KISEP Otology Korean J Otolaryngol 2006;49:1159-64 전정유모세포에서 Minocycline 전처리를통한 Neomycin 이독성예방효과 ;Reactive Oxygen Species 와 Caspase-3 활성억제 단국대학교의과대학이비인후 - 두경부외과학교실, 1 의학레이저연구센터 2 김영생 1 안진철 2 백인영 2 이정구 1 정재윤 1 Minocycline Protects Vestibular Hair Cells from Neomycin-Induced Ototoxicity by Inhibiting Reactive Oxygen Species Production and Caspase-3 Activity Young Saeng Kim, MD 1, Jin-Chul Ahn, PhD 2, In Yeong Baek, BS 2 Chung Ku Rhee, MD 1 and Jae Yun Jung, MD 1 1 Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery; 2 Medical Laser Research Center, College of Medicine, Dankook University, Cheonan, Korea ABSTRACT Background and Objectives:Aminoglycosides, a commonly used antibiotic agent, destroys the sensory hair cells in the cochlear and vestibular system leading to irreversible hearing loss and balance problem. Minocycline, a second-generation tetracycline antibiotic, has been known to possess anti-apoptotic properties in addition to its antimicrobial action. We hypothesized that minocycline would attenuate aminoglycosides induced vestibulotoxicity in rat utricles. Subjects and Method:Utricular maculae prepared from postnatal day 3-4 rats were treated with neomycin alone or in combination with minocycline. For hair cell count, utricles were stained with phalloidin- FITC. Reactive oxygen species (ROS) was assessed using the fluorescent probe, hydrofluorescent diacetate acetyl ester (H 2 DCFDA). Caspase-3 activity was also examined using the fluorescent caspase-3 substrate. Results:Neomycin induced dose-dependent loss of utricular hair cells. Minocycline reduced ROS production and caspase-3 activation in neomycin treated utricular hair cells. Conclusion:Minocycline has protective effect in neomycin induced ototoxicity in rat utricle by inhibiting ROS production and caspase-3 activity. (Korean J Otolaryngol 2006;49:1159-64) KEY WORDS:Minocycline Caspase-3 Reactive oxygen species Utricle. 서 론 아미노글라이코사이드계항생제는높은효과와낮은비용때문에그람음성세균감염의치료에많이사용되고있고, 또한낭성섬유증이나 Duchenne muscular dystrophy 의치료에도사용되고있다. 1,2) 그러나아미노글라이코사이드계항생제는심각한이독성과신독성을일으킬수있어치료에제한을갖는다. 특히내이의청각과전정유모세포는아미노글라이코사이드계항생제같은다양한약물에반응하여비가역적인세포사가일어날수있다. 3) 이러한청각과전정유모세포의파괴는영구적인청력감소와어지 논문접수일 :2006 년 7 월 29 일 / 심사완료일 :2006 년 9 월 21 일교신저자 : 정재윤, 330-714 충남천안시안서동산 16 번지단국대학교의과대학이비인후 - 두경부외과학교실전화 :(041) 550-3973 전송 :(041) 556-1090 E-mail:jjking@dankook.ac.kr 러움을일으키게된다. 현재까지약물이나소음으로인한유모세포의이독성에대한생화학적기전에대해서많은연구가이루어졌으며, 몇몇연구결과에따르면 reactive oxygen species(ros) 의생성이아미노글라이코사이드계항생제의유모세포손상을유발하는것으로보고되고있다. 4,5) Caspase 는정상적으로비활성화형태로존재하는단백분해효소계로세포고사에중요한역할을수행하고내이의유모세포의고사에도중요한역할을한다. 또한아미노글라이코사이드계항생제에의한유모세포의고사는외인성경로와내인성경로중내인성경로가더큰역할을할것으로생각되고있다. 6) Minocycline 은넓은항균작용을갖는 2세대 tetracycline 계항생제로피부, 성기, 요로감염뿐만아니라폐렴이나여드름을치료하는데흔히사용된다. Minocycline 은항균작용뿐만아니라세포고사를억제하는특징을가지고있 1159
