Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 29(1): 72-80 (2014) http://dx.doi.org/10.7841/ksbbj.2014.29.1.72 ISSN 1225-7117 / eissn 2288-8268 연구논문 종속영양질산화 - 호기적탈질세균 Stenotrophomonas sp. CW-4Y 의분리와질소제거특성 이은영 1 *, 이창원 2 Isolation and Nitrogen Removal Characteristics of Heterotrophic Nitrification-Aerobic Denitrifying Bacteria, Stenotrophomonas sp. CW-4Y Eun Young Lee 1 * and Chang Won Lee 2 접수 : 2013 년 12 월 30 일 / 게재승인 : 2014 년 2 월 15 일 2014 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Abstract: CW-4Y was identified as Stenotrophomonas sp. by morphological and physiological characteristics, and phylogenetic analysis of its 16S rdna gene sequence. Nitrogen removal by CW-4Y was analyzed in relation to the ammonium concentration, presence of organic carbon, carbon source, and carbon-to-nitrogen ratio (C/N). Stenotrophomonas CW-4Y has heterotrophic nitrification and aerobic denitrification abilities. Stenotrophomonas CW-4Y utilized only glucose as carbon sources, and heterotrophic nitrification and aerobic denitrification were observed regardless of the type of nitrogen source. The maximum ammonium removal rate of CW-4Y was 80 mg-n L -1 d -1 and its denitrification rate of 192 mg- N L -1 d -1 at NO 3 -N (about 280 ppm) in shake culture experiments at a C/N ratio of about 15 was about 30 times higher than those of other bacteria with the same ability. Keywords: Heterotrophic nitrification, Aerobic denitrification, Stenotrophomonas sp. Ammonia 1 수원대학교환경에너지공학과 1 Department of Environmental and Energy Engineering, The University of Suwon Tel: +82-31-220-2614, Fax: +82-31-220-2533 e-mail: ley@suwon.ac.kr 2 도드람환경연구소 2 Dodram Environmental Research Institute 1. 서론 질소는생물의주요영양소이며, 질소순환은육지생태계와수생태계에서그리고연결고리에서미생물이중요한역할을한다. 이때수생태계에막대한양의질소가순환하지않을경우부영양화등의환경문제가발생된다. 질소유입의주경로는축사및양계사의분뇨가함유된폐수이다 [1]. 각종폐수에서질소를제거하는과정은주로호기적환경의독립영양성질산화균과혐기적인환경에서의종속영양성탈질세균의상호작용의결과로나타난다. 질산화세균은호기적환경에서암모니아를아질산을거쳐질산으로산화시켜준다. 탈질세균은혐기적환경에서질산염이산소대신최종전자수용체로작용하여환원되면서에너지를생산하는과정으로질산을아질산으로환원시켜주고이는다시 NO, N 2 O의중간대사체를거쳐가스상의질소로전환된다 [2]. 하수처리장에서질소제거에이용되는대표적인질산화미생물은 Azotobacter, Azomonas, Clostridium, Nitobacter, Nitrosomonas와 Nitrospira가알려져있으며탈질화미생물은주로혐기적상태에생존하는미생물로 Agrobacter, Camphylobacter, Eikenella, Flavobacter, Kingella, Moraxella, Morococcus, Ochrobacterium, Oligella, Sphingobacterium, Tsukamurella 등이알려져있다 [3]. 그러나, 이와같은질소처리과정은질산화과정을안정화시키는데시간이오래걸리고질산화와탈질과정을두개의별도의시스템으로운전해야한다는어려운점이있다. 두개의대사과정은생리학적혹은생화학적인면에서구별된다. 질산화과정에참여하는세균의경우, 유기물에저해를받는반면에 [4], 탈질과정에는유기물이필요하다. 산소요구도역
