(72) 발명자 김종화 강원도춘천시서부대성로 327, 104 동 902 호 ( 후평동, 동아아파트 ) 박경철 강원도춘천시퇴계동한주아파트 호 손재한 강원도동해시망상 2 길 ( 망상동 ) 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 C

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수진 왕
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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C12N 15/11 ( ) C12Q 1/68 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2011 년 01 월 06 일 심사청구일자 전체청구항수 : 총 7 항 2011 년 01 월 06 일 (11) 공개번호 (43) 공개일자 2012 년 07 월 16 일 (71) 출원인 강원대학교산학협력단 강원도춘천시강원대학길 1 ( 효자동 ) (72) 발명자 이성일 강원도춘천시영서로 2169, 이안아파트 105 동 1602 호 ( 퇴계동 ) 김남수 강원도춘천시동내면춘천순환로 93, 성우오스타아파트 105 동 902 호 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 이희숙 (54) 발명의명칭나리속나팔나리절식물의품종또는육성계통판별을위한 SSR 프라이머및이의용도 (57) 요약 본발명은나리속나팔나리절식물의품종또는육성계통판별을위한 SSR 프라이머및이의용도에관한것으로서, 보다상세하게는서열번호 1 내지서열번호 34 로이루어진군에서선택되는 2 개의염기서열을갖는 SSR 프라이머쌍및이를이용하여 PCR 을수행하는것을포함하는나리속나팔나리절식물의품종또는육성계통판별을위한 SSR 프라이머및이를이용한품종또는육성계통판별방법에관한것이다. 본발명에따른 SSR 프라이머는백합속나팔나리절품종및육성계통식물식물의 DNA 프로파일을작성하는데매우유용하게이용될수있다. 이를통해나리유전자원을효율적으로평가함으로써신규유전자원도입시기존보유자원과의중복성분석및신규성확립을효과적으로수행할수있다. 또한, 본발명에따른 SSR 프라이머는백합속나팔나리절품종및육성계통식물의 DNA 다형성을효과적으로검출할수있으며, 이를통하여나리의품종을판별할수있다. 대표도 - 도 1-1 -

2 (72) 발명자 김종화 강원도춘천시서부대성로 327, 104 동 902 호 ( 후평동, 동아아파트 ) 박경철 강원도춘천시퇴계동한주아파트 호 손재한 강원도동해시망상 2 길 ( 망상동 ) 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 C 부처명 강원도농업기술원 연구사업명 특화작목연구개발과제 연구과제명 신나팔독창성부여마커개발 주관기관 강원대학교산학협력단 연구기간 ~

3 특허청구의범위 청구항 1 서열번호 1 내지서열번호 34 로이루어진군에서선택되는 2 개의염기서열을갖는 SSR 프라이머쌍. 청구항 2 제1항에있어서, 서열번호 1과 2로표시되는프라이머쌍 ; 서열번호 3과 4로표시되는프라이머쌍 ; 서열번호 5 와 6으로표시되는프라이머쌍 ; 서열번호 7과 8로표시되는프라이머쌍 ; 서열번호 9와 10으로표시되는프라이머쌍 ; 서열번호 11과 12로표시되는프라이머쌍 ; 서열번호 13과 14로표시되는프라이머쌍 ; 서열번호 15와 16으로표시되는프라이머쌍 ; 서열번호 17과 18로표시되는프라이머쌍 ; 서열번호 19와 20으로표시되는프라이머쌍 ; 서열번호 21와 22로표시되는프라이머쌍 ; 서열번호 23과 24로표시되는프라이머쌍 ; 서열번호 25와 26으로표시되는프라이머쌍 ; 서열번호 27와 28로표시되는프라이머쌍 ; 서열번호 29와 30으로표시되는프라이머쌍 ; 서열번호 31와 32로표시되는프라이머쌍및서열번호 33와 34로표시되는프라이머쌍으로이루어진군에서선택되는 SSR 프라이머쌍. 청구항 3 제 1 항또는제 2 항에있어서, 상기 SSR 프라이머쌍은나리속나팔나리절품종또는육성계통식물을동정하는 것임을특징으로하는 SSR 프라이머쌍. 청구항 4 (a) 분석하고자하는나리속식물로부터게놈 DNA를추출하는단계 ; (b) 추출된게놈 DNA를주형으로하고제1항또는제2항의 SSR 프라이머쌍을이용하여 PCR을수행하는단계 ; 및 (c) PCR 산물을크기별로분리하는단계를포함하는나리속나팔나리절품종또는육성계통식물의 DNA 다형성검출방법. 청구항 5 (a) 나리및대조군나리품종으로부터게놈 DNA를추출하는단계 ; (b) 추출된각게놈 DNA를주형으로하고제1항의 SSR 프라이머쌍을이용하여 PCR을수행하는단계 ; (c) 각 PCR 산물을크기별로분리하는단계 ; 및 (d) 상기나리및대조군나리품종의크기별분리결과를비교하는단계를포함하는나리속나팔나리절품종또는육성계통의동정방법. 청구항 6 제 1 항또는제 2 항의 SSR 프라이머쌍, DNA 중합효소및 PCR 반응완충용액을포함하는나리속식물의 DNA 다 형성검출용키트. 청구항 7-3 -

