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1 Korean Chem. Eng. Res., Vol. 46, No. 4, August, 2008, pp 총 설 Salvia Miltiorrhiza Bunge 로부터 Tanshinone IIA 의용매추출 만효룡 정용안 * 노경호 인하대학교화학공학과초정밀생물분리기술센터 인천시남구용현동 253 * 한국기기유화시험연구원화학분석평가팀 서울시강남구신사동 (2008 년 4 월 1 일접수, 2008 년 4 월 21 일채택 ) Solvent Extraction of Tanshinone IIA from Salvia Miltiorrhiza Bunge Xiaolong Wan, Yong An Jung* and Kyung Ho Row Center for Advanced Bioseparation Technology, Department of Chemical Engineering, Inha University, 253 Yonghyun-Dong, Nam-Ku, Incheon , Korea *Chemical Analysis & Research Team, Korea Machinery-Meter and Petrochemical Testing & Research Institute, , Sinsa-Dong, Gangnam-Gu, Seoul Korea (Received 1 April 2008; accepted 21 April 2008) 요 약 본연구에서는분석용 HPLC 를사용하여단삼 (Salvia Miltiorrhiza Bunge; SMB) 의추출물로부터 Tanshinone IIA (TIIA) 를분리하였다. 우선유기용매를사용하여추출및전처리한단삼추출액으로부터 HPLC 를사용하여 TIIA 을분석하였으며, 고순도의 TIIA 을분리하기위한최적의분석조건을실험적으로구하였다. 모든단삼시료들은메탄올, 에틸아세테이트, 에탄올등과같은유기용매로추출하고비교분석하였다. 실험결과에의하면추출용매로메탄올을사용한경우, 단삼으로부터 TIIA 의추출효율이가장우수하였다. 또한 TIIA 를분석하기위한조건으로는 C 18 컬럼을사용하였고, 이동상은물과메탄올을사용하여주로등용매용리를적용하였을때, SMB 1 mg 에 µg TIIA 를분말로추출하였다. Abstract In this work, analytical HPLC was utilized to obtain Tanshinone IIA (TIIA) from Salvia Miltiorrhiza Bunge (SMB). The optimum operating conditions were experimentally determined to analyze the TIIA in the pretreated extract. SMB was extracted with the various organic solvents of methanol, ethyl acetate, and ethanol, then the extract was analyzed to compare the amount of TIIA. From the results, the methanol showed the best extraction efficiency of TIIAd. The analysis by C 18 column was performed. The mobile phase was composed of methanol and water, and the isocratic elution mode was mainly applied µg of TIIA/mg of SMB powder was extracted with methanol. Key words: Salvia Miltiorrhiza Bunge, Tanshinone IIA, Extraction, Purification, RP-HPLC 1. 서론 단삼 (Salvia Miltiorrhiza Bunge) 은꿀풀과 (Labiatae) 에속하는다년생약용식물로서뿌리가붉기때문에단삼이라한다 [1]. 단삼의뿌리와줄기는오래전부터중국의전통의약으로혈액순환, 심장질환등에사용되어왔다 [2]. 바이오산업에서웰빙이추구되는현대사회는환경오염및식생활문화에의하여다양한질병인성인병발생이증가하고예방에따른건강의관심이높아지고있다. 대표적으로비만, 고혈압, 심장질환등이인체에미치는영향이매우크다. To whom correspondence should be addressed. rowkho@inha.ac.kr 이논문은인하대학교정성택교수님의정년을기념하여투고되었습니다. 