종속영양질산화 - 호기적탈질세균 Stenotrophomonas sp. CW-4Y 의분리와질소제거특성 73 시상반된조건인데, 질산화세균은폐수의높은산소용해도 (DO) 를요구하나, 탈질세균의경우산소는유독하게작용하여무산소조로운영된다 [5]. 이와같은차이는폐수처리장의규모를대형화시키고초기건설비를높게투자해야하는문제점을유발한다 [6]. 1972년종속영양성질산화과정을하는 Arthrobacter sp. 가발견 [7] 된이후, 1983년 Thiosphaera pantotropha (Paracoccus denitrifican) 이종속영양성질산화와호기적탈질을수행한다는것이폐수처리장의활성슬러지에서발견되었다 [8]. 이후많은연구가진행되었으며, 이후 Alcaligenes faecalis [2,9], Bacillus sp. [10], Diaphorobacteria sp. [11], Acinetobacter calcoaceticus [12], Agrobacterium sp. [13], Pseudomonas putida [14], P. stutzeri [15], Microvirgula aerodenitrificans [16] 등이발견되었다. 종속영양성질산화및호기적탈질과정을통한질소제거기작은다양한측면에서유리한점이있다. 첫째로, 유기물과산소를이용할수있는조건이동일하여동시에질산화와탈질이한반응기내에서일어날수있다. 둘째로탈질과정이진행되는반응기내의 ph의변화를균형있게유지시켜서질산화과정중에일어나는산성화과정을억제해줄수있다. 마지막으로, 종속영양성질산화의최종생성물및기질이다양하기때문에다양한미생물의혼합배양을할수있고그응용범위도넓게확대될수있다 [17]. 본연구에서는암모니아를제거하기위한미생물을농화배양하는과정에서영양배지에서암모니아를제거하는종속영양성암모니아산화세균을분리하게되었다. 분리세균의생리학적특성을알아보는과정에서종속영양적질산화및호기적탈질이진행되는것을알았으며, 분자생물학적분석결과분리된미생물이 Stenotrophomonas sp. CW-4Y으로동정되었다. 지금까지많은종속영양적질산화및호기성탈질균이발견되었지만, 아직도별도의포기조와무산소조가운영되고있음은현장에서그효과를검증받지못했기때문이며게다가효율적인균주의개발이아직미흡하기때문이다. 따라서, 본연구를통해기존알려진유사균주와의비교를통해질소제거능력을비교하여보았다. 2. 실험재료및방법 2.1. 시료채취및균주의분리본실험에사용된시료는 I 시의공단의오염된하천슬러지를이용하였으며, 채취한시료는직사광선의차단을위해멸균한 1L 갈색채수병에넣은후 4 o C 냉장보관을하여실험실로운반하였다. 암모니아를제거하는균주를분리하기위하여위의시료 10 ml 을 LB Broth 배지 100 ml 를함유한 300 ml 삼각플라스크에접종한후 30 o C 에서 180 rpm 으로 24 시간진탕배양하였다. 물과혼합하였을때암모니아가스가발생되는혼합유박 ( 질소전량 4%, 인산전량 2%, 가리전량 1%, 피마자박 57%, 채종박 25%, 미강박 18%, ( 주 ) 케미칼 ) 0.2 g 과 Glucose 0.1% 가첨가된증류수 10 ml 에 LB Broth 배지에서전배양된균주 1mL 을 70 ml 용량의바이얼에서접종한후실리콘스토퍼로막고농화배양하였다 (Table 1). 이배양액에서발생되는암모니아가스를가스검지관 (KITAGAWA, Japan) 을이용하여측정하였다. 측정후암모니아가스의배출이균주를접종하지않은대조군에비해분해되는배양액을다시 5 회에걸친계대과정과정을마친후 LB Agar 배지에도말하였다. 형성된 colony 를화염멸균된백금이로 streaking 하였다. 이러한방법을 2~3 회반복한후독립된단일 colony 를배양하여위와같은방법으로혼합유박과 glucose 를넣은 vial 에접종하여암모니아가스가대조군에비해분해되는균주를최종적으로선택하였다. 혼합유박의성분과 C, H, N, S 조성은 Table 1 에나타냈으며, C, H, N, S 원소분석은 CHN/S Analyzer (LECO Corp., USA) 을이용하여분석하였고, 미량원소에대한분석은 ICP-OES (Optima 5300DV, Perkinelmer, USA) 로분석하였다. 2.2. 종속영양질산화 - 호기적탈질화균주의동정암모니아가스분해효과가있는것으로관찰된순수균주의 colony 는 MACROGEN 사에의뢰하여 16S rdna 의염기서열을분석하였다. 이때 primer 는 F27 (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3') 과 R1492 (5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3') 를사용하였다. 분석된염기서열은 The National Center for Biotechnology Information (NCBI) web site 의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) algorithm 을통해 Gen Bank database 와비교하여분리된미생물을동정하였다. 2.3. 분리균 Stenotrophomonas sp. CW-4Y 의암모니아가스분해평가암모니아가스분해능력을가진균주의암모니아가스분해능력을알아보기위해 70 ml vial 에혼합유박 0.2 g 을넣고 glucose 를 0.1% 함유한증류수 10 ml 에균주 1 ml 을접종하였다. 배양 2 일째와 7 일째암모니아가스검지관 (KITAGA- WA, Japan) 을이용하여암모니아가스의농도를측정하였다. 본실험의경우배양온도는 30 o C 였고, 180 rpm 으로진탕배양 Table 1. Compositions of sesame dregs CHNS ICP C H N S Qualitative analysis of ICP-OES Quantitative analysis of ICP-OES (PE) Cr Cu Fe Al Zn Mn 40.24 wt.%(dry basis) 5.78 wt.%(dry basis) 5.28 wt.%(dry basis) N.D. Sr, Mg, Ca, K, Na, Al, Si, Fe, Mn, Ti, Er, P, Li, Cu, Zn, Ba, V, Cl, Y, Cr 17 ppm 25.8 ppm 1145 ppm 1301 ppm 0.1 ppm 103.8 ppm