4 제 1 항또는제 2 항의 SSR 프라이머쌍을포함하는나리속나팔나리절품종또는육성계통동정용키트. 명세서 [0001] 기술분야본발명은나리속나팔나리절식물의품종또는육성계통판별을위한 SSR프라이머및이의용도에관한것으로서, 보다상세하게는서열번호 1 내지서열번호 34로이루어진군에서선택되는 2개의염기서열을갖는 SSR 프라이머쌍및이를이용하여 PCR을수행하는것을포함하는나리속나팔나리절식물의품종또는육성계통판별을위한 SSR프라이머및이를이용한품종또는육성계통판별방법에관한것이다. [0002] 배경기술육종에이용되고있는대부분의주요작물및소재배작물에서해마다많은양의유전자원이수집되고있다. 그러나, 이에반해유전자원에대한평가는충분히이루어지지않고있는실정이다. 수집된유전자원의종간및아종간품종의신속한판별은정확한유전자원의관리및보호를위하여매우중요하다. 또한품종의판별과함께유전자원의유형형질탐색과분류, 그리고유연관계의규명은유전자원의보존이나신품종의창출및작물의개량에있어서매우중요하다. [0003] 최근분자생물학의급속한발전으로핵산 (DNA) 수준에서유전자원의다양성 (bio-diversity) 연구를가능케하는핵산지문분석방법및다양한 DNA 마커들이개발되었다. 이를통해유용형질탐색, 생물의종판별, 품종분류 / 동정및집단개체군의유연관계분석을외부환경등에대하여거의영향을받지않고간단하고신속하게수행할수있게되었다. 지금까지개발된 PCR(polymerase chain reaction) 을이용한핵산지문법 (fingerprinting) 에는 RAPD(randomly amplified polymorphic DNAs) 방법, AFLP(amplified fragment length polymorphic DNA) 방법, SSR(simple sequence repeat) 방법등이있다. 상기방법중 RAPD 방법은비특이적 PCR 산물이증폭되므로재현성이떨어지는단점이있고, AFLP 방법은높은 DNA 다형성검출로각광받고있지만재현성이떨어지는밴드의출현과분석이복잡하다는단점이있다. 이에반해, SSR 방법은 DNA 반복배열인초위성체 (microsatellite) 영역의염기배열정보를근거로 PCR 프라이머를제작하여이용하는방법으로서, 초위성체분석이용이하고높은재현성을가지는장점으로인하여생물종의동정에자주사용되고있다. 특히 SSR 방법은외부환경의영향을전혀받지않는다는장점이있다. 이와같은 SSR 방법의우수성으로인해여러주요작물및소재배작물에서 SSR 마커를개발하려는연구가한창진행중에있다. [0004] 벼에서는벼게놈에반복되는 SSR을 PCR 기술로증폭하여벼품종의유전자형을동정하는초위성체마커들이개발되었다 ( 특허출원번호제 호 ). 미국의탕 (Tang) 박사팀은 879개의 SSR 마커들을개발한해바라기의유전자지도를발표한바있다 (Tang et al., Theor. Appl. Genet., 105: , 2002). 이외에도보리, 콩, 율무, 매실, 귤, 인삼, 생강, 아마란스, 잔디, 조, 녹두, 기장, 옥수수, 메밀, 팥, 다래, 구기자, 버섯, 마늘, 참깨, 들깨등많은식물에서 SSR 마커들이개발되었다. 그러나, 나리 ( 백합 ) 에대한 SSR 마커가전혀개발된바없다. [0005] 나리 ( 백합 ) 는식물학적으로현화식물 (Phanerogamae), 피자식물아문 (Angiospermae), 단자엽식물강 (Monocotyledonea), 나리과군 (Liliales), 나리과 (Liliaceae), 나리속 (Lilium) 에속하는내한성추식구근이며, 2배체 (2n) 또는 3배체 (3n) 로서체세포염색체수는 24 또는 36이다. 나리는북반구온대지역에 130 여종이자생하고있는데, 이중 71종이아시아에, 22종이유럽및유라시아에, 그밖에 37종이북미대륙에분포되어있는것으로알려져있으며변종을합치면모두 600여종에달하고원예품종은 4,000종에이를정도로많다 ( 허북구, 한용희, 이순봉, 김삼곤 나리 ( 백합 ) 재배의실제와이론 ). [0006] 나리속에관한분류는 1754 년 Linne 에의해처음으로구분되었으며그당시에는 Lilium candidum, L. bulbiferum, L. pomponium, L. chalcedonicum, L. martagon, L. canadence, L. camtschatcence 등 7 종만이 - 4 -

