Kor J Oral Maxillofac Pathol 2011;35(5):273-284 <Abstract> 암세포주에양이온성리피드복합체를이용한유전자전달의효율성비교 최종선 1), 이석준 2), 곽희진 3), 홍승희 4) * 강원대학교의학전문대학원의학과미생물학교실 1), 단국대학교체육대학태권도학과 2), 한국보건복지인력개발원 3), 한북대학교식품영양학과 4) Efficiency of Gene Delivery-complexed with Cationic Lipid in Human Cancer Cell Lines Jong Seon Choe 1), Suk Jun Lee 2), Hee Jin Kwak 3), Seung Hee Hong 4) * Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine, Kangwon National University 1), Department of Taekwondo, School of Physical Education Dankook University 2), Korea human resource development Institutue for Health & Welfare 3), Department of Food Nutritional Sciences, Hanbuk University 4) For investigate intracellular function and role of genes in the biological processes, various gene delivery methods into cell have been developed. Many studies performed to construct optimum conditions of gene delivery into cells and tissues. In this study, we examined efficiency of gene delivery-complexed with cationic lipid vector in human cancer cell lines. GFP plasmids were complexed with cationic lipid and transfected into human cancer cell lines at different concentrations. And then, expression of GFP was analysed with fluorescent microscope and FACS. To determine efficiency of gene delivery, we investigated GFP expression level in various cancer cell lines. GFP expression cells were not shown in hepatocellular carcinoma cell line HepG2 and lung carcimona cell line A549 after 24hr transfection, while, GFP expression cells were observed at 500ng concentration after 48hr transfection. In colorectal carcinoma cell line HCT116, GFP expression cells were observed at 100ng and 500ng concentrations after 24hr transfection and slightly increased at 48hr. After transfection into ovary adenocarcinoma cell line SKOV3, we could found that many cells expressed GFP at 500ng concentration after 24hr and highly elevated GFP expression cells after 48hr. For further evaluate gene expression level, we confirmed GFP expression level by using FACS analysis after 48hr transfection. As a result, HepG2 was expressed GFP in very low level at 10ng, 100ng, and 500ng concentrations. We also identified that GFP was expressed low level at 10ng and 100ng in HCT116 and A549, but highly increased at 500ng concentration to 14.19% and 16.57%, respectively. In case of SKOV3, GFP expression was highly elevated to 13.14% at 100ng and 58.10% at 500ng compared with 10ng transfection. By Comparing efficiency of gene expression among cancer cell lines, GFP expression was similar with cell lines at 10ng transfection, but significantly differed from cell lines at 500ng higher concentration. Additionally, GFP expression level of SKOV3 