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1 241 CHAPTER 8 E-C coupling CHAPTER 8 EXCITATION-CONTRACTION COUPLING Ringer (1883) 의고전적인실험에서세포외액에 Ca이결핍되면개구리심장이수축하지않는현상을관찰한이래, 근육수축에 Ca이극히중요하다는사실은점점분명해졌다. 그림 105A 는 Ringer 실험의현대판으로, 쥐심실근세포의주변 medium에서 Ca o 을재빨리제거하면즉시수축이사라지는것을보여준다 (<1 초안에 ; Rich 등, 1988). 이는골격근 ( 그림 50B) 과크게대조적인데, 골격근은세포외액에 Ca이전혀없어도몇분동안수축할수있다 (Armstring 등, 1972). 그림 106A는분리한기니피그심실근세포를 voltage-clamp하는동안몇가지인자 (parameters) 의 E m - dependence( 막전위의존성 ) 를보여준다. 근수축과 Ca transient의막전위의존성은종모양 (bellshaped) 으로, 심장조직샘플 (cardiac preparations) 의 I Ca 와같다. 690 이것은 SR Ca release에연결된것으로보이는심장근의 intrinsic birefringence signal 691 에도마찬가지다 (Maylie와 Morad, 1984). 그러나, 690 원주 ) McDonald 등, 1975; London과 Krueger, 1986; Cannell 등, 1987; Beuckelmann과 Wier, 1988; Callewaert 등, 1988; dubell과 Houser, 역주 ) birefringence( 복굴절 ) 은이방성격자를형성하는미세구조를통과하는빛이두경로로굴절되는현상이다. 근섬유의 intrinsic birefringence는많은섬유상단백질샘플에서관찰되는 structural birefringence의범주에속한다. 근수축상태 ( 예 ; sarcomere 길이 ) 에따라 myofilament lattice의광학적성질이변한다.

2 CHAPTER 8 E-C coupling 242 심장에서 Ca통로분자가활성화될때, intramembrane charge movement의막전위의존성은 sigmoidal 곡선이다. 692 즉, 심장에서는탈분극이 charge movement를유도하고그결과 I Ca 와 Ca transient가발생한다. E m > 10 mv에서 (driving force가더낮으므로 ) I Ca 는더낮고, 따라서더작은 [Ca]i과수축을일으킨다. 이렇게 I Ca 와 Ca transient amplitude가함께변동하기때문에때때로 Ca entry의직접적인영향과 Ca entry로유도된 SR Ca release를구별하기어렵다 (9 장 ). 그러나, SR Ca release가심장근수축에주역할을한다는증거가셋있다 : 1) 카페인, Ry, TG 등 SR Ca에영향을주는 agents 를처리하면심장근수축이억제되는점, 2) I Ca 으로유입되는 Ca entry와 myofilament 활성화에필요한 Ca 량의정량적인비교, 3) force-frequency relationships의해석. 그리고, I Ca 과 [Ca]i의막전위의존성이종모양인것은 cardiac E-C coupling의가장큰특징이다 (hallmark) 으로, SR Ca release가 Ca influx 의존적인성질에서 Ca-induced Ca-release (CICR) 이란용어가나왔다. 693 골격근에서도 charge movement는 E m 에대한 sigmoidal 함수이나 ( 그림 106B, Schneider와 Chander, 1973) [Ca]i 와 force, birefringence signal 모두의막전위의존성이이모양을따른다 ( 대조적으로심장에서는 I Ca 가종모양 (bell-shaperd) 이다 ). 실제로골격근 I Ca 는너무느리게활성화되기때문에 (22 C에서 ~200 ms에 peak I Ca 에이른다. 대조적으로심장 I Ca 는 ~5 ms 안에 peak) 정상 692 원주 ) Field 등, 1988; Bean 과 Ríos, 1989; Hadley 와 Lederer, 1989, 원문 ) Moreover the bell-shaped E m -dependence of I Ca and [Ca]i is a hallmark of cardiac E-C coupling and the dependence of SR Ca release on Ca influx led to the moniker, Ca-induced Ca-release (CICR), which will be examined below.

3 243 CHAPTER 8 E-C coupling twitch 동안 Ca flux 가거의없다. 694 이렇게골격근의 E-C coupling 은본질적으로더막전위의존적 이기때문에, charge-coupled SR Ca release 또는 voltage-dependent Ca release (VDCR) 이라고불린다. 695 그래서질적으로유사하기는하지만 ( 뒷부분에서설명 ), 심장근과골격근 E-C coupling간에는근본적으로큰차이가있다. 아래목록 ( 그리고그림 107) 은지금까지많은연구자들이심장근의 SR Ca release에기여할것으로예상한 7가지가능한기작들이다. Possible Activators of Cardiac SR Ca release Ca-induced Ca-release (CICR) variants 1.L-type I Ca. 2.T-type or TTX sensitive I Ca (I Ca,TTX ) 3.Ca influx via Na/Ca exchange driven directly by E m -dependence of I Na/Ca. 4.Ca influx via Na/Ca exchange driven by local high [Na]i, secondary to I Na. 5.Altered selectivity of Na channels (allowing Ca permeation) with PKA activation Ca influx-independent variants 6.Voltage-dependent SR Ca release (VDCR) 7.Inositol (1,4,5)-triphosphate (IP 3 )-induced SR Ca release (IP 3 ICR) 이하의섹션에서각각의근육종류에가장두드러지는세가지주기작을중점으로다룰 것이다 ( 즉, 골격근의 VDCR, 심장근에 CICR, 민무늬근의 IP3ICR). 그중에서도특히심장근에서 694 원주 ) Sandez 와 Stefani, 1978, 1983; Gonzalez-Serratos 등, 원문 ) This more intrinsically E m -dependent E-C coupling mechanism in skeletal muscle is referred to as chargecoupled SR Ca release or voltage-dependent Ca release (VDCR) and will be discussed below.

4 CHAPTER 8 E-C coupling 244 탈분극과 Ca-, IP3- 로유도되는 Ca release 에초점을두겠다. VOLTAGE-DEPENDENT Ca RELEASE (VDCR) AND SKELETAL MUSCLE E-C COUPLING 골격근의활성화는크게막전위의존성인데 (Hodgkin 돠 Horowicz, 1960) Scheider 와 Chandler(1973) 는 SR Ca release 를유도 ( 그래서수축을유도 ) 할것같은 intramembrane charge movement 를기술했다. 이 charge movement 는알려진모든이온전류를 block 하고 linear capacitative current 696 를차감한 (subtracted) 조건에서탈분극될때외향성전류 (outward current) 로기록된다 ( 그림 108B). 재분극되면동량의전하가반대로움직이므로이전하이동은막에한정된것으로생각된 다 (membrane delimited). Voltage clamp protocols, 전류곡선의특성 (kinetics), 약리적효과 (pharmacological agents) 결과를볼때, 이 charge movement(charge 1) 는두구성요소 (β, γ) 로나눌수 있다. 하나는 Qγ 라불리고 SR Ca release 와밀접하게연관된듯한데, 흔히둥근언덕 (hump) 모양으 로나타난다 (Hui, 1983; Ríos 등, 1992). Qγ 은 Ca transients 와똑같은역치 ( 60mV 근처 ) 와가파른 E m - 의존도를보인다 (e- 배변화하는데 2.5 mv, Hui 와 Chandler, 1990). Ríos 와 Pizzaro(1991) 의실험자 료들은 Qγ 이 Ca release 의결과이지 Ca release 를유발하지않는다는 working model 로이어졌다. 그 들은, RyR 이탈분극과 Qβ 로활성화되어 local SR Ca release 를유발하면, 이 Ca 이 DHPR 의세포막 내면에노출된 voltage sensor 의음전하에결합 (DHPR) 해 local E m 을상승시키고, 더많은 DHPR 분 자들이 charge movemtent 전이 (transition) 를일으킬것이라고제안했다. E m 으로크게활성화하고몇 초가지나면 charge movement 는고정되거나 (immobilized) inactivated state 로진입해더이상의 SR Ca release 를방지한다. 이때 on-, off-charge movement 가균등하지않으므로 (Na 통로 gating 처럼 ) charge 가 resting state 로돌아가기위해서더낮은 (more negative) E m 이필요하다 ( 때때로 charge 2 라불린 다 ). Chandler 등 (1976a,b) 은 Schneider와 Chandler (1973) 의연구를추적했고, T-tubule 막의 charge movement가 SR Ca release를활성화한다는물리적인 plunger( 마개 ) 모델을제안했다.( 그림 108A). 이모델에서, 전하를띤입자 +Z 1 ( 원자가valence = +3) 이 T-tubule 막을가로질러이동해마개 (plunger; T-tubule과 SR 사이틈gap을잇는 ) 를 SR 밖으로뽑아당겨세포질로 Ca이방출되도록허용한다. 그후 2Z 2 ( 전체원자가가 3 보다더낮음negative) 가 +Z 1 을원래이온통로에꽂혀있던자리로되돌릴때, release mechanism( 방출기작 ) 은천천히불응상태 (refractory state) 로이동한다. 이개념적인모델이얼마나물리적인상호작용을반영하는지는분명하지않으나, 대단히통찰력있는 696 역주 ) 실험조건에서지질이중막은컨덴서와같은역할을하므로, 막전위를바로변화시키면짧은순간전류가흐르는데 (capacitative current) 본문에서, intramembrane charge movement 는막전위가변하는순간 (, 이것을차감해주어야확인할수있다.