5 포함되었으나, 그후많은종의나리가추가로발견되어현재에는 130여종의나리원종이나리속에포함된다. 윌슨은화서, 꽃의형태잎의모양및인경등을기초로하여나팔나리아속 (Leucolirion; 통상화측향또는하향, 상향개화 ), 산나리아속 (Archelirion; 누두화상향개화, 측향개화 ), 틈나리아속 (Pseudolirion; 배상화상향개화 ), 말나리아속 (Marathon; 종종상화하향개화 ) 등 4가지아속으로분류하였다 (Wilson EH The lilies of Eastern Asia: A Monograph. Dulau & Company, LTD. London). 콤버는각종 (Species) 의화형, 지리적인분포, 구근의모양, 잎의부착모양, 종자의발아습성, 발육과정등을고려하여원종을구분하였는데 (Comber HF A New classification of the genus Lilium. R. H. S. Lily Yearbook 15:86-105) 이러한분류는몇몇종에서는분류상다소의문이가는것도있지만원종의유사성및교배친화성측면에서는윌슨의분류법보다타당성이높아폭넓게이용되고있다. 이후원종간의교잡이진행되어다수의원예품종이육성되어, 원예학적분류가필요하게되면서, 1967년영국왕립원예학회 (RHS; Royal Horiticultural Society) 에서발행한 The International Lily Register 에의한분류법이보편적으로사용되고있다. 이분류법은교잡친화성에따라아시아계 (Asiatic group), 말타곤계 (Martagon group or Turk s Cap group), 캔디듐계 (Candidum group), 아메리칸계 (American group), 나팔나리계 (Longiflorum group), 트럼펫계 (Trumpet group), 오리엔탈계 (Oriental group) 등 7계이고, 이중에동서양을막론하고절화, 분화, 화단용등상업적으로많이이용되고있는것은아시아틱계, 나팔나리계, 오리엔탈계등이다. 이후 Oriental hybrids, 기타나머지종을한계로하여 2가지절을새로추가원예품종들을 8개의계로분류, 현재까지이용되고있다 (McRae, E, A Lilies. Timber Press, Portland). [0007] 이와같이나리는북반구온대에약 70종이자생하고있고, 우리나라에는약 11종이분포하고있어서한국은나리의자생국이라할수있다. 하지만우리나라자생나리에대한연구로는일부종류의재배와번식학적인면에서약간의연구가있을뿐유전적다양성에대해서는그실적이매우미흡한실정이다 ( 정적학, 김기선, 염도의, 홍영표 한국자생나리의분포및생태, 형태학적특성에관한연구 ). DNA 마커는품종의유전적특성을본질적으로반영할뿐만아니라생물체의보편적특성으로서전작물에대하여개발및적용이가능하며이론적으로거의무한대의마커를확보하여품종특성화할수있다는측면에서그이상성을발견할수있다. 더욱이 DNA 마커를품종식별목적으로사용할경우품종및품종간구별성을계량화하여정의할수있으며환경의영향을받지않고품종구별성에대한기여도가동일하여구별성정의에왜곡이없는등활용도가매우높다고할수있다 ( 박성환, 다카라코리아. Microsatellite marker를이용한품종판별 Life Science & Biotechnology 14-15p). 백합은전세계적으로매우중요한화훼작물로우리나라에서는세번째로많이생산되고있다. 우리나라자생나리는백합원예품종육성의중요모본으로활용되어왔으며지금도많은국가에서이용되고있다. 특히 Longiflorum 절의품종들은흰색의백합을대표하는그룹으로많은종과품종이육성되어왔다. Longiflorum 절에는 Lilium logiflorum, L. formosanum, L. philippinense등이대표종이고이들을이용하여육성된대표적인품종들은 Gelria', 'Augusta', 'White american', 'Julius', August', 'Stuyava', Raizan Herald', 'Adelina, Hinomoto' 등이있으나이들품종간구별을위한분자마커는아직개발된적이없다. [0008] 이들중요품종들의고유한마커개발은새롭게육성되는품종들에대한고유특성을부여할수있는근거로활용될수있기때문에매우중요하다고할수있다. 따라서원예학적측면에서만연구되었던나리를분자유전학측면에서연구하고, SSR마커를개발하여나리품종또는계통들간의유전적유사성과다양성을분석하고자연구가지속적으로요구되어왔다. [0009] 본명세서전체에걸쳐다수의논문및특허문헌이참조되고그인용이표시되어있다. 인용된논문및특허 문헌의개시내용은그전체로서본명세서에참조로삽입되어본발명이속하는기술분야의수준및본발 명의내용이보다명확하게설명된다. 발명의내용 [0010] 해결하려는과제이에본발명자들은나리의유전자원을효율적으로평가할수있는 SSR 마커를개발하기위하여연구를거듭하던중, 백합속 Longiflorum 절의품종및계통들에서다형성변이를많이나타내는 SSR 프라이머쌍을개발 - 5 -

6 함으로써본발명을완성하였다. [0011] 따라서, 본발명의목적은백합속 Longiflorum 절의품종및육성계통을효율적으로평가할수있는 SSR 마커 및이의용도를제공하는것이다. [0012] [0013] [0014] [0015] [0016] 과제의해결수단상기와같은목적을달성하기위하여, 본발명은서열번호 1 내지서열번호 34로이루어진군에서선택되는 2 개의염기서열을갖는 SSR 프라이머쌍을제공한다. 본발명의다른목적을달성하기위하여, 본발명은 (a) 분석하고자하는나리속식물로부터게놈 DNA를추출하는단계 ; (b) 추출된게놈 DNA를주형으로하고본발명의 SSR 프라이머쌍을이용하여 PCR을수행하는단계 ; 및 (c) PCR 산물을크기별로분리하는단계를포함하는나리속나팔나리절의품종및육성계통식물의 DNA 다형성검출방법을제공한다. 본발명의또다른목적을달성하기위하여, 본발명은 (a) 나리및대조군나리품종으로부터게놈 DNA를추출하는단계 ; (b) 추출된각게놈 DNA를주형으로하고본발명의 SSR 프라이머쌍을이용하여 PCR을수행하는단계 ; (c) 각 PCR 산물을크기별로분리하는단계 ; 및 (d) 상기나리및대조군나리품종의크기별분리결과를비교하는단계를포함하는나리속나팔나리절품종또는육성계통의동정방법을제공한다. 본발명의또다른목적을달성하기위하여, 본발명은본발명의 SSR 프라이머쌍, DNA 중합효소및 PCR 반응완충용액을포함하는나리속식물의 DNA 다형성검출용키트를제공한다. 본발명의또다른목적을달성하기위하여, 본발명은본발명의 SSR 프라이머쌍을포함하는나리속나팔나리절품종또는육성계통동정용키트를제공한다. [0017] 이하, 본발명을상세히설명한다. [0018] 본발명은나리속 (Lilium spp.) 나팔나리절 (Longiflorum section) 식물의유전적다양성을특이적으로분석 할수있는 SSR 마커를제공한다는점에특징이있다. 본발명에서는 AFLP 와한방향 (one way) PCR 을결합시 킨새로운방법으로나리속식물로부터 SSR 마커를개발하였다. [0019] 본발명에서제공하는 SSR 마커는 PCR 프라이머쌍을말하며, 정방향프라이머와역방향프라이머를포함한다. 본발명에서제공되는 SSR 프라이머쌍은서열번호 1 내지서열번호 34로이루어진군에서선택되는 2개의염기서열을가진다. 바람직하게는 L37( 서열번호 1과 2로표시되는프라이머쌍 ), L49( 서열번호 3과 4로표시되는프라이머쌍 ), L50( 서열번호 5와 6으로표시되는프라이머쌍 ), L67( 서열번호 7과 8로표시되는프라이머쌍 ), L75( 서열번호 9와 10으로표시되는프라이머쌍 ), el40( 서열번호 11과 12로표시되는프라이머쌍 ), el42( 서열번호 13과 14로표시되는프라이머쌍 ), el58( 서열번호 15와 16으로표시되는프라이머쌍 ), el61( 서열번호 17 과 18로표시되는프라이머쌍 ), el64( 서열번호 19와 20으로표시되는프라이머쌍 ), el65( 서열번호 21와 22로표시되는프라이머쌍 ), el68( 서열번호 23과 24로표시되는프라이머쌍 ), AAG37( 서열번호 25와 26으로표시되는프라이머쌍 ), AAC44( 서열번호 27와 28로표시되는프라이머쌍 ), AGC43( 서열번호 29와 30으로표시되는프라이머쌍 ), f5( 서열번호 31와 32로표시되는프라이머쌍 ) 및 f10( 서열번호 33와 34로표시되는프라이머쌍 ) 으로이루어진군에서선택된다. [0020] 본발명의프라이머세트는바람직하게는상기 17개의 SSR 프라이머세트로이루어진군으로부터선택되는 1 개이상, 2개이상, 3개이상, 4개이상, 5개이상, 6개이상, 7개이상, 8개이상, 9개이상, 10개이상, 11 개이상, 12개이상, 13개이상, 14개이상, 15개이상, 16개이상또는 17개이상의 SSR 프라이머세트를포함하며, 가장바람직하게는 30개의 SSR 프라이머세트를동시에이용할수있다. 17개의 SSR 프라이머세트를동시에이용하면다른나리품종으로부터나리품종을더욱효율적으로구분할수있다

