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대규 탄
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1 대한수혈학회지 : 제 18 권제 3 호, 2007 RHCE 유전자의인트론 2 삽입부위에대한염기서열특이 - 중합효소연쇄반응을이용한 RhC/c 혈액형의판정 박철민 1 ㆍ허세란 2 ㆍ진선경 2 ㆍ장호은 2 ㆍ박경운 1,2 ㆍ송정한 1,2 ㆍ한규섭 1 = Abstract = 서울대학교의과대학검사의학교실 1, 분당서울대학교병원진단검사의학과 2 Determination of the RhC/c Blood Group by Polymerase Chain Reaction with Sequence-specific Primers of the Intron 2 Insert of the RHCE Gene Chul Min Park 1, Se Ran Heo 2, Sun Kyung Jin 2, Ho Eun Chang 2, Kyoung Un Park 1,2, Junghan Song 1,2, Kyou Sup Han 1 Department of Laboratory Medicine, Seoul National University College of Medicine 1, Seoul, Seoul National University Bundang Hospital 2, Seongnam, Korea Background: RhC/c blood group antigens are of clinical importance and molecular genotyping for them can be useful when serological typing is difficult. A method to determine the RhC/c genotype, by targeting exon 1 nt48 and exon 2 nt307, has been used. However, this approach is not accurate for the RHc(cyt48) variant allele. We applied a more accurate genotyping method, using the intron bp insert of the RHCE gene, and evaluated its performance in comparison with the standard method. Methods: RhD and RhC/c serotypes of 236 subjects were determined. We compared two genotype results with the serological phenotype. One method examined the allele-specific exon 1 nt48 and exon 2 nt307 polymorphism area (Method 1), while the other method detected the intron 2 insert instead of the exon 1 nt48 (Method 2) by polymerase chain reaction with sequence-specific primers (PCR-SSP). Results: The predicted phenotypes by Method 1 were not matched with the true phenotypes in 24 cases (24/236, 10.2%). By contrast, the predicted results by Method 2 matched with true phenotypes in all cases except one. The RHc(cyt48) variant was suspected in 22 cases (23.7%) of the 93 Rhc cases. Conclusion: For the determination of the RhC/c genotype in Koreans, the method that analyzes exon 1 nt48 is inaccurate. Instead, intron 2 insert analysis with exon 2 nt307 by PCR-SSP appears to be a more accurate alternative. (Korean J Blood Transfus 2007;18: ) Key words: RHCE, Genotype, RhC/c, PCR-SSP 접수일 :2007년 10월 26일, 승인일 :2007년 12월 14일책임저자 : 박경운 경기도성남시분당구구미동 300 분당서울대학교병원진단검사의학과 TEL: 031) , FAX: 031) , m91w95@dreamwiz.com