따라서천연물로부터생리활성물질의소재탐색연구가많은연구자로부터관심을갖고있으며, 항암물질에의한면역시스템의활성화를통해질병에대한생체방어능력을보강해준다 [3]. 단삼 ( 뿌리 ) 은치료수단인동시에국내에서사용되는한약재중의하나이다 [4]. 몇몇의약리작용에관한연구에서는크게두가지형태의화합물인 lipid-soluble diterpenoids와 water-soluble polyphenolic의 화합물로나눌수있으며 [5], 이것은항산화활성의산화방지에대하여혈관및피부세포조직질환에중요한요인으로많은연구가되고있다 [5, 6]. 단삼의유용성분을살펴보면대부분이 tanshinone I, IIA, IIB, dihydrotashinone, cryptotanshinone, neotanshinone A, B, C, isotanshinone I, IIB, isocryptotanshinone등의 furo-1, 2 또는 furo-1, 4-naphthoquinone moiety를가지는 abietane 형태의 diterpenoid 660

2 Salvia Miltiorrhiza Bunge 로부터 Tanshinone IIA 의용매추출 661 색소이며, rosemarinic acid, lithospermate B, magnesium lithospermate B 같은 phenol성화합물이알려져있다 [4, 7]. 이중에서도항암및고혈압조절제인 Cryptotanshinone, tanshinone I, tanshinone IIA는중요한활성성분으로구성되었다 [3-8]. 특히 TIIA는주활동성성분으로분자량이 C 19 H 18 O 3 (Molecular Weight: ) 며, 퇴행성골질환를예방과치료 [9], 심장질환, 혈관계에서혈류량을증가, 항균, 소염, 신부전증개선, 심근경색, 신장질환효과등이보고되어있다 [9-11]. 이러한효능때문에여러측면을연구한결과식품, 의약품등의외용제및건강식품, 과립차및음료로이용되고있고, 단삼의성분분석과효능에관한것뿐만아니라고순도분리에대한연구는계속해서진행되고있다 [12]. TIIA를얻기위한추출방법으로는일반적인용매추출법으로물, 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴을주로사용하며 [13], Soxhlet은전통적인증류방법으로많이알려져있으며, 초음파기술추출공정은고주파와저주파의사용에따라캐비테이션 ( 기포가생성되는현상 ) 에따라강도가달라진다. 또한시료물질에미치는영향은파장의침투력이미세부분의조직까지쉽게침투하여추출효과를향상하며 [8, 14], 일반적인추출방법보다, 빠르고, 자동적이며, 환경에안전하여유용물질을선택적으로얻을수있는초임계 CO 2 를이용한추출방법이연구되어지고있다 [2, 15]. 또한생물공학분야에서필수적으로사용되고있는 HPLC는탁월한분석및분취능력으로인해서최근에는생물제품생산용장치로서도부각되고단삼에서의분리및정제의연구도보고되고있다 [16, 17]. 본연구에서는단삼에함유된유용성분인 Tanshinone IIA (TIIA) 에대한추출공정및분석용 HPLC를사용하여분리할수있는최적분리조건을실험적으로확립함으로써 TIIA에대한상용공정의기초자료를제공하고자한다. 2. 실험 2-1. 실험재료및시약본실험에사용된건조된단삼뿌리는경동시장 ( 서울 ) 에서구입하였다. 시료는균일하게분쇄하여 38~56 μm의체에여과한후에사용하였으며, 시료의균일성을위하여수분조절용기 (Desiccator) 에보관하여사용하였다. 표준시료인 TIIA은 National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products ( 북경, China) 에서구입하였다. 모든시료들은주입하기전에막여과지 (PVDF 0.2 μm, Waters Co.) 를이용하여여과를하였다. 이동상으로사용된메탄올, 에탄올, 에틸아세테이트는덕산화학에서구입하였으며, 아세트산은동양화학에서구입하였다. 물은감압펌프 (Waters Co.) 와필터 (HA-0.5 μm, Waters Co.) 를이용하여여과한 3차증류수를사용하였다. 또한표준용액은표준시약 TIIA 1 mg 을에탄올 10 ml에녹여 100 ppm으로사용하였다. Fig. 1에서는단삼에서추출된 TIIA의화학적구조식을보여주고있다. Fig. 1. The molecular structure of TIIA. 집장치인 Chromate (Ver. 3.0, Interface Eng., Korea) 를통해서얻었다. 