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진 명
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1 J Korean Soc Food Sci Nutr 한국식품영양과학회지 46(5), 646~652(17) 생물전환된참깨발효물의 Lignan 화합물의분석법검증 연구노트 정태동 1 김재민 1 최선일 1 최승현 1 조봉연 1 이진하 1 이상종 2 박선주 2 허인영 2 이옥환 1 1 강원대학교식품생명공학과 2 ( 주 ) 에스티알바이오텍 Method Validation for Determination of Lignan Content in Sesame by Bioconversion Tae-Dong Jung 1, Jae-Min Kim 1, Sun-Il Choi 1, Seung-Hyun Choi 1, Bong-Yeon Cho 1, Jin-Ha Lee 1, Sang Jong Lee 2, Seon Ju Park 2, In Young Heo 2, and Ok-Hwan Lee 1 1 Department of Food Science and Biotechnology, Kangwon National University 2 STR Biotech Co., LTD. ABSTRACT The aim of this study was to investigate method validation for determination of sesamol, sesamin, and sesamolin in non-fermented and fermented by bioconversion. For validation, the specificity, linearity, precision, accuracy, limits of detection (LOD), and quantification (LOQ) of sesamol, sesamin, and sesamolin were measured by HPLC. Linearity tests showed that the coefficients of calibration correlation (R 2 ) for sesamol, sesamin, and sesamolin were Recovery rates of lignan contents in non-fermented and fermented were high in the ranges of % and %, respectively. The inter-day and intra-day precisions of sesamin and sesamolin analyses for non-fermented and fermented were % and %, respectively. The LOD and LOQ were μg/g and μg/g, respectively. These results indicate that the validated method is appropriate for the determination of sesamol, sesamin, and sesamolin. Key words: Sesamum indicum L., lignan, method validation, bioconversion, HPLC-PDA 서 참깨 (Sesamum indicum L.) 는참깨과 (Pedaliaceae) 참깨속 (Sesamum) 에속하는식물로예로부터재배되어온주요유지작물중하나이며 (1), 주성분은지질약 50%, 단백질약 %, 탄수화물약 %, 회분약 5% 로구성되어있다 (2). 참깨를이용하여기름을짠참기름은고온에서장시간방치하여도산화되지않는강한산화안정성을가지고있는데, 이는참깨의항산화성분인 sesamol, sesamin, sesamolin 등의 lignan 화합물에의한효과로알려져있다 (3). 참깨의지표성분인 lignan 화합물의효능으로는 sesamol 을급여한흰쥐의항산화효과 (4), 피부진피세포에서 UV- B에의하여유도된산화적스트레스에대한 sesamol의보호효과 (5) 및방사선에의한 DNA 손상및지질과산화물생성억제 (6) 등이보고되어있으며, sesamin의경우신경세포내의활성산소저하작용 (7) 및 dopamine 생합성촉진 Received 8 February 17; Accepted 13 April 17 Corresponding author: Ok-Hwan Lee, Department of Food Science and Biotechnology, Kangwon National University, Chuncheon, Gangwon 24341, Korea loh99@kangwon.ac.kr, Phone: 론 (8) 이알려져있다. Sesamolin은마우스의간과신장에서의과산화지질억제효과 (9) 및 streptozotocin으로유도된당뇨병모델마우스에서의혈관내과산화지질및산화적스트레스감소 (10) 등의효능이보고되었다. 생물전환 (bioconversion) 이란생물공정 (bioprocessing), 생합성 (biosynthesis) 등의용어와의미상중복성을가지며, 미생물및효소등을이용한생물학적방법을통하여전구물질로부터원하는산물을제조하는기술을뜻한다. 즉기존천연물에함유된물질의구조적변화를유도하여유효성분의함량증가및새로운기능성분의생성을유도하는기술이다. 기존의발효공정은상대적으로간단한원료물질에서출발하는반면, 생물전환은효소의기질에대한선택성을이용하여전구물질로부터산물을생산한다는점에서차이를나타낸다. 현재의약품이나화장품등의개발에있어서생물전환공정은여러가지방법으로이용되어유용성및효과성을향상시키는데이용되고있다 (11). Na와 Moon (12) 의연구에서대두 isoflavone glucoside의 β-glycoside를가수분해하는 β-glycosidase 등의효소를이용하여생물전환을실시한후 aglycone으로전환된 isoflavone에서항염증, 멜라닌생성억제능등의생물학적활성이증가하는것으로나타났다.