Minocycline 의전정유모세포이독성예방효과 다. 많은연구들은 minocycline 이 ROS뿐만아니라 inducible nitric oxide synthase(inos), caspase-1, cyclooxygenase-2(cox-2) 의발현을억제하고, 미토콘드리아에영향을주어 cytochrome C, AIF, Smac/Diablo 와같은세포고사에관여하는인자들이미토콘드리아로부터세포질로방출되는것을억제하는것을보여왔다. 7-9) 이와같은특징으로인해 minocycline이 Parkinson s disease, Huntington s disease와 amyotrophic lateral sclerosis 와같은 neurodegernerative 질환의진행과, 허혈로인한심근세포손상을억제하는것이여러연구에서증명되고있고, 8-11) gentamicin에의한와우유모세포손상을예방할수있음이보고되었다. 12,13) 본연구에서는 minocycline 이 neomycin 으로인한유모세포의손상을예방할수있음을전정기관중하나인난형낭반조직배양을이용하여알아보았고, 이러한예방효과는 neomycin으로활성화된 ROS 와주요 effector caspase 인 caspase-3의활성을 minocycline이억제함을통해일어남을알아보고자하였다. 대상및방법 난형낭반조직배양배양에이용된난형낭반조직은생후 3, 4일령 (P 3-4) 의흰쥐 Spraque-Dawley rat, Orient, Seongnam, Korea) 로부터얻어졌다. 흰쥐를 70% 에탄올에소독한후두부를절단하였다. 무균적방법으로박리하여난형낭반을얻었고, 이석막의제거없이전체난형낭반을배양하였다. 난형낭반의박리는상온의 Dulbecco s phosphate buffer saline (PBS, Hyclone Laboratory, Logan, UT, USA) 에서시행되었다. 배양액은 Dulbecco s modified Eagle s medium (DMEM, Hyclone Laboratory), 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone Laboratory), N-1 supplement(sigma, St. Louis, MO, USA), 그리고 100 U/ml penicillin(sigma) 으로구성되었다. 난형낭반은 24시간동안배양기 (37, 5 % CO 2 ) 에서배양되었다. 이독성유발및 Minocycline 의투여둘째날에 1 mm과 2 mm 농도의 neomycin(sigma) 을새로운배양액에넣어이독성을유발하였다. 그리고 1 mm 과 2 mm neomycin을처리한난형낭반에 10 um과 100 um의 minocycline 을처리하여결과를비교하였다. Minocycline 투여군은 neomycin 투여 2시간전에미리 minocycline 으로전처리를하였다. 또한 100 um의 minocy- 1160 cline만을배양액에투여하여 minocycline의이독성여부를평가하였다. 약물을투여한후전체양이 2 ml가되도록배양액이더해졌고, 난형낭반은 24시간동안 37 에서배양되었다. 전정유모세포수의평가난형낭반의유모세포의수를평가하기위해 phalloidinfluorescein isothiocyanate(phalloidin-fitc, Sigma) 형광염색을시행하였다. 배양마지막에난형낭반은 4% paraformaldehade로 1시간동안 4 에서고정한후이석막을제거하였다. 0.1 M PBS(pH 7.4) 로세척한후에 0.25% Triton X-100(Sigma) 로 3분동안처리한후상온에서 1.0 ug/ml phalloidin-fitc로염색하였다. 그후, 0.1 M PBS로 3번세척한후유리글라스에봉입한후 FITC에대한적절한필터 (absorption:494 nm, emission:518 nm) 를이용하여공촛점레이저주사현미경 (ZEISS510 META, Gottingen, Germany) 으로관찰하였다. 유모세포의수는유모세포가가장잘관찰되는곳에서 20,000 um 2 당유모세포의수를평균하여평가하였다. 각실험조건에서적어도 3개의난형낭반이이용되었다. 통계처리는 SPSS version 10.0을사용하였으며 Mann-Whitney test를이용하여 95% 유의수준에서검증하였다. ROS 생성의평가 ROS의측정은형광염료인 hydrofluorescent diacetate acetyl ester(h 2 DCFDA, Molecular probes, Eugene, OR, USA) 를사용하여평가하였다. 배양전난형낭반의이석막을주의깊게제거한후 1 mm의 neomycin 을처리한후 1분, 3분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간배양후에각각 ROS 의발현정도를살펴보았다. 각각의배양시간후에 37 에서 10 um H 2 DCFDA 를직접배양액에더한후 30분동안배양기에서배양하였다. 난형낭반을유리글라스에옮긴후고정없이공촛점레이저주사현미경으로관찰하였다. Neomycin 을처리 4시간후에 ROS 가가장많이발현됨을확인한후, 약물을처리하지않은대조군, 1 mm neomycin만을처리한군, 1 mm neomycin 과 10 um minocycline을처리한군으로나누어 4시간동안배양하여 ROS 의발현정도를비교하였다. Caspase-3 활성의평가 Caspase-3 의활성은형광 caspase substrate(caspg- LOW Red Caspase-3 Staining Kit, Biovision, Mountain View, CA, USA) 을이용하여평가하였다. 난형낭반은 ne- Korean J Otolaryngol 2006;49:1159-64
