(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (45) 공고일자 2014년09월01일 (11) 등록번호 10-1433095 (24) 등록일자 2014년08월18일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A01H 5/00 (2006.01) (21) 출원번호 10-2014-0082833 (22) 출원일자 2014 년 07 월 03 일 심사청구일자 (56) 선행기술조사문헌 KR1020090121633 A KR1020050036363 A KR1020130083630 A 2014 년 07 월 03 일 (73) 특허권자 조이시아진지유한회사 광주광역시서구쌍촌로 28 번길 7-4 ( 쌍촌동 ) (72) 발명자 변동효 광주광역시서구상무자유로 32 (74) 대리인 최규환 KR1020070063179 A 전체청구항수 : 총 2 항 심사관 : 김민정 (54) 발명의명칭잔디신품종진지 (57) 요약 본발명은식물체의길이가 1~3 cm, 엽초길이가 0.5~1.2 cm, 엽초색이진한녹색 RHS(Royal Horticultural Society) 134A, 엽신길이가 1~3 cm, 엽신색이진한녹색 RHS(Royal Horticultural Society) 141A 및지하포복경에서자라는뿌리의길이가 30~50 cm 인특징을가지며, 엽초와엽신에털이없고, 녹색유지기간이 12 월초까지유지되고, 내습성이강하여하절기일 2 회관수작업에도병변현상없이번식이왕성하게진행되고, 주요번식형태는지상포복경또는지하경으로영양번식이며, 또한씨앗의발아에의해서도번식하는잔디신품종진지 (Gin gi) 에관한것으로, 잎의녹색도가높고낮게자라는특성이있어서잔디깎기가필요없고매트형성이우수하여개발지, 공원, 경기장또는골프장과같은피복또는녹화를필요로하는지역에유용하게사용할수있으며, 나아가우수한한국잔디품종의해외수출을위한잔디육성산업에도유용하게사용될수있는효과가있다. 대표도 - 도 4-1 -
특허청구의범위청구항 1 하기 (a) 내지 (f) 의형태적특징을가지며, 엽초와엽신에털이없고, 녹색유지기간이 12월초까지유지되고, 내습성이강하여하절기일 2회관수작업에도병변현상없이번식이왕성하게진행되고, 주요번식형태는지상포복경또는지하경으로영양번식이며, 또한씨앗의발아에의해서도번식하는잔디신품종진지 (Gin gi)( 수탁번호 : KCTC 12616BP): (a) 식물체의길이 : 1~3 cm (b) 엽초길이 : 0.5~1.2 cm (c) 엽초색 : 진한녹색 RHS(Royal Horticultural Society) 134A (d) 엽신길이 : 1~3 cm (e) 엽신색 : 진한녹색 RHS(Royal Horticultural Society) 141A 및 (f) 지하포복경에서자라는뿌리의길이 : 30~50 cm. 청구항 2 삭제청구항 3 제1항에있어서, 상기잔디신품종진지는서열번호 1의프라이머를사용하여 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) 분석하는경우 1.5kb 및 1.8kb의특이밴드를나타내지않고, 서열번호 2의프라이머를사용하여 RAPD 분석하는경우 1.3kb 및 2.2kb의특이밴드를나타내지않고, 서열번호 3의프라이머를사용하여 RAPD 분석하는경우 1.0kb 및 2.7kb의특이밴드를나타내지않는것을특징으로하는잔디신품종진지. 명세서 [0001] 기술분야본발명은잔디신품종진지에관한것으로, 더욱상세하게는식물체의길이가 1~3 cm, 엽초길이가 0.5~1.2 cm, 엽초색이진한녹색 RHS(Royal Horticultural Society) 134A, 엽신길이가 1~3 cm, 엽신색이진한녹색 RHS(Royal Horticultural Society) 141A, 및지하포복경에서자라는뿌리의길이가 30~50 cm인특징을가지며, 엽초와엽신에털이없고, 녹색유지기간이 12월초까지유지되고, 내습성이강하여하절기일 2회관수작업에도병변현상없이번식이왕성하게진행되고, 주요번식형태는지상포복경또는지하경으로영양번식이며, 또한씨앗의발아에의해서도번식하는잔디 " 신품종진지 (Gin gi)" 에관한것이다. [0002] [0003] 배경기술잔디란화본과다년생식물로질감이매우좋은초본식물이며짧게깎인상태로지표면을덮고있는것과정원의잔디초지를말한다. 