2 참깨발효물의리그난분석법검증 647 건강기능식품을개발하기위해서는기능성및안전성을과학적으로입증해야하며기능성원료에대한표준화및규격화가필요하다 (13). 건강기능식품의표준화를위해서는일반적으로물리적, 화학적, 미생물학적등의기본적인관리요소뿐만아니라지표성분의표준화방법을사용한다. 표준화란천연물질에함유된고유한성분의변동을최소화하여생산되는배치에상관없이일정한품질을유지하기위해원재료의생산에서부터제조과정전반에걸쳐관리하는것을말한다. 지표성분은공인된방법이나정밀하다고판단되는분석법을사용하며반드시분석방법에대한과학적타당성과신뢰성이검증되어야한다 (14). 참깨의지표성분인 lignan 화합물에대한검출방법및분석법검증은시도된바있으나 (,16), 생물전환을이용한참깨의지표성분및유용성분에대한검출방법및분석법검증에대한연구는시도된바없다. 따라서본연구에서는생물전환에의한참깨발효물을건강기능식품원료로써개발시원료의표준화를위하여 lignan 화합물인 sesamol, sesamin 및 sesamolin의분석방법및분석법검증에대한연구를실시하였다. 재료및방법실험재료및시약본연구에사용한참깨는 14년 10월에수확된진율품종으로, 국립식량과학원 (Miryang, Korea) 에서제공받아사용하였다. 표준물질인 sesamol, sesamin, sesamolin은 Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd.(Chengdu, Sichuan, China) 에서구입하였으며, HPLC용용매 methanol 은 J.T. Baker(Phillipsburg, NJ, USA) 에서구입하였다. 참깨의생물전환참깨의생물전환공정은효소처리및멸균과정을거쳐배양배지화한표고균사를접종하여생물전환발효공정을통해 1차발효물을생산하였다. 그후 2차생물전환효소처리공정을실시하였다. 발효미생물로선정한표고버섯균사의접종량과배양시간을최적화하기위하여종균배양의 growth curve fitting을통해각발효미생물의배양상태를확인한후 cell mass 농도에따라 3 point를선정하고, 접종량을각각 10%, % 로하여본발효배양에접종하여배양시간및접종량을비교하여최적화를진행하였다. 효소처리최적화는배양기질인참깨와발효배양산물인배양균사체의세포벽을구성하고있는유용물질을세포벽으로부터효율적으로추출하기위하여 β-glucanase, cellulase, hemicellulase(dms Food Specialties, Chilgok, Korea) pectinase, β-glucosidase, amylase, protease(shin Nihon Chemical Co., Ltd., Aichi, Japan) 등의효소를 0.1~2% 로첨가하여 50~60 C 조건에서 1~3시간동안 shaker(si-4000r, Jeio Tech Co., Ltd., Seoul, Korea) 를이용하여 0 rpm에서 효소 / 기질반응을수행하였다. 추출물제조 참깨비발효물및생물전환에의한발효물은각각 2.5 g 의시료에 50 ml 메탄올을첨가하여 1시간 sonicator(jac Ultrasonic, KODO, Hwaseong, Korea) 를이용하여추출하였고, 추출후원심분리기 (416G, Gyrogen Co., Ltd., Daejeon, Korea) 를사용하여 3,000 rpm에서 10분간원심분리하여고형분을제거한다음 - C에서보관하며사용하였다. Lignan 화합물분석참깨에함유된 lignan 화합물의분석을위하여추출물을 0.45 μm syringe filter(whatman, Maidstone, UK) 를이용하여여과한후 HPLC 분석에사용하였다. Lignan 화합물의 HPLC 분석은식품첨가물의기준및규격천연첨가물참깨유불검화물 (17) 을변형하여실시하였다 (Table 1). 기기는 Waters 2695 Separation Module HPLC system과 Waters 996 Photodiode Array Detector(Waters Co., Milford, MA, USA) 를사용하였으며, 분석용 column으로는 Sunfire C 18(4.6 mm 0 mm, 5.0 μm, Waters Co.) 