was showed about 10 fold higher than HepG2, and about 4 fold higher than HCT116 and A549 at 500ng. These results demonstrated that efficiency of gene delivery-complexed with cationic lipid vector was the highest in SKOV3, while HepG2 was showed the lowest efficiency. Taken together, we could determined that efficiency of gene delivery into cells differed from each human cancer cell lines. Our study suggest that cellular properties should be considered in gene delivery-complexed with cationic lipid vector to improve cellular expression efficiency of gene. Key words:cationic lipid, Gene delivery, GFP, Human cancer cell lines. * Correspondence : Seung Hee Hong, Department of Food Nutritional Sciences, Hanbuk University, #233-1, Sangpae-dong, Dongducheon-si, Gyeonggi-do, 483-120, Korea. Tel: +82-31-860-1444, E-mail: hsh@hanbuk.ac.kr * 이논문은 2011년교육과학기술부로부터지원받아수행된연구임 (To J.C., 지역거점연구단육성사업 / 의료 바이오신소재융복합연구사업단 ). Received: Aug 31, 2011; Revised: Sep 01, 2011; Accepted: Sep 09, 2011 Ⅰ. 서론 유전자의기능을밝히는연구를비롯하여유전자를세포내부로전달하여세포내발현에따른영향을연구하기위
하여다양한방법들이활용되고있다. 세포내부로전달된유전자는그기능과다른유전자들과의연관성을밝히기위하여다양하게활용되고있다. 우선, 세포내로전달된유전자를다량으로발현시켜그기능과역할을밝히고자하는연구가주로이루어지고있다 1,2). 또한세포내특정유전자의발현을억제하거나제거하여그기능과역할을알기위한연구에도유전자의세포내전달이이용되고있다 3). 그리고유전적인결함으로병을유발하는원인이되는유전자를정상유전자로치환하거나, 암의치료등에도유전자의전달이매우중요한역할을하고있다 4). 유전자를세포내로전달하여성공적으로발현시키기위해서는여러가지극복해야할문제들이있다. 세포내유전자발현에서가장중요한부분은유전자를전달하는벡터의역할이라고할수있다. 현재다양한벡터들이개발되어이용되고있으며더욱안전하고효율적인벡터를개발하기위한연구가활발하게진행되고있다. 세포내유전자발현을최적화하기위하여서벡터의여러가지특성들을고려하여야한다 5,6,7). 즉, 발현하고자하는유전자를효율적으로전달할수있는지, 유전자전달벡터가세포에독성 (toxicity) 을유발하는지, 혹은숙주 (host) 의면역성 (immunogenicity) 을유발하는지, 유전자를전달한벡터는세포내에서잘분해되는지등의특성들이주로연구되고있다. 현재까지개발되어이용되고있는벡터는크게바이러스성벡터 (viral vector) 와비바이러스성벡터 (non-viral vector) 로구분할수있다. 비바이러스성벡터는유전자와복합체형성이잘되고, 생산이용이하고, 세포내독성및면역성유발이적다는장점이있다. 다만, 유전자전달의효율이바이러스성벡터에비하여낮은점이단점으로이러한점을개선하기위한많은연구들이이루어지고있다. 현재유전자전달에가장많이쓰이고있는비바이러스성벡터로는지질 (lipid), 리포좀 (liposome), 중합체 (polymer), 무기이온 (inorganic ion) 등이있다. 세포내유전자의전달에주로이용되는비바이러스성벡터로는양이온성지질 (cationic lipid) 이가장보편적으로사용되고있다. 이들은높은전달효율성을나타내고있으며사용이간편하여상용화가활발히이루어지고있다. 양이온성지질은양이온성머리 (head) 부분이 linker 를통하여소수성의 domain에연결되어있는구조로이루어져있다. 지질의양성을띠는머리부분은주로아민 (amine) 들을포함하고있으며 8), 유전자의핵산 (nucleic acid) 에있는음성을띠는인산기 (phosphate group) 와결합하는데필요하다 9). 양이온성지질의머리부분과소수성의 domain을연결하는 linker 부분은주로 ethers 와 esters 가이용되고있다. 소수성 domain 은주로지방산 (fatty acid) 과콜레스테롤 (cholesterol) 유도체들이구조를이루고있다. 양이온성지질들은양친매성으로소수성부분과친수성부분으로이루어져있으며이러한성질들이리포좀 (liposome) 이라고알려진구형의구조를형성한다. 리포좀은한층의지질이중층으로이루어진 unilamellar liposome 과여러층으로구성된 multilamellar liposome 으로구분하기도한다. 리포좀을이용한유전자전달의효율성은지질의구성에따라영향을많이받는것으로알려졌다 10). 리포좀을이용한유전자전달의효율성의차이는유전자와리포좀의생리학적인안정성, 세포내부로의침투성, 엔도좀방출 (endosomal release), 핵내의전달성 (nucleolar localization) 등에기인할것으로생각된다. 예를들면, polyethylene glycol(peg) 를리포좀에첨가하면안정성과침투성이높아지는것으로밝혀졌다 11). 