2 인트론 2 분석을통한 RhC/c 혈액형의판정 서론 Rh 혈액형은임상적으로중요한적혈구항원이며 50여종류가알려져있지만특히중요한것은 D, C, c, E, e이다. Rh 혈액형을결정하는유전자는 RHD와 RHCE로, RHD 유전자는 D 항원을 RHCE 유전자는 C, c, E, e 항원을각각표현한다. RHD와 RHCE 유전자는염색체 1번에서로이웃하여위치하며염기배열상 95% 의유사성을보이는것으로알려져있다. 1,2) Rh 혈액형항원등적혈구항원의존재여부를알기위해서는보통각항원에반응하는항혈청을사용하여혈구응집법을시행한다. 최근에는분자유전학의발달로대부분의혈액형유전자구조가밝혀져혈액형과관련된유전자에대한검사를통한표현형의예측이가능하게되었다. 3) 이러한유전자형검사는대량수혈을받은환자의경우나자가면역성용혈성빈혈환자의경우, 또는태아의산전진단등혈청학적으로혈액형을결정하기가어려운경우에유용할수있다. 4,5) RHCE는 RhC/c와 RhE/e 항원을표현하는유전자로서 10개의엑손으로이루어져있으며, 엑손 2와엑손 5 부분의단일염기의다형성에의해그표현형이결정되는것으로알려져있다. 6) 그중 RhC/c 항원의표현형을결정하는부분은엑손 2 의 307번염기로, Rhc 항원을표현하는 RHc 대립유전자는시토신 (cytosine) 이며 RhC 항원을표현하는 RHC 대립유전자는티민 (thymine) 이다. 이와같이 307번염기의분석을통해 RHc 대립유전자가있음을증명하는것은비교적용이하다. 그러나 RHC의경우 307번염기가 RHD 유전자와티민으로동일하기때문에 RhD 양성의경우또는 RhD 음성에서 RHD의엑손 2 부위가남아있는경우에는 RHC 존재유무를제대로판단할수없다. 따라서 RHC에특이적인다른부위를검사해 야하는데대표적인방법중하나는엑손 1 의 48 번염기를염기서열특이-중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction with sequence-specific primers, PCR-SSP) 으로증폭하는것이다. 7,8) 엑손 1 의 48번염기는 RHC의경우시토신이며 RHc의경우구아닌 (guanine) 으로알려져있다. 그러나, RHc에서도 48번염기가시토신인경우, 즉 RHc (cyt48) 라는변이형이존재하며, 이경우엑손 1의 48번염기만검사해서는 RHC 대립유전자가없음에도있는것처럼오판할가능성이있다. 국내에서도엑손 1의 48번염기와엑손 2의 307번염기를분석하여 RhC/c 항원의유전자형을확인하려는시도가있었으나, 9) RHc(cyt48) 변이형의존재가간과됨으로인해그정확성에논란이있다. 이에대한대안으로엑손 1의 48번염기를분석하는대신, 인트론 2의 109 bp 삽입부위를검사하는방법을통해 RHc(cyt48) 변이형의영향을받지않고 RHC 대립유전자유무를정확하게알수있다. 10,11) 현재국내에서 RHc(cyt48) 의존재를확인한연구는없으나, 국외연구결과를고려하면한국인에서도이러한변이형이존재할가능성이높다. 그러므로인트론 2의삽입부위를이용한검사법을이용하여한국인에서 RHc(cyt48) 이존재하는지여부를아는것이필요하다. 본연구에서는기존의방법, 즉엑손 1의 48번염기와엑손 2의 307번염기부분을분석하는방법과엑손 1의 48번염기대신인트론 2의삽입부위를분석하는방법을서로비교하여각방법의표현형예측에있어서의정확성을평가하고, 이를통해한국인에서적절한 RhC/c 항원의유전자형검사방법을확립하고자하였다

3 대한수혈학회지 : 제 18 권제 3 호 1. 대상 대상및방법 혈청학적방법으로확인된 RhD 양성 129 명과 RhD 음성 107명을대상으로하였다. 본연구에대해분당서울대학교병원기관윤리위원회의승인 (IRB No. B-0609/ ) 을받았다. 2. RhC/c 표현형결정 검사할적혈구를생리식염수로한번세척한후 3% 부유액으로만들고, 각시험관에 SeraClone (Biotest Diagnostics, Ottawa, Canada) polyclonal anti-c, anti-c 항혈청을각각 1방울넣은후각시험관에이미준비한각검체의 3% 혈구부유액을 1방울넣고 3,400 rpm에서 15초간원심분리한후응집유무를관찰하였다. 응집이없거나결과가의심스러우면 5분실온에서항온한후원심을재시행하였다. 혈구응집이있으면항원양성, 응집이없으면항원음성으로판정하였다. 