7 [0021] 본발명에있어서, " 프라이머 " 는카피하려는핵산가닥에상보적인단일가닥올리고뉴클레오티드서열을말하며, 프라이머연장산물의합성을위한개시점으로서작용할수있다. 상기프라이머의길이및서열은연장산물의합성을시작하도록허용해야한다. 프라이머의구체적인길이및서열은요구되는 DNA 또는 RNA 표적의복합도 (complexity) 뿐만아니라온도및이온강도와같은프라이머이용조건에의존할것이다. [0022] 본발명에서제공되는프라이머쌍및이들에의해증폭되는초위성체에존재하는반복모티브 (repeat motif), 증폭되는초위성체의크기및초위성체가존재하는염색체대립인자에대한정보를하기표 2 에기재하였다. [0023] 본발명에서제공되는 SSR 프라이머쌍은나리속식물에서 DNA 다형성을검출하고유전적다양성을분석하는데유용하게사용될수있다. 본발명에따른 SSR 프라이머를이용하여나리속나팔나리절품종또는육성계통식물을동정할수있으므로나리속식물의유전자원을효율적으로평가및보존할수있다. 따라서본발명은상기 SSR 프라이머쌍을이용하여 PCR을수행하는것을포함하는나리속나팔나리절의품종및육성계통식물의 DNA 다형성검출방법을제공한다. [0024] [0025] [0026] [0027] 구체적으로본발명의방법은 (a) 분석하고자하는나리속식물로부터게놈 DNA를추출하는단계 ; (b) 추출된게놈 DNA를주형으로하고본발명에서제공하는 SSR 프라이머쌍을이용하여 PCR을수행하는단계 ; 및 (c) PCR 산물을크기별로분리하는단계를포함한다. [0028] [0029] 상기 (a) 단계에서게놈 DNA의추출은당업계에서통상적으로사용되는페놀 / 클로로포름추출법또는 SDS 추출법 (Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: , 1990) CTAB 분리법 (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., , 1980) 또는상업적으로판매되는 DNA 추출키트를이용하여수행할수있다. 아울러, 본발명에서나리속식물은바람직하게는나리속나팔나리절식물일수있으나, 샘플식물이나팔나리절식물에속하는지판단이필요할경우도있으므로이에제한되지는않는다. [0030] 또한상기 (b) 단계에서 PCR은 PCR 반응에필요한당업계에공지된여러성분을포함하는 PCR 반응혼합액을이용하여수행될수있다. 상기 PCR 반응혼합액에는분석하고자하는나리속식물, 특히나리속나팔나리절식물에서추출된게놈 DNA와본발명에서제공되는 SSR 프라이머쌍이외에적당량의 DNA 중합효소, dntp, PCR 완충용액및물 (dh 2 O) 을포함한다. 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl 2, KCl 등을포함한다. 이때 MgCl 2 농도는증폭의특이성과수량에크게영향을준다. 바람직하게는 mm의범위로사용될수있다. 일반적으로 Mg 2+ 가과량인경우는비특이적인 PCR 증폭산물이증가하고, Mg 2+ 가부족한경우 PCR 산물의산출율이감소한다. 상기 PCR 완충용액에는적당량의 Triton X-100이추가로포함될수도있다. 또한 PCR은 에서주형 DNA를전변성시킨후, 변성 (denaturation); 결합 (annealing); 및증폭 (extension) 의사이클을거친후, 최종적으로 72 에서연장 (elongation) 시키는일반적인 PCR 반응조건에서수행될수있다. 상기에서변성및증폭은 및 72 에서각각수행될수있으며, 결합시의온도는프라이머의종류에따라달라질수있다. 바람직하게는 이며, 보다바람직하게는 55 이다. 각단계의시간과싸이클수는당업계에일반적으로행해지는조건에따라정해질수있다. 본발명에따른 SSR 프라이머쌍을이용한 PCR 수행시의최적의반응조건은다음과같다 : 95 에서 2분간주형 DNA를전변성시킨후, 95 에서 30초 ; 55 에서 30 초 ; 및 72 에서 1분을 35 싸이클반복수행한후, 최종적으로 72 에서 5분간반응시킨다