74 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 29(1): 72-80 (2014) 을실시하였다. 2.4. 배지순수분리된 Stenotrophomonas sp. CW-4Y 의암모니아가스분해활성테스트를위하여인공적으로배지에질소원을첨가한후확인하였다. 기본배지로써황산암모늄배지를이용하였고 [2], 증류수에 K 2 HPO 4 14 g, KH 2 PO 4 6 g, trisodium citrate dihydrate 17 g, (NH 4 ) 2 SO 4 2 g, MgSO 4 7H 2 O 0.2 g 그리고 trace mineral solution 을 2mL 넣어 1L 로만들었다. Trace mineral solution 은다음과같은성분을포함한다 : ethylenediamine - N, N, N', N'- tetra acetic acid, di sodium salt dehydrate (EDTA 2 Na), 57.1 g/l; ZnSO 4 7H 2 O 3, 9 g/l; CaCl 2 2H 2 O, 7 g/ L; MnCl 2 4H 2 O, 5.1 g/l; FeSO 4 7H 2 O, 5.0 g/l; (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 4H 2 O, 1.1 g/l; CuSO 4 5H 2 O, 1.6 g/l; CoCl 2 6H 2 O (ph=6.0), 1.6 g/l. Fig. 1. Schematic diagram of aerobic bioreactor. 1 Bioreactor (6 L; 17.5 25.5H ); 2 Impeller; 3 DO Meter; 4 Sampling port. 2.5. 호기적배양조건탄소원은기본배지에서의 glucose 대신구연산 (citrate) 염이사용하였으며, 질소원으로는기본배지에서의황산암모늄 ((NH 4 ) 2 SO 4 ) 대신에질산암모늄 (NH 4 NO 2 ) 이사용되었다. 기본배지 (100 ml) 는 250 ml 삼각플라스크에담았으며, 입구부분은실리스토퍼를이용하여막았다. 분리균주 Stenotrophomonas sp. CW-4Y 를멸균된 LB Broth 에접종되어 30 o C, 180 rpm 으로 24 시간전배양을한후, 5 ml 를분취하여새로운활성테스트배지에접종하였다. NH 4 +, NO 3 -, NO 2 - 이온, ph, 및 OD 측정을위해접종직후그리고 24 시간간격으로 3 ml 씩분취하였으며시간 ( 일 ) 의경과에따라관찰하였다. 일정양의황산암모늄에다양한농도의탄소원을첨가하여 C/ N 비율을 5, 10, 20, 30 에맞추어그에따른암모니아및질산염의제거율을알아보았다. 2.6. 혐기적배양조건분리균주 Stenotrophomonas sp. CW-4Y 의혐기적 ( 정치 ) 배양은 500 ml 혈청병을이용하여혐기적조건하에서수행되었다. 혈청병에각각황산암모늄과질산암모늄을넣은합성배지 100 ml 을분주한후 butyl rubber stopper 와 aluminum cap 을이용하여밀봉하였다. 그후혐기적조건을조성하기위하여질소 (99.9%) 가스로치환한후 24 시간 LB Broth 배지에서전배양한 CW-4Y 균주를 syringe 를이용하여 5mL 씩접종하였다. 30 o C 의인큐베이터에서정치배양을한후접종직후그리고 24 시간간격으로 3mL 분취하여 NH 4 +, NO 2 -, NO 3 - 이온농도를분석하였으며, ph, OD 측정을하였다. 시료채취시는혐기적상태를유지하기위하여 syringe 를사용하여분취하였다. 2.7. 호기적반응기운전조건호기적탈질화반응을확인하기위하여유리재질의 6 L (17.5 25.5H) 의반응기 (Fig. 1) 에 3L 의배지를넣고멸균한후전배양된균주를접종한후실험하였다. 반응기에는 DO meter 등이연결되어내부반응기의환경조건을모니터링할수있도록제작되었다. NaNO 3 와 glucose 를 C/N 비 15 로조절하였으며, 초기배지의 ph 는 7.14 였으며, NO 3 -N 의농도는 184 ppm, NO 2 -N 의농도는 0ppm 이였다. 배양온도는 30 o C 로조절해주었다. 그리고공급되는에어의양과배지의수면에위치한 impeller 의교반속도는 50 rpm 에서 200 rpm 사이로조절하여공기중의산소가녹아들게하여배지내의 DO 농도를조절해주었다. Sampling port 로부터 syringe 를이용하여하루에한번씩 5mL 의가스를취하여분석하였다. 2.8. 분석방법 NH 4 -N 의농도, NO 2 -N 및 NO 3 -N 의농도는 씨맥 (C-MAC) 사의시약을이용하여분광광도계 (DR5000 UV; HACH, USA) 를이용하여측정하였다. DO 는 DO meter (KRK Co., DO-5Z) 을이용하여측정하였다. 액체배양된균의광학밀도는분광광도계 (DR5000 UV; HACH, USA) 를이용하여 660 nm 에서 OD 를측정하었다. 3. 실험결과및고찰 3.1. 암모니아가스분해효과 Table 2 에는 I 공단내의다양한지역에서채취한슬러지를 LB 배지에서전배양한후두개의실험군으로접종한후의암모니아가스제거율을나타내었다. 두실험군은각각 0.1% Glucose 를넣은것과 Glucose 를넣지않은것으로구분하였다. 제거율은다음과같이계산하였다. 암모니아제거율 = Control 의암모니아 (ppm) Sample 의암모니아 (ppm) 100 Control 의암모니아 (ppm)
