KISEP Original Article 대한간질학회지 2004;8(2):108 8(2):108-115 115 Kainate 유발간질모델에서 Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease 의빠른소실과이에따른세포고사 신하영 이두재 조경주 김미애 이용현 허경 김경환 이병인 Rapid Loss of Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease and Subsequent Apoptosis in Kainate-Induced Seizure Model Ha Young Shin, M.D., Doo Jae Lee, Ph.D., Kyuong Joo Cho, M.S., Mi Ae Kim, M.D., Yong Hyun Lee, B.S., Kyoung Heo, M.D., Ph.D., Gyung Whan Kim, M.D., Ph.D. and Byung In Lee, M.D. Department of Neurology, College of Medicine, Yonsei University, Seoul, Korea PurposeThe DNA repair enzyme, apurinic/apyrimidinic endonuclease APE plays a role in base excision repair pathway involved in repairing apurinic/apyrimidinic AP site after oxidative stress. To reveal the relationship between APE and neuronal apoptosis associated with oxidative stress after kainate treatment, the temporal change of APE expression was investigated in kainate-induced seizure model. MethodsStatus epilepticus was induced by unilateral intrahippocampal injection of kainate. Superoxide anion radical production and DNA oxidation were evaluated by in situ detection of oxidized hydroethidine and 8-hydroxyguanine 8-OHG immunoreactivity. APE expression was examined by Western blot and immunohistochemical analysis. DNA fragmentation was visualized with terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated uridine 5 -triphosphate-biotin nick end labeling TUNEL staining. ResultsCell loss occurred at 24 hr in CA1, CA2, and CA3 after kainate-injection. 8-OHG immunoreactivity and oxidized hydroethidine were increased comparing with control after kainate-injection. APE immunoreactivity was decreased 4 and 24 hours in the hippocampus after kainate-injection. TUNEL-positive cells were observed 24 hours but not 4 hours in hippocampus after kainate-injection. In double labeling with APE and TUNEL, TUNEL-positive cells did not show APE immunoreactivity. These data showed that cellular oxidative stress was increased, thereby APE was decreased in the hippocampus after kainate-injection. Also, it was shown that the reduction of APE preceded DNA fragmentation. ConclusionThis study suggests that rapid loss of APE may produce the failure of DNA repair-machinary and then induce neuronal apoptosis following kainate-injection. J Korean Epilep Soc 2004;82:108-115 KEY WORDSKainateEpilepsy8-hydroxyguanineAPE Apoptosis. 서 론 - - - 108 대한간질학회지 2004;8(2):108-115
신하영 이두재 조경주등 Kainate 유발간질모델 - - 크레질바이올렛 (cresyl violet) 염색 Kainate 유발간질모델에서의뇌파검사 대상과방법 산소음이온라디칼 (superoxide anion radical, O.- 2 ) 검출 in situ- - 대한간질학회지 2004;8(2):108-115 109
간질모델에서의 DNA 복구효소 - - 산화적 DNA 손상검출 APE 면역조직화학염색검사 - DNA 분절현상 (fragmentation) 검출 - - APE 단백질검사 (Western blot) - 110 대한간질학회지 2004;8(2):108-115