3. DNA 추출및중합효소연쇄반응을위한시발체 말초혈액의백혈구에서 Puregene DNA isolation kit (Gentra Systems, Minneapolis, USA) 를이용하여추출하여, 영하 70도에서보관한 DNA를사용 하였다. 염기서열특이 - 중합효소연쇄반응을위해 RHCE 유전자엑손 1의 48번염기인시토신에대한시발체 (RHC48_F, RHC48_R) 와엑손 2의 307 번염기인구아닌에대한시발체 (RHc307_F, RHc 307_R), 그리고인트론 2의삽입부위를검출하기위한시발체 (RHCInt2_F, RHCInt2_R) 를각각사용하였다. 실험에사용한시발체와그특이성을 Table 1에정리하였다. 4. 엑손 1 의 48 번과엑손 2 의 307 번염기에대한염기서열특이 - 중합효소연쇄반응 ( 방법 1) 시험관에추출한 DNA 7μL (50 ng/μl) 을넣고, Taq polymerase (TaKaRa, Shiga, Japan) 0.25 μl, dntp (2.5 mm) 4μL, 10 완충액 5μL, 그리고시발체 (RHC48_F, RHC48_R, RHc307_F, RHc 307_ R) 를각각 1μL씩을넣어총 50μL의반응액을구성하였다. PCR은 PTC-200 (MJ Research, Waltham, USA) 를사용하여 95 o C에서 3분간처리한다음 95 o C에서 30초, 60 o C에서 30초, 72 o C에서 30초씩 40회증폭하고, 마지막에 72 o C에서 5분간항온시켰다. 증폭여부는 PCR 산물 5μL에 ethidium bromide를첨가하여 2% 아가로즈겔에점적한다음 100 V에서 30분간전기영동을하여확인하였다. Table 1. Sequence-specific primers used for RhC/c genotyping Name DNA sequences (5-3 ) Length (bp) Primer specificity Reference RHC48_F GCG CTG CCT GCC CCT CTT C 19 RHC48_R TAG GAT GCC ACG AGC CCC TTT 21 RHc307_F TAG GCC AAG ATC TGA CCG 18 RHc307_R TGT GAT GAC CAC CTT CCC TGG 21 RHCInt2_F CAG GGC CAC CAC CAT TTG AA 20 RHCInt2_R GAA CAT GCC ACT TCA CTC CAG 21 RHC 8) RHc 8) RHC 9)

PCR은 PTC- 200 (MJ Research, Waltham, USA) 를사용하여 95 o C 에서 3분간처리한다음 95 o C에서 30초, 60 o C에서 30초, 72 o C에서 30초씩 40회증폭하고, 마지막에 72 o C에서 5분간항온시켰다.

4 인트론 2 분석을통한 RhC/c 혈액형의판정 5. 엑손 2 의 307 번염기와인트론 2 삽입부위분석 ( 방법 2) 시험관에추출한 DNA 7μL (50 ng/μl) 을넣고, Taq polymerase (TaKaRa, Shiga, Japan) 0.25 μl, dntp (2.5 mm) 4μL, 10 완충액 5μL, glycerol 2μL, 그리고시발체 (RHc307_F, RHc307_R, RHCInt2_F, RHCInt2_R) 를각각 1μL씩을넣어총 50μL의반응액을구성하였다. PCR은 PTC- 200 (MJ Research, Waltham, USA) 를사용하여 95 o C 에서 3분간처리한다음 95 o C에서 30초, 60 o C에서 30초, 72 o C에서 30초씩 40회증폭하고, 마지막에 72 o C에서 5분간항온시켰다. 증폭여부는 PCR 산물 5μL에 ethidium bromide를첨가하여 2% 아가로즈겔에점적한다음 100 V에서 30분간전기영동을하여확인하였다. 사결과는 Fig. 1 과같았다. 2. 표현형및유전형분석 총 129 명의 RhD 양성환자중 RhC, RhCc, Rhc 6. 중합효소연쇄반응에의한표현형추정과결과분석 방법 1의반응결과 179 bp의증폭산물이있으면 Rhc 항원, 114 bp의증폭산물이있으면 RhC, 둘다있으면 RhCc로표현형을추정하였다. 방법 2의경우는 179 bp의증폭산물이관찰되면 Rhc 항원, 320 bp의증폭산물이있으면 RhC, 둘다있으면 RhCc인것으로추정하였다. 방법 1과방법 2로추정된 RhC/c 표현형을실제혈청학적으로확인된표현형과비교하였다. 결과 1. 중합효소연쇄반응결과방법 1의결과 114 bp, 179 bp의증폭산물이관찰되었다. 방법 2의결과 179 bp와 320 bp의증폭산물이관찰되었다. 