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1 대한수혈학회지 : 제 22 권제 1 호, 2011 장호은 1 ㆍ이경 1 ㆍ홍윤지 2 ㆍ김택수 2 ㆍ송상훈 1,2 ㆍ박경운 1,2 ㆍ송정한 1,2 ㆍ한규섭 2 = Abstract = 분당서울대학교병원진단검사의학과 1, 서울대학교의과대학검사의학교실 2 Three Cases of Anti-K and the KEL Gene Frequency in the Korean Population Ho Eun Chang 1, Kyung Lee 1, Yun Ji Hong 2, Taeksoo Kim 2, Sang Hoon Song 1,2, Kyoung Un Park 1,2, Junghan Song 1,2, Kyou-Sup Han 2 Department of Laboratory Medicine, Seoul National University Bundang Hospital 1, Seongnam, Department of Laboratory Medicine, Seoul National University College of Medicine 2, Seoul, Korea Background: Anti-K is one of the most significant unexpected antibodies that cause hemolytic transfusion reactions. Individuals with anti-k have to be transfused with K antigen-negative red cells. Although Koreans rarely have the K antigen, we have detected three cases of anti-k and we analyzed the Kell blood group genotypes for the KEL*1/KEL*2 alleles at the same time. Methods: We analyzed the KEL*1/KEL*2 allele genotypes from 261 blood donors at Seoul National University Bundang Hospital. Kell genotyping were carried out using polymerase chain reaction (PCR) and restriction enzyme length polymorphism (RFLP). Identification of anti-k was performed using three kinds of methods; 37 o C albumin, an anti-human globulin phase tube, a bead cassette and a gel card. Three cases of anti-k also underwent PCR with a sequence specific primer (SSP) for Kell genotyping. For comparison, the KEL*1 allele (698C>T) was synthesized by site-directed-mutagenesis. Results: All 261 donors were KEL*2/KEL*2 homozygotes and a digested KEL*1 allele was not found. The three patients with anti-k were also KEL*2/KEL*2 homozygotes and the reactivities of the anti-k identification test were the same. Conclusion: The KEL gene frequency for the KEL*1/KEL*2 allele corresponded with that of the Kell phenotype, as was previously reported. We experienced three cases of anti-k and two out of the three were assumed that they had been transfused with the K antigen-positive blood of foreigners. This study revealed that the possibility of anti-k alloimmunization and hemolytic transfusion reactions cannot be excluded in Koreans. (Korean J Blood Transfus 2011;22:31-37) Key words: Anti-K, KEL gene, Genotyping, Alloimmunization 접수일 :2011년 3월 23일, 수정일 :2011년 4월 15일, 승인일 :2011년 4월 15일책임저자 : 박경운 경기도성남시분당구구미로 166 분당서울대학교병원진단검사의학과 TEL: 031) , FAX: 031) , m91w95@dreamwiz.com 이논문은질병관리본부학술용역연구비 ( ) 지원에의해이루어진것임