5 245 CHAPTER 8 E-C coupling 발상이었다. Eisenberg 등 (1983) 은냉각과탈분극을포함하는특별한프로토콜을사용해 SL Ca 통로 antagonist인 D600 을처리하면골격근마비를일으킬수있음을보였다. Hui 등 (1984) 은이들조건에서 charge movement도억제됨을보였다. DHPR antagonists (nifedipine과 PN ) 도 charge movement과근수축을억제할수있는데, 특히탈분극된골격근에효과가좋았다. 697 Ríos와 Brum(1987) 은 DHPRs이골격근 E-C coupling의 voltage sensor일것이라 ( 그리고물론, intramembrane charge movement가발생하는자리라 ) 추정했다. Intramembrane charge movement가이온통로 gating과연동돼있으므로, Ca통로로도기능하는 DHPR은좋은후보 (candidate) 였다. Baylor 등 (1983) 과 Melzer 등 (1987) 은측정된 Ca transient 및 Ca buffering과 SR transport에관한가정에기반해골격근 SR Ca release flux를시계열적으로 (time couese) 측정하는방법을개발했다. 그림 1008B는개구리골격근섬유를 voltage clamp한동안 Ca transient와계산된 Ca flux, intramembrane charge movement를보였다 (Ríos와 Pizzaro, 1988). Schneider와 Simon (1988) 은 Ca release 가빠르게떨어지는현상 ( 그림 108B의화살표 ) 이 [Ca]i 에달렸음을보였다. Ca release flux의 transient component( 일시적으로급격히증가해 peak를이루고닫히는 ) 가 a) 이웃한 VDCR에서유입된 Ca으로 RyR이 transient( 일시적으로 ) CICR activation( 그리고 Ca-의존성 inactivation) 되었기때문인지, 아니면 b) 몇몇막전위의존성방출통로 (release chnnels) 가 Ca-의존성 inactivation됐기때문인 697 원주 ) Lamb, 1986; Lamb 과 Walsh, 1987; Ríos 와 Brum, 1987

6 CHAPTER 8 E-C coupling 246 지는분명치않았다 (it was)(jacquemond 등, 1991; Hollingworth 등, 1992). 이문제는아직완전히규명되지않았지만, 적어도다음세요소 : 1) transient component는 Ca-의존성 RyR gating을 block할수있을정도의낮은 tetracaine 농도로선택적으로 block되는현상 (Pizzaro 등, 1992; Shirokova와 Ríos, 1997), 2) 전자현미경으로 RyRs의물리적인배열을관찰하면 4 량체하나건너하나씩 (alternating ones) T-tubule 입자와연결된것 ( 그림 9,10,109; Block 등, 1988), 3) RyRs의 Ca-dependence의알려진수치 ( 그림 102) 가또하나의 CICR component가있을가능성을제기한다. 이들요소들은 transient CICR과 steady E m -dependence를결합해매력적인 working hypothesis로만든다 (DHPRs와연결된 RyRs의 VDCR이이웃하는연결되지않은 RyRs의 CICR을유발trigger하는것 ). 698 SR Ca release의 sustained E m -dependent component가 Ca-dependent inactivation을보이지않는것도흥미롭다. 실제로골격근의 Ca release flux도재분극과함께곧바로완전히멎는다 (shut-off). 그래서 DHPRs와 RyRs가물리적으로연결되어이것이 41yRs에 Em-dependence를부여하고, 결과적으로 Ca-dependent inactivation에도낮은감수성을보이는듯하다. 재미있게도골격근에저농도카페인을처리하면 Ca release의 shuf-off 양상이이전처럼재분극타이밍에바로맞물리지는앉는다 (Simon 등, 1989; Klein 등, 1990). 이와관련된주목할만한보고에서, 저농도의카페인은골격근 SR Ca release 특성을심장근의경우처럼바꾼다 ([Ca]-감수성과 RCCs 실험 ). 699 실제로 CICR을 skinned 골격근에서관찰할수있다 (Fabiato, 1984). 그러므로골격근 SR Ca release가 E m control을지배적으로받는듯해도, 골격근에서 VDCR하는 RyRs에이웃한 (adjacent) RyRs은 CICR을받아결국두기작이공존할것이다. Shirokova 등 (1996) 은 peak release flux / steady release flux 비 (ratio) 가포유동물골격근 (~2) 보다개구리골격근 (4-6) 에서더높은것을발견했다. 그들은이현상을포유동물보다개구리골격근의 RyR: DHPR 비율이더높은것에연관시켜, 개구리는 DHPR에연동되지않은 (uncoupled) RyR이더많아 VDCR보다 CICR을나타낼것이라예상했다. 그림 109 는 Block 등 (1988) 의 toadfish swimbladder의 untrastructure 700 관찰결과에기초한모델로서, 각열에서하나건너하나꼴로 4 량체가 4개 DHPR과연결돼있다. 각 RyR 4 량체당 high affinity Ry 결합자리가 1개밖에없으니까예상되는 RyR:DHPR 비율은 2:4 또는 0.5 이다. 이것은토끼골격근 (Bers와 Stiffel, 1993; Anderson 등, 1994b) 에서보고된값이기도한데, 개구리골격근에는이값이조금높아 (1-2; Anderson 등, 1994b; Margreth 등, 1993) 개구리의경우 unlinked RyRs가토끼보다더많을것을암시한다 ( 75% vs %). 포유류심실에서이비율은 4-10 으로 (Bers와 Stiffel, 1993), 심장에서는 RyRs 중 10-25% 이 698 원문 ) This issue is not entirely resolved, but at least 3 factors favor an extra CICR component: 1) the transient component can be selectively blocked by low tetracaine concentrations, known to block Ca-dependent RyR channel gating, 2) the physical arrangement of RyRs, where only alternating ones are associated with T-tubule particles, and 3) the known Ca-dependence of RyRs. These factors make the sum of a steady Em-dependence plus a transient CICR an attractive working hypothesis (where CICR at unlinked RyRs is triggered by neighboring VDCR at RyRs linked to DHPRs. 699 원주 ) Endo, 1975b; Rousseau 등, 1988; Sakai, 1965; Konishi 등, 역주 ) 전자현미경관찰대상인세포수준이하의미세구조를이르는말.