8 [0031] PCR 증폭결과는아가로스겔 (agarose gel), 폴리아크릴아미드겔 (polyacrylamide gel) 전기영동또는형광분석장치 (ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram) 에의해크기별로분리하여확인할수있다 ( 상기 (c) 단계 ). 이때, 형광분석장치를이용하기위해서는당업계에공지된형광다이 (dye) 를붙인프라이머쌍을이용하여상기 (b) 단계에서 PCR을수행한다. 바람직하게는폴리아크릴아미드겔전기영동, 보다바람직하게는변성폴리아크릴아미드겔전기영동에의해확인할수있다. 전기영동후실버염색 (silver staining) 으로전기영동결과를분석할수있다. 일반적인 PCR 수행및그결과분석방법에대해서는당업계에잘알려져있다. [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] 아울러, 본발명은상기 SSR 프라이머쌍을이용하여 PCR을수행하는것을포함하는나리속나팔나리절품종또는육성계통의품종동정방법을제공한다. 구체적으로본발명의품종동정방법은 (a) 나리및대조군나리품종또는계통으로부터게놈 DNA를추출하는단계 ; (b) 추출된각게놈 DNA를주형으로하고본발명에서제공하는 SSR 프라이머쌍을이용하여 PCR을수행하는단계 ; (c) 각 PCR 산물을크기별로분리하는단계 ; 및 (d) 상기 (c) 단계의각각의크기별분리결과를서로비교하는단계를포함한다. [0038] (a) 내지 (c) 단계의게놈 DNA 추출, PCR 수행및 PCR 산물의크기별분리는상기에서기재한바와같으며, 상기 (d) 단계에서나리및대조군나리품종또는계통에대한비교는동일한조합의 SSR 프라이머쌍에대한시료가되는나리와대조군나리품종또는계통의각각의 PCR 산물의크기를서로비교하는방법으로수행된다. 각 SSR 프라이머쌍에대한크기비교결과를종합하여시료가되는나리와대조군나리품종또는계통의결과와모두일치하면시료가되는나리는대조군나리품종또는계통과동일한품종으로동정할수있다. 이와같은품종또는계통의동정방법은신규유전자원도입시중복여부판단및원산지확인을통한원산지표시위반여부의판정등품종또는계통의동정이필요한경우에유용하게이용될수있다. [0039] 대조군나리품종또는계통에대한게놈 DNA 추출, PCR 수행및 PCR 산물의크기별분리는시료가되는나리와동시에수행될수도있으나, 시료가되는나리보다이전에수행되어동정의기준표 (reference) 로작성될수도있다. 이러한기준표를이용하면시료가되는나리에대한게놈 DNA 추출, PCR 수행및 PCR 산물의크기별분리만을수행하여기준표와비교할수있어유용하게이용할수있다. [0040] 또한본발명은본발명에따른 SSR 프라이머쌍, DNA 중합효소및 PCR 반응완충용액을포함하는나리속식 물의 DNA 다형성검출용키트를제공한다. 상기에서 PCR 반응완충용액의조성은상기에서기재한바와같다. [0041] 이외에 PCR 산물의증폭여부를확인할수있는전기영동수행에필요한구성성분들이본발명의키트에추가 로포함될수있다. [0042] 또한, 본발명은본발명에따른 SSR 프라이머쌍을포함하는나리속나팔나리절품종또는육성계통동정용키트를제공한다. 품종동정방법은상기에서기재한바와같다. 이외에 PCR 반응을용이하게수행할수있기위해 DNA 중합효소및상기에서기재한조성의 PCR 반응완충용액을추가로포함될수있으며, PCR 산물의증폭여부를확인할수있는전기영동수행에필요한구성성분또는공지된품종또는계통에대한동정기준표들이본발명의키트에추가로포함될수있다. [0043] 본발명에적용될수있는백합속나팔나리절의품종및육성계통은 Lilium formosanum 'TA13', Lilium - 8 -

9 longiflorum 'Gelria', Lilium longiflorum 'White American', Lilium formologi 'Julius', Lilium formologi White Horn', Lilium formologi 'August', Lilium formologi 'Stuyava', Lilium formologi 'Raizan Herald', Lilium longiflorum 'Adelina', Lilium longiflorum 'Hinomoto', [Fu/Jin] /Adel/WHF1/RH, [Jin/WA]/AF1/ RH, [Jin/WA]/AF1, [Jin/Hin]/RH, [Jin/WA]/AF1 /RH /RH, [Jin/WA] /RH /RH, [RH/WA]/Adel/RH, [RH/WA]/AF1, [RH/WA]/A del/rh, [Jin/WA]/RH, Adel/AF1, AF1/ Adel, 어라연1호, 어라연2호, 어라연3호또는영월조생일수있다. [0044] 발명의효과따라서, 본발명에따른 SSR 프라이머는백합속나팔나리절품종및육성계통식물의 DNA 프로파일을작성하는데매우유용하게이용될수있다. 이를통해나리유전자원을효율적으로평가함으로써신규유전자원도입시기존보유자원과의중복성분석및신규성확립을효과적으로수행할수있다. 또한, 본발명에따른 SSR 프라이머는나리속식물의 DNA 다형성을효과적으로검출할수있으며, 이를통하여나리의품종을판별할수있다. [0045] 도면의간단한설명 도 1 은본발명의 SSR 프라이머를이용한백합속나팔나리절품종및육성계통식물식물에서의 SSR 프로파일 을나타낸다. 도 2는본발명의 SSR 프라이머를이용한백합속나팔나리절품종및육성계통식물식물에서의 SSR 프로파일을나타낸다. 도 3은본발명의 SSR 프라이머를이용한백합속나팔나리절품종및육성계통식물식물에서의 SSR 프로파일을나타낸다. 도 4는 SSR 마커에기초한백합속나팔나리절품종및육성계통식물식물의계통도를나타낸다. [0046] [0047] [0048] [0049] [0050] 발명을실시하기위한구체적인내용이하. 본발명을실시예에의해상세히설명한다. 단, 하기실시예는본발명을예시하는것일뿐, 본발명의내용이하기실시예에한정되는것은아니다. < 실험방법 > 1. 실험재료실험에사용된나리들은강원대학교에서제작한개체 47종의개체를사용하였다 ( 표 1 참조 ). [0051] 표 1 사용한나리샘플 순번 레인 분류 명칭 1 1 Cultivar Lilium formosanum 'TA13' 2 2 Cultivar Lilium longiflorum 'Gelria' 3 3 Cultivar Lilium longiflorum 'White American' 4 4 Cultivar Lilium formologi 'Julius' 5 5 Cultivar Lilium formologi White Horn' 6 6 Cultivar Lilium formologi 'August' 7 7 Cultivar Lilium formologi 'Stuyava' 8 8 Cultivar Lilium formologi 'Raizan Herald' 9 9 Cultivar Lilium longiflorum 'Adelina' Cultivar Lilium longiflorum 'Hinomoto' 11 11~20 육성계통 [Fu/Jin] /Adel/WHF1/RH (10 sample) 12 21~30 육성계통 [Jin/WA]/AF1/ RH (10 sample) - 9 -