전세계적으로난대, 온대, 한대지역에널리분포되어있으며거의 600속 (genus) 에약 5000여종 (species) 이존재하고, 기후조건에따른내한성의강약에의해서난지형잔디 (warm season turfgrass) 와한지형잔디 (cool season turfgrass) 로구분된다. 난지형잔디는남방의따뜻하고건조하거나습윤한지대에서주로재배되며이와는반대로한지형잔디는북방의춥고건조하거나습윤한지대에서주로재배된다. 대표적인난지형잔디로는국내에많이자생하는한국잔디 (Zoysia grass) 가있고, 한지형잔디로는켄터기블루그래스 (Kentucky bluegrass), 벤트그래스 (Bentgrass) 등의서양잔디가이에속한다. 한국잔디 (Zoysia grass) 는난지형잔디로서한국을포함한극동아시아에널리자생하고있고, 한국에는들잔디 (Zoysia japonica), 금잔디 (Zoysia matrella), 비로드잔디 (Zoysia tenuifolia), 갯잔디 (Zoysia sinica), 왕잔디 (Zoysia macrostachya) 등 5~6종의잔디가분포되어있는것으로보고되어있다. 들잔디는생활력이강하고, 한국에서사용하는잔디의대부분을차지한다. 엽너비는 4~7mm이고, 높이는 10~20cm로자란다. 따라서한국잔디 - 2 -
는우리나라기후에가장적합한잔디이며, 다른한지형서양잔디및난지형잔디보다환경적응성이뛰어날뿐 만아니라특히내건성, 내답압성, 내한성, 내서성, 내염성등이강한것으로알려져있다. [0004] [0005] [0006] [0007] 최근에잔디의이용이늘면서조성속도가빠르고조성방법이용이한품종, 생육지속기간이긴품종, 종자형품종등각목적에부합되는다양한품종의개발이절실하게요구되고있으며, 이러한요구를충족시키기위해다수의영양계신품종들이등장하고있다. 미국의경우 1905년부터한국잔디에관심을갖고미국농무성과대학들에서한국잔디를연구하여 에메랄드 (Emerald; 1955년 )', ' 메이어 (Meyer; 1951년 )', ' 미드웨스트 (Midwest; 1963년 )' 등의영양번식품종과 ' 제니스 (Zenith)', 'J37', 'J36' 등과같은종자번식품종 (Ruemmele Engelke, Grounds Maintenance, April, 92-126, 1990) 이만들어져보급되고있다. 그러나국내의경우안양중지, 베네스트 7, 건희, 세녹등이있을뿐품종개발에관한연구는외국에비해미미한실정이다. 따라서조성속도가빠르고조성방법이용이한품종, 생육지속기간이긴품종, 종자형품종등각목적에부합되는다양한품종의개발이절실하게요구되고있으며, 이러한요구조건에부합할뿐만아니라국내토양에가장알맞고, 녹색기간이짧은단점을극복하여수입종을대체할수있는최적의특성을가진우수한한국잔디의신품종에대한육종이절실히요구되고있다. 뿐만아니라최근에는기후변화에의해온난화와황사등환경에대한세계적관심과국민생활의변화로인해도시의환경조성을친환경화하려는시도들이대두되고있어녹색도시의요구도가증가함에따라녹화에필요한최적형질의잔디수요가증가하고있다. 한국등록특허제1016249호에는 ' 한국잔디신품종용천 ' 이개시되어있고, 한국공개특허제2013-0083630호에는 ' 잔디신품종그린조아 ' 가개시되어있으나, 본발명의잔디신품종진지에대해서는개시된바가없다. 