2 대한수혈학회지 : 제 22 권제 1 호 Table 1. Kell blood group system Antigen name Popular ISBT 서론 분자유전학적기법의도입을통해대부분의혈액형유전자들에대해클로닝및염기서열분석이이루어졌다. 그중 Kell 혈액형군 ( 국제수혈학회혈액형번호 006) 의주요항원인 K와 k의분자유전학적특성을 Table 1에정리하였다. 1-4) Kell 당단백질을산물로하는 KEL 유전자는염색체 7q34 에위치한다. 2) KEL 유전자는약 21.5 kb (cdna 2,199 bp) 에달하며 19개의엑손 (exon) 으로이루어지는데 5) 6번엑손 ( 뉴클레오티드번호 , 아미노산번호 ) 의 T698C (Met193Thr) 유전자다형성에따라 K와 k 항원이결정된다. 6) K 항원이 Kell 혈액형군중가장강력한면역원이고항-K 항체는항원성이강한 IgG 계열의항체로서임상적으로중요한의미를지니는항체중하나이다. 7) 항-K 항체를보유한사람이 Kell 항원양성인혈액을수혈받는경우는용혈성수혈부작용을일으키므로반드시 Kell 항원음성혈액을수혈받아야한다. 7) 또한구미지역에서는백인의약 9%, 흑인의약 2% 가 K 항원을가지고있기때문에 8) 항-K 항체는가임기여성에서 Rh 계열의항체다음으로신생아용혈성질환과의연관성이높은것으로알려져있다. 9) 항원성이강한항체이지만 Kell 항원의국내보유빈도는 0% 이며항-K 항체검출은일부의보고에그치고 Allele name Molecular basis K KEL1 KEL*1 698T (Met193) k KEL2 KEL*2 698C (Thr193) Abbreviation: ISBT, International Society of Blood Transfusion. 있다 ) 저자들은분당서울대학교병원에서수혈이예정된환자들을대상으로항체선별검사를실시한과정에서 3명의항-K 항체양성을검출하고이를계기로분자유전학적기법을이용한중합효소연쇄반응을통해한국인에서 Kell 혈액형군의대립유전자빈도를조사하였기에이를보고하고자한다. 대상및방법 분당서울대학교병원의헌혈자 261명및 2003 년부터 5월부터 2009년 12월까지수혈이예정된환자들을대상으로시행한비예기항체검사 103,974 건중에서항-K 항체양성으로판정된 3예를대상으로하였다. 본연구는분당서울대학교병원생명윤리심의위원회의승인을받았다. Kell 유전형분석에는중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)- 제한절편길이다형성 (restriction enzyme length polymorphism, RFLP) 을이용하였고추가적으로항-K 항체양성환자에대해서는중합효소연쇄반응-염기특이시발체 (sequence specific primer, SSP) 를시행하였다. 핵산추출에는 QIAamp blood mini kit (Qiagen, Hilden, Germany) 를이용하였다. 1. Kell 유전형분석 중합효소연쇄반응-제한절편길이다형성에있어 KEL*1과 KEL*2 대립유전자의검출을위한중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR) 에는 KEL-F (5'-AAG CTT GGA GGC TGG CGC AT-3') 와 KEL-R (5'-CCT CAC CTG GAT GAC TGG TG-3') 시발체를이용하였다. 6,13) 중합효소연쇄반응의반응액 (25 μl) 은다음과같았다 : 10 완충액 2.5 μl, 2.5 ml dntp 2 μl, 시발체 0.4 μm, 단위 Taq 중합효소 (Takara, Shiga, Japan), 핵산추출물 100 ng. 94 o C에서 5분간초기변성을시

