(51) Int. Cl. C12N 5/16 (2006.01) (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (45) 공고일자 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2007 년 06 월 28 일 10-0733012 2007 년 06 월 21 일 (21) 출원번호 10-2005-0067736 (65) 공개번호 10-2007-0013432 (22) 출원일자 2005년07월26일 (43) 공개일자 2007년01월31일 심사청구일자 2005년07월26일 (73) 특허권자재단법인서울대학교산학협력재단서울특별시관악구봉천동산 4-2 (72) 발명자황우석서울강남구논현동 22 번지논현아파트 104 동 907 호 이병천서울관악구신림동서울대학교수의과대학 85 동 632 호 강성근서울관악구신림동서울대학교수의과대학 85 동 507 호 김민규서울관악구신림동서울대학교수의과대학 85 동 622 호 장구서울관악구신림동서울대학교수의과대학 85 동 622 호 오현주서울관악구신림동서울대학교수의과대학 85 동 622 호 김혜진서울관악구신림동서울대학교수의과대학 85 동 622 호 김정주서울관악구신림동서울대학교수의과대학 85 동 622 호 모하메드후세인샤밈서울관악구신림동서울대학교수의과대학 85 동 622 호 유다헤루파이브리안토서울관악구신림동서울대학교수의과대학 85 동 622 호 (74) 대리인황주명 (56) 선행기술조사문헌 심사관 : 이충호 - 1 -
전체청구항수 : 총 15 항 (54) 복제된개과동물및이의생산방법 (57) 요약 본발명은복제된개과동물및이의생산방법에관한것이다. 보다구체적으로본발명은개과동물의성숙난자로부터핵을제거하여탈핵난자를제조한다음개과동물의체세포를공여핵세포로이용하여상기탈핵난자에최적화된조건으로핵이식을수행하여핵이식란을제조하고, 이를대리모의난관에이식하는것을특징으로하는복제된개과동물의생산방법및상기방법에의해생산된복제된개과동물에관한것이다. 본발명에따른방법은복제된개과동물을생산하는효과가있으며이는우량개과동물의번식, 희귀 멸종위기의개과동물의보존, 이종이식, 질환모델동물등수의학, 인류학및의학연구분야의발달에기여할수있다. 대표도 도 2 특허청구의범위 청구항 1. (a) 개과동물의성숙난자로부터핵을제거하는단계 ; (b) 개과동물의조직으로부터체세포를분리하여공여핵세포를제조하는단계 ; (c) 상기 (a) 단계의탈핵난자에 (b) 단계의공여핵세포를미세주입하고전압이 3.0 3.5kv/cm 인조건으로전기융합시키는단계 ; 및 (d) 상기 (c) 단계에서융합된난자를활성화시키는단계를포함하는개과동물의핵이식란제조방법. 청구항 2. 제 1 항에있어서, 상기 (a) 단계의개과동물의성숙난자는생체내로부터회수된것을특징으로하는개과동물의핵이식란제조방법. 청구항 3. 제 2 항에있어서, 상기생체내로부터회수는개과동물의배란일로부터 48 72 시간에수행하는것임을특징으로하는개과동물의핵이식란제조방법. 청구항 4. 제 1 항에있어서, 상기 (b) 단계에서상기체세포는개과동물의난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌세포, 연골세포, 적혈구, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아줄기세포, 배아생식세포, 태아세포, 태좌세포및배아세포로이루어진그룹중에서선택된어느하나인것을특징으로하는개과동물의핵이식란제조방법. - 2 -
청구항 5. 제 1 항에있어서, 상기 (b) 단계에서체세포는섬유아세포또는난구세포인것을특징으로하는개과동물의핵이식란제조방법. 청구항 6. 제 1 항에있어서, 상기 (c) 단계에서전기융합은직류전압 3.0 3.5kV/cm 조건으로 10~30 μs동안 1~3 회수행하는것을특징으로하는개과동물의핵이식란제조방법. 청구항 7. 제 1 항에있어서, 상기 (d) 단계에서활성화시키는단계는칼슘이오노포어및 DMAP(6-dimethylaminopurine) 를융합된난자에동시에처리하거나단계적으로처리하는것을특징으로개과동물의핵이식란제조방법. 청구항 8. 제 7 항에있어서, 상기칼슘이오노포어 5 10μM 을 37~39 에서 3 5 분동안처리한다음 DMAP(6- dimethylaminopurine) 1.5mM~2.5mM 을 37 39 에서 4 5 시간동안처리하는것을특징으로하는개과동물의핵이식란제조방법. 청구항 9. 제 1 항에있어서, 상기개과동물이개, 늑대, 여우, 재칼, 코요테, 승냥이및너구리로이루어진그룹중에서선택되는것임을특징으로하는개과동물의핵이식란제조방법. 청구항 10. 제 1 항에있어서, 상기개과동물이개, 늑대및여우로이루어진그룹중에서선택되는것임을특징으로하는개과동물의핵이식란제조방법. 청구항 11. 제 1 항내지제 10 항중어느한항의방법에의해제조된핵이식란. 청구항 12. 제 11 항에있어서, 기탁번호 KCTC 10831BP 인핵이식란. 청구항 13. - 3 -
제 11 항또는제 12 항의핵이식란을대리모의난관에이식하여산자를출생하는단계를포함하는복제된개과동물의생산방법. 청구항 14. 제 13 항에있어서, 상기개과동물이개, 늑대, 여우, 재칼, 코요테, 승냥이및너구리로이루어진그룹중에서선택되는것임을특징으로하는복제된개과동물의생산방법. 청구항 15. 제 13 항에있어서, 상기개과동물이개, 늑대및여우로이루어진그룹중에서선택되는것임을특징으로하는복제된개과동물의생산방법. 청구항 16. 삭제 청구항 17. 삭제 청구항 18. 삭제 명세서 발명의상세한설명 발명의목적 발명이속하는기술및그분야의종래기술 본발명은복제된개과동물및이의생산방법에관한것이다. 보다구체적으로본발명은개과동물의성숙난자로부터핵을제거하여탈핵난자를제조한다음개과동물의체세포를공여핵세포로이용하여상기탈핵난자에최적화된조건으로핵이식을수행하여핵이식란을제조하고이를대리모의난관에이식하는것을특징으로하는복제된개과동물의생산방법및상기방법에의해생산된복제된개과동물에관한것이다. 