7 247 CHAPTER 8 E-C coupling 하만 DHPRs와연결된듯하다 ( 그림 10, see below). 개구리골격근에는 α, β RyRs가모두존재하는데 (Sutko와 Airey, 1996), α-ryrs가 VDCR에, β-ryrs가 CICR에참여할가능성이있다. 대부분의포유동물골격근이 RyR1 만발현하지만, 몇가지조직은 RyR3 도낮은수준으로발현하고 ( 예 ; 횡경막과 soleus 701 ), 특히초기발생과정에 RyR3 를많이발현된다 (Conti 등, 1996; Taroni 등, 1997). RyR3 가 VDCR보다는 CICR의 peak Ca release에더기여한다는증거가있다. 702 그러므로, 골격근 RyRs 중 DHPR과물리적으로연동된것들은주로 E m -dependent( 막전위의존적 ) 할것이고, 다른 RyRs의활성화기작은 CICR일것이다. Local Ca release events 또는 Ca sparks (225 쪽 ) 도골격근에서관찰되는데, T-tubule/SR jnunctions에서시작된다 (Tsugorka 등, 1995; Klein 등, 1996). 골격근에서 Ca sparks는탈분극에의해더단단히통제된다 (resting [Ca]i과 E m 에서발생할확률이심장근의경우보다낮다 ;lower stochastic occurrence). Ry, IpTx A, bastadin-10 으로유도한 prolonged release events와 RyR conductance를변화시키는그들의효과에기초해, González 등 (2000) 과 Shtifman 등 (2000) 은골격근의 Ca sparks( 그리고심장근의 Ca sparks도 ) 가 1 개보다는많은 RyR에기인한다고유추했지만, 이그룹들의추정값은서로달랐다 ( 6 또는 2-4 RyR per spark). 골격근에서는 E m 이직접 SR Ca release 를제어한다는것이정설이지만, 다른보고들중에는, 그림 105B 의결과에도불구하고, Ca o 의역할을주장하기도했다. Brum 등 (1988a,b) 은개구리골격 근에서낮은 [Ca]o 가 E-C coupling 에주는영향을상세히연구했다. 그들은낮은 [Ca]o 이 T-tubule 701 역주 ) 발뒤꿈치와종아리뼈의무릎뒤안쪽을연결하는 slow twitch muscle. 해부할때다른근육보 다안에파묻혀있고, 주변근육들보다붉은색임 702 원주 ) Shrikova 등, 1999; Conklin 등, 1999; Ward 등, 2000

8 CHAPTER 8 E-C coupling 248 에존재하는 voltage sensor의효과 ( 또는 charge movement) 이고 Ca fluxes 그자체 (per se) 의영향은아니라고결론지었다. 더구나, 골격근에서 Ca entry가 Ca release를활성화할필요도없다. 주기율표의 Ia족과 IIa족원소어느것이라도 charge movement와수축을일으킬수있다 (Ca > Sr > Mg > Ba >> Li > Na > K > Rb > Cs; Pizzaro 등, 1989). 이상대적인 affinity( 친화도 ) 순서는 Mg을논외로친다면 cardiac SL L-type Ca 통로실험에서보고된것과놀라울정도로비슷하다 ( 표 17, 129 쪽 ). Mg는 cardiac L-type Ca 통로를통과하지못하는것같지만 (Hess 등, 1986), 골격근 L-type Ca 통로를투과할수있다 (McCleskey 와 Almers, 1985). charge movement가발생하려면이들중한이온이 DHPR/Ca 통로구조를점유해야하지만, 골격근에서는이온전류의흐름은필요없다. 실제로, Ca 이온이통과하지못하는 pore 돌연변이골격근 Ca 통로도여전히 SR Ca release를유발할수있다 (Dirkson과 Beam, 1999). 앞으로보겠지만이것은심장근과는크게대조적으로, 심장근에서는 SR Ca release를유발려면 Ca entry가절대적으로필요한듯하다. Murine muscular dysgenesis: A model system Muscular dysgenesis (mdg) 는생쥐의상염색체열성유전자변이 (autosomal recessive genetic mutation) 으로서이쥐의골격근은 E-C coupling이작동하지않는다 ( 예 ; Klaus 등, 1983). 이것은 E-C coupling을연구하는데귀중한질병모델임이증명됐다 (Adams와 Beam, 1990). mdg 생쥐의골격근에는 DHPRs와 Ca 통로의 α1 서브유닛이모두없다 703 (Pinçon-Raymond 등, 1985; Knudson 등, 1989). 이짐승의골격근에서는 slow Ca current와 intramembrane charge movement, 그리고 intramembrane particles의정렬된배열 (tetrads) 모두관찰할수없었다. 704 정상적인 (normal) skeletal DHPR α1s cdna를 mdg myotude에넣어주면 (injection) 정상적인 E-C coupling, charge movement, I Ca 와 tetrads 모두복구됐다. 705 이결과들은 DHPR이 voltage sensor로서골격근 E-C coupling에필수적인 charge movement를만들어낸다는가설을뒷받침한다. 이것은 intramembrane charge movement, tetrad particle, Ca current가모두 DHPR 분자와연관되어있다는증거가되기도한다. Tanabe 등 (1990a,b) 의연구에서도 cardiac Ca 통로 (α1c) 를 encoding하는 cdna를 dysgenic myotube에넣어주면 I Ca 와 E-C coupling이회복되었다. 그러나, 이경우 I Ca 는심장근의경우와더비슷했고 ( 즉, 더빠른활성화와 inactivation kinetics) E-C coupling도심장근같았다 ( 예 ; 세포외액에 Ca이없으면근수축이빠르게사라짐 706 ). Cardiac DHPR의일부서열 ( 예 ; 도메인 II-III사이의세포질쪽 loop, 그림 51, 110) 을 skeletal DHPR의해당서열과치환한 chimeric cdna를사용한실험결과 ( 즉, α1c의 II-III loop을 α1s의 loop으로치환 ), E-C coupling은골격근 type의 VDCR이었다. 그래서, 심장근과골격근 type에따라 E-C coupling이크게차이나는것은각근육의 DHPR이다르기때문인듯하다. 즉, 골격근에서 DHPR은 charge movement( 그리고그결과만들어진기계적영향 ) 로 E-C coupling을유발하며, I Ca 은부수적이다. 심장근에서는 I Ca 을활성화하는데 charge movement 703 원문 ) Both DHPRs and the α1 subunit of the Ca channel are lacking in skeletal muscle from mdg mice. ;??? 704 원주 ) Beam 등, 1986; Beam과 Adams, 1990; Shimahara 등, 1990; Takekura 등, 원주 ) Tanabe 등, 1988; Adams 등, 1990; Takekura 등, 원문 ) contractions were quickly abolished in the absence of extracellular Ca