종속영양질산화 - 호기적탈질세균 Stenotrophomonas sp. CW-4Y 의분리와질소제거특성 75 Table 2. Effect of glucose concentration on the ammonia removal Sample Ammonia Measurement day Glucose 0% in sesame dregs Glucose 0.1% in sesame dregs Control Ammonia concentration 3rd 3 24.6 (ppm) 7th 53.4 70.6 A 3rd 0 93.5 7th 0 66.9 B 3rd 0-5 7th 0-23 C 3rd 0 4.9 7th 0-28 D 3rd -9.9-8.5 7th 27.4 13.5 E 3rd 26.3 21 7th 32.1 0 F 3rd -35.4 12 7th 42.9 0 G 3rd 13.5 21 7th 34 0 축산농가내의분뇨슬러리, 주변토양및하수처리장의활성슬러지등의다양한환경으로부터채취한총 7 개의실험군중 A 실험군에서 0.1% 의 Glucose 를첨가한경우, 3 일째암모니아가스의제거율이 93.5%, 7 일째 66.9% 로나타났으며, 이는모든실험군에서가장우수한제거율을보여주는것이었다. 이후 A 실험군에서배지종류를다양하게하여순수분리를하였다. 이로부터분리된 CW-4Y 균주의암모니아가스제거율은 3 째 100% 의제거율을보여주었다. 3.2. 계통학적특성암모니아가스분해능력이가장높았던 CW-4Y에대한계통학적특성을알아보았으며, 분석된 CW-4Y의 DNA 염기서열은총 1451 bp였고, NCBI Blast search한결과 CW-4Y는 Stenotrophomonas sp. M2T2B9 (NCBI accession number: GQ24 6699) 와는 1447/1450 (99%) 의상동성을보였다. 또한, 가열할경우열분해되어독성을가진염화물, 질소산화물, 황산화물, 인산화물등을방출하는유독물질인클로르피리포스를분해하는 Stenotrophomonas sp. YC-1 (NCBI accession number: DQ537219) 와는 1449/1453 (99%) 의상동성을보였다. 그리고, 클로르피리포스를분해하는것으로보고된 Stenotrophomonas sp. Dsp-4 (NCBI accession number: DQ482654) 와 1449/1453 (99%) 의상동성을가진채가장유사하였다. 지금까지알려져있는질산화미생물로는 Azotobacter, Azomonas, Clostridium, Nitobacter, Nitrosomonas와 Nitrospira가알려져있으며, 혐기적탈질화미생물은 Agrobacter, Camphylobacter, Eikenella, Flavobacter, Kingella, Moraxella, Morococcus, Ochrobacterium, Oligella, Sphingobacterium, Tsukamurella 등이알려져있다. 본연구에서분리된 Stenotrophomonas sp. CW- 4Y는지금까지보고된암모니아분해미생물과는다른 Stenotrophomonas sp. 이며기존 data base에있는 Stenotrophomonas sp. M2T2B9 (GQ246699), Stenotrophomonas sp. YC-1 (DQ537219), 및 Stenotrophomonas sp. Dsp-4 (DQ482654) 의 염기서열과의상동성은모두 99% 이었다. 3.3. 질소원에따른암모니아분해능력평가탄소원으로 glucose 를이용하고, 두종류의질소원에대한분리균주 CW-4Y 의활성을호기적진탕배양조건에서확인하였다 (Fig. 2). 일반적으로미생물은 C/N 비 10 에서의성장과기질이용도가높다고잘알려져있다. 따라서, 초기질소원에따른실험을수행할때의 C/N 비는모두 10 으로설정하였다. 질산암모늄 (NH 4 NO 3 ) 을질소원으로넣어준배지는 CW-4Y 를접종후 5 일째초기농도인 NH 4 + -N 192 mg/l 중평균 143.3 mg/l 를분해하였으며, NO 3 -N 는초기농도인 282 mg/l 를 2 일째까지 256 mg/l 을분해하여 128 mg- N L -1 d -1 의빠른제거속도를보여주었다 (Fig. 2(A)). 반면, 황산암모늄 (NH 4 ) 2 SO 4 을질소원으로넣어준배지에서는초기 NH 4 + -N 농도 448 mg/l 를 5 일째까지 160 mg/l 을분해하였으며, 제거속도는 32 mg-n L -1 d -1 로질산암모늄을질소원으로넣어준배지와거의유사한 NH 4 + -N 의제거속도를보여주었다 (Fig. 2(B)). 그러나 NO 3 -N 는배지에서는초기 NO 3 + -N 농도 22 mg/l 를 5 일째까지의제거속도는 0.5 mg-n L -1 d -1 으로질산암모늄을넣어준배지의제거속도의약 100 배이상의차이가나는데이것은실험초기의질산암모늄농도에기인한결과라사료된다. 황산암모늄배지와질산암모늄배지모두접종후 2 일째최대제거속도로 NH 4 -N 와 NO 3 -N 를제거하였으며, 이는 2 일째 CW-4Y 의성장이대수증식기로인한것으로사료된다. 각각의최대제거속도는황산암모늄배지에서 NH 4 + -N 이 74.3 mg- N L -1 d -1, NO 3 -N 이 3.3 mg-n L -1 d -1 이였고, 질산암모늄배지에서 NH 4 + -N 는 80 mg-n L -1 d -1, NO 3 -N 이 192 mg- N L -1 d -1 로높은제거속도를보여주었다. Joo 등 (2006) 의 Alcaligenes fecaelis No.4 를이용한축산분뇨정화처리를연속공정으로처리하는연구에서초기값이 2000 NH 4 + -N mg/l 일때 30 mg-n L -1 d -1 의제거율을보였다.