양이온성폴리머 (cationic polymer) 는양성전하를갖는물질들로유전자와결합하여폴리플렉스 (polyplex) 라고불리는복합체를형성하여세포내로유전자를전달할수있다. 일반적으로많이쓰이는양이온성폴리머는 polyethylenimine(pei), polylysine, polyamidoamine(panam), chitosan 등이있다 12). 양이온성폴리머의특징은소수성부분을포함하지않고있어물에완전히용해될수있다 13). 또한유전자를작은크기로응집할수있어유전자전달의효율을더욱높일수있는장점이있다 14). 그러므로양이온성폴리머들을세포내로유전자를더욱안전하고효율적으로전달하기위한벡터로서활용하기위하여화학적구조의변형에따른생물물리학적인영향의차이나유전자의결합과응집에영향을주는요인등에대한연구가이루어지고있다. 즉, 유전자전달성과효율성을높이기위하여표면의특징 (surface properties), 용해성 (solubility), 응집방법 (aggregration behavior), 폴리플렉스의분해 (degradation of polyplex) 등이집중적으로연구되고있다. 또한 in vivo 에서암조직에표적하여유전자를전달할수있는방법들도 274
개발되고있다 15). 최근에는, branched polyethylenimine을이용하여전이되거나전이되지않은세포에서다른벡터들보다높은전달효율을가진양이온성폴리머벡터가보고되었다 16). 이벡터는 in vitro 뿐만아니라 in vivo 에서도낮은세포독성, 혈청 (serum) 과높은화합성 (compatibility), 그리고높은유전자전달효율을보여주고있다. 비바이러스성벡터가세포내에서효율적으로유전자를발현하려면여러문제점들을극복해야한다. 우선, 유전자를작은크기로잘응집시켜야하고세포막의수용체에특이적으로결합하여야한다. 또한엔도좀 (endosome) 에서분해되지않아야하며궁극적으로핵 (nucleus) 으로유전자를잘전달하여발현될수있도록해야한다 17). 아직은시작단계이지만, 유전자를세포내부로성공적으로전달하기위하여유전자전달에양이온성펩타이드 (cationic peptide) 들이이용되고있다. 양이온성펩타이드들은양성전하를띠는아미노산들 (lysine, arginine, histidine 등 ) 을포함하고있으며유전자의음성전하를띠는인산기와정전기적으로반응한다 18). 유전자와결합으로생성된작은 nanometer 크기의입자들은세포막의수용체들과결합하여세포내부로침투하게된다. 양이온성펩타이드들의길이와순서등을변형하여유전자전달의효율을높이기위한연구들이진행되고있다. 유전자전달의적합성과효율성을높이기위하여서로다른길이와종류의 branched 펩타이드조합을이용하여실험한결과최소한 6~8개이상의펩타이드들이유전자를응집하는데필요하다는결과가보고되었다 19). 또한 polyethylene glycol(peg) 등다른분자들과결합하여혈장단백질들과결합을억제하거나유전자와펩타이드복합체의혈액순환의기간을연장하기위한시도들이이루어지고있다 20). 세포내로유전자를전달하는방법으로일찍부터사용되어온벡터중의하나가무기이온 (inorganic ion) 이다. 그중에서도 calcium-phosphate 를이용한유전자의전달방법이주로이용되어왔으며, 유전자를세포로전달하기전에 calcium이나 magnesium 으로침전시키면세포내전달효율이증가하는것으로알려졌다. 유전자는우선 calcium 과복합체를형성하고 phosphate 는불용성의침전을형성하여세포내로 endocytosis 로전달된다. 배양액중의 calcium-phosphate- 유전자복합체는매우안정하며높은전달효율을보 이는것으로밝혀졌다 21). 또한무기이온을이용한유전자전달방법은간단하고효과적인방법으로서아직까지실험에널리이용되고있다 22). 하지만, 유전자전달효율이세포의종류나연구의조건에따라차이가많다는것이단점이다. 또한효율성높은유전자전달의위한물리, 화학적인조건이다른벡터들에비하여상당히제한되어있다는것도극복해야할문제이다. 최근에는, calcium-phosphate 를이용하여 in vivo 에서뼈조직에유전자를효과적으로전달할수있다는결과가발표되었다 23). 그러므로, 이실험에서는다양한암세포주에양이온성지질인 lipofectamin LTX를이용하여유전자를전달한후, 세포내에서유전자의발현을비교분석하고자하였다. Ⅱ. 재료및방법 1. 세포주및세포배양사람의간암세포주인 HepG2와대장암세포주인 HCT116 은 Dulbecco's modified Eagle medium(dmem, Invitrogen) 에배양하였다. 사람의폐암세포주인 A549와자궁암세포주인 SKOV3는 RPMI-1640(Invitrogen) 에배양하였다. 10% heat-inactivated fetal bovine serum(fbs, Invitrogen), 50 U/ml penicillin(invitrogen) 과 50 U/ml streptomycin(invitrogen) 이포함된배지를세포주들의배양에이용하였다. 이들세포주는 37, 5% CO 2 배양기에서배양하였다. 2. plasmid transfection 암세포주들에유전자를전달하기위하여, green fluorescence protein(gfp) 를발현할수있는 plasmid를사용하였다. 우선각각의암세포주를 well당 5 10 4 cells의갯수로 12-well 에분주하여배양하였다. 배양 24시간후에, 위의암세포주들에게 GFP-plasmid 를 10 ng, 100 ng, 500 ng의농도로양이온성리피드인 Lipofectamine LTX(Invitrogen) 를사용하여전달하였다. GFP-plasmid 전달방법은 opti-mem 160 μl에각농도에해당하는 GFP-plasmid 를넣고, 여기에 plus reagent를 0.5 μl를넣고상온에서 5분간반응한다. 여 275