9 249 CHAPTER 8 E-C coupling 가중요하기는하지만, Ca 통로 ( 또는 DHPR) 를통한 Ca entry 가 E-C coupling 에필수적인 event 로보 인다. Skeletal muscle DHPR-RyR interaction 골격근 E-C coupling의가장간단한모델은, DHPR이 voltage sensor로서직접적인기계적상호작용을통해신호를전달해 RyR을개방한다고줄일수있다 (Chandler 등의가설, 1976b). 그러나, DHPR-RyR 상호작용에관한생화학적증거는놀랄만큼적다 ( 예 ; Murray와 Ohendeck(1997) 의 crosslinking 연구 ). Caswell 등 (1979) 은 French Press ( 즉, mechanical disruption) 처리해깨어낸 SR T- tubule junctions (triads) 이 cacodylate buffer에서재형성될수있음을보였다. Ikemoto 등 (1984) 은이렇게재형성된 triads가 depolarization-induced Ca release ( 아마도 T-tubule 탈분극에의한듯, 251 쪽 ) 도다시가지는 (restored) 것을보였다. Triads reformation( 재형성 ) 은 GAPD(glyceraldehydes 3-phosphate dehydrogenase) 707 를처리해도촉진됐다. Glycolytic enzyme들, GAPD와 alodolase는 triadin과 sorcin처럼 DHPR, RyR 모두에결합하고 708 이들사이를연결한다고보고됐다. 그러나, 이들중어느단백질도 E-C coupling에직접적인역할을하는지는알려지지않았다. Tanabe 등 (1990a,b) 의키메라 DHPR 연구로인해 DHPR II-III loop와이것이 RyR 속성에주는영향이특별한관심을끌게됐다 ( 그림 110). 몇개그룹들이 DHPR II-III loop에속하는 peptides 들이 RyR1 gating을변화시킬수있음을보였다 (bilayer 실험과 vesicle을사용한 Ca release, Ry binding실험 ). 709 El-Hayek 등 (1995) 은 II-III loop을 4 조각냈고 (peptide A-D) 그중 peptide A(Thr671- Leu690 또는첫번째 10 개잔기 ) 만이 Ry-RyR1 binding과 SR Ca release를변화 ( 둘다활성화 ) 시킬수있고, C peptide (Glu724-Pro760, see also Saiki 등, 1999) 가이효과를 block할수있었다. 보다 intact system (mechanically skinned muscle) 에서, Lamb 등 (2000) 은 peptide A가 spontaneous-, E m - dependent SR Ca release를증가시킬수있고 (enhance) 이렇게유발한 Ca release는 peptide C가억제할수있음을보였다. Nakai 등 (1998b) 의연구에서, peptide C의일부 ( 잔기 ) 를 cardiac DHPR α1c에도입해 dysgenic myotube (RyR1 을발현함 ) 에발현시키면골격근 type의 VDCR을일으키기에충분했고, 단지골격근 α1s에서 18 a.a. ( ) 만으로어느정도 (moderate) VDCR을만들어낼수있었다. Skeletal DHPR RyR1 신호전달 (orthograde signaling) 에더해 Nakai 등 (1996, 1997, 1998a) 은 RyR1 DHPR 로 retrograde 신호전달도있음을보였다. 즉, dyspedic mouse myotubes 710 (Takeshima 등, 707 원주 ) Corbett 등, 1985; Caswell 과 Corbett, 원주 ) Thieleczek 등, 1989; Brandt 등, 1990; Kim 등, 1990; Fan 등, 1995; Meyers 등, 1995, 원주 ) Lu 등, 1994; El-Hayek 등, 1995; Marx 등, 1998b; Dulhunty 등, 1999; Gurrola 등, 1999; Zhu 등, 원주, 역주 ) dysgenic = dys + genic, dyspedic = dys + pedic 이다. 전자는 E-C coupling 의시발 (generating) 단백질인 DHPR 이없는것이고, 후자는 발 이없다는뜻이다. 초기전자현미경보고에서 RyR 의세포질쪽돌출부를 foot 이라불렀고, 이것의라틴어어휘를사용한것이다. Dysgenic mice 는정상적인 RyR1 을발현하지만 DHPR α1s 를발현하지않고, dyspedic mice 는정상적인 DHPR α1s 를발현하지만 RyR1 을발현하지않는다.

10 CHAPTER 8 E-C coupling ) 는정상적인 Ca 통로 gating charge 를갖지만, I Ca 가매우작고, E-C coupling이없다. Dyspedic myotubes에 RyR1 이발현되면 E-C coupling (orthograde signal) 과 I Ca 기능 (retrograde signal) 이모두회복된다. Cardiac RyR2 를발현시키면 E-C coupling이나 α1s를통한 I Ca 어느것도정상으로회복되지못했다. 이결과는 RyR1 에서 α1s로직접피드백 (feedback) 되는기작이있어 Ca통로의 gating charge movement가개방상태로전이되도록촉진함을의미한다. Grabner 등 (1999) 은 skeletal DHPR II-III loop의일부 ( ) 를따교환해줌으로써 cardiac DHPR도 RyR1 으로부터의 retrograde signal 을받을수있도록했다. 그래서, DHPR II-III loop은 α1s와 RyR1 사이의 orthograde/ retrograde signaling에모두중요하다고여겨진다. 그럼, DHPR II-III loop의상대가되는서열은 RyR1 의어디일까? RyR 키메라 (chimera) 를사용한연구에서 Nakai 등 (1998a) 은 RyR1 에서큰영역두군데가 ortho-/retrograde signaling 모두를회복 ( ) 시키거나 retrograde signaling만회복 ( ) 시킬수있다고보고했다. Leong과 MacLennan (1998a,b) 은 α1s II-III loop와결합해잠재적으로중요할것으로짐작되는 RyR1 영역 ( , α1s II-III loop와는특히 ) 을발견했는데, 이것은 α1s의 III-IV loop와도결합한다. 특히, 이 RyR1 영역은 cardiac α1c의 II-III loop이나 III-IV loop 어느것과도결합하지않았다. Yamamoto 등 (1997) 은 RyR1 과 RyR2 사이에크게분화된영역 (RyR1 의 , D2 region) 도 skeletal-type E-C coupling에중요함을보였다. 이정교한연구에서, 골격근 DHPR-RyR connection이

11 251 CHAPTER 8 E-C coupling 독특한상호작용자리를가지고있고상동성이높은 cardiac α1c 나 RyR2 는각각의골격근쪽상 대역인 RyR1 이나 skeletal α1s 의기능을대신하지못했다. 711 Skeletal α1s II-III loop ( 특히 잔기 ) 이골격근 E-C coupling을매개하므로주목을끌기는했지만, Proenza 등 (2000) 이이 10 개 a.a. 서열을뒤섞어 (scrambled) α1s에도입한다음 dysgenic myotube에발현한결과 E-C coupling을회복 ( 또는 retrograde I Ca signaling) 한점에있어차이가없었다. DHPR α1s의 C-terminal에가까운 (proximal) 자리에는 α1c와서열이같은 20 개잔기가있는데 (α1s에서 ), 이 peptide는 RyR1 과 RyR2 모두에서 Ry binding을억제하고 bilayer에서 RyR1 Po를감소시킨다 (Slavik 등, 1997). 특히, 이영역은 C-terminal에있고 I Ca 의 Ca-/ 칼모듈린-의존성 inactiavation 및 facilitation에연관되었다고여겨지는자리가까이에자리한다 (139 쪽 ). 정상적인 Ca 통로 β 서브유닛 (β1a) 이없는생쥐는 RyR1 을발현하고 SR Ca store가충만한데도 charge movement, I Ca, effective E-C coupling을결여한다 (Beurg 등, 1997, 199a,b). 이런 myotubes에 cardiac β2a 서브유닛을발현시키면 I Ca 와 Ca transients의일부만복원되지만, β1a가발현되면 E-C coupling이완전히복원된다. 그래서, DHPR 복합체 ( 특히골격근에서 ) 에는 RyR과기능적으로 ( 물리적혹은비물리적으로 ) 상호작용할가능성이있는영역이여럿있다. Cardiac muscle DHPR-RyR interaction? 심장근의상황은아직골격근보다덜분명하다. 지금부터다룰내용이심장근에서약간의상호작용을언급하지만, DHPR-RyR 상호작용은골격근의경우보다훨씬덜하다. 이것은심장에 VDCR이없고 junction에서 RyR 위에대응하는 DHPR 배열이그리규칙적이지못한점 ( 그림 10), DHPR 수에비해 RyR이 4-10 배가량많은점과들어맞는다 (Bers와 Stiffel, 1993). RyR이 DHPR보다많은것은적어도 RyR의 10-25% 가 DHPR과상호작용할가능성이있다. 그럼에도불구하고비록 tetrad는아니지만 (Franzini-Armstrong과 Protasi, 1997) cardiac DHPR은 SL junction, SR 근처에집중돼있다. El-Hayek 와 Ikemoto (1998) 는 II-III loop cardiac peptide A 의 C-terminal 쪽절반 (Ac-10C, KERKKLARTA) 이 RyR1 을활성화할수있음을발견했고, Lamb 등 (2000) 역시 Ac-10C의골격근 SR Ca release 증가 (enhanced) 작용을보고했다. RyR2 gating에 Ac-10C가미치는영향에관한자료는적지만, 그에의하면 RyR2 에서는반대효과가있다. Bers 등의보고에의하면, bilayer 실험에서 Ac-10C는 RyR2 Po를억제했고 (IC 50 ~1 um, preliminary data), dialyzing patch pepette에첨가하면똑같은 SR Ca load와 [Ca]i 에서 voltage clamped 심실근세포의 Ca spark 빈도 (frequency) 를 63% 줄였다 (Li 등, 1999). 앞서언급했듯이이 carboxy peptide는 α1c와 α1s의공통서열로서 RyR2 의 Ry 711 원문 ) This elegant ongoing body of work has established that the skeletal muscle DHPR-RyR connection has unique interaction sites and that the highly homologous cardiac α1c or RyR2 cannot functionally substitute with the skeletal counterparts.