76 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 29(1): 72-80 (2014) Fig. 2. Effect of Nitrogen source on the ammonium and nitrate removal of Stenotrophomonas sp. CW-4Y in an aerobic culture. (A) Medium containing NH 4 NO 3, (B) medium containing (NH 4 ) 2 SO 4. ( NH 4+ -N; NO 3 -N) Fig. 3. Effect of Carbon source on the ammonium and nitrate removal of Stenotrophomonas sp. CW-4Y in an aerobic culture A, Glucose; B, Citric acid. ( NH 4+ -N; NO 3 -N) 이는기존의연구에비해 5~10 배높은속도를보였다고하였다 [18]. 본연구는인공합성폐수의초기농도가 192~448 NH 4 -N mg/l 로 Joo 등 (2006) 에비해다소낮은값을보이나그제거속도는 2.5~2.6 배가량높았다. Rhodococcus sp. CPZ 24 를이용한삼각플라스크실험에서는초기암모니아의농도값이 50 NH 4 -N mg/l 이었을때, 3.1 mg-n L -1 h -1 의제거율을보였다 [19]. Su 등 (2006) 의연구에서는 Pseudomonas alcaligenes AS-1 가 1.15 mg-n L -1 h -1 의암모니아제거율을보였으며 [20], Zhao 등 (2010) 의연구 [21] 에선, Bacillus sp. LY 가초기암모니아의농도값이 41 NH 4 + -N mg/l 이고, C/N 비가 15 이었을때, 0.43 mg-nl -1 h -1 의제거율을보였다. 본연구에서얻은암모니아제거율을시간단위로환산할경우, 3.1~3.33 mg-n L -1 h -1 의제거율을보이므로초기값이기존발표보다약 3.8~9 배가량높은것을감안하면매우효과적인제거효율을보이는것을알수있었다. 3.4. 탄소원에따른암모니아분해능력평가질소원으로 (NH 4 ) 2 SO 4 를넣고두종류의탄소원이첨가된조건에따라 CW-4Y 의 NH 4 + -N 와 NO - 3-N 의제거능을알아보았다. 실험은진탕배양조건으로하였으며실험초기의 C/N 비는참고문헌등에의거하여 10 으로설정하였으나, 이후적절 한 C/N 비조건을찾은후 16 으로다시조절하였다. Fig. 3(A) 를보면 glucose 를탄소원으로넣어준배지는 CW- 4Y 를접종후 5 일째 NH 4 + -N 360 mg/l 와 NO 3 - -N 35 mg/l 는완벽히분해되었다. 즉, NH 4 + -N 와 NO 3 -N 를동시에분해를할수있는, 질산화와탈질화가동시에이루어진다고할수있다. 반면 Fig. 3(B) 인구연산염 (citric acid) 을넣어준배지에서는 NH 4 + -N 와 NO 3 - -N 모두분해되지않는모습을보여주었는데이는 CW-4Y 균주는탄소원으로 glucose 를쉽게이용할수있으며, 반면에구연산염은탄소원으로이용할수없는것으로사료된다. Glucose 를탄소원으로이용하였을때 NH 4 + -N 의분해속도는 72 mg-n L -1 d -1 였으며, NO 3 -N 의분해속도는 7mg- N L -1 d -1 이였다. 분리균주와동일한활성을보이는것으로알려진 Agrobacterium sp. LAD9 의경우 glucose, sucrose 및기타 4 종류의유기산을이용하는실험에서탄소원에대한이용도를알아본결과, growth rate 는유사한 (0.14~0.16 h -1 ) 결과를보이는반면, 질소분해속도는 acetate (0.32 d -1 ), succinate (0.44 d -1 ), 및 glucose (0.21 d -1 ) 는높았고, citrate 를탄소원으로이용시분해속도 (0.14 d -1 ) 가낮았다 [13]. Chen 과 Ni 의설명에의하면, citrate 를기질로이용할경우대부분이 biomass 의증가에이용됨에따라미생물의질산화속도가낮아진다고하였다.