기에 LTX reagent를 1.25 μl 첨가하여상온에서 30분간반응후, opti-mem을 840 μl 첨가하여잘섞어후세포에처리한다. 4시간후에, 10% FBS(Invitrogen) 가포함된 opti-mem 으로배지를교체하여배양하면서적절한시간에 GFP의발현을관찰한다. 3. 형광현미경관찰유전자전달을확인하기위하여, Lipofectamine LTX(Invitrogen) 를사용하여 GFP-plasmid 를전달한 HepG2, HCT116, A549, SKOV3 암세포주들을각각 24시간과 48시간후에형광현미경 (Carl Zeiss Observer 1, Germany) 으로유전자발현을관찰하였다. 세포의관찰배수는 100 를이용하였다. 4. FACS 분석 GFP-plasmid 전달후, 48시간에각각의암세포주들을 trypsin을처리하여회수하여 1200 rpm에서 10분동안원심분리하였다. 상층액은버리고 1 ml의 1X phosphate buffered saline(pbs) 에세포를재부유시켜 FACS tube로옮겨서다시원심분리하였다. 상층액은버리고 PBS에재부유시켜 BD FACScan flow cytometer 를이용하여형광을측정하였으며, BD CellQuest PRO software(bd Bioscience) 로 GFP 의발현정도를분석하였다. Ⅲ. 결과 1. 암세포주들에서 GFP 유전자발현세포의특성에따른유전자전달의효율을비교하기위하여 GFP 유전자를발현할수있는 plasmid 를양이온성지질과복합체를형성시킨후, 여러종류의암세포주에전달하여 GFP 유전자의발현을관찰하고자하였다. 실험에는각각다른기관 (organ) 으로부터유래한사람의암세포주를사용하여각각의세포의특성뿐만아니라사람의기관간의차이를알아보고자하였다. 사람의간 (liver) 에서유래한 hepatocellular carcinoma 세포주인 HepG2, 대장 (colon) 에 서유래한 colorectal carcinoma 세포주인 HCT116, 폐암 (lung carcinoma) 세포주인 A549, 그리고자궁암 (ovary) 유래의 adenocarcinoma 세포주인 SKOV3를이용하였다. 우선 HepG2에서 GFP의발현양상을형광현미경으로관찰한결과를보면, 유전자전달 24시간후에는 500 ng의농도에서도형광이관찰되지않는다 (Fig. 1). 하지만 48시간후에는 100 ng의농도에서희미하게 GFP 발현이관찰되고있으며 500 ng의농도에서는뚜렷하게 GFP를발현하는세포들이관찰되고있다. 대장암세포인 HCT116 에서는유전자전달 24시간후에 100 ng에서는빈도수는작지만 GFP를발현하는세포가관찰되며 500 ng에서는더욱많은세포들이뚜렷한형광을보이고있다 (Fig. 2). 48시간의경우, 24 시간과같은양상을보이고있으며, 다만형광을발현하는세포의수가약간증가한것을관찰할수있다. 폐암유래세포주인 A549는유전자전달 24시간후에는 HepG2와유사한양상으로 GFP를발현하는세포가관찰할수없으며, 48시간후에도 500 ng의농도에서적은숫자의세포에서 GFP가발현하고있는것을확인할수있다 (Fig. 3). 자궁암세포주인 SKOV3의경우, 전체적으로가장높은유전자발현을관찰할수있으며, 유전자전달 24시간후에 500 ng의농도에서상당히많은양의세포들이 GFP를뚜렷하게발현하는것으로알수있다 (Fig. 4). 또한 48시간후에는 100 ng의농도에서 GFP를발현하는세포들을관찰할수있으며, 500 ng의농도에서는매우많은수의세포에서뚜렷한형광을보이고있다. 위의결과들을종합하여보면, SKOV3 세포가암세포내유전자전달에따른유전자발현이가장효율적으로이루어지는것을확인할수있다. 반면에, 폐암세포주인 A549는높은농도와긴시간의유전자전달에도불구하고유전자발현효율이가장낮게나타나고있다. 또한시간에따른유전자발현의양상에도차이가있어 HepG2의경우는유전자전달 24시간후에는발현이거의일어나지않다가 48시간후에는증가하는것을관찰할수있다. HCT116 의경우는 24시간후에이미여러세포들이 GFP를발현하고있으며, 48시간후에는약간증가하는양상을보이고있다. 그러므로 GFP plasmid 를이용한유전자전달및발현의효율은세포주에따라많은차이를보이고있으며, 유전자전달시간에따라세포 276
Fig. 1. Fig. 2. Fig. 1. Expression of GFP in HepG2 cells transfected with different amount of DNA. HepG2 was seeded at 5 10 4 cells in 12 well plate. Next day, 10 ng. 100 ng. 500 ng of GFP plasmid were complexed with lipofectamin LTX at room temperature and transfected into cells. After 24hr and 48hr, GFP expression in live cells was observed using fluorescent microscopy (100 magnification). Fig. 2. Expression of GFP in HCT116 cells transfected with different amount of DNA. HCT116 was seeded at 5 10 4 cells in 12 well plate. Next day, 10 ng. 100 ng. 500 ng of GFP plasmid were complexed with lipofectamin LTX at room temperature and transfected into cells. After 24hr and 48hr, GFP expression in live cells was observed using fluorescent microscopy (100 magnification). 277