을이용하여분석하였다. 분석법의유효성검증 HPLC를이용한 lignan 화합물의분석방법은의약품등시험방법밸리데이션가이드라인 (18) 을근거로하여특이성 (specificity), 직선성 (linearity), 정밀성 (precision), 정확성 (accuracy), 검출한계 (limits of detection, LOD), 정량한계 (limits of quantification, LOQ) 를이용하여분석법의유효성을검증하였다. 특이성특이성검증은표준물질 sesamol, sesamin, sesamolin 및참깨추출물을 HPLC로분석한후 chromatogram을비교하여 sesamol, sesamin, sesamolin이선택적으로분리가되는지확인하였으며 PDA spectrum을이용하여동일한 spectrum을나타내는지확인하였다. Table 1. HPLC condition of lignan analysis for extracts Instrument Conditions Column Detector Mobile phase (isocratic) Flow rate Injection volume Run time Sunfire C 18 (4.6 0 mm, 5.0 μm) Waters 996 Photodiode Array Detector UV 285 nm MeOH : Water (80:, v/v) 0.7 ml/min 10 μl min

3 648 정태동 김재민 최선일 최승현 조봉연 이진하 이상종 박선주 허인영 이옥환 직선성직선성에대한검증은표준물질 sesamol, sesamin, sesamolin을각각 7.8,.6, 31.3, 62.5, 1.0, 0.0 μg/ml 씩단계적으로희석한다음각각의표준물질을 HPLC로분석하여 3회반복측정하였으며, peak 면적비에대한농도비의관계를표시하는검량선을작성하고작성된검량선으로부터상관계수 (R 2 ) 값을이용하여직선성을확인하였다. 정밀성정밀성에대한검증은참깨추출물을 inter-day( 일간 ) 와 intra-day( 일내 ) 로나누어진행하였다. Inter-day는 1일 1 구간으로 3일간진행하였고, intra-day는 1일 3구간으로나누어진행하였으며, 각시험은구간별로 3회, 9반복하여분석하였다. 분석하여얻어진면적은검량선을이용하여정량하였으며정량한값은표준편차를평균으로나누어상대표준편차 (relative standard deviation, RSD) 를백분율로나타내었다. 정확성정확성검증은농도를알고있는참깨추출물에표준물질 sesamol, sesamin, sesamolin을각각,, μg/ml의 세가지농도로첨가하여분석하였다. 분석한결과를다음식을이용하여회수율 (recovery) 로나타내어 HPLC 분석방법의정확성을확인하였다. % recovery= (Cf-Cu) 100 C a C f: Concentration of test sample added standard solution C u: Concentration of test sample C a: Concentration of standard solution 검출한계및정량한계 Lignan 화합물의검출한계와정량한계는의약품등시험방법밸리데이션가이드라인의반응의표준편차와검량선의기울기에근거하여아래식을이용하여나타내었다. LOD= 3.3σ S LOQ= 10σ S σ: The standard deviation of the response S: The slope of the calibration curve A STD 0.02 AU Wavelength (nm) B 0.04 STD 0.03 C 0.0 STD AU AU Wavelength (nm) Wavelength (nm) Fig. 1. PDA spectrums of sesamol (A), sesamin (B), and sesamolin (C) in non-fermented and fermented.