최근세포융합또는세포직접주입에의한체세포핵이식기술이발전되면서복제동물의생산이본격적으로이루어지고있다. 체세포핵이식기술은생식과정에서일반적으로이루어지는감수분열및반수염색체보유생식세포를경유하지않고도자손을탄생시킬수있는기술로서성체가가진배수체보유체세포를핵이제거된난자에이식하여수정란을생산하고상기수정란을생체내로이식하여새로운개체를발생시키는방법이다. 일반적으로체세포핵이식기술에서체세포공여핵을이식할수핵난자 (recipient oocyte) 는인위적으로시험관내 (in vitro) 에서배양하여 2 차감수분열중기까지도달하도록성숙시켜사용한다. 그다음체세포핵이식에따른염색체이상발생을방지하기위하여체세포를이식하기전에상기성숙난자의핵을제거하고상기탈핵난자의주란강또는세포질내에체세포를주입한다. 그후상기탈핵난자와주란강또는세포질에주입된체세포를전기적자극을통하여물리적으로융합시키고전기자극또는화학물질에의하여활성화시킨후대리모에이식하여산자를탄생시킨다. - 4 -
이러한체세포핵이식기술은우량동물의번식, 희귀 멸종위기동물의보존, 특정영양물질의생산, 치료용생체물질생산, 장기이식용동물생산, 질병질환동물생산, 세포 유전자치료와같은의학적으로가치를지니는장기이식대체용동물의생산등과같은분야에서넓게활용될수있다. 체세포핵이식을통한동물복제기술은영국로슬린연구소의윌멋 (Wilmut) 박사에의해 6 세된암컷양에서채취한유선세포를핵이제거된난자에이식하여핵이식란을생산한후생체내이식을통하여체세포복제동물인돌리를탄생시킴으로써최초로성공하였다. 이후소, 마우스, 염소, 돼지및토끼등에서체세포핵이식방법에의한복제된산자생산이보고되었다 (WO9937143A2, EP930009A1, WO9934669A1, WO9901164A1 및 US5,945,577). 한편, 소, 돼지와같은산업동물의복제와더불어개또는다른애완동물의복제는많은사람들의관심의대상이되고있다. 최근애완동물로는처음으로고양이가복제되었으며수백만달러의기금으로개복제의연구가수행되기도하였다. 그러나, 아직까지체세포핵이식방법에의한개과동물의복제가성공된사례는보고된바없다. 이에본발명자들은체세포핵이식방법에의한복제된개과동물의생산방법을연구하던중전기융합조건, 핵이식란활성화조건및대리모이식조건을최적화하여최초로체세포핵이식방법에의해복제된개과동물을생산함으로써본발명을완성하였다. 발명이이루고자하는기술적과제 따라서, 본발명의목적은체세포핵이식기술을이용한개과동물의핵이식란생산방법을제공하는것이다. 또한, 본발명의다른목적은상기방법에의해제조된개과동물의핵이식란을제공하는것이다. 또한, 본발명의다른목적은상기핵이식란을대리모에이식하여산자를출생하는단계를포함하는복제된개과동물의생산방법을제공하는것이다. 또한, 본발명의다른목적은상기방법에의해생산된복제된개과동물을제공하는것이다. 발명의구성 상기와같은목적을달성하기위하여본발명은체세포핵이식기술을이용한개과동물의핵이식란생산방법을제공한다. 또한, 본발명은상기방법에의해제조된개과동물의핵이식란을제공한다. 또한, 본발명은상기핵이식란을대리모에이식하여산자를출생하는단계를포함하는복제된개과동물의생산방법을제공하는것이다. 또한, 본발명은상기방법에의해생산된복제된개과동물을제공한다. 이하, 본발명을상세히설명하기로한다. 용어정의 본발명에서사용된용어 ' 핵이식 ' 은핵이없는세포에다른세포의핵 DNA 를인공적으로결합시켜동일한형질을갖도록하는유전자조작기술을말한다. 본발명에서사용된용어 ' 핵이식란 ' 은공여핵세포가도입또는융합된난자를말한다. 본발명에서사용된용어 ' 복제 ' 는한개체와동일한유전자세트를가진새로운개체를만드는유전자조작기술로서특히본발명에서는세포, 배아세포, 태아세포및 / 또는동물세포가다른세포의핵 DNA 서열과실질적으로동일한핵 DNA 서열을갖는것을말한다. - 5 -
본발명에서사용된용어 ' 공여핵세포 ' 는핵수용체인수핵난자로핵을전달하는세포또는세포의핵을말한다. 본발명에서사용된용어 ' 수핵난자 ' 는탈핵과정을통해본래의핵이제거되고공여핵세포로부터핵을전달받는난자를말한다. 본발명에서사용된용어 ' 성숙난자 ' 는제 2 차감수분열중기까지도달한난자를말한다. 본발명에서사용된용어 ' 탈핵난자 ' 는난자의핵이제거된것을말한다. 본발명에서사용된용어 ' 융합 ' 은공여핵세포와수핵난자의지질막부분의결합을의미한다. 예를들어, 지질막은세포의플라스마막또는핵막이될수있다. 융합은공여핵세포와수핵난자가서로인접하게위치해있는경우또는공여핵세포가수핵난자의위란강 (perivitelline space) 내에위치해있는경우에전기적자극을가함으로써일어날수있다. 본발명에서사용된용어 ' 활성화 ' 는핵전이단계전, 핵전이단계동안및핵전이단계후에세포가분열하도록자극을주는것을말한다. 바람직하게는, 본발명에서는핵전이단계후세포가분열하도록자극을주는것을말한다. 본발명에서사용된용어 ' 산자 (living offspring)' 는자궁밖에서생존할수있는동물을말한다. 바람직하게는, 1 초, 1 분, 한시간, 하루, 한주, 한달, 6 달또는일년이상생존할수있는동물을말한다. 상기동물은생존을위해자궁내환경을필요로하지않는다. 본발명에서 ' 개과동물 ' 로는개, 늑대, 여우, 재칼, 코요테, 승냥이및너구리가포함될수있다. 바람직하게는개또는늑대가포함된다. 상기개는야생의늑대가가축화된것으로알려져있으며이에따라늑대와개는염색체수가동일하고임신기간, 성호르몬의변화가유사한양상을나타낸다 (Seal US et al., Biology Reproduction 1979, 21:1057-1066). 본발명은개과동물의체세포핵이식기술을사용한복제시핵이식란의전기융합조건과활성화조건을최적화하여개과동물의핵이식란을제조하고, 상기핵이식란을대리모의난관에이식하여산자를생산함으로써최초로개과동물의복제를수행하였다는데에특징이있다. 구체적으로본발명의개과동물의핵이식란생산방법은 (a) 개과동물의성숙난자로부터핵을제거하는단계 ; (b) 개과동물의조직으로부터체세포를분리하여공여핵세포를제조하는단계 ; (c) 상기 (a) 단계의탈핵난자에 (b) 단계의공여핵세포를미세주입하고전압이 3.0 3.5kv/cm 인조건으로전기융합시키는단계 ; 및 (d) 상기 (c) 단계에서융합된난자를활성화시키는단계를포함한다. 