Fig. 3. Fig. 4. Fig. 3. Expression of GFP in A549 cells transfected with different amount of DNA. A549 was seeded at 5 10 4 cells in 12 well plate. Next day, 10 ng. 100 ng. 500 ng of GFP plasmid were complexed with lipofectamin LTX at room temperature and transfected into cells. After 24hr and 48hr, GFP expression in live cells was observed using fluorescent microscopy (100 magnification). Fig. 4. Expression of GFP in SKOV3 cells transfected with different amount of DNA. SKOV3 was seeded at 5 10 4 cells in 12 well plate. Next day, 10 ng. 100 ng. 500 ng of GFP plasmid were complexed with lipofectamin LTX at room temperature and transfected into cells. After 24hr and 48hr, GFP expression in live cells was observed using fluorescent microscopy (100 magnification). 278
주마다서로다른발현양상을보이고있다. 2. FACS를통한유전자발현분석형광현미경을통한실험에서유전자전달및발현의효율과양상이여러암세포주들간에차이가있다는것을관찰하였다. 그러므로유전자발현의효율을더욱정확하게정량화하기위하여 FACS를이용하여 GFP 유전자의발현을분석하였다. 네종류의암세포주에각각 10 ng, 100 ng, 500 ng의 GFP plasmid 를세포내로전달한후 48시간후에 FACS를실시하였다. HepG2 세포의경우, 500ng의높은 GFP plasmid 농도에서도유전자발현이거의일어나지않는것을알수있다 (Fig. 5). 10 ng과 100 ng의농도에서는유전자발현이거의일어나지않고있으며 500 ng으로증가시켜도유전자발현은 5.61% 로거의증가하지않고있다. HCT116 에서는 100ng까지는 HepG2와유사한양상을보이지만 500ng으로농도가높아짐에따라유전자발현이 14.19% 로상당히증가하는것을알수있다 (Fig. 5). A549 세포에서의유전자발현의특징은 10 ng의농도에서도 3.95% 로 다른암세포주들에비하여높은유전자발현이일어나고있으며, 500 ng의농도에서는 16.57% 로상당히증가하는것을확인할수있다 (Fig. 6). SKOV3 세포는형광현미경의관찰결과와같은양상을보이고있으며가장높은유전자발현을보이고있다. 10 ng에서는 0.72% 로유전자발현이거의없다가 100 ng에서는 13.14% 로급격히증가하고있으며, 500 ng에서는 58.10% 의매우높은유전자발현양상을보이고있다 (Fig. 6). 위의결과들을보면 FACS 분석을통한유전자발현의양상은형광현미경관찰과거의일치하고있으며, SKOV3 세포가가장높은유전자발현효율을보이고있다. 가장낮은유전자발현을보이는세포는 HepG2로형광현미경관찰에서가장낮은발현을보인 A549에비하여더욱낮은발현을보이고있다. 3. 암세포주들에서유전자전달의효율성비교사람의여러암세포주들을이용하여유전자전달의차이를비교분석하고자하였다. 앞실험에서이용한세포주들에서로다른농도의 GFP plasmid 를전달하여나타나는 Fig. 5. Fig. 6. Fig. 5. Efficiency of cationic lipid-complexed GFP plasmid transfection in HepG2 and HCT116 cells. Cells were seed in 12 well plates and transfected with 10 ng, 100 ng, and 500 ng of GFP plasmid. At 48 hr post-transfection, GFP expression was determined by FACS analysis. Fig. 6. Efficiency of cationic lipid-complexed GFP plasmid transfection in A549 and SKOV3 cells. Cells were seed in 12 well plates and transfected with 10 ng, 100 ng, and 500 ng of GFP plasmid. At 48 hr post-transfection, GFP expression was determined by FACS analysis. 279