10 13 31~34 육성계통 [Jin/WA]/AF1 (4 sample) 육성계통 [Jin/Hin]/RH 육성계통 [Jin/WA]/AF1 /RH /RH 육성계통 [Jin/WA] /RH /RH 육성계통 [RH/WA]/Adel/RH 육성계통 [RH/WA]/AF 육성계통 [RH/WA]/A del/rh 육성계통 [Jin/WA]/RH 육성계통 Adel/AF 육성계통 AF1/ Adel Cultivar 어라연1호 Cultivar 어라연2호 육성계통 어라연3호 육성계통 영월조생 [0052] [0053] 2. DNA 추출 (extraction) 식물체의게놈 DNA 추출 (Genomic extraction) 은어린잎을채취하여마쇄후상용의키트 (QiAGEN. DNeasy plant Maxi kit) 를이용하여제조사의지침에따라서 large prep을하였다. 추출한 DNA는 1% 아가로스겔 (agarose gel) 에서전기영동하여정량분석을하였다. [0054] [0055] 3. EST-SSR (Simple Sequence Repeats) 마커의개발및프라이머디자인전체 3329개의 Lilium EST-sequecnes중 Longiflorum, Fomosanum, Reagale, Hybrid에서 repeat motif를가지는 EST-sequence 선별하였다. Repeat motif를가진 EST-sequecne를선별하고 ARGOS program을이용하여 166개의 EST-SSR Primer를제작하였다 (L, el primer). 또한 SSR 모티프유전자도서관에서임의적으로 560개의 white 콜로니를선발하여각 clone의염기서열을결정하였고, 확보한 560개의염기서열중 532개는중복되지않은단일염기서열이었으며그중 170개의서열에는 SSR motif를가지고있는것으로확인되었다. 이중 140개의 primer를제작하였고 (AAG37, AAC44, AGC43) 나리의 fosmid 유전자도서관에서 15개의 fosmid SSR primer 15set(f primer) 을제작하였다 (Table 2). [0056] [0057] 4. SSR(Simple Sequence Repeats) 분석 PCR 증폭은정량분석된 DNA 3μl에, 5 μm primer pair, 10X buffer, 2.5mM dntps, 5U/ μl i-starmax II Taq DNApolymerase (intron, Korea) 를첨가하여 25μl volume으로하였고, PCR 반응조건은 95, 2분간전변성 ; 95 30초, 55 30초, 72 1분을 1cycle로하여 35cycle; 및 72 5분의연장반응으로하였다. 증폭된 PCR 산물을확인하기위하여 5μl를전기영동로딩버퍼 (electrophoresis loading buffer; 98% formamide, 0.02% BPB, 0.02% Xylene, and 5mM NaOH) 5μl (1:1) 로섞어주어 6% 폴리아크릴아마이드겔 (polyacrylamide gel) 에서 120분간전기영동 (PAGE) 후실버-스태이닝 (silver-staining) 으로결과물을확인하였다. [0058] [0059] [0060] < 실험결과 > 1. EST-SSR 분석나리에서알려진 EST 서열중에서 SSR 모티프를가지고있는것으로부터전체 166개의 SSR 프라이머를디자인하였다. 나리 SSR motif 유전자도서관에서임의적으로선별한 560개의 colony중 170개의서열에서 SSR motif 를가진것으로확인이중 140개의 SSR primer를디자인하였으며, 나리의 fosmid 유전자도서관을통해 15개의 fosmid ssr primer를제작하였다. 총 321개의 SSR primer set을 10종의 cultivar plant를이용하여 survey 를하였고그중 cultivar line에서 polymorphism을보이는마커를선별하였고, 37종의육성계통을추가하여총 47종의품종에대해실험을수행하였다. 166개의 EST-SSR primer중 polymorphism을보이는 primer 12개를선별하였고, 140개의 SSR motif유전자도서관에서제작한 primer에서 polymorphism을보이는 primer 3개를선별, 15set의 fosmid primer에서 polymorphism을보이는 primer 2개를선별하였다. 이들결과로부터품종구별