발명의내용 [0008] 해결하려는과제본발명은상기와같은요구에의해도출된것으로서, 광주와전남인근지역에서선발한잔디를교잡시켜우수종자를선발해신품종을육성하고, 형태적및분자유전학적특성을비교하여, 엽색이진한녹색 (RHS(Royal Horticultural Society) 141A) 을띠며, 녹색기간이길고지상부에서의식물체의길이가 3 cm 이하로성장할뿐아니라매트형성이우수한잔디를확인하고이를난지형신품종 ' 진지 '(Gin gi) 로명명하여본발명을완성하였다. [0009] [0010] [0011] [0012] [0013] [0014] [0015] 과제의해결수단상기과제를해결하기위해, 본발명은하기의형태적특징을가지며, 엽초와엽신에털이없고, 녹색유지기간이 12월초까지유지되고, 내습성이강하여하절기일 2회관수작업에도병변현상없이번식이왕성하게진행되고, 주요번식형태는지상포복경또는지하경으로영양번식이며, 또한씨앗의발아에의해서도번식하는잔디신품종진지 (Gin gi) 를제공한다 : (a) 식물체의길이 : 1~3 cm (b) 엽초길이 : 0.5~1.2 cm (c) 엽초색 : 진한녹색 RHS(Royal Horticultural Society) 134A (d) 엽신길이 : 1~3 cm (e) 엽신색 : 진한녹색 RHS(Royal Horticultural Society) 141A 및 (f) 지하포복경에서자라는뿌리의길이 : 30~50 cm. [0016] 발명의효과본발명에따른잔디신품종인진지는잎의녹색도가높고낮게자라는특성이있어서잔디깎기가필요없고매트형성이우수하여개발지, 공원, 경기장또는골프장과같은피복또는녹화를필요로하는지역에유용하게사용할수있으며, 나아가우수한한국잔디품종의해외수출을위한잔디육성산업에도유용하게사용될수있는효과가있다. 또한, 뿌리가튼튼하고길어서토사유출을방지하는용도로효율적으로이용될수있다. - 3 -
[0017] 도면의간단한설명 도 1 은신품종진지로부터캘러스 (A) 및신초 (B) 를유기한사진이다. 도 2는신품종진지의포장전경을나타내는사진 ( 상 ) 및진지의포장전경사진을근접촬영한사진 ( 하 ) 이다. 도 3은신품종진지 ( 상 ) 와대조품종인금잔디 ( 하 ) 의생육상태를비교하여나타내는사진이다. 진지는지상부식물체의높이가 3 cm 내외로서예초할필요가없이진한녹색을유지하는반면, 금잔디는길게자라면서옅은녹색을나타낸다. 도 4는신품종진지 ( 상 ) 와비교품종인금잔디 ( 하 ) 의포복경생육모양을비교하여나타내는사진이다. 진지의길이보다금잔디의길이가 2배이상길다. 도 5는신품종진지 ( 상 ) 와비교품종인금잔디 ( 하 ) 의매트 (mat) 화실험의포장전경을나타내는사진이다. 진지는엽의가장자리만약간말리는현상이일부발현되는반면, 금잔디는엽신과기엽이성장후엽신이말리는현상이발현되었다. 도 6은신품종진지 ( 상 ) 와대조품종인금잔디 ( 하 ) 의 1회예초한후의생육상태를비교하여나타내는사진이다. 진지는여전히예초할필요가없이진한녹색인반면, 금잔디는옅은녹색을띠고있을뿐만아니라엽의성장속도가매우빠른것을알수있다. 도 7은신품종진지의포장생육상태를나타내는사진이다. 진지대부분 ( 상 ) 은화서가관찰되지않으나, 소수개체 ( 하 ) 는화서가맺히는생육주기를발현하여씨앗에의한번식도가능함을확인하였다. 도 8은신품종진지의포장생육상태를나타내는사진이다. 2013.11.14에촬영한것으로늦가을임에도불구하고잔디는짙은녹색을띠고있다. 도 9는진지 (1), 금잔디 (2) 및들잔디 (3) 잎에서추출된게놈 DNA의전기영동사진 (A) 및 Nanodrop 분광분석을이용한 DNA 분석그래프도 (B) 를나타낸것이다. 도 10은진지, 들잔디및금잔디를대상으로품종특이프라이머 (OPB-7, OPB-8, OPB-11) 를이용한 RAPD(Random amplified polymorphic DNA) 방법을통해유전적으로상이한특이적인밴드를관찰한결과를나타낸것이다. [0018] [0019] [0020] [0021] [0022] [0023] [0024] [0025] [0026] [0027] 발명을실시하기위한구체적인내용본발명의목적을달성하기위하여, 본발명은하기의형태적특징을가지며, 엽초와엽신에털이없고, 녹색유지기간이 12월초까지유지되고, 내습성이강하여하절기일 2회관수작업에도병변현상없이번식이왕성하게진행되고, 주요번식형태는지상포복경또는지하경으로영양번식이며, 또한씨앗의발아에의해서도번식하는잔디신품종진지 (Gin gi) 를제공한다 : (a) 식물체의길이 : 1~3 cm (b) 엽초길이 : 0.5~1.2 cm (c) 엽초색 : 진한녹색 RHS(Royal Horticultural Society) 134A (d) 엽신길이 : 1~3 cm (e) 엽신색 : 진한녹색 RHS(Royal Horticultural Society) 141A 및 (f) 지하포복경에서자라는뿌리의길이 : 30~50 cm. 