추출액으로부터 TIIA의분석은입자크기가 5μm인물질이충진된분석용 (RS-tech OP C 18, cm) 컬럼을사용하였다. 단삼시료는푸드믹서 (Hanil Mixer FM-909T, 220 W, 1.3 A) 를사용하여 2분동안분쇄하였으며, 분쇄된단산분말로부터교반기 (Model : MS-300, Max : 1600 MTOPS) 를사용하여용매추출을하였다. 이때 RPM 측정은 Digital stroboscope (Tachometer Model : DT-2249) 으로확인하였다. 전처리단계에서단삼추출액에포함된많은양의불순물을제거하기위해서초원심분리기 (Beckman Coulter) 를사용하였다. 추출한시료를농축하기위하여회전식증발기 (BÜCHI Rotavapor R-200, Switzerland) 를사용하였다. 이동상은 A : 물 / 아세트산 (99.5/0.5, vol%)/ B : 메탄올 (100, vol%) 을사용하여 (30/70, vol.%) 까지 20분동안등용매용리법과 A : 물 / 아세트산 (99.5/0.5, vol%), B : 메탄올 (100, vol%) 을 0~10분까지 95:5으로, 10~20분까지 5:95으로기울기용리법 (gradient) 으로수행하였다 추출방법단삼뿌리 (SMB) 에서 TIIA을추출하기위해단삼분말시료 15 mg에메탄올, 에틸아세테이트, 에탄올을각각 50 ml씩넣고상온 (25 o C) 에서 15 h 동안교반 (500 rpm) 추출하였다. 불순물및잔류물 ( 찌꺼기등 ) 을제거하기위해서추출된용액을초원심분리기 (Beckman Coulter) 에서회전속도 10,000 rpm, 4 o C에서 1분동안원심분리를하였으며, 분리된액중상층액을사용하였다. 단삼뿌리 (SMB) 가포함된하층고형물은동일한방법으로 3회반복추출하였다. 이렇게하여얻어진추출액은 0.2 μm 멤브레인필터로여과하여분석을위한최종시료를만들었으며, 분석용컬럼으로분석하였다 실험기기본실험에서사용된분석용 HPLC 장치는 Waters 515 multisolvent delivery system 486 tunable absorbance analytical detector, Rheodyne injector (50 μl sample loop) 를포함한 Waters model 600S liquid chromatography (Waters Associates, Milford, MA, U.S.A.) 를사용했다. HPLC에서얻은 chromatogram은데이터수 Fig. 2. Extraction and purification procedures of SMB. Korean Chem. Eng. Res., Vol. 46, No. 4, August, 2008

3 662 만효룡 정용안 노경호 분석을위한 HPLC의실험조건은유속 1 ml/min, 주입부피 15 μl, 검출파장은 254 nm로고정하여실험하였다. Fig. 2에서는본연구에서적용된추출및정제방법의공정을도식화하였다. 3. 결과및고찰 본연구에서는단삼뿌리 (SMB) 에포함된 TIIA의함량과분리및분석조건을실험적으로고찰하여확인하였다. TIIA은항암물질및고혈압억제제로많이알려진중요한물질이며, 단삼뿌리 (SMB) 에함유되어있는유용성분들은용매의용해도를이용하여추출되어지며, TIIA 및화합물은유사한물질의구조식에따라제거또는최종목적물질까지저순도, 중순도, 고순도로얻게된다 [18]. 실험에서언급한바와같이다양한추출용매를사용하여단삼뿌리로부터 TIIA를추출하였으며, 사용된각각의추출용액에대한 Polarity index는메탄올 (P'=5.1), 에틸아세테트 (P'=4.4), 에탄올 (P'=5.2) 이다 [13,18]. Fig. 3에서는실험을통해서얻은여러가지농도의 TIIA 표준용액으로부터계산된검량선을나타내고있다. 실험에서는단삼추출액으로부터 TIIA의정량분석을위해표준용액의농도를 20, 40, 60, 80, 100 ppm 등 5가지로제조하였다. 제조된각표준용액을 HPLC에주입하여동일한분석조건하에서얻은각각의크로마토그램의피크면적 (Y) 과농도 (X) 와의관계로부터검량선을실험적으로계산하였으며, 이때 TIIA 정량분석을위한계산식은 Y= X 이며상관계수는 r 2 =0.9973이였다. 이계산식으로부터각각의유기용매에추출된 TIIA의양을확인한결과사용한유기용매중메탄올이가장우수한추출수율을나타내었다 (Table 1참조 ). 