종속영양질산화 - 호기적탈질세균 Stenotrophomonas sp. CW-4Y 의분리와질소제거특성 77 Fig. 4. Effect of C/N ratio of substrate on the ammonium-n removal rate. 3.5. C/N 비에따른암모니아분해능력평가배지내의 C/N 비의변화에따라분리균주 CW-4Y 의암모니아제거에미치는영향을알아보았다 (Fig. 4). 일정량의황산암모늄이첨가된배지에탄소원으로이용되는 glucose 의양을달리하여 C/N 비를각각 5, 10, 16, 20, 30 으로설정한후실험을진행하였다. 일반적으로미생물은 C/N 비 10 에서의성장과기질이용도가높다고잘알려져있다. 실험결과, 분리균 CW-4Y 의경우 C/N 비가 5, 10, 16, 20, 30 에서암모니아의분해속도가각각 38.6 mg- N L -1 d -1, 39 mg- N L -1 d -1, 72 mg- N L -1 d -1, 24.3 mg- N L -1 d -1, 25.8 mg- N L -1 d -1 으로나타나 C/ N 비 16 에서가장높은것으로나왔다. 본연구결과와비교할수있는호기성종속영양질산화탈질세균으로알려진 Bacillus subtilis A1 은 acetate 를기질로이용할경우초기암모니움의농도값이 104.27~110.31 NH 4 + -N mg/l 일때, C/N 비가 6 혹은 12 에서큰차이없이 66.5% 와 60.3% 의 NH 4 + -N 의분해효율을보였으며 [22], Bacillus sp. LY 의경우, C/N 비가 15 이었을때, 0.43 mg-n/l h -1 의 NH 4 -N 제거속도를보여주었다 [21]. 즉, 종속영양성질소분해세균의경우기질의종류와균주에따라, C/N 비가 6-15 사이에서최고의암모니아분해효율을보임을알수있었다. 3.6. 호기적 ( 진탕배양 ) 상태와혐기적 ( 정치배양 ) 상태에따른암모니아및질산염의분해분리균주 CW-4Y 의 NH 4 + -N 와 NO 3 - -N 의분해를산소의유무에따라확인하였다. 호기적배양과혐기적배양모두질소원으로는질산암모늄을이용하였으며, 탄소원으로는 glucose 를이용하였으며, C/N 비는 16 으로맞춰주었다. NH 4 + -N 의경우호기적배양에서 6 일간총 148 mgnh 4 + -N/L 를분해하였다. 평균제거속도는 24.7 mg-n L -1 d -1 이였으며, 최대제거속도는 2 일째 80 mg- N L -1 d -1 의제거속도를보여주었다. 반면에혐기적배양의경우 NH 4 + -N 는분해되지않았다 (Fig. 5(A)). 호기적및혐기적배양에서초기 NO 3 -N 의값은각각 282 mg/l 와 277.3 mg/l 였다. 각조건에서총 237.8 mg/l 와 234.7 mg/l 의유사한양을분해하였지만최대제거속도는호기적 배양에서 2 일동안 192 mg- N L -1 d -1, 혐기적배양에서하루만에 253.3 mg- N L -1 d -1 의제거속도를보여주었다. Fig. 5(B) 에서보는바와같이혐기적환경에서배양된 Stenotrophomonas sp. CW-4P 균주는기질로이용되는 NO 3 -N 를하루만에 91.3% 를제거할수있는것을알수있었다. 이는기존의탈질화가혐기적조건하에서이루어진다는결과와같지만 CW-4Y 는호기적조건하에서도 NO 3 -N 를분해하는것을확인할수있었다. 이는, 기존에보고된 A. faecalis OKK17 의최대탈질화속도는 8.3 mg- N L -1 d -1 인것에비해호기적배양에서는약 23 배, 혐기적배양에서는약 30 배나높은수치였다 [23]. 균주접종후 1 일후에호기적배양에서 17.3 mg/l 의 NO 2 - N 가생성되었고, 그이후는평균 0.11 mg/l 이측정되었다. 이는암모늄의아질산화가 1~2 일째가장빨리이루어졌다고볼수있으며, NH 4 + -N 의최대분해속도역시 2 일째 80 mg- N L -1 d -1 로가장빨랐다. 반면혐기적배양에서는평균 0.06 mg/l 의 NO 2 -N 가검출되었다. Fig. 5(E) 의결과에서보듯이, CW-4Y 의성장은혐기적조건에서는저해를받으며, 호기적으로질산화와탈질이진행되는것을알수가있다. 배양 1 일이후부터는균의성장이이루어지지않으나호기적배양에서는약 3 일째까지급속도로성장하는것을알수가있다. 두실험에서초기 ph 는 6.9 이였으며, 6 일동안 ph 의변화는거의발견되지않고소폭상승하였다. 3.7. 호기조건에서의탈질산화 CW-4Y 균주를호기적조건의 5L 용량의반응기에서 NaNO 3 과 glucose 를첨가한배지에서성장을측정하였다. Fig. 6 에서보듯이, NO 3 -N 의농도가 2 일째에서 3 일째 170 ppm 에서약 37.3 ppm 으로급격히분해하였으며, 이기간 NO 3 -N 의분해속도는 132.5 mg- N L -1 d -1 이였다. 같은기간 NO 2 -N 농도는반대로약 0.09 ppm 에서약 40.53 ppm 으로급격히늘어나는모습을보여준다. 이는 NO 2 -N 의농도가변화가없다고기존에보고된종속영양질산화와호기적탈질균주 Pseudomonas stutzeri YZN-001 와는상반된모습을보여주고있다 [24]. 반응기에서 0~1 일차의 DO 농도를 0.4 ppm 으로조절하였을경우 NO 3 -N 와 NO 2 -N 의변화가거의없었다. 즉, 충분한산소가공급되지않는환경에서질산화가진행되지않음을알수있었다. 이후, DO 농도를 4.3 ppm 으로높여준 2 일째부터 (2~7 일까지의평균 DO 농도는약 3.9 ppm 으로해주었다.) NO 3 - N 가소모되며 NH 4 + -N 의질산화과정의중간산물인 NO 2 -N 가늘어나는모습을보여주고있다 (Fig. 6). 이는균주 CW- 4Y 가호기성상태에서탈질화와질산화를동시에진행하고있다는것을알수있다. 4. 결론 본연구에서분리된 Stenotrophomonas sp. CW-4Y 균주는축