본발명의잔디신품종진지는 2014년 7월 1일자로한국생명공학연구원에수탁번호 KCTC 12616BP로기탁되었다. 본발명의일구현예에따른신품종진지는광주광역시와전남인근지역에서선발한금잔디, 중지및들잔디를교잡시켜즉, 선발품종들을다발묽음으로혼합식재하는방식으로재배한것으로인위적인취사선택과자연적인교배가가능하도록하는방식으로교잡종을유도하고우수종자를선발해육종실험을통하여얻어진들잔디변이체를발굴하여육성하였다. 본발명의일구현예에따른신품종진지는, 지상포복경과지하경으로영양번식하고, 화서및씨는전반적으로맺히지않으나, 소수개체에서는화서및씨가봄부터늦가을까지맺히는생육주기를발현하여영양번식외에생육조건이맞으면온대지방에서도씨앗에의한번식도가능하였다. 또한당업계에주지되어있는조직배양 - 4 -
등에의해무성적으로반복생식시킬수있다. [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] 상기진지는광주광역시지역에서 12월초까지녹색을유지하여녹색유지기간이길고, 11월초까지지상포복경이성장하고, 내습성이강하여하절기일 2회관수작업에도병변현상없이번식이왕성하게진행되었다. 또한, 본발명의신품종진지는지상부식물체의높이가 3 cm 이상성장하지않아서잔디깎기를할필요가없고, 지상부식물체의녹색의착색정도가금잔디를대조품종으로비교하여확연하게구별될수있도록진한녹색 (RHS(Royal Horticultural Society) 141A) 으로발현되며, 엽초와엽신의털이관찰되지않고, 질감 (Textur e) 이높고, 튼튼하며, 엽신이단독포자로성장할때는기엽과 90 를유지하나밀도가높아져매트 (mat) 화진행시에는각도가좁아지고, 대조품종인금잔디는엽신과기엽이성장후엽신이말리는현상이발현되나출원품종은엽의가장자리만약간말리는현상이일부발현되고, 색도가계절의변화에따라진해지며, 지하포복경에서자라는뿌리의길이가 30~50 cm이었다. 본발명에있어서, 상기잔디신품종진지는서열번호 1의프라이머를사용하여 RAPD 분석하는경우 1.5kb 및 1.8kb의특이밴드를나타내지않고, 서열번호 2의프라이머를사용하여 RAPD 분석하는경우 1.3kb 및 2.2kb의특이밴드를나타내지않고, 서열번호 3의프라이머를사용하여 RAPD 분석하는경우 1.0kb 및 2.7kb의특이밴드를나타내지않는것을특징으로한다. 본발명의일구현예에따른 RAPD 결과는본발명의진지가다른잔디와유전적으로뚜렷이구별되는자료로이용될수있다. 상기 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 는 PCR-기초마커라고할수있는데, 이는게놈 DNA 상에서약 10-mer로구성된프라이머와일치된부분을 PCR에의해증폭하여분석하는마커다. 이는 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) 와는달리증폭된 DNA량이충분하여동위원소 (radioisotope) 혹은화학적표지 (chemically-labelled) 된프로브 (probe) 를필요로하지않고, 분리된젤상에에티듐브로마이드 (ethidium bromide) 를처리하여혼성화과정없이 DNA 변이를분석할수있다. [0033] 이하, 본발명을실시예에의해상세히설명한다. 단, 하기실시예는본발명을예시하는것일뿐, 본발명의 내용이하기실시예에한정되는것은아니다. [0034] [0035] < 실시예 1> 잔디신품종진지의육성과정및수집하기표 1에서기재한바와같이, 광주광역시와전남인근지역에서녹색의착색정도가강한잔디를선별하여신품종육성을하고자하였다. 개체의엽색이진한품종을수집한결과 5종의한국들잔디및 2종의금잔디를선발하여 2009년 7월부터 2012년 5월까지품종별로다발로묶어서혼합식재하고, 자연방임수분방법으로교잡종을유도하였다. 구체적으로 2009년도부터 10월초순경이되면매해 5종의들잔디와 2종의금잔디를세척후다발을형성하여실로묶은후에노지에식재하였던묶음다발을다시스치로폼박스에이식하고실내온실에서 4 월말까지재배하여잔디의휴면기를없앴다. 