F. The lipocytes in normal human liver. A quantitative study. Digestion 1981;22: Kim Y, Ratziu V, Choi SG, Lalazar A, Theiss G, Dang Q, et al. Transcriptional activation of transforming growth factor beta1 and its receptors by the Kruppel-like factor Zf9/core promoter-binding protein and Sp1. Potential mechanisms for autocrine fibrogenesis in response to injury. J Biol Chem 1998;273: Murakami K, Abe T, Miyazawa M, Yamaguchi M, Masuda T, Matsuura T, et al. Establishment of a new human cell line, LI90, exhibiting characteristics of hepatic Ito (fat-storing) cells. Lab Invest 1995; 72: Weill FX, Blazejewski S, Blanc JF, Huet S, Gauthier JM, Neaud V, et al. Characterization of a new human liver myofibroblast cell line: transcriptional regulation of plasminogen activator inhibitor type I by transforming growth factor beta 1. Lab Invest 1997;77: Xu L, Hui AY, Albanis E, Arthur MJ, O Byrne SM, Blaner WS, et al. Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis. Gut 2005;54: Schnabl B, Choi YH, Olsen JC, Hagedorn CH, Brenner DA. Immortal activated human hepatic stellate cells generated by ectopic telomerase expression. Lab Invest 2002;82: Rubin E, Hutterer F, Popper H. Cell proliferation and fiber formation in chronic carbon tetrachloride intoxication. A morphologic and chemical study. Am J Pathol 1963;42: McLean EK, McLean AE, Sutton PM. Instant cirrhosis. An improved method for producing cirrhosis of the liver in rats by simultaneous administration of carbon tetrachloride and phenobarbitone. Br J Exp Pathol 1969;50: Siegmund SV, Haas S, Singer MV. Animal models and their results in gastrointestinal alcohol research. Dig Dis 2005;23: Risteli J, Kivirikko KI. Intracellular enzymes of collagen biosynthesis in rat liver as a function of age and in hepatic injury induced by dimethylnitrosamine. Changes in prolyl hydroxylase, lysyl hydroxylase, collagen galactosyltransferase and collagen glucosyltransferase activities. Biochem J 1976;158: Perez Tamayo R. Is cirrhosis of the liver experimentally produced by CCl 4 and adequate model of human cirrhosis? Hepatology 1983;3: Kountouras J, Billing BH, Scheuer PJ. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol 1984;65: Zaki FG, Bandt C, Hoffbauer FW. Fatty cirrhosis in the rat. IV. The influence of different levels of dietary fat. Arch Pathol 1963;75: Lieber CS, DeCarli LM. An experimental model of alcohol feeding and liver injury in the baboon. J Med Primatol 1974;3: Tsukamoto H, Reidelberger RD, French SW, Largman C. Long-term cannulation model for blood sampling and intragastric infusion in the rat. Am J Physiol 1984;247:R

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경락경혈학회지 Vol.27, No.1, pp.87 106, 2010 Journal of Meridian & Acupoint Dept. of 1 Meridian & Acupoint, 3 Acupuncture & Moxibustion, College of Oriental Medicine, Daejeon University 2 Division of Clinical

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