4 참깨발효물의리그난분석법검증 649 결과및고찰특이성확인특이성은불순물, 분해물, 추출물등이혼합된상태에서다른성분의영향을받지않고분석대상을선택적으로정확하게측정할수있는능력이다. 즉다른물질의간섭없이분리되는것으로특이성을확인할수있다 (19). 표준물질 sesamol, sesamin, sesamolin을 spectrophotometer를사용하여 0 nm에서 400 nm까지의흡수파장을분석하였다. 그결과, sesamol은 296 nm, sesamin은 287 nm, sesamolin은 288 nm에서각각의최대흡수파장을나타내었다 (Fig. 1). 또한, chromatogram을비교한결과 lignan 화합물 3종의혼합물과참깨추출물에서각 peak의머무름시간 (retention time) 이각각 4.6, 9.5, 11.1분대로다른물질의간섭없이분리되었으며표준용액의머무름시간과참깨추출물의머무름시간이일치하는것으로확인되었다 (Fig. 2). 또한, 동일한 spectrum을나타내어본시험법의특이성을확인하였다 (Fig. 1). 직선성확인직선성은시료중분석물질의양에대하여직선적인측정값을나타내는정도로표준물질 sesamol, sesamin, sesamolin을 이용하여각각 7.8,.6, 31.3, 62.5, 1.0, 0.0 μg/ml의농도로희석하여 HPLC로분석한값으로각물질의검량선을작성하였다. 그결과, sesamol(y= 18309x-17636, R 2 =0.9999), sesamin(y=29746x-33563, R 2 =0.9999), sesamolin(y=17667x-926, R 2 =0.9999) 으로나타났으며모두 의상관계수 (R 2 ) 를나타내어우수한직선성을확인하였다. 정밀성및 lignan 화합물함량정밀성이란같은시료에대하여연속적인분석을통해얻은결과간의유사함을의미하는것으로참깨추출물의정밀성분석결과는 Table 2와같다. Intra-day 정밀성 RSD값은참깨비발효물의 sesamin의경우 0.%, sesamolin은 0.43% 로나타났으며참깨발효물의 sesamin의경우 RSD 값이 0.69%, sesamolin 0.47% 로나타났다. Inter-day 정밀도에서는참깨비발효물 sesamin의경우 0.27%, sesamolin 0.64% 를보였으며참깨발효물에서 sesamin 1.34 %, sesamolin 1.94% 로나타나 inter-day, intra-day 모두 RSD 5% 이하의우수한정밀성을나타내었다. 참깨비발효물의 sesamin 함량의경우 intra-day에서 2.67 mg/g 및 inter-day에서 2.42 mg/g으로나타났으며, sesamolin은 intra-day 3.77 mg/g 및 3.37 mg/g을나타내었다. 참깨 A B C Fig. 2. HPLC chromatograms of sesamol, sesamin, and sesamolin standard (A), non-fermented (B), and fermented (C).

5 650 정태동 김재민 최선일 최승현 조봉연 이진하 이상종 박선주 허인영 이옥환 Table 2. Precision of sesamol, sesamin, and sesamolin analysis for non-fermented and fermented Intra-day 1) Inter-day 2) Analytes Sesamol Sesamin Sesamolin Sesamol Sesamin Sesamolin 4) Mean±SD (mg/g) RSD 3) (%) Mean±SD (mg/g) RSD (%) ND ND 2.67± ±0.02 * ± ±0.02 * ± ±0.02 ND ±0.04 * 3.92±0.08 * 1) Three times per day. 2) One time analysis of lignan per day for 3 days. 3) Relative standard deviation. 4) Not detected. * Significantly different between non-fermented and fermented at P<0.05 by Student s t-test. ND 발효물의 sesamin 함량은 intra, inter-day에서각각 2.97 mg/g, 2.75 mg/g을보였으며, sesamolin은 intra-day 4.23 mg/g, inter-day 3.92 mg/g의함량을보여생물전환을통해참깨의 sesamin, sesamolin의함량이증가하는것으로나타났다. Lim 등 () 은 sesamin과 sesamolin 급여시간지방산산화에관여하는다양한효소의활성증가를보고하였으며, Lee 등 (21) 은 RAW cell에서 sesamin이농도의존적으로 NO 생성억제및 inos 발현을억제시킨다고보고하였다. 또한, Jung 등 (22) 의연구에서생물전환을통한참깨발효물에서 lignan 함량의증가와더불어다양한항산화모델에서효능을증대시켰다. 따라서본연구의생물전환을통한참깨발효물의 sesamin 및 sesamolin의증가로인한추가적인생리활성이기대된다. Sesamol의경우참깨비발효물과발효물에서모두검출되지않았다. 이러한이유는참깨의 sesamol은 roasting 과정중약 170 C 이상에서 sesamolin이열에의해분해되면서 sesamol로전환되기때문에 (23) 열처리하지않은본연구의참깨시료에서는 sesamol이검출되지않은것으로생각된다. 