본발명에따른개과동물의핵이식란생산방법을단계별로설명하면다음과같다. 제 1 단계 : 수핵난자의탈핵 수핵난자는개과동물에서회수된미성숙난자를체외에서성숙시켜이용하거나개과동물의체내에서성숙된난자를회수하여이용할수있다. 일반적으로포유동물 ( 예컨대소, 돼지, 양등 ) 의난자는성숙난자, 즉제 2 차감수분열중기 (metaphase Ⅱ) 에배란되는것에반해, 개과동물의난자는다른동물과는달리제 1 차감수분열의전기에배란되어난관내에서 48 72 시간동안머물면서성숙되는특징이있다. 개과동물의난자의핵성숙률이매우낮고, 배란시기및번식생리가다른포유동물과는달라서, 개과동물의수핵난자는개과동물의생체내에서성숙된난자를회수하는것이바람직하다. 보다구체적으로개과동물로부터성숙난자의회수는개과동물의배란이유도된후약 48 72 시간째, 보다바람직하게는 72 시간째에수행하는것이바람직하다. 상기에서개과동물의배란일은당업계에공지된방법을사용하여결정할수있다. 배란일을결정하는방법으로는예를들면, 이에한정되지는않으나질세포도말검사 (vaginal smear), 혈장성호르몬수준측정및초음파진단시스템을사용할수있다. 개과동물의발정의시작은외음부팽창및장액성혈액의배출여부를통해확인할수있다. - 6 -
본발명의일실시예에서는개과동물의배란일을질세포도말검사와혈장프로게스테론농도검사를수행함으로써무각화상피세포가 80% 이상이고혈장프로게스테론농도가약 4.0~7.5ng/mL 일때를배란일로간주하여배란후 48 72 시간, 바람직하게는배란후약 72 시간째에난자를회수하였다. 한편, 배란된개과동물의난자의성숙시기는배란후 48 72 시간으로알려져있으며본발명자들은배란후 48 시간째, 60 시간째및 72 시간째에난자를회수하여확인해본결과배란후약 72 시간째회수된난자가제 2 차감수분열중기 (metaphase Ⅱ) 에해당하는성숙난자임을확인할수있었다. 또한, 본발명에서실제로복제견의생산에성공한난자도 72 시간째회수된난자였다. 따라서, 개과동물의성숙난자의회수는배란후약 72 시간째가가장바람직함을알수있었다. 생체내성숙난자를회수하는방법으로는대상동물을마취한후개복시키는것을포함하는외과적방법을사용할수있다. 보다구체적으로, 생체내성숙난자의회수는당업계에공지된방법인난관절제법을사용할수있다. 상기난관절제법은난관을수술적으로잘라낸후배아수집배지를난관내부에관류시켜관류액을수득하고상기관류액으로부터난자를회수하는방법이다. 또한, 생체내성숙난자는카테터를난관채에장착한후난관 - 자궁접합부위에주사침을이용하여관류액을주입함으로써회수할수있다. 이방법은난관을손상시키지않기때문에난자를공여하는동물을다음발정에도이용할수있는장점이있다. 따라서, 바람직하게는생체내성숙난자의회수는난관을손상시키지않는카테터를이용한방법을사용한다. 한편, 본발명자들은카테터를이용한난자회수방법에있어서회수율을높이기위해니들의앞부분이둥글게처리되어있어난관입구에장착이용이한난자회수용니들을새롭게개발하였다 ( 도 1 참조 ). 보다구체적으로본발명자들이개발한니들을이용한난자회수방법은앞부분이둥글게처리된난자회수용니들을난관내에삽입 - 결찰한후난관 - 자궁접합부에난자회수용배지를관류시켜상기난자회수용니들에관류액이유입되도록하고상기관류액을현미경으로검경하여성숙한난자를수득하는방법이다. 성숙한난자를회수한다음에는난자의반수체핵을제거한다. 난자의탈핵은당업계에공지된방법을사용하여수행할수있다 ( 미국특허제 4994384 호, 미국특허제 5057420 호, 미국특허제 5945577 호, 유럽특허공개공보제 0930009A1, 대한민국특허제 342437 호, Kanda et al, J. Vet. Med. Sci., 57(4):641-646, 1995; Willadsen, Nature, 320:63-65, 1986, Nagashima et al., Mol. Reprod. Dev. 48:339-343 1997; Nagashima et al., J. Reprod Dev 38:37-78, 1992; Prather et al., Biol. Reprod 41:414-418, 1989, Prather et al., J. Exp. Zool. 255:355-358, 1990; Saito et al., Assis Reprod Tech Andro, 259:257-266, 1992; Terlouw et al., Theriogenology 37:309, 1992). 바람직하게는, 수핵난자의탈핵은크게두가지방법을사용하여수행할수있다. 한가지방법으로는성숙한수핵난자의난구세포 (cumulus cell) 를제거한다음, 미세침을이용하여수핵난자의투명대일부를절개하여절개창을형성하고이를통하여제 1 극체, 난자의핵및세포질 ( 가능한적은양 ) 을제거한다. 다른방법으로는수핵난자의난구세포를제거한다음난자를염색하고미세흡입피펫 (aspiration pipet) 을이용하여제 1 극체및난자의핵을제거한다. 보다바람직하게는, 난자의탈핵은수핵난자의상태를육안으로평가하여생존율이높은난자에대해서흡입방법을사용하고, 그렇지않은난자에대해서는절개창을형성하는방법을사용한다. 제 2 단계 : 공여핵세포의제조 공여핵세포로는개과동물로부터유래된체세포가사용될수있다. 구체적으로, 본발명에서사용된체세포로는개과동물의배아세포 (embryonic cell), 태아세포 (fetus cell), 유세포 (juvenile cell), 성체세포 (adult cell), 바람직하게는성체세포로부터수득될수있는난구, 피부, 구강점막, 혈액, 골수, 간, 폐, 신장, 근육및생식기관등과같은형태의조직으로부터유래된것일수있다. 본발명에서사용될수있는체세포로는예를들면, 이에한정되지는않으나난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌세포, 연골세포, 적혈구, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아줄기세포, 배아생식세포, 태아세포, 태좌세포및배아세포등이있다. 보다바람직하게는, 본발명에서사용되는체세포로는태아및성체섬유아세포, 난구세포일수있다. 나아가, 본발명에서사용되는공여핵세포는상기야생형체세포에특정유전자를삽입하거나조작하여염색체를유전자이식방법이나유전자적중법을이용하여형질전환시킨것일수있다. 상기유전자이식방법이나유전자적중법은당업계에공지된방법이므로당업자라면용이하게실시할수있다. - 7 -