78 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 29(1): 72-80 (2014) Fig. 5. Effect of culture condition on Nitrogen removal, ph change, and bacteria growth condition of CW-4Y. ( Aerobic culture; Anaerobic culture) 산및축산폐수의악취의주요원인물질인암모니아가스를분해하는능력을가졌으며, 종속영양세균으로서호기적질산화 - 탈질화를하여동시에 NH 4 + -N 및 NO 3 -N 를제거하는특이적성질을가졌다. CW-4Y 균주는기존에보고된종속영양호기적탈질화를하는균주와비교하여최대로약 23 배 ( 호기적배양 )~ 약 30 배 ( 혐기적배양 ) 의높은분해속도를보이며, 탄소원으로 glucose 가공급되었을때성장이잘이루어지고 C/N 비 16 부근에서최대 NH 4 + -N 제거율을보인다. 종래에알려진미생물을이용하여생물학적기법으로폐수처리를할경우, 하수처리공정에서질소를제거하기위해서는기존 Bardenpho process [25] 나 A 2 O process [26] 의경우질산화를위한호기조와탈질화를위한무산소조가각각존재해야하기때문에하수처리공정이복잡해질수밖에없고, 시설비가많이들어가는비경제적인문제점, 그리고독립영양미생물을이용하여질산화를시키기때문에발생하는장시간의처리시간이길다는단점을가지고있다. 또한, 지금까지의미생물을이용한폐수처리연구들은단
종속영양질산화 - 호기적탈질세균 Stenotrophomonas sp. CW-4Y 의분리와질소제거특성 79 Fig. 6. Nitrogen removals of Stenotrophomonas sp. CW-4Y in the bioreactor. ( NO 3- -N; NO 2- -N) 순히질산화미생물과탈질화미생물을각각의반응조에첨가하여유기질소원을제거하는방식으로이루어졌다. 하지만이과정에서다량의악취가발생하게되고, 이로인한악취는자극성의정도에따라주민생활에직, 간접적으로영향을끼치는대표적인생활공해물질로서이로인한민원이끊이지않고있어폐수처리장악취제거는시급한문제인데이를 CW-4Y 균주를이용하여해결할수있을것으로기대된다. 사사 본연구는환경부의 차세대에코이노베이션기술개발사업 (Project No. 413-112-010) 으로지원받은과제입니다. REFERENCES 1. Zhang, X. (2009) The status of production and pollution by animal and poultry in China. Env. Sci. Manag. 134: 35-40. 2. Joo, H. S., M. Hirai, and M. Shoda (2005) Characteristics of ammonium removal by heterotrophic nitrification-aerobic denitrification by Alcaligenes faecalis No.4. J. Biosci. Bioeng. 100: 184-191. 3. Shuo, Y., N. Jinren, C. Qian, and Alistair G. L. Borthwick (2013) Enrichment and characterization of a bacteria consortium capable of heterotrophic nitrification and aerobic denitrification at low temperature, Bioresour. Technol., 127: 151-157. 4. Kulikowska, D., T. Jozwiak, P. Kowai, and S. Ciesieski (2010) Municipal landfill leachate nitrification in RBC biofilm-process efficiency and molecular analysis of microbial structure. Bioresour. Technol. 101: 3400-3405. 5. Lioyd, D., L. Boddy, and K. J. P. Davies (1987) Persistence of bacterial denifrification capacity under aerobic conditions-the rule rather than the exception. FEMS Microbiol. Ecol. 45: 185-190. 6. Khin, T. and A. P. Annachhatre (2004) Novel microbial nitrogen removal processes. Biotechnol. Adv. 22: 519-532. 7. Verstrae, W. and M. Alexande (1972) Heterotrophic nitrification by Arthrobacter sp. J. Bacteriol. 110: 955-959. 8. Robertson, L. A. and J. G. Kuenen (1983) Thiosphaera pantotropha gen, nov., sp. nov., a facultatively anaerobic, facultatively autotrophic sulfur bacterium. J. Gen. Microbiol. 129: 2847-2855. 9. Anderson, I. C., M. Poth, J. Homstead, and D. Burdige (1993) A comparison of NO and N 2 O production by the autotrophic nitrifier Nitrosomonas-europaea and the heterotrophic nitrifier Alcaligenes faecalis. Appl. Environ. Microbiol. 59: 3525-3533. 10. Kim, J. K., K. J. Park, K. S. Cho, S. W. Nam, T. J. Park, and R. Bajpai (2005) Aerobic nitrification-denitrification by heterotrophic Bacillus strains. Bioresour. Technol. 96: 1897-1906. 11. Khardenavis, A. A., A. Kapley, and H. J. Purohit (2007) Simultaneous nitrification and denitrification by diverse Diaphorobacter sp., Appl. Microbiol. Biotechnol. 77: 403-409. 12. Zhao, B., Y. L. He, J. Hughes, and X. F. Zhang (2010a) Heterotrophic nitrogen removal by a newly isolated Acinetobacter calcoaceticus HNR. Bioresour. Technol. 101: 5194-5200. 13. Chen, Q. and J. Ni (2012) Ammonium removal by Agrobacterium sp. LAD9 capacble of heterotrophic nitrification-aerobic denitrification, J. Biosci. Bioeng. 