각각의유전자형에따른검 Fig. 1. Results of RhC/c genotyping by two PCR-SSP methods. In Method 1, Lane NC, water control, Lane 1, RhC sample, an RHC-specific product of 114 bp is amplified; Lane 2, RhCc sample, an RHC-specific product of 114 bp and an RHc-specific product of 179 bp are amplified; Lane 3, Rhc sample, RHc-specific product of 179 bp is amplified. In Method 2, Lane NC, water control, Lane 1, RhC sample, an RHC-specific product of 320 bp is amplified; Lane 2, RhCc sample, an RHC-specific product of 320 bp and an RHc-specific product of 179 bp are amplified; Lane 3, Rhc sample, RHc-specific product of 179 bp is amplified

5 대한수혈학회지 : 제 18 권제 3 호 Table 2. Comparisons of predicted phenotypes by two different genotype methods with true serotypes for RhC/c blood group antigen Method 1* Method 2 Serotype [Case No. (%)] RhC RhC and Rhc Rhc RhC RhC and Rhc Rhc RhD+ RhC 54 (41.8) RhCc 57 (44.2) Rhc 18 (14.0) Total 129 (100) RhD RhC 4 (3.7) RhCc 28 (26.2) Rhc 75 (70.1) Total 107 (100) *PCR-SSP with RHC48 and RHc307 primers, PCR-SSP with RHc307 and RHCInt2 primers. Abbreviation: PCR-SSP, polymerase chain reaction with sequence-specific primers. 각각의표현형은 41.8% (54명), 44.2% (57명), 14.0% (18명) 이었다. RhD 음성환자 107명중에는각각 3.7% (4명), 26.2% (28명), 70.1% (75명) 이었다. 방법 1로예측한표현형과실제표현형이다른경우는총 24명 (24/236, 10.2%) 으로, RhD 양성중에는 4명 (4/129, 3.1%) 이고 RhD 음성중에는 20명 (20/107, 18.7%) 이었다. 그중 RhD 양성인 4명중에는 RhCc와 Rhc 혈청형이각각 2명씩이었고, RhD 음성 20명은모두 Rhc 혈청형이었다. 반면에방법 2로표현형을예측하였을경우, RhD 양성으로 RhCc 혈청형인 1명을제외하고는모두실제표현형과일치하였다 (Table 2). 고찰 RhC/c 항원에대한두가지유전자형검사법을비교한결과엑손 1의 48번염기분석보다는인트론 2 삽입부위를분석하는것이더정확하게표현형을예측할수있음을확인하였다. 엑손 1 의 48번염기분석결과에서표현형과일치하지않은경우 24명중 22명은 Rhc(cyt48) 변이형이원 인인것으로생각된다. RHc(cyt48) 변이형은인종에따라상이한분포를보이며, Rhc 표현형인아프리카흑인에서는 74%, 백인에서는 5% 정도라고알려져있다 ) 이전국내연구 9) 에서 RHc (cyt48) 변이형을확인할수없었던것은 Rhc 표현형을보였던대상수가많지않았기때문으로생각된다. 본연구결과 RhD 양성보다는음성에서 RHc (cyt48) 변이형이많은것으로나타났는데, 한국인에서 RhD 음성은매우드문편이며, RhD 양성중에서도 RHc(cyt48) 변이형이분석상문제가되는 Rhc 표현형의비율이매우낮으므로 15) 실제유전형검사에서검출되는 RHc(cyt48) 변이형은많지않을것으로예상된다. RHC 유전형검사법에는본연구에서사용한방법외에도 RHCE 유전자의프로모터영역에대한중합효소연쇄반응-제한절편길이다형성 (polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP) 을이용한방법도알려져있다. 16) 중합효소연쇄반응-제한절편길이다형성을이용한방법은염기서열특이-중합효소연쇄반응