공여핵세포로서제공되는체세포는외과용표본또는생체검사용표본을제조하는방법으로부터수득될수있으며상기표본으로부터공지된방법을사용하여단일세포를수득할수있다. 예를들면, 대상동물로부터조직의일부를무균적으로절개하여상기외과용표본또는생체검사용표본을수득하고이를미세하게세절하여트립신으로처리한다음조직배양용배지에서배양한다. 조직배양용배지에서 3 4 일배양후에배양접시 (dish) 에자라는것을확인하고, 완전히다자라면일부는추후사용을위하여동결하여액체질소에보관하며, 나머지는핵이식에이용하기위하여계속배양을실시한다. 계속하여배양하여핵이식에사용할세포는 10 번계대배양이하를전제로하여세포가과도하게커지는것을방지한다. 상기에서조직배양용배지로는당업계에공지된것을사용할수있으며예를들면, TCM-199, DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 등이있다. 제 3 단계 : 공여핵세포의미세주입및융합 탈핵난자에공여핵세포의미세주입은이식용피펫을사용하여공여핵세포를탈핵난자의세포질과투명대사이에주입함으로써수행한다. 상기에서공여핵세포의미세주입이완료된탈핵난자는세포조작기를이용하여전기적으로공여핵세포와융합시킨다. 전기적융합에서전류는교류또는직류일수있으며, 바람직하게는전압 3.0 3.5kV/cm 조건으로수행할수있으며보다바람직하게는직류전압 3.0 3.5kV/cm 조건으로 10 30 μs동안 1 3 회수행할수있다. 가장바람직하게는, 직류전압 3.0 3.5kV/cm 조건으로 20 μs동안 2 회수행할수있다. 상기에서전압이 3.0kV/cm 미만이거나또는 3.5kV/cm 을초과하는경우에는매우낮은융합율을보인다. 상기전기적융합시의전압범위는지금까지알려진일반적인전기적융합시의전압범위 (1.7 2.0kv/cm) 보다높은특징이있다. 본발명의일실험예에서는전기융합시최적전압범위를결정하기위하여공여핵세포를미세주입한핵이식란을각기다른전압범위에서전기적으로융합한다음현미경으로검경하여융합율을조사하였다 ( 실험예 2 참조 ). 그결과, 낮은전압에서보다높은전압에서의핵융합율이높게나타남을알수있었으며전압범위가 3.0 3.5kV/cm 인경우융합율이 75.2% 로가장높게나타남을알수있었다 ( 표 7 참조 ). 공여핵세포와난자의전기적자극에의한융합은융합용배지내에서수행할수있다. 상기융합용배지로는만니톨, MgSO 4, 헤페스, BSA 가혼합된배지를사용할수있다. 제 4 단계 : 융합된핵이식란의활성화 융합된핵이식란의활성화는성숙과정에서일시적으로정지되어진세포주기를다시가동시키는단계이다. 이를위해서는세포주기정지요소인 MPF, MAP 키타제등의세포신호전달물질의활성을저하시켜야한다. 일반적으로핵이식란을활성화하는방법은전기적방법및화학적방법이있다. 본발명에서는핵이식란의활성화를위한방법으로화학적방법을사용하는것이바람직하다. 상기화학적방법은전기적활성화방법에비해본발명에따른핵이식란의활성화를보다많이 촉진할수있다. 상기에서화학적방법으로는에탄올, 이노시톨트리포스페이트, 2 가이온 ( 예를들어 Ca 2+ 또는 Sr 2+ ), 미 소관억제제 (microtubule inhibitors, 예를들어사이토칼라신 B), 2 가이온이오노포어 (ionophore)( 예를들어, Ca 2+ 이오노포어이노마이신 ), 단백질키나제억제제 ( 예를들어, 6- 디메틸아미노퓨린 ), 단백질합성억제제 ( 예를들어, 사이클로헥시미드 ), 포볼 12- 미리스테이트 13- 아세테이트 (phorbol 12-myristate 13-acetate) 와같은물질을처리하는방법이있다. 바람직하게는, 본발명에서핵이식란의활성화를위한화학적방법으로는칼슘이오노포어와 6- 디메틸아미노퓨린을핵이식란에동시에처리하거나단계적으로처리하는방법을사용할수있다. 보다바람직하게는칼슘이오노포어 5 10μM 을 37~39 에서 3 6 분동안처리한다음 6- 디메틸아미노퓨린 1.5mM 2.5mM 을 37 39 에서 4 5 시간동안처리한다. 본발명의일실험예에서는상기핵이식란을전기적방법과화학적방법으로각각활성화한후핵이식란의발육정도를측정하였다 ( 실험예 3 참조 ). 그결과, 핵이식란의활성에있어서화학적방법이전기적방법에비해보다더우수함을확인할수있었으며, 화학적방법에의해핵이식란을활성화함으로써상실배기까지발육시킬수있음을확인하였다 ( 표 8 참조 ). - 8 -
따라서, 본발명은상기방법에의해제조된개과동물의핵이식란을제공한다. 본발명자들은본발명의일실시예에서제조한개과동물의핵이식란을 Snuppy(cloned canine embryo) 라명명하고, 2005 년 7 월 15 일자로한국생명공학연구원유전자은행 (KCTC, 대전광역시유성구어은동 52 번지 ) 에기탁번호 KCTC 10831BP 로기탁하였다. 상기핵이식란은동결보존한후필요한때에이를용해시켜사용할수있다. 나아가, 본발명에따른개과동물의핵이식란은대리모에이식되어산자를출생시킴으로써복제된개과동물을생산하는데사용될수있다. 바람직하게는, 본발명에따른핵이식란의대리모이식은대리모의난관에이식을수행한다. 이식은당업계에공지된방법을사용하여수행할수있으며바람직하게는카테터를사용하여복제배아를이식할수있다. 본발명의일실시예에서는본발명에따른핵이식란을대리모의난관에이식함으로써복제견 Snuppy 와 NT-2# 을처음으로생산하였다 ( 실시예 6 참조 ). 그러나, 본발명의일실험예에서본발명에따른핵이식란을대리모의자궁에이식한경우에는임신되지않음을확인하였다 ( 실험예 4 참조 ). 따라서, 복제견의생산에있어서핵이식란의이식은대리모의난관에수행하는것이바람직함을알수있었다. 