또한추출액중의 TIIA에대한정성분석은표준시료와의체류시간을비교하여확인하였으며, TIIA의체류시간은 9.1분이었다. Fig. 4에서는메탄올추출물에대한크로마토그램을보여주고있다. Table 1. The extraction amounts of TIIA from SMB with three different extractants Extractant TIIA (µg/mg) Methanol Ethyl acetate Ethanol Fig. 3. The calibration curve of TIIA. Fig. 4. Chromatograms of TIIA standard and methanol extract (Mobile phase: Methanol:Water (70:30, v/v, containing 0.15% AA), Flow rate: 1 ml/min, Injection volume = 15 µl). 일반적으로물질중에함유된유용성분을추출하기위한추출공정에서추출용매의선정은매우중요하다. 추출하고자하는물질의극성과유사한극성을가지는유기용매에서높은용해도를가지기때문에추출수율이크게된다 [13, 16]. 단삼시료로부터 TIIA를추출하기위한추출용매로메탄올을사용하였을때, 극성이서로비슷한것끼리는잘혼합되고섞이고잘붙는성질에따라같은성질끼리서로잘녹으며성질이다른것과는섞이지도녹이지도못한다. 또한극성 ( 투사율 2-3) 이없는것은극성이없는것끼리분자사이로용매가끼어들어녹여낼수가있으며반대의것들은서로침투가어려워져서녹이지못한다. 단삼뿌리 (SMB) 에함유된 TIIA를추출하기위해서분쇄기로잘분쇄한단삼뿌리분말을 100% 의메탄올에넣고, 교반과여과단계를거쳤다. 이과정을통하여 TIIA를고효율적으로추출하였으며, 이경우메탄올에대한 Polarity index는 P'=5.1 로많은부분의 TIIA를용해시킬수있었다. 전처리한단삼추출물은분석용컬럼을사용하여유속 1 ml/min, 주입부피 15 μl의실험조건에서분석하였다. 이동상으로는물, 메탄올의 2성분계의이동상을이용하여여러가지이동상의조성법에의하여분리능을확인한결과메탄올 -물(70:30, v/v, containing 0.15% AA) 으로의등용매용리법이가장우수한분리능을나타내었다. 위와같이분리된 TIIA를추출조건을달리하여피크의면적을확인한결과메탄올 (MeOH) 을사용하였을때함량이 μg/mg로에틸아세테이트 (EtOAc) μg/mg, 에탄올 (EtOH) μg/mg보다 4.3배가량많은양의 TIIA를추출할수있었다. Table 1에서는단삼뿌리 (SMB) 에포함된 TIIA에대해서용매에따른추출함량을보여주고있다. Fig. 5에서는에틸아세테이트로추출한크로마토그램을보여주고있다. 추출용매는메탄올보다낮은극성 (P'=4.4) 을갖고있으며주입부피 15 μl를주입하여동일한실험조건에서분석하였다. TⅡA의용해도는 Fig. 4와는달리다른물질의피크와겹치지않고 baseline이안정된낮은피크의 Intensity를볼수있었으나메탄올추출물에비하여 Intensity가낮았다. 이것은 TIIA 이에틸아세테이트 (EtOAc) 에잘녹지않는극성에가까운물질임을알수있으며, 추출된 TIIA의양은 μg/mg으로메탄올추출물에비하여 2.8배감소하였다. Fig. 6에서는에탄올로추출한크로마토그램을보여주고있다. 추출용매로서메탄올 (P'=5.1) 과에탄올 (P'=5.2) 은비슷한 Polarity index를갖고있지만끓는점은메탄올 (65 o C), 에탄올 (78 o C), 에틸아세테이트 (77 o C) 과같이용매에따 화학공학제 46 권제 4 호 2008 년 8 월

4 Salvia Miltiorrhiza Bunge 로부터 Tanshinone IIA 의용매추출 663 Fig. 5. Chromatograms of TIIA standard and ethyl acetate extract ((Mobile phase: Methanol:Water (70:30, v/v, containing 0.15% AA), Flow rate: 1 ml/min, Injection volume = 15 µl). Fig. 7. Chromatogram of the methanol extract with gradient elution (Flow rate = 1 ml/min, Gradient elution: A: methanol, B: Water +0.5% AA, 0-10 min A/B=95:5, min A/B=5:95, Injection volume = 15 µl). 과등용매용리법은뚜렷한차이를나타내지않았다. 4. 