회수율을이용한정확성확인정확성은표준물질을시료에첨가한후분석하여, 표준물질을가한시료의검출반응과순수표준물질의검출반응을비교하는 spiking과 recovery 방법으로실험하여참값을정확히회수할수있는지회수율계산을통해확인하였다 (24). 농도를알고있는참깨비발효물및발효물에 sesamol, sesamin, sesamolin 표준용액을각각 3가지의농도 (,, μg/ml) 로첨가한후 HPLC로분석하였다. 분석결과 (Table 3), sesamol의회수율은첨가된농도에따라 98.43~110.72% 를나타냈으며, sesamin은 ~1.10 % 의회수율을보였다. Sesamolin의경우 99.18~112.05% 범위의우수한회수율을보였다. Sukumar 등 () 의연구에서참깨의 sesamin, sesamolin의회수율은각각 95.7~ 100.1%, 97.1~102.0% 로나타나본연구와유사한것으로나타났다. 검출한계및정량한계검출한계및정량한계의분석결과, sesamol의검출한계 Table 3. Accuracy of HPLC analysis for sesamol, sesamin, and sesamolin in non-fermented and fermented Sesamol Sesamin Sesamolin Sample Concentration (μg/ml) Recovery Mean±SD RSD (%) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

6 참깨발효물의리그난분석법검증 651 는 0.34 μg/g, 정량한계는 1.03 μg/g으로나타났으며, sesamin의경우검출한계 0.26 μg/g, 정량한계 0.78 μg/g으로나타났다. Sesamolin의검출한계및정량한계는각각 0.23 μg/g, 0.70 μg/g으로나타났다. 이상의결과를종합하여볼때참깨의 sesamol, sesamin 및 sesamolin을유용성분및지표성분으로선정시분석법검증을통하여이들원료의표준화가가능할것으로생각된다. 요 본연구에서는 HPLC를이용하여생물전환된참깨의 lignan 화합물분석법검증을시행하였다. 분석법검증결과표준용액 sesamol, sesamin, sesamolin과참깨비발효물및발효물의머무름시간이일치하는것을확인하였으며, spectrum 분석결과동일한 spectrum을나타내어특이성을확인하였다. 직선성의경우 sesamol, sesamin 및 sesamolin 의검량선은모두 로 1에가까운우수한직선성을보여주었다. 참깨비발효물의 lignan 함량측정결과, intraday에서 2.67 mg/g 및 inter-day에서 2.42 mg/g으로나타났으며, sesamolin은 intra-day에서 3.77 mg/g 및 interday에서 3.37 mg/g을나타내었다. 참깨발효물의 sesamin 함량은 intra, inter-day에서각각 2.97 mg/g, 2.75 mg/g을보였으며, sesamolin은 intra-day 4.23 mg/g, inter-day 3.92 mg/g으로나타났다. 일내정밀도에서참깨비발효물의경우 0.~0.43% 로나타났으며참깨발효물은 0.47~0.69 % 를나타냈다. 일간정밀도에서참깨비발효물은 RSD 0.27 ~0.64% 의정밀도를보였으며참깨발효물은 1.34~1.94% 의정밀도를나타내어모두 RSD 5% 이하의우수한정밀성을나타내었다. 또한, sesamol은 98.43~110.72%, sesamin은 ~1.10%, sesamolin은 99.18~112.05% 의범위의우수한회수율을나타내었다. 검출한계는 sesamol 0.34 μg/g, sesamin 0.26 μg/g, sesamolin 0.23 μg/g 으로나타났으며, 정량한계는각각 1.03 μg/g, 0.78 μg/g, 0.70 μg/g을보였다. 본연구결과지표성분 sesamol, sesamin 및 sesamolin의분석방법이적합한분석방법임을확인할수있었다. 약 감사의글 본연구는 16년도농림축산식품부고부가가치식품기술사업 ( 과제번호 ) 에의해이루어진것이며이에감사드립니다. REFERENCES 1. Kim GS, Kim DH, Jeong MR, Jang IB, Shim KB, Kang CH, Lee SE, Seong NS, Song KS. 04. Quantitative analysis of sesamin and sesamolin in various cultivars of. Korean J Crop Sci 49: Makinde FM, Akinoso R. 14. Comparison between the nutritional quality of flour obtained from raw, roasted and fermented (Sesamum indicum L.) seed grown in Nigeria. Acta Sci Pol Technol Aliment 13: Kikugawa K, Arai M, Kurechi T Participation of sesamol in stability of oil. J Am Chem Soc 60: Lee MS, Kim HW, Bang SK, Kang MH. 05. Antioxidative effects and its metabolites in rat fed sesamol. J Korean Soc Food Sci Nutr 34: Ramachandran S, Prasad NR, Karthikeyan S. 10. Sesamol inhibits UVB-induced ROS generation