한편, 상기대리모이식에있어서상기핵이식란은 1 세포기 ( 바로만들어진복제란 ) 이거나 2 세포기또는 4 세포기의것일수있다. 또한상기핵이식란은대리모가준비되기전까지미네랄오일이덮여진 msof 25 μl미세유적 (microdrop) 에서배양할수있다. 따라서, 본발명은복제된개과동물을제공한다. 상기복제된개과동물은공여핵세포또는공여체와완전히동일한유전적특성을갖는다. 본발명의일실시예에서는본발명의방법에따라복제견을생산하고이의유전적특성을마이크로세틀라이트분석방법을이용하여분석하였다 ( 실험예 1 참조 ). 그결과, 본발명에따른복제견은공여핵세포또는공여체와완전히동일한유전적특성을가짐을확인할수있었다 ( 표 6 참조 ). 이하, 본발명을실시예에의해상세히설명한다. 단, 하기실시예는본발명을예시하는것일뿐, 본발명의내용이하기실시예에의해한정되는것은아니다. < 실시예 1> 개로부터수핵난자의회수 수핵난자의회수를위해사용한개는 1 3 살의잡종암캐 131 마리로서울대학교의사육관리연구소에서확립한표준에따라사육하였다. 발정기가시작된개를대상으로질세포도말검사 (vaginal smear) 와혈청프로게스테론의농도를매일측정하여배란일을결정하고, 배란일로부터 48 72 시간후의성숙난자를회수하였다. 혈청프로게스테론의농도는혈액 3-5ml 을매일채취하고원심분리하여혈청을수득한다음 DSL-3900 ACTIVE 프로게스테론코팅된튜브방사선면역분석키트 (Diagnostic Systems Laboratories, Inc., TX) 를사용하여분석하였다. 프로게스테론농도가 4.0 7.5ng/ml 가되면배란일로간주하였다 (Hase et al., J. Vet. Med. Sci., 62:243-248, 2000). 질세포도말검사는발정기의초기증후가나타난날로부터매일표본을수득함으로써수행하였다. 질세포표본은면봉을외음부로삽입함으로써수집하였고이를슬라이드글라스위에도말하였다. 그다음디프 - 퀴 (Diff-Quik) 염색 (International chemical co., Japan) 으로염색한후현미경으로검경하여표피세포가상피세포인덱스 (cornified index, Evans J.M. et al., Vet. Rec, 7:598-599, 1970) 의 80% 이상인경우를배란시기로간주하였다. 배란된난자의성숙시기는배란후 48 72 시간째인것으로알려져있다. 이에본발명자들은배란후 48 72 시간째의난자를다음과같은방법으로회수하였다. 먼저, 체내성숙난자의채취시기에이른암캐에아트로핀설페이트 (Atropin sulfate, 0.05mg/kg) 와아세프로마진말레이트 (acepromazine maleate, 0.025mg/kg) 를투여하고케타민 (ketamine, 5mg/kg) 을투여하여마취시켰다. 상기마취상태는이소플루란 (isoflurane) 을투여함으로써유지하였다. 상기마취된개를대상으로무균적적으로외과수술을수행하여중간복부부분을 5~10cm 를절개하여난관이노출되도록하였다. 그다음앞부분을둥글게처리한니들 ( 도 1) 을난관복강구에삽입하고삽입된니들이고정되도록일시적으로 - 9 -
봉합사를이용하여상기니들을고정시켰다. 그다음난관 - 자궁접합부에 24 게이지 IV 카테터를장착하여난자회수용배지 ( 표 1) 를관류시킴으로써관류액이 16 게이지니들쪽으로흘러나가게하였다. 상기관류액을멸균페트리디쉬에회수하고현미경으로검경하여성숙난자를선별하였다. 성분 [ 표 1] 난자회수용배지 TCM powder 1L 용 (Gibco 31100-027) 9.9g P/S 항생제 HEPES 완충액 2.38g FBS 함량 1%( 페니실린 10000IU, 스트렙토마이신 10mg) 10%(v/v) NaHCO 3 0.1680g BSA 5mg/L 실험결과, 1 마리의개에게서평균 12 개의성숙난자를수득하였으며총 1370 개의난자를수득하였다. < 실시예 2> 수핵난자의탈핵 Ca 2+ 무첨가 CR2 배지 (Charles Rosenkrans 2)(Rosenkrans et al., Biol. Reprod. 49, 459-462, 1993) 에헤페스 - 버퍼를첨가하여제조한 hcr2aa 배지 ( 표 2) 에 0.1%(v/v) 히알루로니다제 (Sigma, USA) 를첨가한후상기실시예 1 에서수득한난자를넣고반복적으로피펫팅함으로써난구세포를제거하였다. 그다음난구세포가제거된난자를 5 μg /ml 비스벤지미드 (Hoechst 33342) 로 5 분간염색하고형광도립현미경을이용하여 200 의배율로관찰하여제 1 극체가확인된난자만을선별하였다. hcr2aa 배지 ( 표 2) 에 10%(v/v) FBS 와 5 μg /ml 사이토칼라신 B 를첨가한후상기에서선별된난자를넣고미세조작장치 (micromanipulator, Narishige, Tokyo, Japan) 를이용하여탈핵을수행하였다. 즉, 홀딩마이크로피펫 (150 μm직경 ) 으로수핵난자를고정한후제 1 극체와난자핵그리고일부세포질 (5% 이하 ) 을제거하였다. 상기과정을거쳐탈핵된난자는 10%(v/v) FBS 가첨가된 TCM-199 배지 ( 표 3) 에넣어보관하였다. NaCl KCl KH 2 PO 4 P/S Phenol-red 3.1 g/50ml 0.1050 g 0.0230 g 5 ml 400μl 성분 [ 표 2] hcr2aa 배지조성 mcr2-s NaHCO 3 1.0531 g/50ml St-B 640 μl HEPES 0.5958 g/10ml St-E 1680 μl NEAA 함량 4ml 400 μl Glycine 0.0275 g/10ml Glycine 400 μl BSA 0.12g - 10 -