3 행하였고, 연속하여 35회의증폭반응 (94 o C 20초, 62 o C 15초, 72 o C 20초 ) 을실시한후, 최종연장반응을 72 o C에서 5분간시행하였다. 증폭산물을 BsmI 제한효소 (NEB, Beverly, MA, USA) 로절단하여 3% Nusieve 아가로오즈겔에서제한절편길이다형성을관찰하였다. 중합효소연쇄반응-염기특이시발체법의시발체로는 KEL-578TF (5'-GAC TTC CTT AAA CTT TAA CCG CAT-3'), KEL-578CF (5'-GGA CTT CCT TAA ACT TTA ACC GCA C-3') 와 KEL-578R(5'-CGC CAG TGC ATC CCT CAC C-3') 을사용하였다. 그리고내부대조로서사람성장호르몬유전자를증폭시키기위한시발체 HGH-F2 (5'-TGC CTT CCC AAC CAT TCC CTT A-3'), HGH-R2 (5'-CCA CTC ACG GAT TTC TGT TGT GTT TC-3') 도함께사용하였다. 14) 중합효소연쇄반응의반응액 (25 μl) 은다음과같았다 : 10 완충액 2.5 μl, 2.5 mm dntps 2 μl, 시발체각각 0.4 μm, 단위 Taq 중합효소, 핵산추출물 100 ng. 반응의진행은 94 o C에서 5분간초기변성을시행하였고, 연속하여 35회의증폭반응 (94 o C 30초, 63 o C 30초, 72 o C 30초 ) 을실시한후, 최종연장반응을 72 o C에서 5 분간시행하였다. 증폭산물을 2% 아가로오즈겔에전기영동하였다. Kell 유전형분석에있어양성대조는 698C>T 유발돌연변이과정으로확보된재조합유전자를이용하였다. 2. KEL*1 유전형 (698C>T) 확보를위한유발돌연변이과정 KEL*2 유전형으로 698번염기에시토신을가진대립유전자를대상으로 KEL-F와 KEL-R 시발체를이용하여 156 bp의증폭산물을만들었다. TArget Clone kit (TOYOBO, Osaka, Japan) 와 Smart Cells Chemically Competent E. coli (Genlantis, San Diego, CA, USA) 를이용하여제조사의지침에따 라형질전환된플라스미드를확보하고 Plasmid Purification mini kit (Qiagen, Hilden, Germany) 를이용하여 KEL*2 유전형의단일클론재조합유전자를추출하였다. 재조합유전자를대상으로돌연변이유발용시발체 KEL-mut F (5'-GAC TTC CTT AAA CTT TAA CCG CAT GCT GAG ACT TC-3'), KEL-mut R (5'-GAA GTC TCA GCA TGC GGT TAA AGT TTA AGG AAG TC-3') 과 GENEART Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 을이용하여유발돌연변이과정을수행하고염기서열분석을통하여 698C>T 유전자가존재함을확인하였다. 3. 항-K 항체의검출비예기항체선별검사는 Selectogen (Ortho-Clinical Diagnostics, Johnson & Johnson, Rochester, NY, USA) 혈구를이용한 Ortho BioVue System (Ortho- Clinical Diagnostics, Johnson & Johnson, Rochester, NY, USA) 의비드가포함된미세원주응집법으로이루어졌고, 비예기항체동정검사는 Resolve Panel A (Ortho-Clinical Diagnostics, Johnson & Johnson, Rochester, NY, USA) 혈구를이용한시험관법, 비드가포함된미세원주응집법, DiaMed-ID (Dia- Med AG, Cressier, Switzerland) 혈구와젤이포함된미세원주응집법을시행하였다. 시험관법은실온식염수법, 37 o C 알부민법, 항글로불린법의 3단계로실시하였다. 4. K 항원검출검사환자의혈구를 3회세척하여항-K 혈청및항-k 혈청 (Biotest AG, Dreieich, Germany) 을각 1방울씩떨어뜨리고 60분간 37 o C에서반응시킨후 3,000 rpm에서 20초간원심분리하여응집여부를확인하였다

대한수혈학회지 : 제 22 권제 1 호 결과 1. Kell 유전형분석 KEL*1 대립유전자는 KEL-F/KEL-R 시발체에의한 156 bp의핵산증폭산물이 BsmI 제한효소에의해 56 bp와 100 bp로절단되고 KEL*2 대립유전자는절단되지않는다. 이번연구의대상이된 261명과항-K 항체 3예모두에서절단된산물은관찰되지않았다 (Fig. 1).

비드와젤을이용하는미세원주응집법에서도모두 2+ 이상의응집강도를나타내었다 (Table 2). 3. K 항원검사 항-K 항체가검출된 3예모두항-K와항-k 혈청을이용한표현형검사에서 K 항원음성, k 항원양성이었다.