113: 619-623. 14. Kim, M., S. Jeong, S. J. Yoon, S. J. Cho, Y. H. Kim, M. J. Kim, E. Y. Ryu, and S. Lee (2008) Aerobic denitrification of Pseudomonas putida AD-21 at different C/N ratios, J. Biosci. Bioeng. 106: 498-502. 15. Su, J. J., B. Y. Liu, and C. Y. Liu (2001) Comparison of aerobic denitrification under high oxygen atmosphere by Thiosphere pantotropha ATCC 35512 and Pseudomonas stutzeri SU2 newly isolated from the activated sludge of a piggery wastewater treatment system. J. Appl. Microbiol. 90: 457-462. 16. Patureau, D., E. Helloin, E. Rustrain, T. Bouchez, J. P. Delgenes, and R. Moletta (2001) Combined phosphate and nitrogen removal in a sequencing batch reactor using the aerobic denitrifier, Microbirgula aerodenitrificans. Water Res. 35: 189-197. 17. Marazioti, C., M. Kornarons, and G. Lyberatos (2003) Kinetic modeling of a mixed culture of Pseudomonas denitrificans and Bacillus subtilis under aerobic and anoxic operating conditions. Water Res. 37: 1239-1251. 18. Joo, H. S., M. Hirai, and M. Shoda (2006) Piggery wastewater treatment using Alcaligenes faecalis No.4. with heterotrophic nitrification and aerobic denitrification. Water Res. 40: 3029-3036. 19. Chen, P, J. Li, Q. X. Li, Y. Wang, S. Li, T. Ren, and L. Wang (2012) Simultaneous heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by bacterium Rhodococcus sp. CPZ24. Bioresour. Technol. 116: 266-270. 20. Su, J. J., K. S. Yeh, and P. W. Tseng (2006) A Strain of Pseudomonas sp. isolated from piggery wastewater treatment systems with heterotrophic nitrification capability in Taiwan. Curr. Microbiol. 53: 77-81. 21. Zhao, B., Y. L. He, and X. F. Zhang (2010b) Nitrogen removal capability through simultaneous heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by Bacillus sp. LY. Environ. Technol. 31: 409-416. 22. Yang, X. P., S. M. Wang, D. W. Zhang, and L. X. Zhou (2011) Isolation and nitrogen removal characteristics of an aerobic het-
80 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 29(1): 72-80 (2014) erotrophic nitrifying-denitrifying bacterium, Bacillus subtilis A1. Bioresour Technol. 102: 854-862. 23. Nishio, T., T. Yoshikura, H. Mishima, Z. Inouye, and H. Itoh (1998) Conditions for nitrification and denitrification by an immobilized heterotrophic nitrifying bacterium Alcaligenes faecalis OKK17. J. Ferment. Bioeng. 86: 351-356. 24. Zhang, J., P. Wu, B. Hao, and Z. Yu (2011) Heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by the bacterium Pseudomonas stutzeri YZN-001. Bioresour Technol. 102: 9866-9869. 25. Sattayatewa, C., K. Pagilla, P. Pitt, K. Selock, and T. Bruton (2009) Organic nitrogen transformations in a 4-stage Bardenpho nitrogen removal plant and bioavailability/biodegradability of effluent DON. Water Res. 43: 4507-4516. 26. Zeng, W., L. Li, Y. Y. Yang, X. D. Wang, and Y. Z. Peng (2011) Denitrifying phosphorus removal and impact of nitrite accumulation on phosphorus removal in a continuous anaerobic-anoxic-aerobic (A 2 O) process treating domestic wastewater, Enz. Microb. Technol. 48: 134-142.