김영생외 omycin 과 minocycline 을처리하지않은대조군과 neomycin 만을처리한군, neomycin 과 minocycline 을처리한군과 neomycin과 caspase-3의억제제인 Z-VAD-FMK (Z-Val-Ala-Asp(Ome)-CH 2 F) 를처리한군으로나누어 12시간동안배양하였다. 형광 substrate 는배양마지막시간에 1 um의농도로직접배양액에더해졌다. 1시간후에난형낭반은상온에서 0.1 M PBS 로 3번세척한후에 4 에서 4 % paraformaldehyde로 1시간동안고정하였다. 고정한난형낭반의이석막을제거한후상온에서 phalloidin-fitc 로 1시간동안염색하였다. 염색된난형낭반을 0.1 M PBS 로세척한후공촛점레이저주사현미경으로관찰하였다. 결과 Neomycin 의이독성과 minocycline 의이독성예방효과 (Figs. 1 and 2) Minocycline 의이독성예방효과를평가하기위해난형낭반의조직배양을이용하였다. 정상난형낭반의유모세포의수는 20,000 um 2 당평균 237±20(n=3) 이었다. Neomycin 의농도가증가할수록생존한유모세포의수는감소하였는데 1 mm 과 2 mm에서각각 96±17(n=3) 과 66± 18(n=3) 으로정상난형낭반의유모세포의수에비해의미있게감소하였다 (p<0.05). Neomycin 1 mm에서 minocycline 10 um과 100 um을처리한난형낭반의평균유모세포의수는각각 121±23(n=4), 157±13(n=4) 이었고 100 um을처리한군에서만통계적으로의미있는유모세포생존효과를보였다 (p<0.05). Neomycin 2 mm에서는 minocycline 10 um 과 100 um 을처리하였을때, 각각 114 ±34(n=4), 126±25(n=4) 으로두농도모두에서통계적으로의미있는유모세포생존효과를보였다 (p<0.05). 마지막으로유모세포에대한 minocycline 의자체적인세포독성을알아보기위해 100 um의 minocycline 을배양액에넣 고 24시간배양하였는데평균유모세포의수는 203±22 (n=3) 로정상난형낭반의유모세포와비슷한결과를얻었다. ROS의활성 (Fig. 3) Neomycin 으로이독성을유발한후 ROS 측정형광염료인 H 2 DCFDA 를이용하여 ROS 의활성상태를평가하였다. 대조군에서는 ROS 의활성을거의확인할수없었고 neomycin을처리한군에서는 4시간째에 ROS 가가장활성화되었음을확인할수있었다. Minocycline 으로이독성을예방한군에서는 ROS 의활성이뚜렷하게감소된결과를보였다. Caspase-3의활성 (Fig. 4) 유모세포의형광 caspase-3의활성이약물처리 12시간후에측정되었다. Caspase-3 는 neomycin 1 mm 을처리한군에서높은활성을보였다. 어떠한약물도처리하지않은대조군에서도약간의 caspase-3 활성을보였지만 neomycin 을처리한군에비해매우적은활성을보였다. Neomycin 과 minocycline 을같이처리한군에서는 caspase- 3의활성이 neomycin 단독처리군에비해크게감소된결과를보였고대조군에비해서도더적은활성을보였다. Neomycin과 caspase-3 억제제인 Z-VAD-FMK를처리한군에서도 neomycin 을처리한군에비해감소된 caspase-3 의활성을보였다. 고찰 아미노글라이코사이드계항생제의임상적유용성은두가지큰부작용인이독성과신독성에의해제한되어왔다. 아미노글라이코사이드계항생제로인한세포손상의분자학적기전은아직까지정확히알려져있지않지만여러연구들은 ROS 의생성과 caspase-8, 3과같은 caspase 의활성, 미 No of hair cells 300 250 200 150 * 100 * 50 0 Control Minocycline Neomycin Neomycin 1mM 2mM No of hair cells 200 200 1 mm Neomycin * 150 100 50 0 0 10 um 100 um A B C Minocycline (um) No of hair cells 150 100 50 0 2 mm Neomycin * * 0 10 um 100 um Minocycline (um) Fig. 2. (A) Mean number of utricular hair cells per 20,000 um 2 in the control group (n=3) and groups treated with 100 um minocycline (n=3), 1 (n=3) or 2 mm neomycin (n=3). Minocycline-treated group was not significantly different from control group. Neomycin-treated groups were significant different from the control group. Mean numbers of utricular hair cells per 20,000 um 2 in treated 0 (n=3), 10 (n=4), 100 um minocycline (n=4) plus 1 mm (B), 2 mm neomycin (C)(*p<0.05). 1161
