mabs 및 ADC 의 LC/MS 분리를위한 PLRP-S 폴리머역상컬럼 Intact mabs, 조각 mabs 및 ADC 의분석 응용자료 생물약제및생물의약품 저자 Suresh Babu C.V. Agilent Technologies, Inc. 개요 이응용자료는단일클론항체 (mabs) 및항체약물결합체 (ADC) 와같은대형생체분자의특성규명을위한폴리머기반역상컬럼의응용기술을기술하고있습니다. 폴리머컬럼의성능을파악하기위해 intact 및조각수준의 mabs 모두에대한연구가실시되었습니다. 그결과에따르면컬럼의우수한분리성능과더불어 mabs 및 ADC의일상적인 LC/MS 분석을위한적합성이증명되었습니다. 서론 단일클론항체 (mabs) 및항체약물결합체 (ADCs) 는본질적으로 heterogeneous 한치료제분자입니다 [1]. 이러한분자들은약물개발과정에서다양한변형을거칠수있으므로안전성과효능을보장하기위해서는철저한특성규명이요구됩니다. mabs 및 ADC 의주요특성규명을위해질량분석법검출을이용한역상액체크로마토그래피가가장일반적으로사용됩니다. 적절한 LC 컬럼과분석법의선택은재현성있는고분리능분리와고품질 MS 데이터생성에중요합니다. 일반적으로, 이동상으로 MS 친화적인이온쌍시약인포름산 (FA) 을사용할경우기존실리카기반역상컬럼에서총이온크로마토그램 (TIC) 피크모양이좋지않게나옵니다. 이는 LC/MS 결과 ( 분리능, 감도, MS 신호, 정확한분자량정보등 ) 에영향을미칩니다. 때문에, 생체분자의 LC/MS 분석을개선하기위해서는포름산조건과호환되는 LC 컬럼이중요한요구사항입니다.
본연구는 mabs 와 ADC 의 LC/MS 분석을증명하기위해폴리머역상컬럼 (Agilent PLRP-S) 을사용했습니다. PLRP-S 컬럼은폴리스티렌및디비닐벤젠으로만든단단하고큰다공성구형입자로채워집니다. 이러한입자들은전체 ph 범위에서물리화학적으로안정적입니다. 이입자들은본래소수성이므로, 역상분리를위해결합상이나알킬리간드가필요하지않습니다. 이장점덕분에실라놀및중금속이온이없는재현성높은재료가됩니다. 본연구에서는 LC/MS 분석법에 PLRP-S 컬럼을이용하여 ADC 를포함한여러가지치료제 mabs 를분석했습니다. 이러한접근법으로더우수한 LC/MS 결과를얻었으며, intact 및조각 mabs 및 ADC 의정확한질량을확인했습니다. 재료및방법 시료 치료제 mab1, mab2 및 ADC( 라이신결합체 ) 는현지약국에서구입하여제조업체지침에따라보관되었습니다. Intact: mab1, mab2 및 ADC 는 3% 아세토니트릴 (ACN) 에서 0.1% 포름산을사용하여 2µg/µL 의농도로희석되어 1µL 가주입되었습니다. 환원 : 20µL 의 mab(2µg/µl) 시료를 5µL dithiothreitol(dtt)(1m) 과혼합한다음 1 시간동안 37 C 에서배양했습니다. 파파인 (Papain) 분해 : 10µL 의 mab(2µg/µl) 시료를 5µL 분해버퍼 ( 시스테인함유 ) 및 5µL 의활성파파인 (Sigma) 과혼합했습니다. 혼합물을 3 시간동안 37 C 에서배양했습니다. IdeS 단백질분해 : 20µL 의 mab(2µg/µl) 시료를 0.5µL FabRICATOR(30 Units)(Sigma) 와혼합한다음 1 시간동안 37 C 에서배양했습니다. 실험기기 LC: Agilent 1290 Infinity LC 시스템 MS: Agilent 6530 Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight(Q-TOF) 와 Agilent Jet Stream 이온소스 분석조건 Agilent 1290 Infinity LC 시스템 컬럼 : Agilent PLRP-S, 2.1 50mm, 5µm, 1,000Å (p/n PL 1912-1502) 주입량 : 1µL 시료항온장치 : 5 C 이동상 A: 0.1% FA가함유된물 이동상 B: 0.1% FA가함유된 ACN 이동상변화도 : Intact 조각 0분에 20% B 0분에 20% B 4분에 20% B 10분에 50% B 5분에 40% B 10.1분에 85% B 10분에 70% B 11분에 85% B 11분에 90% B 11.1분에 20% B 11.1분에 20% B 중지시간 : 11.1분 처리후시간 : 4분 컬럼온도 : 80 C 유속 : 0.6mL/ 분 Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS 이온모드 : 양이온모드, 듀얼 AJS