신하영 이두재 조경주 등 nology, USA)을 사용하여 실온에서 1시간 동안 반응 시 웨어(Raytest Isotopenmeβgerate GmbH, Germany) 킨 후, 각각의 horseradish peroxidase-linked secondary 를 사용하여 정량 하였다. 항체로 실온에서 1시간 동안 반응시켰고, ECL Plus kit (Amersham Life Sciences, USA)를 이용하여 필름에 감광시켜 검출하였다. 이 필름을 LAS 1000(Fujifilm, Tokyo, Japan)을 이용하여 촬영하였고, TINA 2.0 소프트 통계 처리 자료 분석도구로 StatView(Version 5.0.1, SAS Institute, USA)를 사용하였다. Western blot에서 얻은 정량 값을 상대적인 단백질량(relative protein level)으로 전환 Contralateral hippocampus Figure 1. Cresyl violet staining and EEG recording after kainate treatment. A Histological change did not occur in the hippocampus 4 hr after kainate injection. However, cell loss was appeared in CA1, CA2, and CA3 of the kainite-injected hippo-campus (arrowhead) and CA3 of the contralateral hippocampus (arrow) 24 hr after kainate injection (original magnification 40). B Depth EEG recording during status epilepticus induced by kainate. EEG recording showed continuous epileptiform discharges in the injected hippocampus and intermittent epileptiform discharges in contralateral hippocampus (Gr, ground; Hp, hippocampus). Figure 2. Oxidative stress in hippocampus after kainate treatment. Superoxide anion radical production was visualized by the oxidized HEt signals (the oxidized HEt signal indicates red A-F, original magnification 400). After kainate treatment, there was a significant increase of oxidized HEt signals in injected (E, F) hippocampus compared with the control (A, B) and contralateral hippocampus (C, D). Inserts in D and F showed red granular pattern of oxidized HEt signals, which located in the perinuclear area (nucleus indicates blue) in the contralateral and injected hippocampus respectively (original magnification 1000). The oxidative DNA lesions were detected by anti-8-ohg antibody in the injected hippocampus 4 and 24 hr after kainate injection (I-L, original magnification 400). KA-injected hippocampus A B A C E B D F G I K H J L 대한간질학회지 2004;8(2):108-115 111
간질모델에서의 DNA 복구효소 해 주었으며, ANOVA(Post Hoc Tests)를 이용하여 통계 소체 염색이 약하였다. 또한 kainate 주입 후, 간질 중첩 처리하였고, p<0.05를 유의한 것으로 판정하였다. 현상이 나타나는 것을 확인하기 위해서 뇌파를 분석하였 다. 심부 뇌파(Depth EEG)을 관찰한 결과, kainate를 주 결 과 입한 해마(KA-injected hippocampus)에서는 연속적인 간질형 방전이 관찰되었고, 반대편 해마(contralateral hip- 해마 손상의 조직학적 분석 pocampus)에서도 간헐적 간질형 방전이나타났다(Fig. 1B). Fig. 1A에서 보듯이 kainate 주입 후 4시간에 시행한 Cresyl violet 염색 결과는 정상군의 결과와 비교할 때 큰 산소 음이온 라디칼 생성 및 산화적 DNA 손상 분석 변화가 관찰되지 않았다. 즉 4시간째 절편에서는 해마 부 산화된 hydroethidine 확인 검사와 8-OHG 면역조직 위의 세포 형태가 유지되었다. 하지만 kainate를 주입하고 화학 검사를 각각 시행하여 산화적 스트레스에 의한 세포 24시간 뒤에는 kainate가 주입된 쪽의 해마에서는 den- 손상을 확인하였다. 산소 음이온 라디칼 생성 정도와 그 위 tate gyrus를 제외한 CA1, CA2, 그리고 CA3 모든 부위 치를 확인하기 위하여 kainate 처치 3시간 뒤 hydroethi- 에서 신경세포 니슬소체의 염색 정도가 현저히 줄어들었 dine를 주입하였고 1시간 뒤 검사 결과, 정상군(Fig. 2A, 다. 또한 kainate 주입 반대편 해마에서도 CA3에서 니슬 B)에 비하여 kainate 주입 반대측 해마(Fig. 2C, D)와 Figure 3. Immunohistochemistry of APE. APE immunoreactivity was not changed in KA-injected hippocampus compared with control 1 hr after kainate treatment (G, H). But APE immunoreactivity was significantly decreased in KA-injected hippocampus 4 hr after kainate injection (K, L). APE immunoreactivity was further decreased in KA-injected hippocampus at 24 hr after kainate injection (O, P). APE immunoreactivity was also decreased in contralateral CA1 and CA3 24 hr after kainate treatment (M-N, original magnification 400). 112 대한간질학회지 2004;8(2):108-115