12 CHAPTER 8 E-C coupling 252 binding 을억제한다 (Slavik 등, 1997). 즉, 유사한 (analogous) cardiac α1c 와 RyR2 도메인들이상호작 용할가능성이있지만, 이점을분명히하려면연구가더필요하다. 온전한 (intact) 족제비심실근세포에서 cardiac α1c와 RyR2 의분자간통신 712 을증명하는실험은 Dihydropyridine (DHP) L-type Ca 통로 agonist인 Bay K 8644 를사용해처음이루어졌다. Bay K 8644 (100 nm) 는 resting 심실근세포에서 SR Ca 손실을가속하는데, Ca influx와는완전히독립적이고 DHP antagonist로억제할수있다. 713 이것은세포외 (extracellular) Ca 부재시에 Ca spark 빈도가 400% 증가한것으로분명해졌다 ( 그림 111A). Bak K 8644 의효과는세포가노출되고 10 초후에최고에이르고, AP에의해바뀌지않으며 (Ca free solution에서 ), nifedipine으로완전히억제된다. Bilayer 실험에서 Bay K 8644 는 100 배이상의농도에서도 cardiac RyR에직접영향을주지않았다. DHPR site에결합하지않는또다른 Ca agonist (FPL-64176) 를처리하면 I Ca 는증가했지만 Ca sparks 에는영향을주지못했다. Bay K 8644 는 intact cells에서 Ry binding을증가시켰지만 mechanical disruption이후에는그렇지못했다. Bers DM등의 working hypothesis( 그림 110B) 는이렇다 : Bay K 8644 이 DHPR과결합해 Ca-독립적인 signal을 RyR로전달해 resting Po를변화시킨다. 비록이효과가 Bay K DHPR에결합으로매개되는듯하기는하지만, 이것은 I Ca 효과 ( 더느리게더 depolarization-dependent하게발생한다 ) 와는다르다 (Katoh 등, 2000). Bers DM등의결론은, DHPR과결합한후의경로는 I Ca gating 효과와 RyR에대한 intramolecualr effect로나뉘어그결과, resting Cs sparks가증가한다. 714 세포외 Ca 이완전히제거된조건에서도 Ca sparks 가발생하는현상은주목할만한데 ( 그림 712 원문, 역주 ) intermolecular communication (= interaction) 713 원주 ) Hryshko 등, 1989a,b; McCall 등, 1996b; Satoh 등, 1998; Katoh 등, 원문 ) We concluded that after binding to the DHPR the pathways driving for the I Ca gating effect and the intramoleular effect on the RyR, manifest as increased resting Ca sparks.

13 253 CHAPTER 8 E-C coupling 111A), 확장기 [Ca]i 농도에도낮지만측정가능한빈도로발생하는 Ca sparks가 SR Ca release에기인함을강조한다. 이정도로현미경적인수준에서, [Ca]o 가없이발생한 AP(± Bay K 8644) 가 SR Ca release를만들어낼수없거나 resting Ca sparks 또는 [Ca]i 를변화시킬수없음은분명하다 ( 그림 105A). 그래서, Bay K 8644 연구결과가심장에서 DHPR-RyR 분자간모종의약한상호작용을암시하기는하지만 (Po를 ~ ), 이상호작용은심장근의 VDCR을뒷받침하지는않는다. E-C coupling과관련해, Bay K 8644 는 E-C coupling을감퇴시킨다 (depress)( 주어진 SR Ca load와 I Ca 에대해더낮은 Ca release 715 ). RyR의 Ca 감수성 (sensitivity) 가변화했다고짐작할수도있지만 716, Bay K 8644 가 L-type Ca 통로 (LTCC) 의특성을변형시켜개방시간을연장했기 (prolonged open time) 때문이라고효과를바로설명할수있다 ( 그림 61). 즉, 비슷한 whole cell I Ca 에기여하는개방된통로의수는 Bay K 8644 의존재하에서는더적을것이다 ( 몇몇통로가매우길게개방되기때문이다 ). SR Ca release에는 LTCC이처음몇 ms만개방되면충분하므로, SR Ca release를기동 (trigger) 하는관점에서는대부분의 Ca influx는낭비될것이다 ( 즉, 주어진 I Ca 에대해더낮은 Ca release). 그래서심장에는약한 DHPR-RyR link만있을수도있다. Direct depolarization of the SR Peachy와 Porter(1959) 는골격근 T-튜블의탈분극이 SR 막을탈분극해 Ca release를유발할가능성을제기했다. 이가설은 mechanically skinned 골격근섬유에서이온을치환 (ionic substitution) 하는방법으로시험됐다. 717 이접근법에서는상대적으로비투과성인음이온 ( 예 ; propionate, gluconate, methanesulfonate) 를투과성인음이온 ( 예 ; Cl) 으로치환하거나, 투과성인양이온 ( 예 ; K) 을상대적으로비투과성인양이온 ( 예 ; choline, Tris, Li, Na) 으로치환했다. Solution switch의결과 diffusion potential 변화가생기는데, 이것으로 Ca release를유도할수있지만 (Endo, 1985) 두가지점에서이기전은생리적일것같지않다. 첫째, 이들 skinned fibers에서, T-튜블은밀봉되는데 (seal off) ATP가존재하는상태에서 (skinned fiber solution에필요 ) T-튜블은정상적인 sarcolemmal ion gradient를재형성할수있다 ( 밀봉된 T-튜블내부가높은 [Na] 와더높은전위를보인다 ). 그러면이온치환은 T-튜블을탈분극시킬수있어, 위에서와마찬가지로 Ca release는여전히 charge movement와 VDCR에의존한다. 이설명을뒷받침하는한가지유력한실험은, 이런탈분극-유도된 SR Ca 방출 (depolarization-induced Ca release) 이 skinned fiber에서 Na/K-ATPase를 block하면방지된다는점이다 (T-튜블분극을방지함 718 ). 이논의는 T-튜블-SR junctions을포함할 heavy SR preparation의경우에도역시유효하다. 둘째, 7 장말미에서설명했듯이, 생리적환경에서 1 가양이온은 SR 투과성이매우높아 SR과세포질사이의특별한이온농도차가없다. 719 그결과 SR 막을가로지르는 E m = 0 으로할것이다. 715 원주 ) McCall 과 Bers, 1996; Adachi-Ahahani 등, 원문 ) while one could propose the altered RyR Ca sensitivity 717 원주 ) Costantin 과 Podolsky, 1967; Nakajima 와 Endo, 원주 ) Donaldson, 1985; Stephenson, 1985; Volpe 와 Stephenson, 원주 ) Somylo 등, 1977a,b; Meissner, 1986b; Somlyo 와 Somlyo, 1986