4 대한수혈학회지 : 제 22 권제 1 호 결과 1. Kell 유전형분석 KEL*1 대립유전자는 KEL-F/KEL-R 시발체에의한 156 bp의핵산증폭산물이 BsmI 제한효소에의해 56 bp와 100 bp로절단되고 KEL*2 대립유전자는절단되지않는다. 이번연구의대상이된 261명과항-K 항체 3예모두에서절단된산물은관찰되지않았다 (Fig. 1). 모두 KEL*2 대립유전자만존재하는동형접합체였다. 항-K 항체가발견된 3예에대한중합효소연쇄반응-염기특이시발체에서 140 bp의 KEL*1 대립유전자의증폭산물은관찰되지않았다 (Fig. 2). 중합효소연쇄반응-제한절편길이다형성과중합효소연쇄반응-염기특이시발체에서유발돌연변이과정을거친재조합유전자에서만 KEL*1 대립유전자양성으로확인되었다. 2. 비예기항체동정 시험관법으로진행된비예기항체동정검사의결과 3예모두실온식염수단계에서부터반응을보였고항글로불린단계에서가장강한응집강도를보였다. 비드와젤을이용하는미세원주응집법에서도모두 2+ 이상의응집강도를나타내었다 (Table 2). 3. K 항원검사 항-K 항체가검출된 3예모두항-K와항-k 혈청을이용한표현형검사에서 K 항원음성, k 항원양성이었다. 고찰 수혈이나임신으로발생할수있는동종항체로알려진항-K 항체는국내보고가아주드문비예기항체로비예기항체검출빈도에관한보고서와 12) 2008년수혈로인한항-K 항체보고가있을뿐이다. 13) 저자들은한대학병원에서세명의환자에 Fig. 1. The detection of KEL*1/KEL*2 allele using PCR-RFLP. Lane 1; 100 bp DNA size marker, lane 2, 4, 6, 8; the amplified 156 bp product, lane 3, 5, 7, 9; restriction fragment length patterns. lane 2, 3; 698C>T KEL*1 allele by cloning, lane 4, 5; case 1, lane 6, 7; case 2, lane 8, 9; case 3. All cases are shown no restriction fragment length patterns. The 698C>T KEL*1 allele by cloning shows restriction fragment, 100 and 56 bp. Fig. 2. The detection of KEL*1/KEL*2 allele using PCR-SSP. Lane 1; 100 bp DNA size marker, lane 2-3; 698C>T KEL*1 allele by cloning, lane 4-5; case 1, Lane 6-7; case 2, Lane 8-9; case 3. The amplified 434 bp is intermal control (HGH), 140 bp is KEL*1/KEL*2. The first lane of the case is KEL*1, the second lane of the case is KEL*

5 Table 2. Unexpected antibody identification of case 3 (Resolve Panel A Lot No. RA468) Rh Kell Duffy Kidd Xg Lewis MNS P Lutheran Result No D C E c e f Cw V K k Kpa Kpb Jsa Jsb Fya Fyb Jka Jkb Xga Lea Leb S s M N P1 Lua Lub RT Alb AHG I II 서항-K 항체를동정하여이를보고하게되었고, 이를계기로 K항원을발현시키는 KEL*1/KEL*2 대립유전자빈도를조사하였다. K항원은미국의백인에서 9%, 흑인에서 2% 를보인다고보고된바있으나한국에서는 K항원양성에대한보고가없다. 8,10-12) 저자들이 261명을대상으로시행한유전형분석에서도 KEL*1 대립유전자가검출되지않아국내 K 항원보유율이 0% 인것으로나타났다. 하지만저자들은항-K 항체 3예를동정하여후향적으로항-K 항체빈도를분석한결과총 130,000여건의항체선별검사결과중 3건의항-K 항체가동정되어 0.002% 인것으로판단할수있었다. 3예중 2예는수혈경험이있었다. 1예는 1951 년한국전쟁중파편제거수술 ( 가슴, 손가락 ) 중수혈을받았고나머지 1예는중동지역의건설현장의사고로인한수술중현지인의혈액을수혈받았다. 우리나라수혈의역사에서 1951년한국전쟁당시대량의수혈용혈액이미국으로부터유입되었고, 15) 사우디아라비아인의 K 항원보유빈도가백인이나흑인에비해높으므로 16) 2예모두 K 항원양성혈액을수혈받았을가능성이있다. 이후의수혈력이전혀없는점으로판단할때당시수혈에의해항-K 항체가유발되었을것으로추측된다. 3예중나머지 1예는수혈력이없어항-K 항체유발원인을판단할수없었다. 수혈에의한항-K 항체뿐아니라면역글로불린제제나, 세균감염에의한항-K 항체가보고된바있지만 17-19) 3예의경우모두별다른투약기록이없었고세균감염의임상소견도없었다. 국제적교류가잦은오늘날, 국내에도해외거주경험이있는사람들의동종면역에의한항-K 항체보유가능성이있음을시사하고있다. 국내외국인의비율이과거에비해높아졌고, 다문화가정의빈도가높아지고있어국내거주외국인