ESI( 프로필 ) 건조가스온도 : 350 C 건조가스유속 : 8L/ 분 Sheath 가스온도 : 400 C Sheath 가스유속 : 11L/ 분 Nebulizer: 35psi 캐필러리전압 : 5,500V Fragmentor 전압 : 380V Skimmer 전압 : 65V Oct RF Vpp: 750V MS 모드수집파라미터 : 1GHz에서수집된데이터, MS 전용모드, 질량범위 600 ~ 4,000m/z( 조각 ), 2,000 ~ 6,000m/z(intact) 데이터분석 : LC/MS의데이터를 Agilent MassHunter Qualitative Analysis 소프트웨어및 Agilent MassHunter BioConfirm 소프트웨어를이용해분석했습니다. 최대엔트로피및 pmod deconvolution 알고리즘을사용하여차례로약물결합항체 (ADC) 와 mab1/mab2의영전하 (zero-charge) 스펙트럼을획득했습니다. 2
결과및토의 향상된크로마토그래피성능을달성하기위해일반적으로이동상에이온쌍시약으로서 Trifluoroacetic Acid(TFA) 를추가하여더선명한크로마토그래피피크를생성합니다. 그러나, TFA 는신호억제효과때문에 MS 분석에적합하지않습니다 [2]. 포름산은생체분자응용분야에선호하는 MS 친화적이온쌍시약이지만기존실리카기반컬럼에서는피크모양이안좋아집니다. mabs 와같은고분자량단백질을분석할경우적절한크로마토그래피피크모양과높은신호대잡음비 (S/N) m/z 질량스펙트럼의달성은상충됩니다 [3]. MS 호환성과 mabs 및 ADC 분리가개선된적절한 LC 컬럼을선택하는것이중요합니다. mabs 분리를위해 LC/MS 와실리카기반컬럼을사용하는방법에대한지침은애질런트응용자료를참조하십시오 : 5991-6296EN, 5991-4266EN, 5991-2116EN 및 5990-9631EN[3-6]. 본연구에서폴리머기반 PLRP-S 컬럼을사용하여 intact 및조각수준에서 mabs 와 ADC 를분석했습니다. PLRP-S 는강하고기계적으로안정적이며, 대형생체분자응용작업에적합하게다양한구멍및입자크기로이용할수있습니다. Intact 분석그림 1은 PLRP-S, 2.1 50mm, 5µm, 1,000Å 컬럼을사용하여 intact mabs 및 ADC의 LC/MS 분석을보여줍니다. 이컬럼으로 0.1분의 half maximum에서의전체너비 (FWHM) mabs 그리고 0.25분의 FWHM ADC를가진우수한 TIC 피크모양을얻을수있습니다. 표준 RP 이동상시스템 (ACN + FA) 을사용하여좁은 TIC 피크너비가얻어졌습니다. 두 mabs에유사한피크너비가관찰되었으며이는다양한 mabs 시료에대해분석법의적합성을증명합니다. ADC 시료에대해서는좁은피크너비도입증되었으며이는높은 heterogeneous를나타냅니다. 또한 UV 검출을이용해동일한분석법조건과컬럼을테스트했으며, 동일한머무름시간프로필 ( 데이터표시되지않음 ) 로그만족스러운결과를얻었습니다. 그림 1. Agilent PLRP-S, 2.1 50mm, 5µm, 1,000Å 컬럼에서 intact mab/adc 의 LC/MS 분석. 위 : 총이온크로마토그램 ; 아래 : Deconvoluted 스펙트럼. FWHM: half maximum 에서의전체너비 3
Agilent MassHunter BioConfirm 소프트웨어를이용해원시 (raw) 질량스펙트럼을영전하 (zero-charge) 스펙트럼으로변환했습니다. 그림 1 은 deconvoluted 스펙트라를보여줍니다. 5 개의주요글리코형이 mab1 deconvoluted 스펙트럼에나타났으며반면에 mab2 스펙트럼에서는 4 개의주요글리코형이분명하게나타났습니다. ADC 에대한 deconvoluted 질량스펙트럼은 8 개의주요약물결합체 (D0 ~ D8) 를이용한한번의약물로드단계에서페이로드추세가증가하고있음을보여주었습니다. 조각분석 생성된조각을분석하기위해시료에화학및효소반응을적용했습니다. 그림 2 는 PLRP-S, 2.1 50mm, 5µm, 1,000Å 컬럼을사용하여, 환원된, IdeS 및파파인분해 mabs 및 ADC 의 LC/MS 분리를보여줍니다. 조각피크 ( 다른약물결합체종류를가진 LC, HC, ScFc, F(ab )2, Fc, 2 * Fab2, 및 ADC 조각 ) 는표준이동상시스템 (ACN + FA) 을이용해 PLRP-S 컬럼에서양호하게분리됩니다. 예상대로, 두개의 mab 시료에는분해후 2 개의주요조각을볼수있습니다. 그림 2. Agilent PLRP-S, 2.1 50mm, 5µm, 1,000Å 컬럼에서 mab 조각의 LC/MS 분석. 위 : 환원 ; 중간 : IdeS 분해 ; 아래 : 파파인분해 4