GFP의발현을비교하였다. 우선, 각세포주에서농도에따른차이를서로비교하면, Fig. 7a와같다. 10 ng의농도에서는여러세포주간에유전자발현의큰차이를보이지않는다. 그러나 100 ng의농도에서는 SKOV3와다른세포들간에차이를보이기시작하며, 500 ng에서는더욱큰차이를보이고있다. SKOV3에 100 ng을전달하였을때발현하는 GFP 발현양은 HCT116과 A549에 500 ng의농도와거의비슷한수준을나타내고있다. 또한 500 ng의농도에서각암세포주들을비교하면, HepG2의발현이가장낮고 SKOV3 의발현이가장높은것으로나타나고있다 (Fig. 7b). 가장발현이높은 SKOV3는 HepG2에비하여약 10배이상, HCT116과 A549에비하여약 4배이상높은유전자발현양상을보이고있다. 그러므로같은조건에서세포주에따라유전자전달및발현의효율이크게차이가나는것을알수있다. 또한유전자의농도가높아질수록세포들사이의유전자발현의차이가커지는것을알수있다. 유전자전달의효율이가장높은세포는자궁암의 adenocarcinoma 에서유래한 SKOV3이고, 다음으로는폐암세포주인 A549 와대장암세포주인 HCT116이다. 간암의 hepatocellular 에서유래한 HepG2는유전자전달의효율이가장낮은것으로나타났다. Ⅳ. 고찰세포내부로유전자를전달하는다양한방법들이개발되고있으며효율성과안전성등을개선하기위한많은연구들이진행되고있다. 바이러스성벡터는유전자전달의효율은높은반면에생체내에서안전성을확보해야하는문제가있다. 비바이러스성벡터는안전성은높은반면에유전자전달의효율성을높이는것이극복해야할문제로남아있다. 이들벡터들의효율성을높이기위해서는유전자응집 (condensation), 세포막을통한세포내부로전달, 엔도좀방출, 세포질내로이동, 핵내부로전달, 전사 (transcription) 가능한형태로의전환등여러단계를고려하여야한다. 양이온성지질을이용한유전자전달에중요한단계로는유전자와지질과의 lipoplex 형성, 엔도사이토시스 (endocytosis) 로세포내부로침투, 엔도좀에서분해되지않고세포질로방출되는단계, 핵내부로전달된유전자의전사및발현등이있다. 왜냐하면, 세포내부로전달된복합체들은대부분엔도좀에서분해되어세포질로방출되지못하는것으로알려져있다 24). 양이온성지질을이용한유전자전달에서극복해야할또다른문제점은생체의혈액내에서복합체가빨리제거된다는점과조직이나기관의표적특이성이낮은점이다. 생체내로전달된 lipoplex 는혈액에 A B Fig. 7. Comparison of transfection efficiency of GFP plasmid. A: HepG2, HCT116, A549, and SKOV3 cells were transfected with GFP plasmid-lipofectamin LTX complex at various concentrations. After 48 hr, GFP expression patterns were analyzed by using FACS. B: 500 ng of GFP plasmid was transfected into various cell lines. Expression patterns of GFP in various cell lines were also determined with FACS analysis. 280
있는백혈구나 reticuloendothelial system에의하여주로제거되는것으로알려졌다. 이러한문제점을해결하기위하여복합체의표면을변형시켜려는연구들이진행되고있다. 최근에는 polyethylene glycol(peg) 를결합시킨 polyelectrolyte complex micelles(pecm) 를 in vitro 에서세포에처리하면유전자의세포내전달이증가하고, in vivo 에서는암조직에주로축적되는것으로보고되었다 25). 양이온성중합체 (cationic polymer) 와유전자를결합시켜세포에전달하고자할때에는주로결합강도 (binding affinity), 복합체의크기, 전하, 형태등을고려하여야한다. 유전자와복합체형성에는이온 (ion) 들, 온도, 전하의밀도등이영향을미치는것으로알려져있다. 그리고양이온성중합체를이용한유전자의전달은주로세포독성과비분해성등이문제가되고있다. 그러므로생체내에서분해가가능한중합체를개발하려는연구들이진행되고있다. 새로개발된중합체시스템인 poly(β-amino esters) 는유전자를 nanometer 크기로응집시킬수있으며물에더욱잘용해되며독성도적은것으로알려졌다 26). 또한이복합체는독성물질을생성없이쉽게합성될수있어유전자치료에적용이가능할것으로알려지고있다. 유전자전달의새로운벡터로사용되고있는양이온성펩타이드들은다른비바이러스성벡터들에비하여여러장점을갖는것으로알려졌다. 양이온성펩타이드들은염기성잔기들을많이가지고있어효율적으로유전자를응축할수있으며, 크기가작은복합체는혈액에서더욱안정할것으로생각된다. 복합체에리간드 (ligand) 를붙여특정한수용체나세포에특이성을부여할수있으며, 엔도좀막을선택적으로분해하여복합체들이세포질로쉽게방출될수있다. 또한짧은펩타이드사슬은복합체가핵에더잘들어갈수있는장점을부여한다. 이러한이유들로인하여새로운양이온성펩타이드벡터를개발하려는시도들이진행되고있다. 비바이러스성유전자전달의한계를극복하기위하여기존의방법들을개선하거나새로운방법들이개발해야하는필요성이커지고있다. 새롭게개발되고있는여러가지유전자전달시스템중의한분야로서나노물질 (nanoparticle) 과지질을결합시키거나여기에자기장을주는물질과같이복합체를형성하여유전자를전달하려는시도들이이루어지 고있다. 진단용이나치료용유전자를포함하는 lipid-coated nanoparticles 을개발하여생물학분야나의학분야에적용하려는시도들이이루어지고있다. lipid nanoparticle 들은양이온성머리부분을가지고있어음성을띠는유전자와결합이가능하고소수성의치료약은지질막에결합시키거나친수성의약은지질막내부의친수성공간에포함하여전달할수있다. 게다가자기장, 빛, 또는방사선등의외부자극에반응함으로써의학적으로더욱유용한 lipid nanoparticle들이개발되고있다. Promoter-enhancer 와전사활성물질을포함하는 lipid nanoparticle, 형광물질을내는 lipid-coated nonoparticle 등다양한종류의 lipid nanoparticle들은질병의진단이나암등유전자치료의효율을향상시킬것으로기대되고있다 27). 