이렇게함으로써금잔디의화서와씨앗을관찰할수없다는한계를극복할수있었다. 방임수분의환경여건을인위적으로조성하여자연교잡이이루어질수있게한것으로한국들잔디및금잔디모두다실내에서는 3월이면동시기에화서출현및종자형성을관찰하였다. 이중키가작은자연교잡종을분리선발하여 2012년 5월부터계통육성하게되었으며상기자연교잡종의특성이일정하게유지됨을확인하였다. 이들잔디는광주광역시지역 ( 서구치평동 ) 에소재한포장에서영양번식의방법으로증식하였다. 표 1 [0036] 수집지역전라남도장성군북이면 전라남도장성군북하면 전라남도장성군삼서면 전라남도장성군삼계면 전라북도고창군고창읍 광주광역시치평동 수집기준 엽색이 RHS(Royal Horticultural Society) 134 보다진한잔디 총수집된잔디품종 7종 (5종의들잔디및 2종의금잔디 ) - 5 -
[0037] [0038] [0039] 2012년 ~2013년육성과정에서한차례도병충해에노출되지않았으며, 이형체가발현되지않고동일체만성장및번식하여안정성을확보하고있고, RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) 를통한신품종잔디진지의분자생물학적변이분석자료에서검증되는바와같이한국들잔디및금잔디와는확연하게차이를보이는것으로구별성을가지고있다. 그리고외관상균일성 ( 밀도, 색깔및잔디깎기높이등 ) 을유지하였다. 또한, 포장에서일일 2회관수하는포장과인위적으로관수하지않은포장모두생리장해는발생하지않았으나관수를한포장은 2배이상성장발육하였다. 내습성이강하여하절기일 2회관수작업에도병변현상없이번식이왕성하게진행되었다. 성장속도를높이기위해서는 4월말이후부터는인위적으로자주관수가필요하나동절기 (12월-3월말 ) 에는 1주일에 1회정도가적절한것으로확인되었다. 상기품종의특성조사및 DNA 마커개발을위하여얻어진종자, 즉진지를조직배양 ( 식물세포배양및캘러스 (callus)) 하여개체의특성발현연구과제를수행한후, 한국생명공학연구원에 2014년 7월 1일자로기탁하였다 ( 수탁번호 KCTC 12616BP). 잔디캘러스유도는다음과같은방법으로수행하였다. 확보한잔디시료를흐르는물에충분히세척한다음마디부분을가위로절단하였다. 절단된잔디시료를 10% 상업용락스용액에약 20분간흔들어주면서표면살균을실시하였다. 표면살균을마친잔디시료를멸균수로 3회세척하였다. 상기의잔디시료를무균작업대내에서멸균여과지를이용하여남아있는수분을제거한다음메스를이용하여약 5 mm 크기로절단하여배지에치상함으로써캘러스를유도하였다. 캘러스유도배지는 MS (Murashige & Skoog) 배지에 2,4-D 1 mg/l가첨가된배지를기본배지로사용하였다. 잔디마디절편을각배지에치상한다음약 1주간격으로캘러스형성여부를현미경하에서관찰하였다. 아울러잔디마디절편으로부터신초유도를위해마디절편을 MS (Murashige & Skoog) 배지에 BA가 1 mg/l 첨가된배지에배양을개시하였다. 각각의배양은 25-26 항온기에서암배양을실시하였다. 약 4주배양후 2,4-D가첨가된배지에배양중인잔디마디절편으로부터백색의세포괴가형성되었으며이후동일한배지에계대배양을통해캘러스를증식하였다 ( 도 1). [0040] [0041] < 실시예 2> 잔디신품종진지의형태적변이분석 상기실시예 1 에서선별된한국형들잔디의변이종인신품종진지와대조품종인금잔디의형태적인특성을포장 에서실험관찰하였으며, 그결과를하기표 2 및도 2 내지 8 에나타내었다. [0042] 표 2 신품종진지와대조품종간의형태적특징비교 특징 진지 대조품종 ( 금잔디 ) 비고 식물체길이 3 cm 이하 5~7 cm 짧음 어린식물의줄기형태 0.5~1 cm 1~3 cm 좁음 엽초길이 1.2 cm 이하 1.5 cm 이하 엽초색 green group 134A green group 134B 전남농업기술원의 RHS(Royal Horticultural Society) 챠트를이용하여측정 엽초입구털의밀도 관찰불가 약간드문형 엽신길이 3 cm 이하 3~10 cm 엽신너비 4 mm 이하 4 mm 이하 엽신녹색착색정도 green group 141A green group 134A 엽신표면털밀도 드문형 약간드문형 엽신이면털밀도 관찰불가 약간드문형 엽신기엽과의각도 좁음 중간 사진참조 기엽길이 3 cm 이하 3~10 cm 기엽너비 4 mm 이하 4 mm 이하 화서길이 2 cm 이하 화서너비 2 mm 이하 화경지면과의직립각도 직립 90 이삭길이 2 cm 이하 - 6 -