이러한주요조각피크사이의분리는더적절한 MS 감도와정확한분자량결정을위해충분히개선할수있습니다 ( 그림 3). 이용가능한여러라이신잔류물에서이루어진결합으로 heterogeneity 가높아지기때문에조각종류의분리는 ADC 시료에는매우난제에속합니다. 그림 2 는 PLRP-S 펌프에서글리코실화된 ADC 조각의분리를보여줍니다. 서로다른약물결합체가설명된 LC/MS 조건에서적절하게분리된다는사실이증명되었으며 PLRP-S 컬럼의분리성능을보여주었습니다. 그림 3 은 mab1 및 ADC 조각에대한대표적인 deconvoluted 스펙트럼을보여줍니다. 결론 Agilent PLRP-S 컬럼은 intact 및조각레벨에서 mabs 및 ADC 의분석에우수한분리성능을보여주었습니다. Agilent PLRP-S 컬럼은포름산함유이동상에서더우수한크로마토그래피성능과고품질의 MS 감응을제공했습니다. Agilent PLRP-S 컬럼과 Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS 를연계한 mab 및 ADC 분석이증명되었습니다. 그림 3. 대표적인 deconvoluted 질량스펙트럼. 위 : 환원 ; 중간 : IdeS 분해 ; 아래 : 파파인분해 5
참조문헌 1. Beck, A.; Reichert, J. M. Antibody-drug conjugates. mabs 2014, 6:1, 15-17. 2. McCalley, D. V. Effect of buffer on peak shape of peptides in reversed-phase high performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A 2004, 1038, 77 84. 3. Gudihal, R.; Suresh Babu C. V.; Tang, N. Analysis of Monoclonal Antibody(mAb) Using Agilent 1290 Infinity LC System Coupled to Agilent 6530 Accurate- Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF). 응용자료, Agilent Technologies, Inc. 발행물번호 5991-4266EN, 2014. 4. Suresh Babu, C. V. LC/MS of Intact TherapeuticMonoclonal Antibodies Using Agilent AdvanceBio RP-mAb. 응용자료, Agilent Technologies, Inc. 발행물번호 5991-6296EN, 2015. 5. Gudihal, R.; Suresh Babu, C. V.; Tang, N.; Madhavi H. N.; Uma, M. Intact Protein Analysis using an Agilent 6550 Q-TOF Mass Spectrometer. 응용자료, Agilent Technologies, Inc. 발행물번호 5991-2116EN, 2013. 6. Martosella, J.; Duong, P.; Moyer, S. Rapid UHPLC Analysis of Reduced Monoclonal Antibodies using an Agilent ZORBAX Rapid Resolution High Definition (RRHD) 300SB-C8 Column. 응용자료, Agilent Technologies, Inc. 발행물번호 5990-9631EN, 2012. 자세한정보 이러한데이터는일반적인결과를나타냅니다. 애질런트의제품및서비스에대한자세한정보는애질런트웹사이트 (www.agilent.com/chem) 를방문하십시오. www.agilent.com/chem/advancebio 연구용도로만사용하십시오. 진단용도로는사용하실수없습니다. 이정보는사전공지없이변경될수있습니다. Agilent Technologies, Inc., 2016 2016년 8월 1일한국에서인쇄 5991-7163KO 서울시용산구한남대로 98, 일신빌딩 4층우 )04418 한국애질런트테크놀로지스 ( 주 ) 생명과학 / 화학분석사업부고객지원센터 080-004-5090 www.agilent.co.kr