11 에사용할수있는 SSR Marker 17 개를선별하였다 ( 표 2). [0061] 표 2 나리에서의 EST-SSR marker 의프라이머서열 순번 프라 이머 서열 서열 번호 반복모티프 증폭되는초위성체의크기의범위 (bp) 1 L37 ATAAACCAAATCAACACAACAC 1 (CCT) GCTTTATAAGACGATCACCATT 2 2 L49 TCCCTCTAATCACGTACTAACC 3 (TC) ATTGAAGGAGGAGGAAGTTGTA 4 3 L50 AAACTGCAGAATATCACAAACA 5 (GGA) GAGTTTATTAGTCCAGCGAGTC 6 4 L67 CAGAGATACAAAGCAAAAACAA 7 (CT) AAGAGTGGAGGATCTGAAGAG 8 5 L75 AGACCGTGAAGAATGTTGTC 9 (CCA) TGCTCTAACATAAAATGAAGCA 10 6 el40 TGCGCTCTGTAGTGTGTTCCAT 11 (GGC) CAGACATGCCATGAAAACGAAG 12 7 el42 TGCCCACCATAACCTTGGTAAC 13 (GCA) CATGGATCTGGACTAGGGATGG 14 8 el58 CCGAAAAGGTGGGACTGCTC 15 (CTC) CGGCTAGTTCTGCCGGTGTT 16 9 el61 GACGACAATGACAGTCGCTCAC 17 (GAG) CTCATCCTCCTCTTGCATCCAT el64 CTCCAGGAGGAAGCAAATCTCA 19 (GAG) CTCGGCATCATCTTCGTCTTCT el65 TCACCCCTATAAACTCCCCGAT 21 (GCG) CTCTCCTTGCCGCTCTTCTTC el68 TGGTGGTAGAGGGCAATCATCT 23 (CCG) CTTGAGCAAAACAGACATCCCC AAG37 CAACTCTCACCACAAATTTTCA 25 (CT) TGCCAAGTCATTCCTAGCTC AAC44 AGCAGGAGAAGTACCCGACT 27 (CTT) ATGGCTCTGTCACCAATGTT AGC43 AAACCAAAACAACTCTCCCC 29 (AAC) TGTGAAGAGCAGCAGTCAGA f5 CCTTTCGGTCAATAGTATTTGT 31 (AT) AACTGAATTCAAGTCCTCATTC f10 ATCACGGTACCTTAGTGTTTTC 33 (TA) CAAGGCCATTATCAAATTATCT 34 대립인자의수 [0062] [0063] [0064] [0065] [0066] [0067] [0068] 증폭결과를바탕으로한품종구분방법의예시는다음과같다. 기준이되는프라이머조합은 L37로하였다.( 하기기재는 레인-구분가능한 SSR 마커종류 의형식으로기재됨 ) (1) L37을기준으로 1,5,9,14,19,43,45 교배종은같은 allele패턴을가짐 1-L37/ L49,L50,L67,L75,eL42,eL61,eL68 5-L37/ L67,f5,AAG37,eL42,eL64,eL65 8-L37/L49/f10/eL40/ 9-L37/ AAG37,eL61 14-L37/ L49,L75,f10,AAG37,eL

12 [0069] [0070] [0071] [0072] [0073] [0074] [0075] [0076] [0077] [0078] [0079] [0080] [0081] [0082] [0083] [0084] [0085] [0086] [0087] [0088] [0089] [0090] [0091] [0092] [0093] [0094] [0095] [0096] [0097] [0098] [0099] [0100] [0101] [0102] [0103] 19-L37/ AAG37/eL40 36-L37/ AAG37/eL40, L67,eL64 43-L37/ L67,f10,AAG37 45-L37/L49/ f10/el40/ 이중 19, 36 교배종은 L37/AAG37/eL40 프라이머조합을이용해구별한다. 8,45 교배종은 L37/L49/ f10/el40 프라이머조합을이용해구별한다 (2) L37을기준으로 2,10,17,18,47 교배종은같은 allele패턴을가짐 2-L37/ L67,eL42,eL58, el68 15-L37/ el42 17-L37/ AAG37,eL42,eL64 18-L37/ L67,AAG37,eL64 47-L37/ L49,eL40 (3) L37을기준으로 4,21,26,28,29,35,37,39,41,44,46 교배종은같은 allele 패턴을가짐 4-L37/ AAG37,eL58,eL68 11-L37/ L67 13-L37/ L67 21-L37/ L67,eL68 26-L37/ L67 28-L37/ el42/el64 29-L37/ el42/el64 35-L37/ L67,eL40,eL68 37-L37/ AAG37,eL68 39-L37/ L49 41-L37/ AAG37,eL64 44-L37/ AAG37 46-L37/ L49,f10,eL40 (4) L37을기준으로7,27,30,31 교배종은같은 allele 패턴을가짐 7-L37/L49,L75,f10,AAG37,eL58,eL64,eL68 27-L37/ L67,AAC44,AAG37,eL58,eL64,eL68 30-L37/ L50,AAC44,AAG37,EL58,eL64 31-L/37 L49,f10,eL58,eL64 (5) L37을기준으로16,20 교배종은같은 allele 패턴을가짐 16-L49,L50,eL40,eL42,eL64,eL68 20-L49,L50,eL40,eL42,eL64,eL68 (6) L37을기준으로24,40 교배종은같은 allele 패턴을가짐 24-L37/ L49,L50,L67,f5,AAC44,AAG37,eL40,eL42,eL58,eL61,eL