Minocycline의 전정 유모세포 이독성 예방 효과 토콘드리아의 transmembrane potential의 변화를 통한 cy- 되었다. 이 중 minocycline은 2세대 반합성, tetracycline tochrome c의 방출 증가와 c-jun N-terminal kinase의 계 항생제로 1세대에 비해 더 높은 조직 흡수와 더 긴 반 5,14) 1940년대, tetracyclin계 감기를 가지고 있다. 또한 minocycline은 고유한 항균 작용 항생제가 발견된 이래, 항균력을 높이고, 조직 흡수를 늘리 외에 세포 고사를 억제하는 역할을 하여 여러 가지 신경질 며, 반감기를 길게 하기 위해 다양한 분자학적 변형이 시도 환이나 허혈성 심장질환의 진행을 예방하는 것이 동물과 임 활성 등으로 보고하고 있다. Fig. 1. Photomicrographs showing utricular organotypic cultures labeled phalloidin-fitc. Upper column shows normal culture (A) and cultures treated with 1 or 2 mm of neomycin (B, C). Lower column shows culture treated with 100 um minocycline alone (D) or a combination of 100 um minocycline plus 1 or 2 mm of neomycin. E, F Scale bar shown in panels. A A B C D E F B C Fig. 3. Effects of minocycline on neomycin-induced production of reactive oxygen species (ROS). Four hours after neomycin treatment, utricle hair cells were loaded with H2DCFDA (10 um) for 1 hr at 37. Photomicrographs showing ROS activation in control (A), 1 mm neomycin (B), 1 mm neomycin plus 100 um minocycline (C). Scale bar shown in panels (H2DCFDA hydrofluorescent diacetate acetyl ester). A B C D Fig. 4. Photomicrographs showing red caspase-3 substrate activation in normal utricular culture (A), utricular cultures treated with 1 mm neomycin (B), utricular cultures treated with 1 mm neomycin plus 100 um minocycline (C), and cultures treated with 1 mm neomycin plus Z-VAD-FMK (D). The utricles were cultured for 12 hr. Neomycin induced activation of caspase-3 substrate was suppressed by minocycline and Z-VAD-FMK. Scale bar shown in panels. 1162 Korean J Otolaryngol 2006;49:1159-64
김영생외 상실험에서보고되고있다. 8-11) Minocycline은미토콘드리아로부터 cytochrome C의방출을억제하며 anti-apoptotic 단백질인 Bcl-2 의발현을증가시키고 p38 mitogenactivated protein kinase(mapk) 와 caspase-3의활성을방해한다고알려졌다. 내이에서도와우조직배양을통한실험에서 minocycline 이 gentamicin 으로유도된이독성을예방할수있음이보고되었고, 12) 비슷한실험을통하여이와같은보호기전은 p38 MAP kinase 와 caspase-3 의활성을억제하여유모세포의세포고사를억제하는것을통해이루어졌다는연구결과도있었다. 13) 본연구에서는먼저내이의다른기관인난형낭반을이용하여 neomycin 으로유도된난형낭반의유모세포의손상에 minocycline 이어떤영향을주는지알아보았다. 난형낭반에 neomycin을처리하고 24시간후에난형낭반의유모세포를정량적으로분석한결과 neomycin의농도가증가함에따라더많은수의유모세포가손상되었으며, neomycin 과 minocycline 을같이처리한군에서는모든군에서 neomycin만을처리한군보다유모세포의생존율이높았고, 10 um의농도에비해 100 um이더큰보호효과를나타내는것을확인할수있었다 (Figs. 1 and 2). 또한 minocycline 만을처리하여배양한난형낭반을대조군과비교한결과유모세포의수가큰차이가없는것을알수있었고, 따라서 minocycline 이유모세포에별다른손상을주지않는다는것을확인할수있었다. Minocycline 은항산화작용을가지고있다고알려져있다. Minocycline은 6-hydroxydopamine으로유도된신경독성과흰쥐소뇌뉴런의 ROS 의생성을방해하고혈장박탈로유도한망막신경절의 ROS 에의한손상도예방할수있다고보고되었다. 7,15) Hydrogen peroxide(h 2 O 2 ), nitric oxide(no), superoxide anion (O 2- ), hydroxyl radical( OH) 와같은 ROS는 transcription factor 활성, 유전자발현, 세포증식과같은많은세포내과정의조절에관여하는것으로생각되고있다. 그러나 ROS 의과생성은여러형태의세포사에관여하고, cisplatin 과아미노글라이코사이드계항생제, 소음으로인한유모세포의손상에도 ROS 의생성이관여된다고보고되고있다. ROS 의생성이내이의항산화체계보다우위에있을때유모세포의손상이초래되고, ROS가아미노글라이코사이드계항생제를처리한와우및전정조직배양에서과다발현됨이알려져있다. 