6 인트론 2 분석을통한 RhC/c 혈액형의판정 방법에비해분자유전학적으로보다정확한방법으로알려져있으나, 검사수행시간이긴단점이있다. 본연구에서염기서열특이-중합효소연쇄반응을이용하여 200예이상검사를시행하였으나, 분석의신뢰성과정확성에특별한문제는없었다. 인트론 2 삽입부위분석시드물지만위음성을보일수있음이알려져있다. Ekman 등 12) 은미국흑인을대상으로한연구에서일부 RhCc 표현형에서인트론 2 삽입부위가제대로증폭이되지않아위음성을보였다고하였고, Tax 등 17) 은이런경우 RhC 항원을약하게표현하는 RHD 유전자의변이형인 r s (Cde s ) 가원인임을밝혔다. r s 변이형은백인에서 0.4%, 남미흑인에서 9.9%, 아프리카흑인에서는 7.2% 의빈도로나타나며, 약하게 RhC항원을표현하지만본연구에서사용한것과같은인트론 2 삽입부위검사에서는음성을보인다. 따라서이러한경우인트론 2 삽입부위분석은정확하지않으며 Tax 등 17) 은이러한변이형을제대로검출하기위해 hex3 부위등에대한검사를포함시킬것을제안하였다. 아직한국인에서이러한변이형이있는지여부는알려지지않았으며, 본연구에서인트론 2 검사결과가표현형과일치하지않은 1명도이러한변이형의가능성이있는것으로생각된다. 본연구에서저자들은 RHc(cyt48) 변이형이한국인에서도적지않은빈도로존재하며, 이로인해한국인에서 RhC 표현형을예측하는데엑손 1의 48번염기를검사하는방법보다인트론 2 삽입부위를검사하는방법이더정확한방법임을확인하였다. 따라서한국인에서 RhC/c 유전자형분석시엑손 2의 307번염기와인트론 2 삽입부위를염기서열특이-중합효소연쇄반응법으로분석하는것이유용하다고생각한다. 요약배경 : RhC/c는임상적으로중요한혈액형이며, 유전자형에대한검사는혈청학적으로혈액형을결정하기어려운경우유용하게사용할수있다. 기존에는엑손 1의 48번염기와엑손 2의 307번염기분석으로유전자형을결정하는방법이이용되었으나, RHc(cyt48) 변이형이존재하므로혈액형판정에오류를범하게된다. 저자들은보다정확한인트론 2의 109 bp 삽입부위에대한분석법을사용하여기존방법과표현형예측의정확성을비교평가하고자하였다. 방법 : 236명을대상으로혈청학적으로 RhD와 RhC/c 표현형을결정하였다. RHCE 유전자엑손 1의 48번염기와엑손 2의 307번염기를염기서열특이-중합효소연쇄반응으로분석한결과 ( 방법 1) 와엑손 2의 307번염기와인트론 2의 109 bp 삽입부위를분석한결과 ( 방법 2) 를혈청학적표현형과비교하여두방법의정확성을비교하였다. 결과 : 방법 1로예측한표현형과실제표현형이다른경우는총 24명 (24/236, 10.2%) 이었고, 반면에방법 2로표현형을예측하였을경우, RhD 양성으로 RhCc 표현형을보인 1명을제외하고는모두실제표현형과일치하였다. RHc(cyt48) 변이형으로추정되는경우는 Rhc 표현형 93중 22명 (23.7%) 이었다. 결론 : 한국인에서 RhC/c 유전자형결정시, 엑손 1의 48번염기를분석하는방법은부정확하며, 대신인트론 2 삽입부위를엑손 2의 307번염기와함께염기서열특이-중합효소연쇄반응으로분석하는방법이유용할것으로보인다

7 대한수혈학회지 : 제 18 권제 3 호 참고문헌 1. Cherif-Zahar B, Mattei MG, Le Van Kim C, Bailly P, Cartron JP, Colin Y. Localization of the human Rh blood group gene structure to chromosome region 1p34.3-1p36.1 by in situ hybridization. Hum Genet 1991;86: Cherif-Zahar B, Le Van Kim C, Rouillac C, Raynal V, Cartron JP, Colin Y. Organization of the gene (RHCE) encoding the human blood group RhCcEe antigens and characterization of the promoter region. Genomics 1994;19: Reid ME, Lomas-Francis C. Molecular approaches to blood group identification. Curr Opin Hematol 2002;9: Bennett PR, Le Van Kim C, Colin Y, Warwick RM, Cherif-Zahar B, Fisk NM, et al. Prenatal determination of fetal RhD type by DNA amplification. N Engl J Med 1993;329: Legler TJ, Eber SW, Lakomek M, Lynen R, Maas