성분 TCM199 liquid [ 표 3] TCM-199 배지조성 함량 89ml pyruvic acid 0.0099g P/S( 항생제 ) 1ml FBS 10% < 실시예 3> 공여핵세포의제조 공여핵세포로는개로부터수득한성체섬유아세포를사용하였다. 이를위해먼저아프간하운드 (Afghan Hound, 3 살 ) 의귀피부조직을분리하였다. 상기귀피부조직단편을 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) 로 3 회세척하고외과용칼로잘게세절하였다. 상기세절한피부조직을 0.25%(w/v) 트립신및 1mM EDTA 가포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지 (DMEM Life Technologies, Rockville, MD) 에넣고 37 로 1 시간동안처리하였다. 트 립신에의해분해된세포를 Ca 2+ 및 Mg 2+ 무첨가 DPBS 로 1 회세적하고 300 g 로 2 분간원심분리한후 100mm 플라스틱배양용접시에옮겼다. 그다음상기세포를 10%(v/v) FBS, 1mM 글루타민, 25mM NaHCO 3 및 1%(v/v) 최소필수배 지비필수아미노산용액 (Life Technologies) 이첨가된 DMEM 배지에서 39, 5% CO 2 의조건하의포화습도배양기내 에서 6 8 일간배양하였다. 부착되지않은세포는제거하고부착된나머지세포는 0.1% 트립신및 0.02% EDTA 를이용하여 1 분간트립신분해하여 4 내지 6 일간격으로계대배양하였다. 그다음 80%(v/v) DMEM, 10%(v/v) DMSO 및 10% (v/v) FBS 로이루어진냉동용배지에넣고 -196 의액체질소에보관하였다. < 실시예 4> 탈핵난자에공여핵세포의미세주입및융합 상기 < 실시예 2> 에서제조한탈핵난자에상기 < 실시예 3> 에서제조한공여핵세포를미세주입하였다. 상기 < 실시예 2> 의미세조작장치상의절개용피펫을이식용피펫으로교체한후정치된탈핵난자를 100 μg /ml 피토헤마글루티닌 (phytohemagglutinin) 이함유된 hcr2aa 배지를처리하고탈핵난자의절개창을고정용피펫으로고정한다음이식용피펫을절개창으로삽입하여 < 실시예 3> 에서단일세포로분리된섬유아세포를탈핵난자의세포질과투명대사이에주입하였다. 상기에서공여핵세포가주입된난자를융합배지 (0.26M 만니톨, 0.1mM MgSO 4, 0.5mM 헤페스및 0.05% BSA) 에넣 고스테인레스스틸전극이장착된세포융합챔버 (BTX 453, 3.2mm gap; BTX, San Diego, CA) 로옮겼다. 3 분간평형시킨다음 BTX 전기 - 세포조작장치 (Electro-Cell Manipulator) 를이용하여상기난자를전압 3.0~3.5kV/cM 으로 20 초간직류전류를통전하여핵이식란을융합시켰다. 상기에서전압은회수된난자가약한난자인경우에낮은전압으로 (3.0kv/cM 에근접하도록 ), 건강한난자인경우에는높은전압 (3.5kv/cM 에근접하도록 ) 으로융합을수행하였으며, 평균 3.3kv/cM 의전압으로융합을수행하였다. 융합된핵이식란을입체현미경으로검경하여 1,095 개를선별하였고이를 msof(modified synthetic oviductal fluid) ( 표 4) 에서 3 시간동안배양하였다 (Jang et al., Reprod Fertil Dev, 15, 179-185, 2003). 성분 [ 표 4] msof 의조성 부피 - 11 -
NaCl(54.44) 2.900-3.100g/ml KCl(74.55) 0.2669g KH 2 PO 4 (136.1) 0.0810g Sod. Lactate 0.28ml Kanamycin 0.0375g Phenol-Red 0.0050g NaHCO 3 (84.01) 1.0531g/50ml 0.42124g/20ml Stock-T Stock-B Sod. Pyruvate(110.0) 0.0182g/5ml Stock-C 200 μl MgCl 2 6H 2 O(147.0) 0.0996g/10ml Stock-M 200 μl CaCl 2 2H 2 O(203.3) 0.2514g/10ml Stock-D 200 μl Glucose(180) 0.27024g/10ml 200 μl Glutamine(146.1) 0.14618g/10ml 200 μl Citri Acid(192) 0.096g/10ml Stock-CA 200 μl HEPES(238.3) 0.5958g/10ml Stock-E 200 μl EAA(Gibco 11051-018) 400 μl NEAA(Gibco 11140-019) 200 μl ITS(I-3146) 100 μl BSA(fatty acid free) 0.1600g Hyaluronic Acid 0.5mg/ml 1N NaOH D.W. 총 20ml ph 7.2-7.4 삼투압 275-285 EAA, NEAA 는빛에민감하므로주의 Phenol-Red 는지시약이므로배지에첨가하는양중요하지않음. 2ml 2ml < 실시예 5> 핵이식란의활성화 상기 < 실시예 4> 에서수득한핵이식란을 10μM 이오노포어 (Sigma) 가함유된 msof( 표 4) 에넣고 39 에서 4 분간배양하였다. 그다음상기핵이식란을세척하고 1.9mM 6- 디메틸아미노퓨린이첨가된 msof 에서 4 시간동안추가로배양하였다. 본발명자들은상기에서제조한핵이식란중하나를 Snuppy(cloned canine embryo) 라명명하고, 2005 년 7 월 15 일자로국제기탁기관인한국생명공학연구원유전자은행 (KCTC, 대전광역시유성구어은동 52 번지 ) 에기탁번호 KCTC 10831BP 로기탁하였다. 상기핵이식란은대리모에이식하기전까지미네랄오일이덮여진 msof 25 μl미세유적 (microdrop) 에서배양하였다. < 실시예 6> 대리모이식및복제견의생산 상기 < 실시예 5> 의핵이식란을외과적수술방법에의해대리모의난관에이식하였다. 이식은상기 < 실시예 5> 에서핵이식란을활성화한후대리모의준비상태에따라수행하였다. 즉, 대리모가바로준비되는경우에는이식을바로수행하였고그렇지않은경우에는핵이식란을활성화한다음날 ( 복제배아단계 : 2 세포기또는 4 세포기 ) 에이식을수행하였다. 대리모로는질병에이환되지않으며정상적인발정주기가반복되며자궁상태가정상인잡종견및라브라도리트리버로이루어진 123 마리의개를사용하였다. 상기대리모에상기 < 실시예 5> 의핵이식란 1,095 개를외과적수술방법에의해이식하였다. 이를위해먼저대리모에 0.1mg/kg 아세프로마진 (acepromazine) 과 6mg/kg 프로포폴 (propofol) 을혈관주사하여 - 12 -