13 [0104] [0105] [0106] [0107] [0108] [0109] [0110] [0111] [0112] [0113] [0114] [0115] [0116] [0117] [0118] [0119] [0120] [0121] 40-L37/ L49,L50,L67,f5,AAC44,AAG37,eL40,eL42,eL58,eL61,eL64 (7) L37을기준으로23, 32 교배종은같은 allele 패턴을가짐 23-L37/ L67,L75,f10,AAC44,AAG37,eL42,eL58,eL68 32-L37/ L67,L75,f10,AAC44,AAG37,eL42,eL58,eL69 (8) L37을기준으로25, 33,38교배종은같은 allele 패턴을가짐 25-L37/ L49,L50,f10,eL58,eL64 33-L37/ L49,L67,L75,f5,AAC44,AAG37,eL58,eL64,eL68 38-L37/ L49,AAG37,eL40,eL42,eL64 (9) L37을기준으로3,42교배종은같은 allele 패턴을가짐 3-L37/ L50,L75,f5,f10,AAG37,eL42,eL61,eL68 42-L37/ L50,L75,f5,f10,AAG37,eL42,eL61,eL68 (10) 기타 6-L37 10-L37 12-L37 22-L37 34-L37 위와같은조합으로 47개품종에대하여구분지을수있다. 아울러, 본발명의실시예및도면에기재된결과를통해 L37이아닌다른프라이머쌍을기준으로하여상기와같은품종의구분방법을확립할수있다. [0122] 산업상이용가능성이상살펴본바와같이, 본발명에따른 SSR 프라이머는백합속나팔나리절품종및육성계통식물식물의 DNA 프로파일을작성하는데매우유용하게이용될수있다. 이를통해나리유전자원을효율적으로평가함으로써신규유전자원도입시기존보유자원과의중복성분석및신규성확립을효과적으로수행할수있다. 또한, 본발명에따른 SSR 프라이머는백합속나팔나리절품종및육성계통식물의 DNA 다형성을효과적으로검출할수있으며, 이를통하여나리의품종을판별할수있다

14 도면 도면 1 도면

15 도면

16 도면 4 서열목록 <110> University-industry cooperation foundation kangwon national university <120> SSR primer for screening race or line of Lilium spp. Longiflorum section and use thereof <130> NP <160> 34 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <220><223> L37 forward

17 <400> 1 ataaaccaaa tcaacacaac ac 22 <210> 2 <220><223> L37 reverse <400> 2 gctttataag acgatcacca tt 22 <210> 3 <220><223> L49 forward <400> 3 tccctctaat cacgtactaa cc 22 <210> 4 <220><223> L49 reverse <400> 4 attgaaggag gaggaagttg ta 22 <210> 5 <220><223> L50 forward <400> 5 aaactgcaga atatcacaaa ca 22 <210>

18 <220><223> L50 reverse <400> 6 gagtttatta gtccagcgag tc 22 <210> 7 <220><223> L67 forward <400> 7 cagagataca aagcaaaaac aa 22 <210> 8 <211> 21 <220><223> L67 reverse <400> 8 aagagtggag gatctgaaga g 21 <210> 9 <211> 20 <220><223> L75 forward <400> 9 agaccgtgaa gaatgttgtc 20 <210> 10 <220><223> L75 reverse <400> 10 tgctctaaca taaaatgaag ca 22 <210>

19 <220><223> el40 forward <400> 11 tgcgctctgt agtgtgttcc at 22 <210> 12 <220><223> el40 reverese <400> 12 cagacatgcc atgaaaacga ag 22 <210> 13 <220><223> el42 forward <400> 13 tgcccaccat aaccttggta ac 22 <210> 14 <220><223> el42 reverse <400> 14 catggatctg gactagggat gg 22 <210> 15 <211> 20 <220><223> el58 forward <400> 15 ccgaaaaggt gggactgctc 20 <210> 16 <211>

20 <220><223> el58 reverse <400> 16 cggctagttc tgccggtgtt 20 <210> 17 <220><223> el61 forward <400> 17 gacgacaatg acagtcgctc ac 22 <210> 18 <220><223> el61 reverse <400> 18 ctcatcctcc tcttgcatcc at 22 <210> 19 <220><223> el64 forward <400> 19 ctccaggagg aagcaaatct ca 22 <210> 20 <220><223> el64 reverse <400> 20 ctcggcatca tcttcgtctt ct 22 <210>

21 <220><223> el65 forward <400> 21 tcacccctat aaactccccg at 22 <210> 22 <211> 21 <220><223> el65 reverse <400> 22 ctctccttgc cgctcttctt c 21 <210> 23 <220><223> el68 forward <400> 23 tggtggtaga gggcaatcat ct 22 <210> 24 <220><223> el68 reverse <400> 24 cttgagcaaa acagacatcc cc 22 <210> 25 <220><223> AAG37 forward <400> 25 caactctcac cacaaatttt ca 22 <210>

22 <211> 20 <220><223> AAG37 reverse <400> 26 tgccaagtca ttcctagctc 20 <210> 27 <211> 20 <220><223> AAC44 forward <400> 27 agcaggagaa gtacccgact 20 <210> 28 <211> 20 <220><223> AAC44 reverse <400> 28 atggctctgt caccaatgtt 20 <210> 29 <211> 20 <220><223> AGC43 forward <400> 29 aaaccaaaac aactctcccc 20 <210> 30 <211> 20 <220><223> AGC43 reverse <400> 30 tgtgaagagc agcagtcaga 20 <210>

23 <220><223> f5 forward <400> 31 cctttcggtc aatagtattt gt 22 <210> 32 <220><223> f5 reverse <400> 32 aactgaattc aagtcctcat tc 22 <210> 33 <220><223> f10 forward <400> 33 atcacggtac cttagtgttt tc 22 <210> 34 <220><223> f10 reverse <400> 34 caaggccatt atcaaattat ct

Technical/Specs Sequencing 서비스안내 Standard Sequencing Plasmid/PCR product 를 primer 를이용하여고객이원하는 region 을분석하는서비스이며, 대부분의 normal 샘플에대해 최적화되어있습니다. Full Len

Technical/Specs Sequencing 서비스안내 Standard Sequencing Plasmid/PCR product 를 primer 를이용하여고객이원하는 region 을분석하는서비스이며, 대부분의 normal 샘플에대해 최적화되어있습니다. Full Length Sequencing (Primer walking) 길이가긴 insert 를포함한 plasmid