16) 또한여러연구들은 vitamine E, D-methionine, α- lipoic acid와 ebselen 등의다양한항산화물질로 ROS의생성을막거나이미형성된 ROS 를 scavenge 함으로써이독성을예방할수있음을보였다. 17,18) 본연구에서는난형낭반조직배양에서 neomycin 처리후 ROS 의발현을형광시약인 H 2 DCFDA 를이용하여검사하였고 minocycline 으로이러한 ROS 의생성을억제할수있는지를보았다. 먼저 neomycin 처리후 1분, 3분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간후에각각 ROS 의발현정도를보았는데, 처리 4시간후에가장높은 ROS 발현을확인할수있었고, 이후발현정도가감소하였다. Minocycline 을같이처리한군에서는대조군에비해서는 ROS 의발현이증가되었지만 neomycin 만을처리한군에비해서는뚜렷하게 ROS 의발현이감소됨을확인할수있었다 (Fig. 3). 아미노글라이코사이드계항생제로인한유모세포의세포고사에서 downstream effector caspase 인 caspase-3 는매우중요한역할을한다. 전체 14개의 caspase가포유동물에서확인되었으며이중약절반이세포고사에기여하는것으로알려져있다. 세포고사와관련된 caspase는 upstream initiator caspase와 downstream effector caspase 로분류되어왔다. caspase-8, 9와같은 upstream initiator caspase의활성은 caspase-3 같은 downstream effector caspase 를활성화시킨다. Effector caspase 는 Bcl- 2 같은세포생존에필수적인단백질을분할함으로써세포고사를유도한다. 19) 본실험에서는형광 caspase-3 substrate 를사용하였는데, 이는세포내의활성화된 caspase-3 에의해분할되어붉은색의형광을발현한다. Neomycin 처리 12시간후에난형낭반조직배양에서높은 caspase-3 의발현을확인하였다. 12시간의배양시간은유모세포의사멸을일으키지않고 caspase-3의활성만을평가하기위해선택되었다. 본실험에서 minocycline은 neomycin으로인한 caspase-3 의발현을억제하였고, 이를통해 minocycline 이 caspase-3 로유도되는세포고사를막을수있음을확인하였다. 또한 minocycline 을처리한군은정상대조군에비해서도더적은 caspase-3 의발현을보여 minocycline 이정상적인배양중에일어나는생리적인세포고사도억제함을알수있었다. Caspase-3 억제제인 Z-VAD-FMK 을처리한군에서도 neomycin 만을처리한군에비해뚜렷한 caspase-3 발현감소를보였으나 minocycline 을처리한군에비해서는높은활성을보여 minocycline 이 caspase-3 로인한경로외에다른경로를통해서도세포고사를억제함을추측할수있었다 (Fig. 4). 따라서 minocycline 은아미노글라이코사이드계항생제와같이사용함으로써부가적인항균작용과더불어내이의유모세포의이독성을예방하여아미노글라이코사이드계항생 1163
Minocycline 의전정유모세포이독성예방효과 제로인한평형기능장애를예방할것으로기대된다. 결 론 난형낭의조직배양모델을통해 minocycline 이 neomycin 으로유발된전정이독성을 ROS 의생성억제와 caspase-3 의발현감소를통해예방할수있음을확인하였다. 중심단어 : 미노사이클린 Caspase 활성산소 난형낭반. 본연구는과학기술부 21 세기프론티어세포응용연구사업단연구지원에의한것임 (SC2100). REFERENCES 1) Barton-Davis ER, Cordier L, Shoturma DI, Leland SE, Sweeney HL. Aminoglycoside antibiotics restore dystrophy function to skeletal muscles of mdx mice. J Clin Invest 1999;104(4):375-81. 2) Mulherin D, Fahy J, Grant W, Keogan M, Kavanagh B, FitzGerald M. Aminoglycoside induced ototoxicity in patients with cystic fibrosis. Ir J Med Sci 1991;160(6):173-5. 3) Forge A, Li L. Apoptotic death of hair cells in mammalian vestibular sensory epithelia. Hear Res 2000;139(1-2):97-115. 4) Hirose K, Westrum LE, Stone JS, Zirpel L, Rubel EW. Dynamic studies of ototoxicity in mature avian auditory epithelium. Ann N Y Acad Sci 1999;884:389-409. 5) Forge A, Schacht J. Aminoglycoside antibiotics. Audiol Neurootol 2000;5(1):3-22. 6) Cunningham LL, Cheng AG, Rubel EW. Caspase activation in hair cells of the mouse utricle exposed to neomycin. J Neurosci 2002; 22(19):8532-40. 