이삭수 10~16 성숙한이삭의안토시아닌착색정 RHS(Royal 도 Horticultural Society) 152c 미성숙한이삭의안토시아닌착색정도 RHS(Royal Horticultural Society) 150d 양성화수 10~16 수꽃수 10~16 암꽃수 10~16 약길이 5 mm 이하 약너비 5 mm 이하 수술대길이 5 mm 이하 암술길이 3 mm 이하 자방길이 1 mm 이하 열매형태 선형 [0043] 대조품종의화서및씨의자연관찰이불가하여상기의대조품종의일부데이타가누락됨. [0044] [0045] [0046] [0047] [0048] 본발명의신품종진지는지상부식물체의발아초기에는대조품종인금잔디와유사하나성숙한개체는들잔디및중지의외형적특성을발현하였다. 외관상제일유사한품종은금잔디로서, 이후금잔디, 들잔디, 중지를대상으로대조하였다. 조사결과, 진지는지상포복경과지하경으로영양번식하고, 지상부식물체의높이가 3cm 이상성장하지않아서잔디깎기를할필요가없고, 지상부식물체의녹색의착색정도가대조품종인금잔디와비교하여확연하게구별될수있도록진한녹색 (RHS(Royal Horticultural Society) 141A) 으로변하지않고일정함을확인하였다 ( 도 2 내지 8). 진지의경우에는엽초와엽신의털이관찰되지않고, 질감 (Texture) 이높고, 튼튼하며, 지하포복경에서자라는뿌리의길이가 30~50 cm인특징들이확인되었다 ( 표 2 및도 4). 도 5에서보이는바와같이진지의엽신이단독포자로성장할때는기엽과 90 를유지하나밀도가높아져매트 (mat) 화진행시에는각도가좁아지고, 대조품종인금잔디는엽신과기엽이성장후엽신이말리는현상이발현되나신품종은엽의가장자리만약간말리는현상이일부발현되었다. 또한, 진지는화서및씨가전반적으로맺히지않으나, 소수개체에서는화서및씨가봄부터늦가을까지맺히는생육주기를발현하여영양번식외에생육조건이맞으면온대지방에서도씨앗 (seed) 에의한번식도가능함을확인하였다 ( 도 7). 진지는색도가녹색기간이길고, 11월초까지지상포복경이성장하며, 색도가계절의변화에따라진해졌다 ( 도 8). [0049] [0050] < 실시예 3> 잔디신품종진지의게놈 DNA 추출진지, 들잔디및금잔디의잎을채취한후막자사발에액체질소를혼합하여분쇄하였다. 분쇄된잎은 1.5ml 튜브에옮기고 DNeasy Plant Mini kit(qiagen) 의프로토콜에의거해서 DNA을추출하였다. 간단히기재하면, 분쇄된잎에 400μl AP1 버퍼와 4μl RNase A 용액 (100mg/ml) 를주입하고혼합한후 65 배양기에서 10분동안방치하였다. 130μl P3 버퍼를주입하고얼음에서 5분동안배양한후, 14000rpm으로 5분동안원심분리하였다. QIAshredder Mini spin column에반응물을주입하고 14000rpm으로 2분동안원심분리하였다. 450μl용출액은 1.5ml 튜브에옮기며 675μl AW1 버퍼에첨가하고혼합하였다. 650μl혼합물을스핀컬럼에주입하여 8000rpm, 1 분동안원심분리후에용출액을버렸다. 스핀컬럼에분리된 DNA의세척을위해 500μl AW2 버퍼를주입하고 8000rpm, 1분동안원심분리하였다. 다시 14000rpm으로 2분동안원심분리하여스핀컬럼막을건조하였다. 스핀컬럼을 1.5ml 튜브에옮기고 100μl AE 버퍼에주입하여상온에서 5분동안방치한후 8000rpm으로원심분리하여게놈 DNA을추출하였다. 추출된게놈 DNA를 1.5%(w/v) 아가로스겔에로딩하여존재여부를확인하고 ( 도 9A), 그결과를표 3 및도 9B에보이는바와같이 Nanodrop 분광분석을이용하여게놈 DNA 피크가확인되었고, 이는정상적으로 DNA가추출되었음을의미한다. - 7 -