14 CHAPTER 8 E-C coupling 254 Fabiato(1985f) 역시 skinned 비둘기심장근세포 ( 이것은 T- 튜블은결여하고, CICR 은보인다 ) 에서직 접적인 (direct) 탈분극 - 유도 SR Ca 방출증거를찾을수없었다. 그러므로, 직접적인탈분극 - 유도 SR Ca 방출은그럴듯하지않다 (untenable). Mg as a possible mediator of VDCR in skeletal muscle Lamb과 Stephenson(1990, 1994) 그리고다른연구자들은위에서언급한 skinned 골격근섬유표본 ( 밀봉된 T-튜블을포함 ) 을활용해세포질이온조건을손쉽게조작할수있는조건에서골격근의 VDCR을연구했다. Lamb(2000) 은흥미로운제안을했는데, VDCR은 tonic Mg-dependent inhibition of RyR1 720 을제거하는방식으로작동한다는것이다 ( 그래서그림 102 의 RyR1 gating이더심장의그것과가깝게보이도록 ). 1 mm [Mg]i ( 또는 [Ca]i ) 이골격근 RyR은강력하게 inactivate하지만 cardiac RyR은그렇게하지함을기억하자. Mg 역시 RyR activation curve를더높은 [Ca] 쪽으로이동시킨다. 그래서, 탈분극되면주변 (ambient) [Ca] 이 SR Ca release를활성화하고재분극은신속한 Mg-의존성 RyR 억제를유발한다. 결론적으로, 골격근에서는 VDCR에관한명백하고믿을만한증거가있다. 핵심분자들이동정되었고 (DHPR과 RyR) 이들단백질들은물리적으로 junctional space에이웃하며, 이론적 / 생물리학적측면에서뿐만아니라분자상호작용의관점에서이들의상호작용을이해하기위한노력이경주되고있다. 골격근역시 CICR을보이는데이것은 VDCR로유도된 Ca releaase인듯하다. 그래서, VDCR이 SR Ca release에필수적인듯하지만, CICR이초기 release 속도 (rate) 를가속하는 (boost) 듯하다. 심장근에서 VDCR이기능하지않음을암시하는여러증거가있다. 1) [Ca]i 과수축의막전위의존성이 I Ca 를따르지 charge movement를따르지않는다 ( 그림 106). 2) Ca entry는심장근에서는절대적으로필요한듯하고 ( 그림 105A와이하논의 ), 3) 탈분극은그자체로서는 SR Ca release 를유도하지않고 SR로부터의 CICR을변형 (modify) 하지않는것처럼보이며 ( 그림 114, 115, 117), 4) 심장의 corbular SR( 만약, 생리적으로 corbular SR에서 Ca release가정말일어난다면 ) 과 extended junctional SR로부터의 SR release는 VDCR로보기에너무떨어져있고, 5) 골격근에서뚜렷한 DHPR-RyR 결합구조와상호작용 ( 그림 ) 이심장에서는보이지않는다. 그럼에도불구하고여러그룹들이심장근에서 VDCR이존재한다고주장했고, CICR과 cardiac E-C coupling에서의 CICR의역할에관한증거를고찰한후이가능성을논할것이다 ( 쪽 ). 생리학적관점에서 CICR 은 E-C coupling 의좀더원시적인형태다. 이관점에서대부분의 무척추동물골격근 ( 예 : 왕새우 crayfish) 은기능적으로포유동물심장근과매우비슷하다 (Györke 와 Palade, 1993, 1994). 저자 [Bers DM] 의관점에서는 CICR 은계통학적으로매우오래됐고일반적으로 720 역주 ) in vitro 실험으로미루어, 평상시 Mg은 RyR1 활성을 지속적으로 억제한다. 그래서, tonic hihibition ( 강직성억제 ) 라한것으로보인다.

15 255 CHAPTER 8 E-C coupling ( 수축속도-speed-가가장중요한요소는아닌 ) 심장에서는 adapted mechanism 721 으로생각된다. 그래서, 심장 DHPR과 RyR 사이에 ( 직간접적으로 ) 약한상호작용이존재할지는몰라도이것은주로이웃한 RyR clusters의 SL Ca 통로들을유지하기위한기능이다. Fast-twitch 골격근에서는빠른수축속도로인한상당한장점 ( 생존능향상 ) 이존재한다. 포유동물골격근 DHPR과 RyR1 은아마분자내에부가적인상호작용지점들을가지고있어상호작용이더강한동시에 Ca influx 없이도전압센서의신호 722 를이용해 E-C coupling 신호를매우빠르게전달할수있을것이다. 이런문맥에서, 골격근의 ICa은본질적으로흔적기관 (vestigial; E-C coupling에대해서는 ) 이고결과적으로 Ca통로로서의기능은진화와함께퇴화됐다고 (deteriorated) 볼수있다. 이는포유동물골격근에서 I Ca 활성화가매우느린 723 (charge movement나 cardiac I Ca 와대조적으로 ) 것과아귀가들어맞는다. 물론, 이상은단지생각일뿐이다 (just musings). Ca-INDUCED Ca-RELEASE (CICR) Ca-induced Ca-release in skeletal muscle CICR은골격근에서처음기술됐다 (Endo 등, 1970; Ford와 Podolsky, 1970). CICR이심장근과골격근모두에존재하지만 (7 장 ), 주된논점은이것이생리적으로발생하는지, 그리고다른가능한기작과어떻게상호작용하는지다. Endo(197a, 1977) 는단지생리적이지않은낮은 [Mg], 그리고 heavy SR Ca loading, 매우높은 trigger [Ca] 에서만 CICR을보일수있다고주장했다 ( 예 ; 100 um Ca, 0.9 mm Mg 또는 10 um Ca, 50 um Mg). 그러나, Fabiato(1984, 1985a) 는 100 nm Ca와 ~3 mm free [Mg] 조건에서 nm까지신속히 [Ca] 을증가시켜시동하는 (trigger) 방법으로골격근 CICR을증명했다. 앞서의섹션은골격근과심장근에서 CICR과 VDCR이공존하고함께기능하는지기술했다. Ca-induced Ca-release in mechanically skinned cardiac muscle 단일심장근세포를 mechanical skinning한표본을사용한일련의정교하고많은 (formidsble) 연구를통해 Fabiato와 Fabiato는 CICR의특성을광범위하게기술했다. 724 일련의연구의정점에서 725, Fabiato (1985a-c) 는 mechanically skinned canine Purkinje fibers(t-튜블이없다 726 ) 를사용했다. Solution은 5 um 칼모듈린 (Ca release를약간-slightly-증가시킨다 ) 과 ~3 mm free Mg를포함했다. 가장큰 CICR은 1-3 mm Mg에서관찰됐는데, 하지만여기서 CICR을유발하는 [Ca] 역치값은더낮은 721 역주 ) adaptation은심장생리, 특히심장질환논문에서는정상적인기능이감퇴될때보완적으로다른기전을활성화해심장의기본능력 ( 예 ; cardiac output) 을유지하려는현상을말한다. Adaptation은나름대로 trade-off가있다. 722 역주 ) volatage sensor signal = charge movement-induced conformational change in DHPR 723 원문 ) very slow activation of I Ca 724 원주 ) Fabiato와 Fabiato, 1973, 1975a,b, 1978a,b, 1979; Fabiato 1981a, 1983, 1985a-c 725 원문 ) in a culminating experimental series 726 원주 ) 이표본에서 T-tubule이재봉합 (reseal) 되면실험결과를해석하기복잡해진다.

16 CHAPTER 8 E-C coupling 256 [Mg] 에서보다더높았다 (Fabiato, 1983). 신속한 Ca 처리 (application) 는 I Ca 을통한 Ca entry를자극해 SR Ca release를유도한다. 이들 skinned cells에 ~1 ms까지의다양한속도 (rate) 로다양한 [Ca] 농도를가진 solution을처리할수있었고, aquorin 형광과수축으로 SR Ca release를측정했다. CICR이 positive feedback을내포하는만큼, Ca release가 completion에선행 ( 방출된 Ca이더많은 Ca 방출을유발 ) 한다고생각할수도있다. 하지만, 주목할만한 CICR의특성은방출된 Ca이 trigger Ca 량에비례한다는점이다 (Fabiato, 1983, 1985b). 실제로, 더높은 [Ca] 에서 CICR은억제되거나 (inhibited) inactivate된다 ( 이하설명 ).