7) Shimazawa M, Yamashima T, Agarwal N, Hara H. Neuroprotective effects of minocycline against in vitro and in vivo retinal ganglion cell damage. Brain Res 2005;1053(1-2):185-94. 8) Wang X, Zhu S, Drozda M, Zhang W, Stavrovskaya IG, Cattaneo E, et al. Minocycline inhibits caspase-independent and dependent mitochondrial dell death pathways in models of Huntington s disease. Proc Natl Acad Sci USA 2003;100(18):10483-7. 9) Zhu S, Stavrovskaya IG, Drozda M, Kim BY, Ona V, Li M, et el. Minocycline inhibits cytochrome c release and delays progression of amytophic lateral sclerosis in mice. Nature 2002;417(6884):74-8. 10) Thomas M, Le WD, Jankovic J. Minocycline and other tetracycline derivatives: A neuprotective strategy in Parkinson s disease and Huntington s disease. Clin Neuropharmacol 2003;26(1):18-23. 11) Scarabelli TM, Stephanou A, Pasini E, Gitti G, Townsend P, Lawrence K, et al. Minocycline inhibits caspase activation and reactivation, increases the ratio of XIAP to smac/diablo, and reduces the mitochondrial leakage of cytochrome c and smac/diablo. J Am Coll Cardiol 2004;43(5):865-74. 12) Corbacella E, Lanzoni I, Ding D, Previati M, Salvi R. Minocycline attenuate gentamicin induced hair cell loss in neonatal cochlear cultures. Hear Res 2004;197(1-2):11-8. 13) Wei X, Zhao L, Liu J, Dodel RC, Farlow MR, Du Y. Minocycline prevents gentamicin-induced ototoxicity by inhibiting p38 MAP kinase phosphorylation and caspase-3 activation. Neuroscience 2005;131 (2): 513-21. 14) Wang J, Van De Water TR, Bonny C, de Ribaupierre F, Puel JL, Zine A. A peptide inhibitor of c-jun N-terminal kinase protects against both aminoglycoside and acoustic trauma-induced auditory hair cell death and hearing loss. J Neurosci 2003;113(24):491-502. 15) Lin S, Wei X, Xu Y, Yan C, Dodel R, Zhang Y, et el. Minocycline blocks 6-hydroxydopamine-induced neurotoxicity and free radical production in rat cerebellar granule neurons. Life Sci 2003;72(14): 1635-41. 16) Hirose K, Hockenbery DM, Rubel EW. Reactive oxygen species in chick hair cells after gentamicin exposure in vitro. Hear Res 1997; 104(1-2):1-14. 17) Fetoni AR, Sergi B, Scarano E, Paludetti G, Ferraresi A, Troiani D. Protective effects of alpha-tocopherol against gentamicin-induced Oto-vestibulo toxicity: An experimental study. Acta Otolaryngol 2003; 123(2):192-7. 18) Sha SH, Schacht J. Antioxidants attenuate gentamicin-induced free radical formation in vitro and ototoxicity in vivo: D-methionine is a potential protectant. Hear Res 2000;142(1-2):34-40. 19) Kirsch DG, Doseff A, Chau BN, Lim DS, de Souza-Pinto NC, Hansford R, et el. Caspase-3-dependent cleavage of Bcl-2 promotes release of cytochrome c. J Biol Chem 1999;274(30):21155-61. 1164 Korean J Otolaryngol 2006;49:1159-64