표 3 [0051] 연번 시료명 DNA 농도 (ng/ μl ) 260/280 260/230 추출된양 (ng) 1 진지 30.1 1.86 3.07 1505 2 금잔디 29.4 1.74 3.61 1470 3 들잔디 18.9 1.76 2.78 945 [0052] [0053] [0054] [0055] < 실시예 4> RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) 를통한신품종잔디진지분자생물학적변이분석대조군인들잔디, 금잔디와본발명의신품종진지를대상으로품종특이프라이머를이용한 RAPD 방법을통해진지의분자유전학적특징을규명하고자하였다. 상기실시예에서추출한게놈 DNA를 RAPD 분석을위한 PCR 주형으로서사용하였다. PCR은 Minicycler(MJ Research Inc.) 를사용하여추출한 DNA를증폭하였다. PCR 반응액은 10ng DNA, 2uM 프라이머, 2x Multiplex PCR Master Mix 버퍼및 Q-Solution 용액을혼합하여반응양은 25μl로조정하였다. PCR 반응조건은 95 (5분 ), [95 (1분), 38 (1분 30초 ), 72 (2분 ), 45cycle], 68 (10분 ) 이었다. 5μl PCR 반응산물과 1μl Gelstar 핵산염색액을혼합한뒤에 1x TAE가포함된 1.5%(w/v) 아가로스겔에 50 볼트로 3시간전기영동한후 Gel document 시스템 (Vilber) 으로증폭된 DNA을촬영했다. 상기 PCR에는한국잔디학회지제24권제2호 ( 최준수, 2010) 논문을근거로하여 OPB-07(5'-GGTGACGCAG-3'; 서열번호 1), OPB-08(5'-GTCCACACGG-3'; 서열번호 2) 및 OPB-11(5'-GTAGACCCGT-3'; 서열번호 3) 를프라이머 (Bioneer) 로선별하여사용하였다. 잔디신품종진지의 RAPD PCR 결과는하기의표 4 및도 10에요약하였다. OPB-07를이용한분석결과에서진지는금잔디와들잔디에비해 "b, c" 가관찰되지않았다. OPB-08를이용한분석결과에서진지는금잔디와들잔디에비해 "b, c" 가관찰되지않았다. OPB-11를이용한분석결과에서진지잔디는금잔디와들잔디에비해 "a, d" 가관찰되지않았다. 종합적으로 OPB-07, OPB-08 및 OPB-11를사용하여분석할경우진지는금잔디및들잔디와다른게놈 DNA 유형으로관찰되어신품종인것으로확인되었다. 표 4 [0056] 신품종진지의 RAPD 분석결과얻은다형성밴드의데이타 잔디종 OPB-7 OPB-8 OPB-11 a b c a b c a b c d 진지 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 금잔디 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 들잔디 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 [0057] 1 은밴드존재, 0 은밴드존재하지않음. 수탁번호 [0058] 기탁기관명 : 한국생명공학연구원 수탁번호 : KCTC12616BP 수탁일자 : 20140701-8 -
도면 도면 1 도면 2-9 -
도면 3 도면 4-10 -
도면 5 도면 6-11 -
도면 7 도면 8-12 -
도면 9 도면 10 서열목록 <110> Zoysia Gingi limited liability company <120> Zoysia japonica Steud Gin gi <130> PN14128 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> OPB-07 primer <400> 1 ggtgacgcag 10 <210> 2-13 -
<211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> OPB-08 primer <400> 2 gtccacacgg 10 <210> 3 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> OPB-11 primer <400> 3 gtagacccgt 10-14 -