JH, Pekrun A, et al. Application of RHD and RHCE genotyping for correct blood group determination in chronically transfused patients. Transfusion 1999;39: Mouro I, Colin Y, Cherif-Zshar B, Cartron JP, Le Van Kim C. Molecular genietic basis of the human Rhesus blood group system. Nature Genetics 1993;5: Faas BH, Beckers EA, Wildoer P, Ligthart PC, Overbeeke MA, Zondervan HA, et al. Molecular background of VS and weak C expression in blacks. Transfusion 1997;37: Gassner C, Schmarda A, Kilga-Nogler S, Jenny- Feldkircher B, Rainer E, Muller TH, et al. RHD/CE typing by polymerase chain reaction using sequence-specific primers. Transfusion 1997;37: Seo DH, Oh HB, Hwang YS, Kim SI. Rh C/c, E/e genotyping by polymerase chain reaction using sequence-specific primers. Korean J Blood Transfus 1999;10: Avent ND. Antenatal genotyping of the blood groups of the fetus. Vox Sang 1998;74(Suppl 2): Flegel WA, Wagner FF, Muller TH, Gassner C. Rh phenotype prediction by DNA typing and its application to practice. Transfus Med 1998; 8: Ekman GC, Billingsly R, Hessner MJ. Rh genotyping: avoiding false-negative and falsepositive results among individuals of African ancestry. Am J Hematol 2002;69: Hyland CA, Wolter LC, Liew YW, Saul A. A southern analysis of Rh blood group genes: association between restriction fragment length polymorphism patterns and Rh serotypes. Blood 1994;83: Wolter LC, Hyland CA, Saul A. Refining the DNA polymorphisms that associate with the rhesus c phenotype. Blood 1994;84: Hwang YS. Haplotype frequencies of Rh gene loci in Koreans. Korean J Blood Transfus 1996; 7: Tanaka M, Yamashita N, Takahashi J, Hirayama F, Kajii E, Tani Y. RHC/c genotyping based on polymorphism in the promoter region of the RHCE gene. Leg Med (Tokyo) 2001;3: Tax MG, van der Schoot CE, van Doorn R, Douglas-Berger L, van Rhenen DJ, MaaskantvanWijk PA. RHC and RHc genotyping in different ethnic groups. Transfusion 2002;42:

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untitled 대한수혈학회지 : 제 22 권제 1 호, 2011 장호은 1 ㆍ이경 1 ㆍ홍윤지 2 ㆍ김택수 2 ㆍ송상훈 1,2 ㆍ박경운 1,2 ㆍ송정한 1,2 ㆍ한규섭 2 = Abstract = 분당서울대학교병원진단검사의학과 1, 서울대학교의과대학검사의학교실 2 Three Cases of Anti-K and the KEL Gene Frequency in the Korean