신하영 이두재 조경주등 A APE -actin B Relative protein level 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0 hr 1 hr 4 hr 24 hr 0 hr 1 hr 4 hr 24 hr Time Figure 4. Western blot analysis of APE after kainate treatment. APE expression was shown as 37-kDa and was significantly decreased in the kainite-injected hippocampus 4 hr and 24 hr after kainate treatment ANOVA, p0.05, p0.01. - APE 면역조직화학염색분석 * APE 단백질검사분석 (Western blot) - p p TUNEL 염색분석과 APE/ TUNEL의이중염색분석 고찰 대한간질학회지 2004;8(2):108-115 113
간질모델에서의 DNA 복구효소 A B C D E F Figure 5. TUNEL staining and double staining of APE/TUNEL 24 hr after kainate treatment. TUNEL-positive cells appeared in CA1 (C original magnification 400) and CA3 (D original magnification 400) of KA-injected hippocampus. TUNEL-positive cells showed in CA3 (B original magnification 400) of contralateral hippocampus after kainate injection. However, there was no TUNELpositive cell in CA1 of contralateral hippocampus (A original magnification 400). In double staining of APE/TUNEL, APE positive cells did not show TUNEL staining (E original magnification 400). In high power field (F original magnification 1000) TUNELpositive cells had no APE immunoreactivity (F, arrowhead), and APE positive cells showed no TUNEL staining (F, arrow). DNA 분절현상이 일어나기 전에 DNA 복구 효소인 APE 하면 8-OHG와 같은 병변이 나타날 수 있다.19 DNA의 단백질이 먼저 빠르게 소실되었다. 산화적 손상은 뇌허혈, 뇌 외상 그리고 kainate로 유발시킨 Kainate에 의한 발작 이후 산화적 스트레스가 증가하고, 12 간질 모델에서 입증되었다.7,20-22 본 실험 결과, kainate 주 산 입 4시간 후에는 8-OHG 면역 반응 정도가 약하게 보였 소 음이온 라디칼을 측정하는 방법으로 in situ HEt 방법 다. 하지만 kainate 주입 24시간 뒤에는 주입한 쪽 해마에 이 사용되고 있으며, HEt은 반응성 산소종에 의해서 붉은 8-OHG 면역 반응 정도가 현저히 증가되었다. Kainate 색 형광을 띠는 ethidine과 기타 소량의 기타 산화물로 산 주입 4시간 뒤에 in situ HEt 방법으로 확인한 결과 산화 화된다. 뇌허혈 모델, 3-nitropropionic acid 신경독성 모 적 스트레스가 크게 증가되어 있었지만 8-OHG 검사로 델, 외상성 뇌 손상 모델, 그리고 pilocarpine으로 유발된 확인한 산화적 DNA 손상은 크게 나타나지 않았다. 그리 간질 모델에서 HEt을 이용하여 산소 음이온 라디칼의 생 고 24시간째 8-OHG 면역반응이 크게 증가하였고 그 시 이것이 세포 손상에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 14-17 본 실험에서는 간대에 TUNEL 양성 세포들이 나타나기 시작하였다. 이 kainate에 의해 유발된 발작 후에 해마 부위에서 산소 음 것은 APE 등 DNA 복구 효소의 작용으로 4시간째에는 이온 라디칼의 생성 정도를 확인하기 위하여 in situ HEt 산화적 DNA 손상이 복구되어 8-OHG 양성반응이 거의 방법을 이용하였고, 산소 음이온 라디칼의 세포내 위치를 나타나지 않다가 APE의 양이 현저히 줄어든 24시간째에 알아보기 위하여 Hoechst로 같이 염색하여 비교하였다. 이 는 8-OHG 양성으로 표현되는 DNA 손상이 복구되지 못 실험을 통하여 kainate 처치 후 산소 음이온 라디칼의 생 하고 점차 누적되어 결국 세포 고사에 이르게 되었을 가 성이 증가되었고, 주로 세포질에 있는 미토콘드리아에 위 능성을 제시한다. 성 정도를 확인한 결과들이 밝혀졌다. 치해 있음을 추정할 수 있었다. 뇌 허혈과 뇌 외상 모델에서는 APE에 대하여 실험되 산화적 손상을 더욱 규명하기 위하여 산화적 DNA 손 었지만 간질 모델에서는 아직 APE의 변화와 세포고사에 상을 8-OHG 항체에 대한 면역반응 검사로 확인하였다. 대한 실험이 이루어지지 않았다. Rat에서 심정지 후 나타 Kainate에 의해 유발된 발작 후에 산소 음이온 라디칼이 증 나는 광범위 뇌 허혈(global ischemia) 모델을 이용한 이 가되고, 이것이 superoxide dismutase에 의해 H2O2로 변 전 실험에서 해마의 CA1 부분에서 APE 단백질이 감소하 한 뒤 Fenton 반응에 의해 HO (hydroxyl radical)가 생 였으나 APE의 mrna는 오히려 증가되어 있다고 보고 되 성될 수 있다. 이렇게 생성된 HO 이 DNA 염기와 반응 고 있다.4 그리고 또 다른 실험들에서 뇌에 손상이 가해져 114 대한간질학회지 2004;8(2):108-115
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