결론 Fig. 6. Chromatograms of TIIA standard and ethanol extract (Mobile phase: Methanol:Water (70:30, v/v, containing 0.15% AA), Flow rate: 1 ml/min, Injection volume = 15 µl). 라차이가있다. 극성이강한화합물은뜨거운비극성용매에는잘용해되지않으나, 극성용매에는차가워도잘용해되는성질이있다. 일반적으로천연물추출에서는물질이높은온도에의해서유용성분들이분해되지않도록상온에서조업을한다. 본실험에서는에탄올로추출한시료를주입부피 15 μl하고 HPLC에주입하여앞에서와동일한분석조건에서실험하였다. 에탄올추출에서 TIIA 의용해도는 Fig. 5와비슷한낮은 Intensity의크로마토그램을보이고있다. TIIA의추출된양은 μg/mg으로메탄올추출물에비하여 4배정도감소하였다. Fig. 7에서는 Fig. 4와동일한메탄올추출용매를이용하여기울기용리법 (gradient) 으로분석한크로마토그램을보여주고있으며, 같은주입부피, 유량조건에서실험하였다. 이동상조성은 A : 물 / 아세트산, 99.5/0.5(vol%)/B : 메탄올 / 100(vol%) 로 0~10분까지 95:5으로, 10~20분까지 5:95으로기울기용리법 (gradient) 으로분석하였다. Fig. 4에서얻은결과와비하여 TIIA의체류시간이 13.5분으로길어진반면, 컬럼효율과분리도는감소하였으며, 표준물질로부터 TIIA를확인할수있었다. 또한분석법에따른함량변화의차이는 ±0.05로거의없었다. 따라서두분석방법에대한 TIIA의정량분석결과, 기울기용리법 (gradient) 본연구에서는분석용 HPLC를사용하여단삼 (SMB) 의추출물로부터 TIIA를추출및분석하였다. TIIA를추출하기위한추출용매로메탄올, 에탄올, 에틸아세테이트를사용하였으며, 추출액은역상 C 18 컬럼을이용하여동일한분석조건하에서추출물에포함된 TIIA를분석하였다. 실험결과에의하면추출용매로메탄올 (MeOH) 을사용하였을때 TIIA의함량이 μg/mg로에틸아세테이트 (EtOAc) μg/mg, 에탄올 (EtOH) μg/mg보다더우수한추출수율을나타내었다. 단삼에함유된 TIIA를분석하기위한최적조건은분석용컬럼을사용하여유속 1 ml/min, 주입부피 10 μl 의실험조건에서이동상으로물, 메탄올의 2성분계의이동상을이용하여, 등용매용리법으로분석하였을때메탄올-물 (70:30, v/v, containing 0.15% AA) 이가장우수한분리능을나타내었다. 또한등용매용리법과기울기용리법 (gradient) 을적용하여 TIIA에대한추출량을비교할결과, 두방법모두비슷한경향을보였다. 감 본연구는인하대학교고순도분리연구실에서수행하였으며, 초정밀생물분리기술연구센터의연구비지원에감사드립니다. 사 참고문헌 1. Han, W. S., Isolation of Antimicrobial Compounds from Salvia Miltiorrhiza Bunge, Korean J. Medicinal Crop Sci., 12(3), (2004). 2. Dean, J. R., Liu, B. and Price, R., Extraction of Tanshinone IIA from Salvia Miltiorrhiza Bunge Using Supercritical Fluid Extraction and a New Extraction Technique, Phytosol Solvent Extraction, Journal of Chromatography A, 799(1-2), (1998). 3. Yoon, Y. S., Kim, Y. O., Jeon, W. K., Park, H. J. and Sung, H. J., Tanshinone IIA Isolated from Salvia Miltiorrhiza Bunge Korean Chem. Eng. Res., Vol. 46, No. 4, August, 2008

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한약재품질표준화연구사업단 단삼 ( 丹參 ) Salviae Miltiorrhizae Radix 생약연구과

한약재품질표준화연구사업단 단삼 ( 丹參 ) Salviae Miltiorrhizae Radix 생약연구과 - 1 - KP 11 CP 2015 Salvia miltiorrhizae Radix Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma Salvia miltiorrhiza Bunge Salvia miltiorrhiza Bunge salvianolic