17 257 CHAPTER 8 E-C coupling 그림 112A에 Fabiato의접근법을그렸는데, 높은 [Ca] 에서 CICR이 inactivation되는것을보여준다. 대조군의수축 ( C ) 에서, SR에 Ca을충전하기위해 100 nm Ca solution을사용한후제거하고, 이어 SR Ca release를활성화하기위해 250 nm Ca solution을짧게 (briefly) 처리했다 ( 이농도의 [Ca] 이수축을직접활성화하기에충분했음을상기 ; 그림 21A). 세번째수축 (test) 에서, 250 nm Ca 를 30 ms 처리한직후에더높은 [Ca](10 um) 을처리했다 (~150 nm). 이높은 [Ca] 처리의결과는더작은 (smaller) 수축과더낮은 [Ca]i 이었다. 이것은더높은 [Ca] 이통상의 (usual) CICR을 inactivate함을가리킨다. 그림 112B는 CICR로만들어진 tension transient의 trigger [Ca] 의존도 (dependence) 를보여준다 (Fabiato, 1985b). 자료는지정된 trigger [Ca] 에도달하는데걸리는시간을다르게한결과 tension의차이를보였다. SR에서방출된 Ca은 trigger [Ca] 과그 trigger Ca 농도에도달하는데걸린시간모두에의존했다. 더높은 ( 혹은최적값보다큰supra-optimal) trigger [Ca] 에서, SR Ca release는억제됐다. CICR은또한연속적으로두번째 Ca release를유도할수없는불응기 (refractory period) 를보였다. 이것은카페인-유도 Ca release에서는찾아볼수없는특성이었다. Fabiato(1985b) 는이를 SL Ca 통로에서기술된 inactivation( 그리고 inactivation에서 recovery) 과관련있다고보았다. 또한그는 63 nm Ca에서어떤 steady state inactivation이존재함을보였지만, 이 inactivation은 [Ca] = 12 nm 농도에서몇초처리후사라졌다 (I Ca inactivation과 recovery과유사하다analogous). 이상의발견에근거해 Fabiato(1985b) 는모델을제시했는데 ( 그림 113), 여기서 Ca은활성화자리한곳 (an activating site) 에높은속도 (on rate) 로결합 ( 그러나친화성은별로높지않은modest affinity) 하고또한친화성이높은두번째 inactivating site에낮은 association constant([ca]= 63 nm에서 ~0.7 sec) 로결합한다. 그래서, [Ca]i 가빠르게증가하면활성화자리가점유되고 SR Ca release가일어난다. Inactivation site는더느리게 Ca과결합해 Ca release를끈다 (turn off). 매우높은 [Ca] 을재

18 CHAPTER 8 E-C coupling 258 빨리처리 (application) 하면 inactivation을직접만들어내는데, inactivation site에 Ca이결합하는경향이속도on rate와 [Ca] 의곱 (product) 에비례할것으로예상되기때문이다. 그러므로, 매우높은 [Ca] 은느린결합속도on rate의한계를부분적으로넘을수있다. 이모델은심장근세포 E-C coupling의전반적인행태를세포수준에서이해하는데유용한뼈대 (framework) 가된다. Ca-induced Ca-release: Support from intact cardiac myocytes 그림 113 에서 SL Ca 통로를 SR Ca 방출통로 (RyR) 에가깝게그려놓았다. 이그림에서, I Ca 로들어온 Ca entry는손쉽게 SR Ca 방출통로의활성화자리 ( 그리고 inactivation sites) 에접근한다. 심장근세포에서 I Ca, 수축, Ca i transient의막전위의존성 (E m -dependence) 이비슷한것은 ( 그림 106A) 심장의 CICR을뒷받침하는고전적인발견들이다 I Ca tail currents ( 그림 114, Cannell 등, 1987; Beuckelmann과 Wier, 1988) 관찰에서이를부가적으로뒷받침하는근거를찾을수있다. 이것은세포를처음 positive E m ( 예 ; +100 mv) 으로 voltage clamp에걸때발생하는데 729, 여기서 Ca 통로는개방됐지만 I Ca 는전혀관찰되지않고, Ca transient도전혀발생하지않는다. 그리곤막전위가갑자기 (suddenly) negative E m ( 예 ; -50 mv) 으로 clamp back 되면 Ca 통로는 deactivate되지만 Ca 통로가닫히는동안의짧은시간동안커다란 inward I Ca 가열린 Ca 통로를통해흘러 (tail current) Ca transient 와수축을유도한다. 이것을설명하기위해서는복잡한막전위의존성이연구되어야할테지만 730, 727 원문 ) The similar are classic findings which are consistent with CICR in heart. 728 원주 ) London과 Krueger, 1986; Cannell 등, 1987; Beuckelmann과 Wier, 1988; Callewaert 등, 1988; dubell과 Houser, 원문 ) These occur when a cell is first voltage clamped at positive E m (e.g mv), 원문 ) although a complex E m -dependence could be contrived to explain this

19 259 CHAPTER 8 E-C coupling 일단 CICR(VDCR과대조적으로 ) 을반영하는현상인것같다 (Cannell 등, 1987). 이들 tail Ca i transients 는전압이 SR Ca 방출을보다직접제어한다고생각되는골격근에서는관찰되지않는 다. Näbauer 등 (1999) 은쥐심실근세포에서 CICR(vs. VDCR) 의존재를뒷받침하는설득력있는증거를발견했다 ( 그림 115). 첫번째펄스 (pulse) 는 control depolarization 731 으로커다란 ICa와 Ca transient를수반한다. 두번째펄스에서, 4 mm EGTA를처리해 [Ca]o 를 submicromolar level로감소시켰다. 이조건에서 Ca 통로는커다란 Na 전류를운반하고 (5 장을보라 ) 이경우, I Ca 에비해매우느리게 inactivate한다. 이펄스에서 1) 이온전류가 Ca 통로를통해흘렀고 2) Ca 통로가활성화되면서 charge movement가있었고, SR Ca이많았는데도 ( 카페인유도 Ca transient로보였음 ), 이경우 Ca transient가전혀관찰되지않았다. 그들은또한 Ba current가 SR Ca release를유도하지못함을보였다. 그런고로, E-C coupling은 Ca 통로의 charge movement나전류그자체per se만으로는일어날수없다. 심장근에서 Ca release를유도하려면 Ca entry가절대적으로필요한듯하다. 두가지빛에취약한 (photoliable) Ca 킬레이터 (chelators) 인 Nitr-5 (Adams 등, 1988) 와 DMnitrophen (Kaplan과 Ellis-Davies, 1988) 은빛을받음과동시에 Ca 친화성이감소하므로온전한세포에처리하면 ( 원하는순간에 ) [Ca]i 이급격히증가하도록할수있다. Kentish 등 (1990) 은 saponin skinned 심장근에 Nitr-5 를처리해 CICR을증명했는데, IP 3 -induced Ca release(ip 3 -유도된 Ca 방출 ) 과비교했다 (287 쪽 ). Valdeomillos 등 (1989) 은쥐심실근세포에서 Ca-Nitr-5 의광분해 (photolysis) 가리 731 역주 ) test depolarization( 탈분극 ) 과비교하기위한것. 실험재료가같지않을경우의대조군실험 (control experiment) 에해당.