6 대한수혈학회지 : 제 22 권제 1 호 의진료시항-K 항체에의한신생아용혈성질환의가능성을배제할수없다고사료되어항-K 항체검출에대한경험과관심이필요하다고생각된다. 다행히저자들이경험한항-K 항체검출은그리까다롭지않았다. 비예기항체선별검사와동정검사모두 2+ 이상의응집강도를보였으며실온식염수법, 37 o C 알부민법, 항글로불린법단계에이르기까지그응집강도가유지되었다. 최근여러병원에서널리사용하고있는미세원주응집카드를이용한검출에도문제가없었다. 항- K 항체는강력한항원성을지니고있고심각한수혈부작용을유발하는것으로알려져있지만저자들의 Kell 유전형분석결과와같이한국인의 KEL*1 대립유전자보유비율이 0% 이고항-K 항체의검출에도 3가지방법동일한양상을나타내므로교차적합시험에의한안전한혈액의출고에는어려움이없을것으로판단된다. 젤이포함된미세원주응집법을시행하였다. 항-K 항체양성으로판정된 3예에대해서는중합효소연쇄반응-염기특이시발체를추가적으로시행하였다. 반응의대조용으로 KEL*1 대립유전자 (698 C>T) 를유발돌연변이를통해확보하였다. 결과 : 대상이된 261명과항-K 항체 3예모두 KEL*2 대립유전자만존재하는동형접합체였다. 항-K 항체가발견된 3예도모두 KEL*2/KEL*2 동형접합체였고세가지방법의항체동정검사결과는서로일치하였다. 결론 : KEL*1/KEL*2 대립유전자빈도는기존에보고된 K 항원표현형빈도와일치하였다. 저자들은 3예의항-K 항체를검출하였고 2예는외국인의혈액을수혈받은것으로추정할수있었다. 이는국내에서도항-K 항체에의한동종면역과용혈성수혈부작용의가능성이있음을시사한다고판단되었다. 요약배경 : 항-K 항체는용혈성수혈부작용을일으키는가장중요한비예기항체중하나이므로항- K 항체를보유한사람은반드시 K항원음성혈액을수혈받아야한다. 한국인의거의 K항원을보유하고있지않다. 저자들은 3명의항-K 항체양성을검출하였고이를계기로분자유전학적기법을이용한중합효소연쇄반응을통해한국인에서 Kell 혈액형군의대립유전자빈도를조사하였기에이를보고하고자한다. 방법 : 헌혈자 261명을대상으로중합효소연쇄반응-제한절편길이다형성을이용하여 KEL*1/KEL*2 대립유전자를분석하였다. 비예기항체동정검사는 Ortho사의혈구를이용한실온식염수법, 37 o C 알부민법, 항글로불린법의 3단계시험관법, 비드가포함된미세원주응집법, DiaMed사의혈구와 참고문헌 1. Garratty G, Dzik W, Issitt PD, Lublin DM, Reid ME, Zelinski T. Terminology for blood group antigens and genes-historical origins and guidelines in the new millennium. Transfusion 2000;40: Daniels GL, Fletcher A, Garratty G, Henry S, Jørgensen J, Judd WJ; International Society of Blood Transfusion. Blood group terminology 2004: from the International Society of Blood Transfusion committee on terminology for red cell surface antigens. Vox Sang 2004;87: Issitt PD, Anstee DJ. Applied blood group serology. 4th ed. Durham, North Carolina: Montgomery Scientific Publications, Westhoff CM, Reid ME. Review: the Kell, Duffy, and Kidd blood group systems. Immunohematology 2004;20:

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