and subsequent oxidative damage in cultured human skin dermal fibroblasts. Arch Dermatol Res 302: Prasad NR, Menon VP, Vasudev V, Pugalendi KV. 05. Radioprotective effect of sesamol on γ-radiation induced DNA damage, lipid peroxidation and antioxidants levels in cultured human lymphocytes. Toxicology 9: Hou RCW, Huang HM, Tzen JTC, Jeng KCG. 03. Protective effects of sesamin and sesamolin on hypoxic neuronal and PC12 cells. J Neurosci Res 74: Min Z, Choi HS, Lee MK. 10. Enhancement of dopamine biosynthesis by sesamin in PC12 cells. Korean J Pharmacogn 41: Kang MH, Naito M, Tsujihara N, Osawa T Sesamolin inhibits lipid peroxidation in rat liver and kidney. J Nutr 128: Dehkordi FR, Roghani M. 11. Mechanisms underlying sesamolin-induced attenuation of vascular dysfunction in rats with streptozotocin-induced diabetes. Int J Endocrinol Metab 9: Cho YH, Cho JS, Lee GW. 11. Antioxidant activity of wood vinegar by bioconversion. J Korea Acad Industr Coop Soc 12: Na EJ, Moon JS.. Studies on the biological activities of the bioconversioned soybean extracts. J Kor Soc Cosm 21: Kim YH, Bae DB, Park SO, Lee SJ, Cho OH, Lee OH. 13. Method validation for the determination of eleutherosides and β-glucan in Acanthopanax koreanum. J Korean Soc Food Sci Nutr 42: KFDA. 08. Guideline for standard of health functional food. Korea Food and Drug Administration, Seoul, Korea. p Schwertner HA, Stankus JJ.. Characterization of the fluorescent spectra and intensities of various lignans: application to HPLC analysis with fluorescent detection. J Chromatogr Sci 53: Sadeghi N, Oveisi MR, Hajimahmoodi M, Jannat B, Mazaheri M, Mansouri S. 09. The contents of sesamol in Iranian seeds. Iran J Pharm Res 8: KFDA.. Korea Food Additives Code. Korea Food and Drug Administration, Osong, Korea. p KFDA.. Analytical method guideline about validation of drugs and etc. Korea Food and Drug Administration, Osong, Korea. p Jeon SY, Jeong EJ, Baek JH, Cha YJ. 11. Analytical method validation of quercetin in Changnyeong onion extract as a functional ingredient for functional health food. J Korean Soc Food Sci Nutr 40: Lim JS, Adachi Y, Takahashi Y, Ide T. 07. Comparative analysis of lignans (sesamin and sesamolin) in affecting hepatic fatty acid metabolism in rats. Br J Nutr 97:

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한약재품질표준화연구사업단 단삼 ( 丹參 ) Salviae Miltiorrhizae Radix 생약연구과

한약재품질표준화연구사업단 단삼 ( 丹參 ) Salviae Miltiorrhizae Radix 생약연구과 - 1 - KP 11 CP 2015 Salvia miltiorrhizae Radix Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma Salvia miltiorrhiza Bunge Salvia miltiorrhiza Bunge salvianolic