최근에는플라스미드 DNA, polyethyleneimine(pei), 그리고 magnetic nanoparticles(mnps) 를결합시킨새로운유전자전달벡터가개발되었다. 이러한벡터를만드는방법을 magnetofection 이라불리고있으며, 이렇게만들어진복합체들은 magnetofectin 이라불린다. magnetofectin들은빠른시간안에표적세포에농축될수있으며유전자전달의효율이자기장을사용하지않은벡터에비하여수천배이상증가하는것으로보고되었다 28). 그러므로이러한벡터들은세포나조직내에서유전자발현을상당히증가시킬수있으며기존에사용되고있는벡터들보다매우효율적으로유전자를전달할수있을것으로생각된다. 서로다른기관에서유래한암세포주에양이온성지질을이용한유전자전달의양상을알아보고자수행한실험에서보면암세포주에따라유전자발현의효율이매우다르다는것을확인할수있었다. 전체적으로유전자전달의효율이가장높은세포주는자궁암에서유래한 SKOV3이고, 가장낮은유전자전달을보이는것은간암세포주인 HepG2 로관찰되었다. 각세포주별로시간에따른발현양상을비교해보면 HepG2와 A549는유전자전달 24시간후에는발현이거의없다가 48시간후에높은농도에서발현이일어나고있었다. 반면에대장암에서유래한 HCT116 은유전자전달 24시간후에상당한세포들이유전자를뚜렷하게발현하고있으며 48시간이지나면조금증가하는양상을보이고있다. 이러한현상은세포외부로부터전달된유전자가발현하기까지의시간적인차이가있으며, 아마도세포 281
내에서유전자발현에필요한요인들의차이에의한것으로생각된다. 농도에따른유전자발현양상도세포주에따라다르다는것을역시확인할수있었다. HepG2는낮은농도인 10 ng과높은농도인 500 ng에서모두유전자발현양이낮은반면에, HCT116 과 A549는 10 ng과 100 ng에서는낮은유전자발현을보이다가 500 ng으로농도가높아지면유전자발현이상당히증가하는것을알수있었다. SKOV3는 100 ng의농도부터유전자발현이증가하기시작하는것을확인할수있었다. 그러므로암세포주들간의유전자발현의효율은낮은농도에서는거의비슷하지만농도가높아질수록더욱큰차이를보이고있는것으로나타났다. 유전자발현을형광현미경으로관찰한경우, A549 가유전자발현이가장낮은것으로관찰되었으나 FACS를통한분석의경우 HepG2가유전자발현이더욱낮은것으로나타났다. 아마도이러한차이를보이는것은각방법의민감도때문이라생각된다. 즉형광현미경은세포내부의형광이어느정도수준이상으로발현되어야만관찰이가능한데비하여 FACS 분석은전체세포내부의형광을나타내므로세포에서형광을발현하고있지만현미경으로관찰되지못한부분이 FACS 분석에반영되었을것으로추측된다. 500 ng의유전자전달농도에서유전자발현양상을비교하면 HepG2는전체세포의 5.61% 만이유전자를발현하는반면에 SKOV3는 58.10% 의세포가유전자를발현하고있으며약 10배정도차이를나타내고있다. 암세포주에따른이러한유전자발현의차이는여러단계의원인들이관련되어있을것으로생각된다. 유전자가세포내부로얼마만큼잘전달되고있는지, 엔도좀 (endosome) 에서분해되지않고얼마나안전하게세포질로방출될수있는지, 핵으로의전달은잘되는지, 핵내에서전사 (transcription) 잘이루지고있는지등다양한요인들이유전자발현의효율을결정할것으로여겨진다. 결론적으로본실험의결과에서알수있는것은서로다른암세포에같은종류의벡터를이용하여유전자를전달하더라도유전자의전달및발현효율이상당히차이가있다는것을확인하였다. 일반적으로유전자의세포내전달이나발현에관련된연구를진행하기위해서는높은유전자발현이필요할것으로생각된다. 그러므로각각의세 포주에가장효율적인유전자전달벡터를선택하여야하며, 각세포주에적합한최적의유전자전달시스템을먼저확립하여야할것으로생각된다. Ⅴ. 요약 1. 연구목적유전자의기능을밝히고생체내에서의역할을연구하는데필요한다양한유전자전달방법들이개발되고있으며, 효율성과안전성등여러조건들을만족시킬수있는최적의방법을확립하기위한연구가활발히진행되고있다. 이연구에서는유전자전달방법으로양이온성지질을이용하여사람의여러암세포주에서유전자전달의효율을비교하고자하였다. 2. 연구방법연구방법으로는 GFP plasmid를양이온성지질인 lipofectamin LTX와복합체를형성시킨후, 여러종류의암세포주에전달하여 GFP의발현양상을형광현미경과 FACS를통하여분석하였다. 3. 결과각각의암세포주에서 GFP 유전자발현을관찰해보면, HepG2와 A549의경우는유전자전달 24시간후에는 GFP 를발현하는세포가거의없으나 48시간후에는 500 ng에서약간증가하는것을알수있다. HCT116는 24시간후에 100 ng에서적은수의 GFP 발현세포를관찰할수있으며 500 ng에서는더욱많은세포들이 GFP를발현하고있다. 48시간후에는 24시간과크게차이는없으며약간의증가를보이고있다. SKOV3는유전자전달 24시간후에 500 ng에서상당히많은세포들이 GFP를발현하고있으며, 48시간후에는 100 ng과 500 ng에서 24시간보다더욱증가된양의 GFP 발현을관찰할수있었다. 유전자전달 48시간후에 FACS를통한 GFP 발현을분석 282