20 CHAPTER 8 E-C coupling 260 아노딘민감성수축 (ryanodine-sensitive contractions) 을유도하고, 이것이 10 mm Ni 존재하에서지속됨을보였다 (bath solution에 10 mm Ni가존재하면 I Ca 와 Na/Ca exchange 모두 block). 이런수축은아마도 CICR을반영하는듯하지만, 여기서 E m 은측정되지않았다. Näbauer과 Morad (1990) 그리고 Niggli와 Lederer (1990) 는분리한심근세포를 voltage clamp에걸어이런꼴의광분해실험을진행했다. 수축은카페인, 리아노딘처리로크게저하됐는데 (suppressed), 이측정은모두일정한 E m 을유지한조건에서얻어졌다 ( 어떤탈분극에의한 Ca 방출가능성도배제하기위해 ). Niggli와 Lederer (1990) 는또한 CICR이 E m 이 100, 0, +100 mv일때동일함을보여심장근에서 E m 이 CICR 을변형되지않음 (not modify) 을암시했다 ( 이하설명 ). Näbauer과 Morad (1990) 역시 Fabiato의실험 ( 그림 112A) 을재현하려고했는데, 수축이발생하는동안 (rising phase) flash photolysis로 [Ca]i 를증가시키는방법이었다. 732 그들은 [Ca]i 가더높아져 SR Ca 방출이 inactivate됐다는어떤증거도얻지못했고, 실험결과는단지수축이더증가했을뿐이었다. DM-nitrophen의광분해로도달한 [Ca]i 가 inactivation을만들어낼만큼충분히높지못했을수 ( 또는길지못했거나 ) 있지만, 아직그림 112A에서지적한 supra-optima Ca trigger에의한 CICR inactivation을확인한온전한세포실험자료 (no intact cellular data) 는없다. CICR inactivation과 SR Ca 방출의종료 (termination) 에관해서는뒤 ( 쪽 ) 에서더자세히다룰것이다. Repolarization induced turn-off of Ca-release in cardiac muscle? Cannell 등 (1987) 은재분극이 [Ca]i 상승 (rise) 을단축될 (cutailed) 수있음을보였는데, 특히, peak I Ca 가발생한후에도유효했다 ( 그림 116). 그들은그이유를아마도 CICR 프로세스 (process) 가본질적으로막전위의존적이거나또는재분극이 SR Ca 방출을중지 (turn off) 시켰기때문일것 ( 골격근에서처럼 ) 이라제안했다. 또다른가능성으로, 재분극이 Na/Ca exchange를통한 Ca 배출을가속해서 (hasten) [Ca]i 상승을제한했기때문일수도있다. 하지만, 이가능성은그럴듯하지않은데, Bers 등 (1970) 이 Na/Ca exchange가없어도 (Na-free solutions처리로, 그림 116) [Ca]i 의지속시간의존성 (duration-dependence) 이여전히뚜렷함을보였기때문이다. CICR의본질적인막전위의존성 (intrinsic E m -dependence) 은아래세가지실험에근거해그럴듯하지않다. 첫째, Niggli와 Lederer (1990) 가 Ca-Nitr-5 를광해리시켜수축을유발했을때 100, 0, +100 mv에서수축정도가같았다. 둘째, 그림 116 과같은실험에서, Cleeman과 Morad (1991) 는 40 mv 재분극 (deactivating I Ca ) 시키거나 +100 mv로더탈분극시켜 ( 그래서, 전기생화학적으로 Ca influx를막아 ) I Ca 을통한 Ca entry가정지하면두경우에똑같이 Ca transients가단축됨을보였다. 셋째, 매우작은 I Ca 로도상당한 Ca transient를볼수있기는하지만, I Ca 의막전위의존성은 Ca transients와수축의경우와비슷하다 ( 그림 106)(Cannell 등, 1987). 그림 117 은다른방식으로이종류의결과를본것이다. 만약 SR Ca 방출이 (Ca에더해 ) E m 의존적이라면, 더높은 (more positive) 732 원문 ).. by increasing [Ca]i with a flash during the rising phase of the contraction.

21 261 CHAPTER 8 E-C coupling E m 에서주어진 I Ca 에대해 [Ca]i 도더높을것이다. 그림 은그반대를보여준다. 똑같은 I Ca 에대해, 더높은 E m 에서더적은 [Ca]i 이관찰된다. 이것은 single channel I Ca 의크기 (size) 가다른 E m 에서다른것으로설명된다. 즉, 더낮은 (negative) E m 에서 i Ca 크기 (amplitude) 는더큰데, 이것은단지전기생화학적인기전력 (electrochemical driving force; E m -E Ca ; 그림 117B) 이더크기때문이다. 그래서, 더낮은 (negative) E m 에서개방된 Ca 통로는더큰 i Ca 를생산하고, 결과적으로 SR Ca release를더잘 trigger한다. 단일통로 (single channel) 관점에서본이논리는또한그림 116 의 E-C coupling의 duration-dependence도설명한다. Duration-dependence는더낮은 E m 에서더두드러지는데 ( 그림 116), 이것은단일 LTCC의개방 latency가길어진것과들어맞고, 734 이현상은특히활성화역치값바로위의 E m 에서뚜렷하다 (Rose 등, 1992). 그래서, i Ca latency에근거한다면 20 mv 에서의 duration dependence는아마 i Ca 가주변 SR Ca 방출통로를확보, 개방시키는데어느정도시간이걸리는것 735 을반영한것이라여겨진다. 이상의결과은종합적으로, CICR이 E m 에의해직접변형 (modify) 되지않음을강하게시사한다. Positive E m 에서는주어진 I Ca 에대해더높은 [Ca]i 가보고되었는데 ( 예 ; [Na]i 가상승한경우, Isenberg 등, 1988), 이결과는 I Na/Ca 또는 VDCR을통한 Ca entry로설명된다 ( 쪽 ). 733 원주 ) Beukelmann 과 Wier, 1988; Wier 등, 1994; 그러나, 다음섹션을보라 734 원문 ).., consistent with longer latencies for single L-type Ca channel opening, 원문 ) time-dependent recruitment of SR Ca release units

22 CHAPTER 8 E-C coupling 262 LOCAL CONTROL AND CICR CICR 을좀더정량적으로고찰하려면 junction 내부의지역적인물리적환경과이영역의 확산한계에관한훨씬더자세한정보가필요하다. 736 우선 SL Ca 통로의내부입구 (inner mouth) 에인접한영역 (vicinity) 에서예상되는 [Ca]i 를고찰하는편이유용하다. 반구중심의점원 (point source) 에서 [Ca] 이반경을변수로확산되는방정식의해를이용하면쉽게얻을수있다 (Crank, 1975). [ Ca] rt = [ Ca] t0 + 2π q Dr r erfc 2 Dr (8.1) 여기서 [Ca] t0 과 [Ca] rt 는초기 [Ca]i, 그리고전류 q 가활성화된후시간 t 인시점에 SL Ca 통로 입구 (mouth) 에서반경 r 거리인지점의 [Ca]i 를의미하고, D 는확산계수 (diffusion coefficient) 이다. 그림 118A는 [Ca]i 를 SL Ca 통로의내부입구를기준한반경의함수로보였다 ( 두가지 D 값에대해 ). SL막내면에 Ca binding이있다고고려하면 steady state가지연되지만, 최종값 (final value) 은바뀌지않는다 (Bers와 Peskoff, 1991). 통로근처 (r ~2 nm) 에서 [Ca] 는매우높은값까지올라가고, RyR Ca binding site가있을것이라여겨지는 junctional cleft의 SR 쪽 (r ~15 nm) 에서 um 에이른다. r < 20 nm 인영역에서 [Ca]i 은 < 1 ms 안에 steady state에도달한다 ( 식 8.1 의마지막인수-factor-가 ~1). 이것 737 은이영역에서확산되는 Ca이통로를통해들어오는 Ca entry로메꿔진다는 ( keeping up ) 뜻이다. 그래서, I Ca 가멈추는즉시이영역의 [Ca]i 이급격히감소할것을암묵적으로시사한다. 이것으로초기재분극 (early depolarization) 으로 I Ca 가멈추면 SR Ca release가 736 원문 ) A more quantitative consideration of CICR requires much more detailed information about the local physical environment in the junction and diffusional limitations in this region. 737 역주 ) steady state 가형성된다는것은