마취시켰고, 2% 이소플루란 (isoflurane) 을이용하여흡입마취상태를유지하였다. 마취된개의수술부위를무균처리하고난관을노출시키기위해일반적인개복수술법에따라배중앙부분을 5~10cm 절개하였다. 손으로복강내를촉진하여난소와난관및자궁을절개창으로견인하였다. 견인된난소의난소간막을조심스레다루어난관의개구부를인지하고 1.0ml 튜버큘린 (tuberculin) 주사기 (Latex free, Becton Dickinson & CO. Franklin lakes, NJ 07417) 가장착된 3.5F 톰캣카테터 (Tom cat catheter, Sherwood, St. Louis, MO) 를난관내로넣어카테터전방에충분한공간을확보하고핵이식란을주입하였다. 핵이식란의주입여부는현미경을검경하였고항생제를혼합한생리식염수 500ml 를복강내주입하였다. 복부의봉합은흡수성봉합사를이용하였고이후피부봉합을실시하였다. 수술후감염을방지하기위하여광범위항생제를 3 일간투여하였다. 임신여부는대리모에핵이식란을이식한후 22 일째에 7.0 MHZ 리니어프로브가장착된 SONOACE 9900 초음파스캐너 (Medison Co. LTD, Korea) 를이용하여검사하였다. 임신상태는초기에임신을확인한후 2 주마다모니터하였다. 그결과, 3 마리의개에게서임신사실을확인하였다. 그중한마리는유산하였고, 나머지한마리로부터핵이식란을이식한지 60 일후에 2005 년 4 월 24 일제왕절개수술로복제견이분만되었다. 복제견의체중은 530g 으로건강하였다. 복제견의이름은 "Snuppy"(Seoul National University puppy) 로명명하였다. 또한, 나머지한마리로부터핵이식란을이식한지 60 일후에 2005 년 5 월 29 일제왕절개수술로복제견이분만되었다. 복제견의체중은 550g 으로건강하였으며, 이름을 NT- 2# 로명명하였다. < 실험예 1> 본발명의방법에따라생산된복제견의유전적동질성조사 본발명의방법에따라상기 < 실시예 6> 에서수득한복제견 Snuppy 와복제견 NT-2# 가상기 < 실시예 3> 의공여핵세포를제공한공여견인아프칸하운드와유전적으로동일한지를조사하였다. 이를위해복제견, 대리모, 공여핵세포인섬유아세포의게놈 DNA 를분리하였다. 먼저, 복제견의꼬리로부터조직단편을회수하였고공여견및대리모로부터는혈액시료를회수하였다. 상기조직단편, 혈액및섬유아세포를 400 μg프로테이나제 K 가첨가된용해완충액 [0.05M 트리스 (ph 8.0), 0.05M EDTA(pH 8.0), 0.5% SDS] 에각각넣고하룻밤동안배양하였다. 그다음페놀추출및에탄올침전을수행하여각시료로부터게놈 DNA 를분리하였다. 상기에서분리된 DNA 를 50 μl TE 에용해시키고이를이용하여 8 개의개과동물에특이적인마커 [PEZ01, PEZ02, PEZ08, PEZ15( 미국특허제 5874217 호참조 ), REN162B09, REN105L03, REN165M10, FH2140(http:// www.fhcre.org/science/dog_ genome/dog.html 참조 )](Francisco, L.V. et al. Mamm. Genome 7, 359-362 1996; Neff, M.W. et al. Genetics. 151, 803-820, 1999; Richman, M. et al. J. Biochem. Biophys. Methods 47, 137-149, 2001; Denise, S. et al. Animal Genetics. 35, 14-17, 2004) 를이용한마이크로세틀라이트분석을수행하였다. 상기에서분리한게놈 DNA 를주형으로하고상기공지된마커들의서열을기초로하여제조한형광표지된부위특이적프라이머 ( 표 5) 를이용하여 PCR 증폭을수행한후 PCR 증폭산물을자동 DNA 서열분석기 (ABI 373: Applied Biosystems, Foster City, CA) 를이용하여분석하였다. PCR 증폭조건으로는 94 에서 1 분간 1 회전변성시킨후 94 에서 20 초간변성, 58 에서 20 초간어닐링, 74 에서 20 초간신장하는단계를 30 회수행하고 74 에서 5 분간 1 회후신장단계를거치도록하였다. 또한, PCR 산물의크기를분석하기위하여소프트웨어 (GeneScan and Genotyper, Applied Biosystems) 를사용하였다. PEZ01 PEZ02 PEZ08 PEZ15 [ 표 5] PCR 증폭에사용된프라이머 프라이머서열서열번호 센스 5'-GGCTGTCACTTTTCCCTTTC -3' 1 안티센스 5'-CACCACAATCTCTCTCATAAATAC -3' 2 센스 5'- TCCTCTCTAACTGCCTATGC -3' 3 안티센스 5'-GCCCTTGAATATGAACAATGACACTGTATC -3' 4 센스 5'-TATCGACTTTATCACTGTGG -3' 5 안티센스 5'-ATGGAGCCTCATGTCTCATC -3' 6 센스 5'-CTGGGGCTTAACTCCAAGTTC -3' 7 안티센스 5'-CAGTACAGAGTCTGCTTATC -3' 8-13 -