한결과, HepG2 는 10 ng, 100 ng, 500 ng 농도에서모두 유전가거의발현되지않고있다. HCT116 과 A549 는 10 ng 과 100 ng 에서는유전자발현이거의일어나지않고있으 며농도를 500 ng 으로증가시키면각각 14.19% 와 16.57% 로 GFP 의발현이증가하는것을관찰할수있다. SKOV3 의경우, 10 ng 에서는유전자발현이거의없고 100 ng 의 농도에서급격히증가하여 13.14% 를보이고있다. 500 ng 의농도에서는전체세포의 58.10% 가 GFP 를발현하는것 으로나타났다. 암세포주들간의유전자전달의효율성을 비교하면, 10 ng 에서는세포들간의차이를보이지않고있 다가 100 ng 에서차이를보이기시작하여 500 ng 에서더욱 큰차이를보이고있다. 500 ng 의농도에서비교하면, SKOV3 가 HepG2 에비하여약 10 배, HCT116 과 A549 에비 하여약 4 배이상의 GFP 발현이높은것을알수있다. 4. 결론 결론적으로양이온성지질을이용한유전자전달의효율 은자궁암세포주인 SKOV3 가가장높고, 다음으로폐암 세포주인 A549 와대장암세포주인 HCT116 으로나타났다. 간암의 hepatocellular 에서유래한 HepG2 가가장낮은유 전자전달효율을나타내고있다. 유전자전달및발현의 효율은서로다른기관에서유래한암세포주에따라많은 차이를보이고있는것을확인할수있었다. 그러므로세 포내유전자발현은각세포주의특성을고려하여가장 효율적인유전자전달조건을확립하는것이필요할것으 로생각된다. Ⅵ. 참고문헌 1. Vasir JK, Labhasetwar V: Polymeric nanoparticles for gene delivery. Expert Opin Drug Deliv 2006; 3: 325-344. 2. Gilmore IR, Fox SP, Hollins AJ, Akhtar S: Delivery Strategies for sirna-mediated Gene Silencing. Curr Drug Deliv 2006; 3:147-155. 3. Zhang S, Zhao B, Jiang H, Wang B, Ma B: Cationic lipids and polymers mediated vectors for delivery of sirna. J Control Release 2007; 123:1-10. 4. Kay MA: State-of-the-art gene-based therapies: the road ahead. Nat Rev Genet 2011; 12:316-328. 5. Ewert K, Ahmad A, Evans HM, Schmidt HW, Safinya CR: Efficient synthesis and cell-transfection properties of a new multivalent cationic lipid for nonviral gene delivery. J Med Chem 2002; 45:5023-5029. 6. Wang L, MacDonald RC: New strategy for transfection: mixtures of medium-chain and long-chain cationic lipids synergistically enhance transfection. Gene Ther 2004; 11:1358-1362. 7. Lv H, Zhang S, Wang B, Cui S, Yan J: Toxicity of cationic lipids and cationic polymers in gene delivery. J Control Release 2006; 114:100-109. 8. Ren T, Song YK, Zhang G, Liu D: Structural basis of DOTMA for its high intravenous transfection activity in mouse. Gene Ther 2000; 7:764-768. 9. Morille M, Passirani C, Vonarbourg A, Clavreul A, Benoit JP: Progress in developing cationic vectors for non-viral systemic gene therapy against cancer. Biomaterials 2008; 29:3477-3496. 10. Mok KW, Lam AM, Cullis PR: Stabilized plasmid-lipid particles: factors influencing plasmid entrapment and transfection properties. Biochim Biophys Acta 1999; 1419:137-150. 11. Song LY, Ahkong QF, Rong Q, Wang S, Ansell MJ, Mui HB: Characterization of the inhibitory effects of PEG-lipid conjugates on the intracellular delivery of plasmid and antisense DNA mediated by cationic lipid liposomes. Biochem Biophys Acta 2002; 1558:1-13. 12. De Smedt SC, Demeester J, Hennink WE: Cationic Polymer Based Gene Delivery Systems. Pharm Res 2000; 17:113-126. 13. Elouahabi A, Ruysschaert JM: Formation and intracellular trafficking of lipoplexes and polyplexes. Mol Ther 2005; 11:336-347. 14. Ruponen M, Seppo Yla-Herttuala S, Urtti A: Interactions of polymeric and liposomal gene delivery systems with 283
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