REN162B09 REN105L03 REN165M10 FH2140 센스 5'-CAAACTTGACAGTCTTTTCAGGA -3' 9 안티센스 5'-GCATTCAAGATGCACCAATG -3' 10 센스 5'-GGAATCAAAAGCTGGCTCTCT -3' 11 안티센스 5'-GAGATTGCTGCCCTTTTTACC -3' 12 센스 5'-AACAGCCAAATCATGGAAGC -3' 13 안티센스 5'-AGCACCTCCATCCTTTCCTT -3' 14 센스 5'-GGGGAAGCCATTTTTAAAGC -3' 15 안티센스 5'-TGACCCTCTGGCATCTAGGA -3' 16 실험결과, 본발명의방법에따라생산된복제견 Snuppy 와 NT-2 # 는공여견인아프간하운드및상기아프간하운드로부터분리한섬유아세포와유전적으로완전히동일함을확인할수있었다. 반면, 본발명의복제견과대리모 ( 래브라도리트리버또는잡종견 ) 는유전적으로상이함을확인할수있었다 ( 표 6). 마커 공여견 ( 아프간하운드 ) 혈액림프구 [ 표 6] 개과동물의특이적인마이크로세틀라이트부위분석 공여핵섬유아세포 복제견 (Snuppy, 꼬리조직단편 ) 대리모복제견 ( 래브라도리트 (NT-2#, 꼬리조직리버, 혈액림프단편 ) 구 ) 대리모 ( 잡종견, 혈액림프구 ) 피크 1 피크 2 피크 1 피크 2 피크 1 피크 2 피크 1 피크 2 피크 1 피크 2 피크 1 피크 2 PEZ01 110 118 110 118 110 118 118 110 118 119 123 PEZ02 123 230 123 230 123 230 114 126 123 230 126 134 PEZ08 230 230 230 232 230 215 219 PEZ15 214 214 214 208 217 214 214 244 REN162B09 191 195 191 195 191 195 181 191 195 182 192 REN105L03 235 235 235 235 243 235 248 252 REN165M10 187 191 187 191 187 191 177 187 187 191 179 187 FH2140 122 122 122 131 122 121 131 < 실험예 2> 핵이식란의전기적융합조건의최적화 핵이식란의전기적융합조건을최적화하기위하여상기실시예 4 와동일한방법으로탈핵난자에공여핵세포를미세주입한후전압조건을각각 1,7 1.9kv/cm, 2.1 2.5kv/cm, 3.0 3.5kv/cm 의조건으로달리하여융합시킨다음융합된핵이식란을입체현미경으로검경하여융합여부를확인하였다. 실험결과, 전압을 3.0 3.5kv/cm 으로한경우핵이식란 270 개중 203 개가융합된것으로나타나 ( 융합율 75.2%), 다른조건에비해융합효율이매우높음을확인할수있었다 ( 표 7). [ 표 7] 전기적융합시전압조건에따른핵이식란의융합율 사용한난자수전압조건융합된난자의수 30 1.7~1.9 kv/cm 10 (33.3%) 50 2.1~2.5 kv/cm 22(44.0%) - 14 -
270 3.0~3.5 kv/cm 203(75.2%) < 실험예 3> 핵이식란의활성화조건의최적화 상기 < 실시예 4> 에서수득한핵이식란을전기적방법또는화학적방법에의해활성화시키고핵이식란의발육정도를관찰하였다. 핵이식란의전기적방법에의한활성화는상기 < 실시예 4> 의핵이식란을칼슘 (CaCl 2 ) 100nM 이첨가된만니 톨배지 (0.26M 만니톨, 0.1mM MgSO 4, 0.5mM 헤페스및 0.05% BSA) 에넣고스테인레스스틸전극이장착된세포융 합챔버 (BTX 453, 3.2mm gap; BTX, San Diego, CA) 로옮겼다. 3 분간평형시킨다음 BTX 전기 - 세포조작장치 (Electro-Cell Manipulator) 를이용하여상기난자를전압 3.0~3.5kV/cM 으로 20 초간직류전류를통전하였다. 화학적활성화방법으로는 < 실시예 4> 의핵이식란을 10μM 이오노포어 (Sigma) 가함유된 msof 에넣고 39 에서 4 분간배양한다음세척하고 1.9mM 6- 디메틸아미노퓨린이첨가된 msof( 표 4) 에서 4 시간동안추가로배양하였다. 배양이완료된후 TCM199 배지 ( 표 3) 로옮겨핵이식란의발육정도는입체현미경으로 100 배로검경하여확인하였다. 실험결과, 핵이식란의활성화방법에있어서화학적인방법이전기적방법에비해보다더우수함을확인할수있었다. 즉, 화학적방법에의해서활성화한경우 2 세포기까지도달한난자는 80% 였으나전기적방법을사용한경우에는약 53% 만이 2 세포기에도달하였음을확인하였다. 또한, 화학적방법을사용하면핵이식란이상실배기까지발육되었으나전기적방법을사용한경우에는 16 세포기까지밖에발육되지않음을알수있었다 ( 표 8). [ 표 8] 활성화방법에따른핵이식란의발육 활성화방법난자수분할 (2 세포기 ) 4 세포기 8 세포기 16 세포기상실배기배반포기 화학적방법 50 40 20 16 8 2 전기적방법 40 21 8 5 1 < 실험예 4> 본발명에따른개의핵이식란의대리모이식조건의최적화 상기 < 실시예 5> 에서활성화한핵이식란을 msof 배지 ( 표 4) 에서 38 39 의 5% 이산화탄소, 5% 산소가유지되는배양기에서배양하여 8 세포기까지자란배아를 0.1% 소태아혈청이첨가된 PBS 에침적시키고이를스트로우에장착한다음 20 마리의대리모 ( 잡종견 ) 의자궁각에이식하였다. 임신여부는상기 < 실시예 6> 과동일한방법으로핵이식란을이식한후 22 일째에초음파스캐너 (Medison Co. LTD, Korea) 를이용하여검사하였다. 실험결과, 자궁에핵이식란을이식한경우에는모두임신이되지않는것으로나타났다. 따라서, 핵이식란은 < 실시예 6> 에예시한바와같이난관에이식하는것이바람직함을알수있었다. 발명의효과 이상상기에서살펴본바와같이, 본발명에따른방법은복제된개과동물을생산하는효과가있으며이는우량개과동물의번식, 희귀 멸종위기의개과동물의보존, 이종이식, 질환모델동물등수의학, 인류학및의학연구분야의발달에기여할수있다. 도면의간단한설명 - 15 -
도 1 은본발명에따른일실시예에서개로부터난자를회수하기위하여사용한 15 게이지및 18 게이지난자회수용니들사진이다. 도 2 는본발명의방법에따라생산된복제견 Snuppy 와공여견의사진 (a) 및복제견 Snuppy 와대리모의사진 (b) 이다. 도면 도면 1 도면 2 서열목록 서열목록전자파일첨부 - 16 -